Abstract

Τα microRNAs (Mirs) είναι μικρά, ενδογενή, μη-κωδικοποίησης RNA που ρυθμίζουν την σταθερότητα ή /και τη μετάφραση του mRNA συμπληρωματικούς στόχους. Mirs έχουν προκύψει όχι μόνο ως κρίσιμη ρυθμιστές κανονικές φυσιολογικές διαδικασίες, αλλά απορρύθμιση τους μπορεί να επηρεάσει σημαντικά προστάτη και άλλων καρκίνων. Η έκφραση του miR-23b και miR-27b, τα οποία κωδικοποιούνται από το ίδιο σύμπλεγμα miR (MIR-23b /-27b), τα μειωτικά στα μεταστατικά, ο ευνουχισμός ανθεκτικά όγκους σε σύγκριση με πρωτογενή καρκίνο του προστάτη και καλοήθη ιστό? Ωστόσο, πιθανός ρόλος τους στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη είναι άγνωστη. Βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-23b /-27b σε δύο ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη ευνουχισμός ανθεκτικά οδήγησε σε καταστολή της εισβολής και της μετανάστευσης, καθώς και μειωμένη επιβίωση σε μαλακό άγαρ (ένα μέτρο της anoikis). Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία επίδραση του miR-23b /-27b στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που υποδηλώνει ότι αυτές οι Mirs λειτουργούν ως μετάσταση (αλλά όχι ανάπτυξη) καταστολείς στον καρκίνο του προστάτη. Αντιστρόφως, η αναστολή της miR-23b /-27b στο λιγότερο επιθετικά εξαρτώμενων από ανδρογόνα LNCaP καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή είχε σαν αποτέλεσμα αυξημένη εισβολή και τη μετανάστευση επίσης χωρίς να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό. Μηχανιστικά, βρήκαμε ότι η εισαγωγή του miR-23b /-27b σε μεταστατικό, ο ευνουχισμός ανθεκτικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη ως αποτέλεσμα τη σημαντική εξασθένηση της δραστηριότητας Rac1 χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα της ολικής Rac1 και προκάλεσε αυξημένα επίπεδα του καταστολέα όγκου Ε-καδερίνης. Η αναστολή αυτών των Mirs είχε το αντίθετο αποτέλεσμα σε κύτταρα LNCaP ανδρογόνο-εξαρτώμενη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-23b /είναι -27b μετάσταση καταστολείς που θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως νέων βιολογικών δεικτών και θεραπευτικών παραγόντων για ευνουχισμό ανθεκτική νόσο

Παράθεση:. Ishteiwy RA, Ward TM, Dykxhoorn DM, Burnstein KL (2012) η microRNA -23b /-27b Cluster καταστέλλει την Μεταστατικό Φαινότυπος του ευνουχισμού-ανθεκτικά κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (12): e52106. doi: 10.1371 /journal.pone.0052106

Επιμέλεια: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31 Ιούλ 2012? Αποδεκτές: 9 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Δεκ 2012

Copyright: © 2012 Ishteiwy et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης CA132200 (σε KLB) και DOD προ-διδακτορικό επιχορήγηση της κατάρτισης w81xwh-11-1-0314 (στη RAI). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

για περισσότερο από μισό αιώνα, στέρησης ανδρογόνων ήταν η τυπική θεραπεία για προχωρημένο και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη, όπως οι όγκοι εξαρτώνται αρχικά σε ανδρογόνα για την επιβίωση και την ανάπτυξη. Δυστυχώς, στους περισσότερους ασθενείς, οι όγκοι τελικά εξελίσσονται σε μία ανίατη, ο ευνουχισμός-ανθεκτικό και μεταστατική μορφή. Ως εκ τούτου, οι αποτελεσματικές νέες θεραπείες και ακριβής προγνωστικοί δείκτες που απαιτούνται για να βελτιωθεί η κλινική φροντίδα των ανδρών με καρκίνο του προστάτη.

Μετάσταση, ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της κακοήθειας, είναι η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων μέσω του συστήματος κυκλοφορίας του αίματος ή της λέμφου από τον αρχικό όγκο ιστοσελίδα σε απομακρυσμένα όργανα. Μεταστατικό ανάπτυξη προχωρεί μέσω μιας διαδικασίας πολλών σταδίων που περιλαμβάνει την τοπική εισβολή, κίνηση στην κυκλοφορία του αίματος (ενδαγγείωση), επιβίωση στην κυκλοφορία, την έξοδο από τα αιμοφόρα αγγεία (εξαγγείωση), την έναρξη και τη συντήρηση των μικρομεταστάσεων σε απομακρυσμένες θέσεις και, τέλος, αγγείωση των νέων όγκων [ ,,,0],1]. Για να προχωρήσει προς αυτή την μεταστατικού καταρράκτη, πρωτογενή καρκινικά κύτταρα συσσωρεύονται γενετικές και επιγενετικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένης της απορρύθμισης των προτύπων έκφρασης των miRNAs. Διελεύκανση των μηχανισμών που διευκολύνουν τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή είναι ένας σημαντικός στόχος της έρευνας για τον καρκίνο, όπως μετάσταση παραμένει η αιτία του 90% των θανάτων από στερεούς όγκους [1]. Η διάμεση επιβίωση για ασθενείς με εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη είναι μεγαλύτερο από 5 χρόνια, ενώ οι άνδρες με μεταστατική νόσο έχουν περιορισθεί σημαντικά τα ποσοστά επιβίωσης [1].

Τα microRNAs (Mirs), μικρά μη κωδικοποιητική 18 έως RNAs 24 νουκλεοτιδίων, προβλέπεται να ρυθμίζουν την έκφραση του περισσότερο από 90% των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, επηρεάζοντας έτσι ποικίλες κυτταρικές και μοριακές διαδικασίες [2]. Mirs ρυθμίζουν τα επίπεδα του mRNA και τη μετάφραση μέσω κανονικού ζευγαρώματος βάσεων μεταξύ της αλληλουχίας των σπόρων των miRNA (νουκλεοτίδια 2-8 στο 5 ‘άκρο) και τις συμπληρωματικές αλληλουχίες αγώνα σπόρων των mRNA στόχου, που συνήθως βρίσκεται στη μη μεταφραζόμενη περιοχή 3’ (UTR ) [3]. Τα microRNAs φιμώσουν συγγενικό τους στόχους από τη διάσπαση του mRNA, μεταφραστική καταστολή, αποσταθεροποίηση mRNA ή ένα συνδυασμό [4] αυτών των μηχανισμών. Περισσότερο από το 50% των γονιδίων σημειώνονται ανθρώπινης miR βρίσκονται σε χρωμοσωμικές περιοχές που είναι επιρρεπείς σε ενίσχυση, διαγραφή ή μετατόπιση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου [5]. Mirs παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην μετάσταση, πιθανόν να οφείλεται στην ικανότητά τους να μετα-μεταγραφικά ρυθμίζουν δίκτυα γονίδιο σημαντικό για την κυτταρική εισβολή, την κινητικότητα και τη μετανάστευση [6].

Η βιογένεση των Mirs είναι μια πολύ οργανωμένη, πολυσταδιακή διαδικασία [ ,,,0],7]. Πάνω από το 40% του ανθρώπινου Mirs είναι οργανωμένοι σε εξελικτικά συντηρημένη συστάδες, οι οποίες cotranscribed ως διακριτές πολυκιστρονικών pri-miRNAs. Ένας μεγάλος αριθμός των Mirs και miR συστάδες έχουν απελευθερωθεί στην ογκογένεση και τη μεταστατική ανάπτυξη [8].

MiR-23b και miR-27b, που αποτελούνται από ένα σύμπλεγμα στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 9, είναι ειδικά κάτω-ρυθμίζονται σε ανθρώπινο ευνουχισμό ανθεκτικών καρκίνου του προστάτη (CRPC) κλινικά δείγματα [9] – [12], καθώς και σε κυτταρικές μοντέλα CRPC [10], [13]. Είναι ενδιαφέρον, Sun et al. [12] βρήκαν ότι miR-23b /-27b έκφραση μειώνεται σημαντικά (2,8 φορές) σε πρωτογενείς όγκους (σε σύγκριση με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό) και περαιτέρω μειώθηκε κατά 3,2 φορές σε μεταστατικό CRPC δείγματα. Σε αυτή τη μελέτη, 15 από τους 17 CRPC δείγματα όγκου εμφάνισαν ρύθμιση προς τα κάτω του miR-23b /-27b σε σύγκριση με τα δείγματα πρωτογενούς όγκου [12]. Παρά τη συσχέτιση της μειωμένης miR-23b /-27b με αυξημένη παθογένεια της νόσου, ο ρόλος του miR-23b /-27b σε CRPC μεταστατική νόσο δεν έχει χαρακτηρισθεί καλά. Εδώ έχουμε παράσχει αποδείξεις ότι το miR-23b /-27b καταστέλλει κλειδί μεταστατικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων εισβολή, τη μετανάστευση και την αγκύρωση-ανεξάρτητη επιβίωση χωρίς να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Οι επιδράσεις αυτές συνοδεύονται από αυξημένα επίπεδα Ε-καδερίνης και εξασθένηση της δραστηριότητας Rac1

Ε-καδερίνης, ένα μόριο κυτταρικής προσκόλλησης, καταστέλλει την επεμβατική και μεταναστευτικές φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων [14] – [17].. Απώλεια της Ε-καδερίνης είναι κατά κανόνα συνδέονται με εισβολή όγκου, μεταστατική διάδοση και κακή πρόγνωση ασθενή σε μια ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη. Για παράδειγμα, η απώλεια του Ε-καδερίνης προσδίδει ικανότητα μεταστατικά σε σχετικά μη επιθετική, επιθηλιακά κύτταρα μετασχηματισμένα μαστού [16]. Επιπλέον, η Ε-καντερίνη αρνητικά κύτταρα δεικνύουν αυξημένη εισβολή και μεταστατικό δυναμικό σε σύγκριση με Ε-καδερίνης θετικά κύτταρα στο μοντέλο όγκου προστάτη αρουραίου Dunning [14], [15], [18]. Η Rho ΟΤΡάσης Rac1, η οποία ρυθμίζει κυτταροσκελετού αναδιατάξεις που απαιτούνται για την κυτταρική μετανάστευση, συνδέεται στενά με επιθετικό καρκίνο του προστάτη [19] – [22]. Αυξημένα Rac1 απαιτείται για επεμβατική συμπεριφορά του καρκίνου του προστάτη ανθρώπινη κυτταρική σειρά PC3 [23]. Έτσι, τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ είναι συνεπή με ένα ρόλο για το miR-23b /-27b cluster στην καταστολή μετάστασης μέσω συνέπειες για E-cadherin και Rac1.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Το ανθρώπινο προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές ALVA31 (που λαμβάνεται από το Δρ. Stephen Loop και Richard Ostensen, Τμήμα Υποθέσεων Βετεράνων Ιατρικό Κέντρο, Τακόμα, WA) [24], LNCaP (American Type Culture Collection, Manassas, VA), PC3 -ML (ελήφθη από τον Dr. Alessandro Fatatis, Drexel University College of Medicine) [25] ανακαλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 IU /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 100 g /ml Ε-γλουταμίνη. Όλες οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Απομόνωση RNA και Ποσοτική RT-PCR

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας απομόνωση miRVana miRNA kit (Applied Biosystems, Foster City, California). Η TaqMan stem-loop μέθοδο RT-PCR χρησιμοποιώντας το κιτ TaqMan® miRNA αντίστροφη μεταγραφή και τις δοκιμασίες που TaqMan® miRNA (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η έκφραση του miR-27b.U6 μικρό πυρηνικό RNA χρησίμευσε ως εσωτερικός μάρτυρας για όλα τα πειράματα .

ανοσοαποτύπωσης

οι κυτταρικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα SDS-PAGE, και αναλύσεις κηλίδος Western πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με πρότυπες διαδικασίες. Western κηλίδωση του β-ακτίνης στην ίδια μεμβράνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-Ε-καδερίνης (BD 610181), αντι-Rac1 (Milipore 23A8), και αντι-ακτίνης (Santa Cruz 1616).

Πλασμίδια και λεντοϊών Παραγωγή

Το ανθρώπινο miR-23b /-27b πρόδρομος (pMIRNA-23b /-27b-GFP) και η ομελέτα ελέγχου (pMIRNA-ομελέτα-GFP) κλωνοποιήθηκε σε φορείς λεντοϊών (Συστήματα Βιοεπιστημών (SBI) Mountain View CA, USA) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα LentiX ΗΕΚ ( Clontech, Mountain View CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. έκφραση GFP σε μετασχηματισμένα κύτταρα ALVA31 και PC3-ML καθορίστηκε από cytometery ροή.

κυτταρομετρίας ροής

θρυψίνη κύτταρα διαπερατά χρησιμοποιώντας 0,05% θρυψίνη με 0,53 mM EDTA (Cellgro). Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε σε ένα Accuri C6 κυτταρομετρίας χρησιμοποιώντας το λογισμικό CFlow σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Οι επιμολύνσεις κυττάρων

Τα χημικώς τροποποιημένα αντινοηματικά νουκλεοτίδια (antagomiRs) έναντι miR-23b και miR-27b ή antagomiRs ελέγχου αγοράστηκαν από την Applied Biosystems και επιμολύνθηκαν σε 50 ηΜ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όλες οι πειραματικές δοκιμασίες διεξήχθησαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Μετανάστευση Αναλύσεις

δοκιμασίες Scratch πραγματοποιήθηκαν σε ALVA31 κύτταρα 72 ώρες μετά την μεταγωγή με miR-23b /-27b ή ομελέτα έλεγχο ή σε LNCaP κύτταρα 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με antagomiR-23b /-27b ή τον έλεγχο antagomiR. Ένα στείρο ρύγχος πιπέτας σύρθηκε κατά μήκος συρρέουσες μονοστοιβάδες κυττάρων για να δημιουργήσει το μηδέν. Οι μονοστοιβάδες στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα και επωάστηκαν στους 37 ° C 5% CO

2 για 4 ώρες. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν αμέσως μετά το ξύσιμο και πάλι μετά από 4 ώρες. Εικόνα J χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί το πλάτος μηδέν ως συνάρτηση του χρόνου. Το ποσοστό του κενού (μηδέν) κλείσιμο υπολογίστηκε ως το ποσοστό του εναπομείναντος ελεύθερου κυτταρική επιφάνεια σε σύγκριση με την περιοχή του αρχικού τραύματος. Δύο ανεξάρτητα πειράματα με ένα σύνολο τουλάχιστον 6 γρατσουνιές για κάθε κυτταρική σειρά.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Αναλύσεις

ALVA31, PC3-ML (εκφράζουν miR-23b /-27b ή ομελέτα ελέγχου) και τα κύτταρα LNCaP (επιμολυσμένα με antagomiR-23b /-27b ή ελέγχουν antagomiR) τοποθετήθηκαν σε μία αρχική πυκνότητα των 10000 κυττάρων /φρεάτιο σε μια έξι-φρεατίων. Στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και βιώσιμα κύτταρα (εκείνα που αποκλείουν trypan blue) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο.

εισβολής σε Matrigel Δοκιμασίες

Δοκιμασία εισβολής σε Matrigel (BD Biosciences) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ALVA31 και PC3-ML κύτταρα 72 ώρες μετά την μεταγωγή με miR-23b /-27b ή ομελέτα ελέγχου και LNCaP κύτταρα 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με antagomiR-23b /-27b ή ελέγχουν antagomiR. 50.000 κύτταρα στερήθηκαν ορού για 16 ώρες και στη συνέχεια σπέρνονται σε άνω θάλαμο της συσκευής transwell με επιστρωμένο με Matrigel μεμβράνη (24 καλά ένθετο, 8 χιλιοστά μέγεθος πόρου). Μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοπροσελκυστικό. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 48 ώρες, οι κορυφαίες θάλαμοι σκουπίζεται με βαμβάκι για την απομάκρυνση μη αποδημητικών ή μη επεμβατική κύτταρα. Τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή μεθανόλη, βάφτηκαν με 0.01% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο.

Soft Agar Δοκιμασίες

Soft δοκιμασίες άγαρ διεξήχθησαν σε ALVA31 ή κύτταρα PC3-ML 72 ώρες μετά την μεταγωγή με miR-23b /-27b ή ομελέτα ελέγχου. Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη αξιολογήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]

Rac1 Δοκιμασίες Δραστηριότητας

δοκιμασίες δραστηριότητας Rac1 διεξήχθησαν σε ALVA31 ή κύτταρα PC3-ML 72 ώρες μετά την μεταγωγή με miR-23b /. – 27β ή ομελέτα ελέγχου. GTP-δεσμεύεται Rac1 διαχωρίζεται από το ΑΕΠ-Rac1 χρησιμοποιώντας ένα pull-down προσέγγιση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Εν συντομία, κυτταρολύματα επωάστηκαν με 200 mg /ml PBD-GST [ρ21-πεδίο σύνδεσης, PBD, του τελεστή PAK Rac1 /Cdc42 (ρ21-ενεργοποιημένη κινάση)]. GTP-Rac1 ανακτήθηκε μετά από επώαση με σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης. Συγκροτήματα συλλέχθηκαν, μετουσιώνεται και αναλύθηκαν με SDS-PAGE. Ενεργά Rac1 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western με αντι-Rac1 αντισώματα (Millipore). Συνολικά 5% του αρχικού λύμα αναλύθηκε επίσης με ανοσοαποτύπωση για να καθορίσει τα συνολικά επίπεδα της Rac1 (ΑΕΠ-και GTP-δεσμευμένη).

Αποτελέσματα

MiR-23b /-27b Καταστέλλει Κινητικότητα , εισβολή και Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη του ευνουχισμού-ανθεκτικά κύτταρα του καρκίνου του προστάτη

με δεδομένη την αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του miR-23b /-27b έκφρασης και κακοήθη φαινότυπο του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη, επιδιώξαμε να αξιολογηθεί η δυνατότητα αντι-νεοπλασματικές ρόλο (ες) για αυτό το σύμπλεγμα miRNA. Προς τούτο, ο miR-23b /-27b συμπλέγματος εκτοπικά εκφραζόμενη χρησιμοποιώντας έναν φορέα λεντοϊού (που κωδικοποιεί επίσης GFP) σε δύο ανεξάρτητα εξαιρετικά επιθετική ευνουχισμός ανθεκτικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, ALVA31 και PC3-ML. 72 ώρες μετά την μεταγωγή, τα κύτταρα αναλύθηκαν για έκφραση GFP με χρήση κυτταρομετρίας ροής για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας μεταγωγής για κάθε πείραμα (S1). Τα πειράματα διεξήχθησαν μόνο όταν περισσότερο από 95% των κυττάρων εξέφρασαν GFP. Από miR-27b βρίσκεται 3 ‘ως προς miR-23b, παρακολουθήσαμε τα επίπεδα miR-27b με αντίστροφη μεταγραφάση qPCR εξής μεταγωγή με φακοϊούς κωδικοποιεί αυτή συστάδα miRNA ή ένα στοιχείο ελέγχου μη-ειδική miRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μεταγωγή με το miR-23b /-27b φορέα λεντοϊού οδήγησε σε επίπεδα Mir-27b συγκρίσιμα με εκείνα που βρέθηκαν σε φυσιολογικά κύτταρα MCF7, η οποία χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για miR-27β [27]. Εναλλακτικά, miR-23b /-27b ανεστάλη στη γραμμή LNCaP εξαρτώμενων από ανδρογόνα χρησιμοποιώντας antagomiRs, τα οποία είναι συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια συμπληρωματικά προς το στόχο miRNA που οδηγούν σε διάσπαση του αντίστοιχου miRNA (S2).

Για να καθοριστεί εάν miR-23b /-27b ρυθμίζει την κυτταρική μεταστατικό διαδικασίες, αναλύσαμε τα αποτελέσματα των μεταβάλλοντας miR-23b /-27b έκφραση για τον ευνουχισμό ανθεκτική κυτταρική κινητικότητα και τη μετανάστευση. Χρησιμοποιώντας δοκιμασίες μηδέν, βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-23b /-27b στην CRPC γραμμή, ALVA31 μειωμένη κυτταρική κινητικότητα περίπου 2-φορές μετά από μόνο 4 ώρες (Σχήμα 1Α). Αντιστρόφως, η αναστολή της ενδογενούς miR-23b /-27b έκφραση σε κύτταρα LNCaP, τα οποία έχουν σχετικά υψηλά ενδογενή επίπεδα αυτών των miRNAs και παρουσιάζουν μικρή κινητικότητα, οδήγησε σε μεγαλύτερη από 2-φορές αυξημένη κινητικότητα σε σύγκριση με τον έλεγχο antagomiR-επιμολυσμένα κύτταρα (Εικόνα 1Β ).

-27b έκφρασης μειώνει τον ευνουχισμό ανθεκτικά μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη, ενώ η αναστολή των miR-23b /-27b αυξάνει τη μετανάστευση των εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. δοκιμασίες Scratch διεξήχθησαν σε κύτταρα που εκφράζουν ALVA31 miR-23b /-27b ή ομελέτα ελέγχου (Α) και τα κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με 50 ηΜ antagomiR-23β-27b ή ελέγχουν antagomiR (Β). Εικόνες των εκκαθαριστεί ζωνών (εκπρόσωπος εικόνες που παρουσιάζονται στα δεξιά) ελήφθησαν πριν και μετά από μια επώαση 4 ωρών και οι εκκαθαρίζονται περιοχές μετράται χρησιμοποιώντας λογισμικό Image J. Το μέσο ποσοστό κλείσιμο της ψαλίδας (± SD) (λόγω της μετανάστευσης των κυττάρων) παρουσιάζεται για δύο ανεξάρτητα πειράματα από 7 γρατσουνιές (Α) και 6 γρατσουνιές (Β) (*** Ρ & lt? 0.001).

Η

Στη συνέχεια, θα εξεταστεί αν miR-23b /-27b έκφραση επηρεάζεται εισβολής του ευνουχισμού-ανθεκτικά κύτταρα χρησιμοποιώντας θαλάμους εισβολή Matrigel. Κύτταρα με έλλειψη ορού προστέθηκαν σε ανώτερους θαλάμους της transwell και τους αριθμούς των κυττάρων που εισβάλλουν μέσα από το φράγμα Matrigel σε απόκριση σε χημειοελκτικό (ορού) κατά τη διάρκεια μιας χρονικής περιόδου 48 h αξιολογήθηκαν. Εισαγωγή miR-23b /-27b σε ALVA31 και τα κύτταρα PC3-ML μείωσε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων που εισβάλλουν κατά περισσότερο από 2 φορές (Σχήμα 2Α και Β). Σε αντίθεση, η εξάντληση του miR-23b /-27b δραστηριότητας στις λιγότερο επιθετική εξαρτώμενων από ανδρογόνα LNCaP κυτταρική σειρά σημαντικά ενισχυμένη κυτταρική εισβολή (Σχήμα 2C).

-27b έκφραση μειώνει την διεισδυτικότητα του ευνουχισμού ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη ενώ η αναστολή του miR-23b /-27b στην εξαρτώμενη από ανδρογόνο καρκινικών κυττάρων του προστάτη αυξάνει τη διεισδυτικότητα. Α, προσδιορισμοί εισβολή Matrigel διεξήχθησαν σε ALVA31 κύτταρα (Α) και τα κύτταρα PC3-ML (Β) που εκφράζουν miR-23b /-27b ή ομελέτα κύτταρα ελέγχου μεταγωγή. Άνω πάνελ δείχνουν αντιπροσωπευτικές περιοχές των φίλτρων θαλάμου με κρυσταλλικό ιώδες-χρωματισμένα κύτταρα. Η πολλαπλή μεταβολή (± SEM) αντιπροσωπεύει τον αριθμό των εισέβαλαν κυττάρων ανά θάλαμο διαιρούμενο με τους ελέγχους από τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για το Α και των μέσων (± SD) από ένα ανεξάρτητο πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν για το Β (*** Ρ & lt? 0.001 ). C, τα κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με 50 ηΜ ελέγχου antagomiR ή antagomiR-23β /-27b. δοκιμασίες Matrigel εισβολής διεξήχθησαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, όπως εξηγήθηκε παραπάνω. Τα μέσα (± SD) των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν εμφανίζονται (*** Ρ & lt? 0.001).

Η

Εκτός από τη μετανάστευση και την εισβολή, μεταστατικά κύτταρα καρκινώματος συχνά αποκτούν την ικανότητα να αναπτύσσονται σε η αγκύρωση-ανεξάρτητο τρόπο, αντιστέκονται anoikis. Ως εκ τούτου, εμείς προσδιορίστηκαν τα αποτελέσματα του miR-23b /-27b έκφραση σε προστάτη επιβίωση των καρκινικών κυττάρων σε μαλακό άγαρ. ALVA31 και PC3-ML κύτταρα (MIR-23b /-27b που εκφράζουν και κωδικοποιημένα σε μεταγωγή ελέγχου) φέρθηκαν σε μέσα με χαμηλή προσκόλληση (μαλακό άγαρ) και η επιβίωση αποικία αξιολογήθηκε 2-4 εβδομάδες μετά την επίστρωση. σχηματισμός αποικιών ήταν σημαντικά μειωμένη σε ALVA31 και κυτταρικές γραμμές Ρ3-ML που εκφράζουν miR-23b /-27b σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα στοιχεία ελέγχου (Σχήμα 3). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν έντονα ότι miR-23b /-27b έκφραση προσδίδει ευαισθησία anoikis στην επιθετική ευνουχισμό ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

-27b μειώνει αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη από τον ευνουχισμό ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη. Μαλακό δοκιμασίες άγαρ έγιναν σε ALVA31 και τα κύτταρα PC3-ML εκφράζουν miR-23b /-27b ή μεταγωγή με ομελέτα ελέγχου (** P & lt? 0,01). Μέσος αριθμός αποικιών (± SEM) ανά πλάκα από δύο ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για κάθε κυτταρική γραμμή που εμφανίζεται (** Ρ & lt? 0,01).

Η

Είναι ενδιαφέρον ότι, η υπερέκφραση του miR-23b /- 27β στα ευνουχισμός ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές, ALVA31 και Ρ3-ML, δεν επηρεάζουν σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 4Α και Β). Επιπλέον, η αναστολή αυτών των Mirs σε ανδρογόνα εξαρτώμενου καρκίνου του προστάτη LNCaP κύτταρα επίσης δεν επηρέασε τα ποσοστά πολλαπλασιασμού (Σχήμα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο miR-23b /-27b σύμπλεγμα μπορεί να παίζει βασικό ρόλο στη μεταστατική διαδικασία, όπως υποδεικνύεται από τις παρατηρούμενες φαινοτύπους σε δοκιμασίες εισβολή, τη μετανάστευση και anoikis. Εντούτοις, μεταβολές στο επίπεδο της miR-23b /-27b σύμπλεγμα δεν είχε καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών.

-27b δεν ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Α και Β, της διάδοσης των κυττάρων που εκφράζουν miR-23b /-27b συγκρίθηκε με εκείνη των κωδικοποιημένα τα κύτταρα ελέγχου μεταγωγή. Ο μέσος αριθμός κυττάρων (± SEM) σε σύνολο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν παρουσιάζεται για ALVA31 κύτταρα και ο μέσος αριθμός κυττάρων (± SD) ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν παρουσιάζεται για τα κύτταρα PC3-ML. C, αξιολογήθηκε πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP επιμολυσμένα με antagomiR-23b /-27b ή τον έλεγχο antagomiR. Ο αριθμός μέσου κυττάρων (± SD) από δύο ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν φαίνεται.

Η

έκτοπη έκφραση της miR-23b /-27b αυξάνει σημαντικά Ε-καδερίνης επίπεδα πρωτεΐνης και μειώνει Rac1 Δραστηριότητα

Για να κατανοήσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς του miR-23b /-27b μεσολάβηση αναστολή της μεταστατικής φαινοτύπων, εξετάσαμε την έκφραση των βασικών παραγόντων στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή. Συνήθως, η μετανάστευση και η εισβολή των καρκινικών κυττάρων προωθείται από την απώλεια της αλληλεπίδρασης των ενώσεων προσφύσεως με τον κυτταρικό σκελετό και μεταγενέστερες αλλαγές στις δραστηριότητες της οικογένειας Rho μικρά ΘΤΡάσες όπως Rac1 και Cdc42 [28]. Βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-23b /-27b οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης και στις δύο ALVA31 και τα κύτταρα PC3-ML. Αντιστρόφως, η αναστολή της miR-23b /-27b σε κύτταρα LNCaP οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα Ε-καδερίνης (Εικόνα 5).

-27b αυξάνει σημαντικά την έκφραση Ε-καδερίνης σε ευνουχισμό ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών. ALVA31 ή PC3-ML κύτταρα που εκφράζουν miR-23b /-27b ή μεταγωγή με ομελέτα ελέγχου και LNCaP κύτταρα επιμολυσμένα με antagomiR-23b /-27b ή τον έλεγχο antagomiR υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για το E-cadherin και ακτίνης. Αντιπροσωπευτικά κηλίδες φαίνονται σε σύνολο 2-6 πειραμάτων.

Η

δραστικότητα Rac1 συνδέεται με και φαίνεται να είναι απαραίτητη για την μεταστατικό φαινότυπο του καρκίνου του προστάτη, καθώς και άλλα επιθηλιακά καρκίνους [19] , [29]. Η ενδογενής δραστηριότητα Rac1 προωθεί αγκυροβόλιο ανεξάρτητη ανάπτυξη και απαιτείται για την επεμβατική συμπεριφορά του CRPC κυτταρική σειρά PC3 [29]. Για τους λόγους αυτούς, θα καθορίζεται εάν έκτοπη έκφραση του miR-23b /-27b σε επιθετικό καρκίνο του προστάτη κύτταρα που επηρεάζονται δραστηριότητα Rac1. Εισαγωγή miR-23b /-27b σε ALVA31 και PC3-ML, οι οποίες έχουν υψηλή ενδογενή δραστικότητα Rac1 [19], εξασθενημένα σημαντικά δραστηριότητα Rac1 χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα της ολικής Rac1 (Σχήμα 6). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα παρέχουν μηχανιστικές διορατικότητα στο ρόλο του miR-23b /-27b σε καταστολή της μεταστατικής φαινοτύπων.

-27b μειώνει σημαντικά τη δραστικότητα Rac1 αλλά όχι συνολικά επίπεδα Rac1 σε ευνουχισμό ανθεκτικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. δοκιμασίες δραστικότητας Rac1 εκτελέστηκαν σε ALVA31 (Α) και τα κύτταρα PC3-ML (Β) που εκφράζουν miR-23b /-27b ή μεταγωγή με περιπλεγμένο έλεγχο. GTP-δεσμευμένη Rac1 διαχωρίστηκε από GDP-Rac1 χρησιμοποιώντας δοκιμασία αναπτυσσόμενο όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Συγκροτήματα περιέχουν GTP-Rac1 (ενεργός Rac1) συλλέχθηκαν, μετουσιώνεται και αναλύθηκαν με SDS-PAGE που ακολουθείται από κηλίδωση Western με αντι-Rac1 αντισώματα. Σύνολο Rac1 (ΑΕΠ-και GTP-δεσμευμένη) αντιπροσωπεύει το 5% του αρχικού κυτταρικού λύματος. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Ποσοτικοποίηση των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται με μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM (* Ρ & lt? 0,05), (** Ρ & lt? 0,01).

Η

Συζήτηση

Mirs ρυθμίζουν μία ευρεία ποικιλία βιολογικών και παθολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της μεταστατικό καταρράκτη. Πάνω από χίλια Mirs κωδικοποιούνται στο ανθρώπινο γονιδίωμα και η διαλεύκανση των λειτουργιών τους είναι ένας σημαντικός τομέας της έρευνας [6]. Δεδομένου ότι πολλοί Mirs έχουν ρόλους στην απόπτωση και μιτογένεση [30] δυνητική συμβολή τους στην μετάσταση μπορεί να είναι δύσκολο να διακρίνει κανείς. Δείχνουμε εδώ ότι το miR-23b /-27b κατέστειλε τη μετανάστευση και την εισβολή του επιθετικού καρκίνου του προστάτη κύτταρα χωρίς να ασκούν σύγχυσης επιδράσεις στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Mirs με αυτούς τους τύπους των χαρακτηριστικών περιγράφονται ως υποψήφιος «καταστολείς μετάσταση» [6], [31].

Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να εξουδετερώσει anoikis, μεταναστεύουν και εισβάλλουν απαιτεί την απόκτηση πολλαπλών μοριακών χαρακτηριστικών [32] . Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η έκτοπη έκφραση του miR-23b /-27b σε μεταστατικό CRPC κυτταρικές γραμμές, ALVA31 και PC3-ML, οδήγησε σε μειωμένη ανάπτυξη σε μαλακό άγαρ καθώς και μειωμένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Αντιστρόφως, η αναστολή της miR-23b /-27b στην εξαρτώμενη από ανδρογόνο κυτταρική γραμμή καρκίνου του προστάτη, LNCaP, είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Προκειμένου για τα κύτταρα επιθηλιακά καρκινικά να εισβάλει και να μεταναστεύσουν, η ακεραιότητα του επιθηλίου και της βασικής μεμβράνης θα πρέπει να διαταραχθεί επιτρέποντας στα κύτταρα να αποκτήσουν πρόσβαση στο υποκείμενο στρώμα. Αυτή η διαδικασία απαιτεί διάσπαση του επιθηλιακού κυττάρου-κυττάρου επαφές, οι οποίες μπορεί να συμβεί μέσω μειωμένα επίπεδα μορίων κυτταρικής προσκόλλησης όπως Ε-καδερίνης. Η έκφραση του miR-23b /-27b αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης σε δύο ανεξάρτητες CRPC κυτταρικές σειρές? Αντιστρόφως αναστολή της miR-23b /-27b σε μια λιγότερο επιθετική εξαρτώμενων από ανδρογόνα κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη, LNCaP, οδήγησαν σε μείωση των επιπέδων Ε-καδερίνης.

απώλεια του μορίου κυτταρικής προσκόλλησης Ε-καδερίνης σε προστάτη δείγματα ασθενή με καρκίνο συνδέεται στενά με μεταστατική συμπεριφορά και κακή κλινική έκβαση [14], [15], [18]. Αυτές οι μελέτες υποστηρίζουν E-cadherin απορρύθμιση ως ένα κρίσιμο γεγονός στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και είναι συνεπείς με τα ευρήματα μας ότι το miR-23b /-27b-έκφραση οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα E-cadherin και μείωση της μεταστατικής χαρακτηριστικά. Η μοριακή βάση για αυξητική ρύθμιση της Ε-καδερίνης σε miR-23b /27b που εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη είναι άγνωστη. Ενώ πιθανολογείται ότι αυτό το αποτέλεσμα οφείλεται σε miR-23b /-27b μεσολάβηση αναστολής (είτε άμεσα ή έμμεσα) από μία ή περισσότερες από τις γνωστές μεταγραφικοί καταστολείς Ε-καδερίνης [33] – [35], δεν παρατηρήσαμε συγκλινουσών ενδείξεων καταστολής της Twist καταστολείς Ε-καδερίνης, Slug, Snail, Zeb1 ή Zeb2 σε CRPC κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν miR-23b /-27b (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν την πιθανή συμμετοχή άλλων καταστολείς ή /και miR-23b /-27b μεσολάβηση up ρύθμιση της E-cadherin παρουσιάζεται μέσα από ένα πιο σύνθετο μηχανισμό (ες).

Η μεταστατική διαδικασία περιλαμβάνει όχι μόνο την απώλεια του κυττάρου-κυττάρου συμφύσεις, αλλά τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να αποκτήσουν την ικανότητα να μεταναστεύουν προκειμένου να αποικίσουν απομακρυσμένες περιοχές. Η Rho ΟΤΡάσης Rac1 ρυθμίζει αναδιάταξη του κυτταροσκελετού της ακτίνης που απαιτείται για την κυτταρική μετανάστευση. Η υπερέκφραση του Rac1 σχετίζεται με αυξημένη μεταστατικό δυναμικό του προστάτη και άλλων επιθηλιακών τύπων καρκίνου [36] – [38]. δραστηριότητα Αυξημένα Rac1 εμφανίζεται σε CRPC, προωθεί ανθεκτικά ευνουχισμό, καθώς επίσης και, αγκυροβόλιο ανάπτυξη ανεξάρτητη και απαιτείται για την επεμβατική συμπεριφορά του CRPC κυτταρική γραμμή PC3 [19], [21]. Μία ποικιλία ενεργοποιητών Rac1 έχει αποδειχθεί ότι είναι σημαντική στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη ή για την απόκτηση ενός επεμβατικού φαινότυπο. Για παράδειγμα, εμείς και άλλοι απέδειξαν τη σημασία της Rho παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίου γουανίνης (GEFs) στην εξέλιξη της CRPC [21], [22], [26], [39]. Επιπλέον, αυξημένη έκφραση ορισμένων Rac1 GEFs συσχετίζεται με αυξημένη βιοχημική υποτροπή [22] και μειωμένη επιβίωση χωρίς ασθένεια σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [40]. Πρωτεΐνες που μειώνουν την δραστικότητα Rac1 μέσω υδρόλυσης του GTP, ΟΤΡάσης ενεργοποίηση πρωτεϊνών (διάκενα), δρουν ως καταστολείς των όγκων [41]. Αν και miR-23b /-27b δεν επηρέασε τα επίπεδα των συνολικών Rac1, εισαγωγή αυτών των Mirs σε ALVA31 και τα κύτταρα PC3-ML μειωμένα επίπεδα του δραστικού (GTP-δεσμευμένη) Rac1. Ως εκ τούτου, θεωρούμε ότι το miR-23-β /27-β πρέπει να αναστέλλουν μία ή περισσότερες από τις πολλές ανάντη ενεργοποιητές της Rac1 ή έμμεσα αυξάνουν ανασταλτικές πρωτεΐνες Rac1.

Αν και η έκφραση του miR-23b /-27b μεσολάβηση της μείωσης δραστηριότητας Rac1 και οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης, τα αποτελέσματα αυτά υπόνοιες ότι είναι έμμεση. Από το ατομικό Mirs συχνά ρυθμίζουν πολλά γονίδια-στόχους, miR-23b /-27b μπορεί να καταστείλει πολλαπλούς στόχους και τα δίκτυα που οδηγούν τελικά στις μεγάλες φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρήσαμε. Ένας αριθμός miR-23b και στόχος miR-27b γονίδια έχουν ταυτοποιηθεί σε άλλους τύπους καρκινικών κυττάρων στα οποία αυτές οι Mirs εκφράζονται διαφορικά σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του ήπατος και των πνευμόνων [42] – [50]. Ωστόσο, δεδομένου ότι πολλές από τις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από αυτά τα γονίδια στόχοι εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αναμένουμε ότι αυτά τα γονίδια δεν αντιπροσωπεύουν τις σχετικούς στόχους σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Επιπλέον, εντοπίσαμε πολλά υπολογιστικά προβλέψει υποψήφιων στόχων του miR-23b /-27b που συνδέονται με Rac1 σηματοδότηση και τη ρύθμιση E-cadherin συμπεριλαμβανομένων ΡΙ3-κινάσης, ΜΑΡΚ, TGF-β, Wnt, mTOR, Jak-STAT, διοδίων-όπως υποδοχέα και Notch μεταξύ άλλων. Μέσα σε αυτά τα πολύπλοκα ενοποιητική δίκτυα, οι στόχοι του miR-23b /-27b μπορεί να συγκλίνουν για να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα Rac1 και E-cadherin. Επιδιώκουμε ενεργά αυτές τις πιθανούς στόχους. Επιπλέον, θα είναι σημαντικό να οριοθετηθούν τα επιμέρους ρόλους των δύο Mirs σε αυτό το σύμπλεγμα για εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη.

Από μεταστάσεων είναι υπεύθυνες για τη θνησιμότητα των ασθενών σχεδόν σε όλα τα ανθρώπινα καρκινώματα, η ικανότητα της miR-23b /-27b να εμποδίσουν μεταστατική διαδικασίες θα μπορούσαν να είναι κλινικής αξίας. Απώλεια miR-23b /-27b μπορεί να χρησιμεύσει ως προγνωστικός δείκτης για επιθετικό καρκίνο του προστάτη. Βιοδείκτες που διακρίνουν νωχελικός από επιθετικό καρκίνο του προστάτη είναι αυστηρά απαραίτητη, και την απώλεια του miR-23b /-27b μπορεί να προβλέψει μεταστατική νόσο. Από Mirs έχουν επίσης πιθανή χρήση ως θεραπευτικές μεθόδους [51], miR-23b /-27b «μιμείται» θα πρέπει να αξιολογηθεί σε προκλινικά μοντέλα μετάστασης του καρκίνου του προστάτη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σύρετε S1.

Αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας μεταγωγής των ALVA31 και τα κύτταρα PC3-ML. έκφραση GFP του ALVA31 (Α) ή κύτταρα PC3-ML (Β) 72 ώρες μετά από δύο διαδοχικές μεταγωγές με τις GFP-κωδικοποιημένα φορείς λεντοϊών pMIRNA-miR-23b /-27b ή pMIRNA-ομελέτα φορείς λεντοϊών (Συστήματα Βιοεπιστημών (SBI) Mountain View CA, USA). έκφραση GFP σε μη μεταδιηγερμένα και μεταγωγή κύτταρα εκτιμήθηκε με ανάλυση FACS

doi:. 10.1371 /journal.pone.0052106.s001

(ΔΕΘ)

Σύρετε S2.

επίπεδα MiR-27β μειωθεί στα κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με antagomiR-23β /-27b. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ antagomiR-23b /-27b ή ελέγχουν antagomiR. επίπεδα MiR-27β προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο-PCR 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι τιμές είναι το επίπεδο miR-27b κανονικοποιημένη να U6 snRNA στα κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με έλεγχο antagomiR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0052106.s002

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ. Balakrishna και Vinata Lokeshwar, Pedro Salas (Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι Miller School of Medicine), Jennifer Richer (Πανεπιστήμιο του Κολοράντο στο Κέντρο Επιστημών Υγείας) για απλόχερα παρέχει αντιδραστήρια και συμβουλές. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω τον Δρ Σεθ Περιπλανηθείτε, Dekaung Zhao, Carol Maiorino, Δρ Leah Λυών, Δρ Fayi Wu, Stephanie Peacock και Cale Fahrenholtz (Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι Miller School of Medicine) για συμβουλές και βοήθεια.