Abstract

Το μιτοχονδριακό Bit1 (αναστολέας Bcl-2 της μεταγραφής 1) πρωτεΐνη είναι ένα μέρος μιας αποπτωτικής παθολογικής οδού που ρυθμίζεται από μοναδικά προσάρτησης διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη. Ως τελεστή anoikis, Bit1 απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα μετά την απώλεια της προσκόλλησης κυττάρου και προκαλεί μία κασπάσης-ανεξάρτητη μορφή της απόπτωσης. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η αντίσταση anoikis είναι ένας κρίσιμος καθοριστικός παράγοντας μετασχηματισμού, υποθέσαμε ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να καταστρατηγούν το αποπτωτικό μονοπάτι Bit1 για την επίτευξη αγκυροβόλιο της ανεξαρτησίας και της πιθανής καρκινογένεσης. Εδώ, θα παρέχει τα πρώτα στοιχεία της επίδρασης καταστολής όγκου των Bit1 μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει την επαγωγή anoikis σε ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα προέρχονται τα κύτταρα Α549. Αποκατάσταση των Bit1 σε anoikis κύτταρα ανθεκτικά Α549 είναι επαρκής για να επάγει την αποκόλληση επαγόμενη απόπτωση παρά ελάττωμα σε ενεργοποίηση της κασπάσης και εξασθενίζει ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη τους. Αντιθέτως, μια σταθερή αρνητική ρύθμιση των Bit1 σε αυτά τα κύτταρα ενισχύει σημαντικά την αντοχή anoikis τους και αγκυροβόλιο-ανεξάρτητη ανάπτυξη. Τα κύτταρα νοκ ντάουν Bit1 εμφανίζουν αυξημένη σημαντικά tumorigenecity

in vivo

. Έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι η συν-καταστολέα πυρηνική TLE1 είναι ένα υποθετικό ογκογονίδιο στον καρκίνο του πνεύμονα, και δείχνουμε εδώ ότι αποκλείει TLE1 Bit1 μεσολάβηση anoikis εν μέρει μέσω απομόνωσης του προ-αποπτωτική εταίρος του Bit1, το αμινο-τερματικό Enhancer του Split (AES) πρωτεΐνη, στον πυρήνα. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν μια κατασταλτική του όγκου ρόλος της κασπάσης-ανεξάρτητο anoikis τελεστή Bit1 στον καρκίνο του πνεύμονα. Συνεπής με το ρόλο της ως καταστολέας των όγκων, έχουμε διαπιστώσει ότι Bit1 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ιστούς

Παράθεση:. Yao Χ, Jennings S, η Ιρλανδία SK, Pham Τ, Ναός Β, Davis Μ, et al. (2014) Η Anoikis τελεστή Bit1 Εμφανίζει Λειτουργία Κατασταλτικός όγκων σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (7): e101564. doi: 10.1371 /journal.pone.0101564

Επιμέλεια: Λουκία R. Languino, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Μαρτίου του 2014? Αποδεκτές: 8 Ιουνίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 8 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Yao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και δικαιολογητικά στοιχεία της αρχεία

Χρηματοδότηση: Το έργο υποστηρίχθηκε από τη Λουιζιάνα Cancer Research Consortium (LCRC) Εκκίνηση Grant (ΗΒ), ΝΙΗ RCMI G12RR026250-03 Grant (ο Xavier Πανεπιστημίου Losuiana), και ΝΙΗ 1R15CA158677-01A1 Grant (ΗΒ). Αυτές οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ένα κρίσιμο παράγοντα της κακοήθους επιθηλιακής φαινότυπο είναι αγκυροβόλιο ανεξαρτησία. Η απώλεια της εξάρτησης αγκύρωσης στην εξωκυττάρια μήτρα από κακοήθη κύτταρα τους επιτρέπει να αναπτύσσονται απουσία προσκόλλησης κυττάρου, να διαδώσει σε μια τρισδιάστατη μήτρα, να εισβάλει γειτονικούς ιστούς, και μετάσταση σε απομακρυσμένα όργανα [1], [2]. Οι μοριακοί μηχανισμοί και κυτταρικών οδών υποκείμενες αγκύρωση-ανεξαρτησία των καρκινικών κυττάρων έχουν μελετηθεί εκτενώς [3], και οι περισσότερες από αυτές τις μοριακές αλλαγές παρουσιάζουν κακοήθη κύτταρα την ικανότητα να αποφύγει το πρόγραμμα anoikis η οποία είναι σε θέση σε φυσιολογικά κύτταρα. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η κατάρρευση του ελέγχου anoikis συμβάλλει στην ανάπτυξη και κακοήθειας των πολλών στερεών όγκων, την αποκατάσταση της ευαισθησίας anoikis αντιπροσωπεύει μια σημαντική θεραπευτική στρατηγική σε περιορισμό της επιθετικότητας του όγκου και τη μετάσταση. Ως εκ τούτου, η ταυτοποίηση νέων μοριακών στόχων της anoikis μεσολάβηση μονοπάτι κυτταρικού θανάτου έχει σημαντικές θεραπευτικές συνέπειες.

Δύο αποπτωτικών οδών, η μιτοχονδριακή (εγγενής) και του υποδοχέα κυτταρικό θάνατο (εξωγενής), έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει την anoikis διαδικασία. Μετά την αποκόλληση επαγόμενη απώλεια της ιντεγκρίνης μεσολάβηση σηματοδότηση επιβίωσης, η εγγενής αποπτωτικό μονοπάτι πυροδοτείται μέσω της ενεργοποίησης του προ-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl οικογένειας πρωτεϊνών (συμπεριλαμβανομένων Βαχ, Bad, Bid και ΒΙΜ). Αυτές οι πρωτεΐνες ενεργοποιούν διαπερατότητα της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης που οδηγεί σε κυτοσολικά απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και κατάντη ενεργοποίηση των ενζύμων κασπάσης [5], [6]. Αυτό μιτοχονδριακή εξαρτώμενη βρόχο ενεργοποίησης της κασπάσης, η οποία μπορεί να ενισχυθεί περαιτέρω μέσω μειορρύθμιση της έκφρασης των αντι-αποπτωτικών Bcl μέλη της οικογένειας (όπως Bcl-2 και Bcl-XL) που λειτουργούν στη φύλαξη μιτοχονδριακή ακεραιότητα [7], μπορεί τελικά να οδηγήσει σε κατακερματισμό του DNA και θάνατο των κυττάρων. Η (εξωγενής) οδού του υποδοχέα θανάτου εξαρτάται από την σύνδεση του προσδεμάτων θανάτου (Fas ή TRAIL) με τον υποδοχέα του θανάτου και χρησιμοποιεί το σχηματισμό ενός επάγει θάνατο σύμπλεγμα σηματοδότησης (ΔΙΣΚΟΣ) στην ενεργοποίηση του κατάντη κασπάσης-8. Αυτός ο θάνατος μεσολάβηση υποδοχέα ενεργοποίηση της κασπάσης 8 μπορεί να επηρεάσει αποσταθεροποίηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης που οδηγεί σε απόπτωση [8], [9]. Παρά το γεγονός ότι η σύγκλιση και η στιχομυθία μεταξύ εξωγενών και ενδογενών αποπτωτικά μονοπάτια υπάρχουν σε διάφορα επίπεδα, και οι δύο οδοί βασίζονται σε βρόχο ενεργοποίησης της κασπάσης να πραγματοποιήσει τον κυτταρικό θάνατο. Ωστόσο, αποδεικτικά στοιχεία έχουν προκύψει υποδεικνύει την ύπαρξη μηχανισμών κασπάσης-ανεξάρτητη anoikis [10],. Ειδικότερα, η αναστολή της ενεργοποίηση της κασπάσης είτε μέσω υπερέκφρασης Bcl-2 ή θεραπεία με αναστολείς κασπάσης παγκόσμια δεν είναι σε θέση να εμποδίσει βασικοκυτταρικό anoikis σε κύτταρα όγκου όπως αξιολογήθηκε με ανάλυση σκάλα DNA [10]. Η εναλλακτική λειτουργία κασπάσης-ανεξάρτητη από anoikis είναι ένας σημαντικός θεραπευτικός στόχος σε όγκους που εμφανίζουν ένα ανάπηρο κασπάσης-εξαρτώμενο μονοπάτι απόπτωσης.

Ruoslahti και οι συνεργάτες του έχουν επισημάνει πρόσφατα μία νέα ιντεγκρίνη εξαρτώμενη αποπτωτική οδό που προκαλείται από το μιτοχονδριακό Bit1 (Bcl2, αναστολέας της μεταγραφής 1) πρωτεΐνη [11]. Μετά την απώλεια του κυτταρική προσκόλληση διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη, Bit1 απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα, σχηματίζει ένα σύμπλοκο με το μεταγραφικό coregulator AES, και στη συνέχεια προκαλεί μια λειτουργία κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση. Ενώ πολλές γνωστές αντι-αποπτωτικών παραγόντων όπως Bcl-2, Bcl-XL, Akt είναι αναποτελεσματικές στην παρεμπόδιση Bit1 απόπτωση, διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη προσκόλλησης είναι ο μοναδικός αντι-αποπτωτική θεραπεία που μπορεί να καταστείλει την απόπτωση Bit1 λειτουργία [11]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη προσκόλλησης κυττάρου, ιδιαίτερα την ιντεγρίνη α5β1, είναι η θεραπεία μόνο ανάντη που μπορεί να μπλοκάρει την οδό απόπτωσης Bit1, Bit1 μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην anoikis ως φύλακας της εξάρτησης αγκύρωσης [11] – [15]. Με βάση την ανικανότητα των αναστολέων κασπάσης για την αναστολή Bit1 απόπτωση και την απουσία ενεργοποίηση της κασπάσης σε Bit1 επιμολυσμένα κύτταρα, η οδός Bit1 μπορεί να αντιπροσωπεύει έναν από τους μηχανισμούς anoikis κασπάσης-ανεξάρτητος σε κακοήθη κύτταρα [11]. Ως εκ τούτου, η οδός Bit1 αποπτωτική φαίνεται να είναι ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος σε παράκαμψη αντίσταση anoikis ιδιαίτερα σε καρκινικά κύτταρα τα οποία εμφανίζουν ανεπαρκή δραστικότητα κασπάσης. Αξιοποίηση των Bit1 ως θεραπευτικός στόχος απαιτεί μια λεπτομερή εξέταση του μηχανισμού της λειτουργίας της απόπτωσης, το οποίο έχουμε βρεθεί να εξαρτάται εν μέρει από την απενεργοποίηση ενός προγράμματος μεταγραφής γονιδίων που προάγουν την επιβίωση που ελέγχονται από την Groucho μεταγραφικό συγκαταστολέας TLE1 [15].

Ο ρόλος των Bit1 σε anoikis έχει καταδειχθεί σε αρκετές μετασχηματισμένες κυτταρικές γραμμές. Μέσω προσεγγίσεις γενετικό χειρισμό, έχουμε δείξει ότι η εξωγενής έκφραση του μιτοχονδριακού μπλοκ Bit1 την αντίσταση anoikis αρκετών κυτταρικών γραμμών όγκου, ενώ προς τα κάτω ρύθμιση έκφρασης ενδογενούς Bit1 συγχέει περαιτέρω anoikis τους αναισθησία [11] – [15]. Δεδομένου ότι η απόκτηση της αντίστασης anoikis είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της νεοπλασματικό μετασχηματισμό και μεταστατικό δυναμικό [1], [2], η καταστολή της anoikis οδού Bit1 σε κακοήθη κύτταρα μπορεί να συμβάλλει στην εξέλιξη του καρκίνου, ιδιαίτερα στην απόκτηση των προηγμένων ογκογόνο και μεταστατικό συμπεριφορά. Πράγματι, προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι Bit1 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας της μετάστασης

in vivo

[14]. Αν και ο ακριβής μηχανισμός που βρίσκεται κάτω μετάστασης ανασταλτική δράση του παραμένει να προσδιορισθεί, η Bit1 anoikis λειτουργία επαγωγής μπορεί να παίζει ένα περιοριστικό συντελεστή βήμα στη διαδικασία της μετάστασης. Είναι ενδιαφέρον, ο ρόλος των Bit1 στην ογκογένεση δεν έχει αποδειχθεί μέχρι σήμερα.

Για να αντιμετωπιστεί περαιτέρω ο ρόλος της Bit1 στο σχηματισμό του καρκίνου, έχουμε πραγματοποιήσει προκαταρκτική έρευνα σε απευθείας σύνδεση βάση δεδομένων για να εξετάσει κατά πόσον η έκφραση Bit1 μεταβάλλεται σε διάφορους τύπους ανθρώπινων όγκων συγκριτικά με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς. Περιέργως, ανακαλύψαμε ότι η έκφραση Bit1 επιλεκτικά και κατέστειλε σημαντικά στον καρκίνο του πνεύμονα. Αυτή η προκαταρκτική διαπίστωση, σε συνδυασμό με την πρόσφατα στοιχεία που τεκμηριώνουν ότι TLE1 μπορεί να λειτουργήσει ως πνεύμονας συγκεκριμένο ογκογονίδιο [16], μας έχει ζητηθεί να διερευνήσει τη σημασία της οδού αποπτωτικών Bit1 στην αναισθησία anoikis και ογκογόνο δυναμικό των μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα ( NSCLC), η οποία είναι η πιο επιθετική μορφή καρκίνου του πνεύμονα και είναι ιδιαίτερα χημειοθεραπεία εν μέρει οφείλεται σε ανεπαρκή κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση μονοπάτι [17], [18]. Εδώ, δείχνουμε ότι η εξωγενής Bit1 παρακάμπτει την αντίσταση anoikis του ανθρώπινου πνεύμονα Α549 κυττάρων αδενοκαρκινώματος μέσω της ενεργοποίησης της κασπάσης-ανεξάρτητης απόπτωσης και εξασθενίζει ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη τους. Με συνέπεια, νοκ ντάουν της ενδογενούς Bit1 σε αυτά τα κύτταρα ενισχύει περαιτέρω anoikis τους αναισθησία και αγκύρωση-ανεξάρτητο δυναμικό

in vitro

και ενισχύει ογκογόνο ανάπτυξή τους

in vivo

. Σύμφωνα με τη λειτουργία του κατασταλτική του όγκου, η έκφραση Bit1 βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε όγκους NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

δοκιμασίες

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

NSCLC Α549 και Η460 κυττάρων γραμμές που λαμβάνονται από την American Type Culture Collection (ATCC) καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) με γλουταμίνη που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη και. Η σταθερή Α549 προέρχεται ελέγχου και Bit1 shRNA δεξαμενή κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) με γλουταμίνη που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου, πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη, και 1 μg /ml πουρομυκίνη (Invitrogen). Δοκιμές μεταβατικής μεταμόλυνσης εκτελέστηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen) για κύτταρα Α549 και αντιδραστήριο Lipofectamine LTX (Invitrogen) για Η460 κυττάρων σε ΟΡΤΙ-ΜΕΜ (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με τη συνολική ποσότητα του πλασμιδίου που χρησιμοποιείται ανά επιμόλυνση κανονικοποιημένη με το αντίστοιχο κενός κατασκευή φορέα.

Χημικά αντιδραστήρια, αντισώματα, και τα πλασμίδια

πολυ (μεθακρυλικό 2-υδροξυαιθυλεστέρα (πολυΗΕΜΑ) και το μονοκλωνικό ποντικού αντι-FLAG, αντι-AES, αντι-GFP και αντι αντισώματα -Β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). το πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-TLE1 ελήφθη από Abcam (Cambridge, ΜΑ). ο αναστολέας κασπάσης-ίτηκ και το αντι-myc αντίσωμα αγοράσθηκαν από την Calbiochem ( La Jolla, CA). Η αντι-κασπάση-3, αντι-διασπασμένη κασπάση 3, Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad, και αντι-PARP αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Η φορέα έκφρασης που κωδικοποιεί θηλαστικών για μιτοχονδριακή Bit1 δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Τα πλασμίδια GFP-TLE1 ελήφθησαν από ΟηΟεηε (Rockville, MD). Το κατασκεύασμα που κωδικοποιεί την περιοχή κυτταρικού θανάτου (CDD) του Bit1 ελήφθη από τον Dr. Erkki Ruoslahti (Sanford-Burnham Medical Research Institute) και είχε προηγουμένως χαρακτηριστεί [19].

siRNA και shRNA διαμόλυνση

οι ειδικές siRNAs TLE1 και τον έλεγχο siRNAs μη στόχευση αγοράστηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Για πειράματα παροδικής επιμόλυνσης, κύτταρα Α549 (2 × 10

5) διαμολύνθηκαν με 25 μΜ από κάθε siRNA με τη χρήση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση ή anoikis δοκιμασίες όπως περιγράφεται παρακάτω. Για την παραγωγή σταθερών Α549 Bit1 knockdown και ελέγχου πισίνες, Α549 γονικά κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορέα pRS που περιέχει το βραχύ φουρκέτα RNA κατά TLE1 (ΟηΟεηε) ή η μη στόχευση κωδικοποιημένο shRNA (ΟηΟεηε). 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, 1 μg /ml πουρομυκίνη (Invitrogen) προστέθηκε στο μέσο για να επιλεγούν πουρομυκίνη-ανθεκτικών κλώνων. Μεμονωμένα πουρομυκίνη-ανθεκτικοί κλώνοι σαρώθηκαν για Bit1 προς τα κάτω ρύθμιση με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα για να Bit11 [15]. Δύο Bit1 shRNA knockdown-θετικούς κλώνους και δύο ελέγχου shRNA κλώνοι ομαδοποιήθηκαν για περαιτέρω χαρακτηρισμό.

Ανάλυση της απόπτωσης, anoikis, και κυτταρική βιωσιμότητα

Η απόπτωση προσδιορίστηκε με ποσοτικοποίηση του επιπέδου του κυτοσολικού νουκλεοσώματος θραύσματα με τη χρήση των κυττάρων κιτ Death Detection ELISA (Roche Molecular Biochemicals) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή [14], [15]. Για να εκτιμηθεί για anoikis κυτταρικό θάνατο, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν επάνω σε πολυΗΕΜΑ επικαλυμμένες πλάκες 96 φρεατίων σε πλήρες μέσο ανάπτυξης το οποίο περιείχε 0,5% μεθυλοκυτταρίνη σε πυκνότητα 1,0 × 10

4 /φρεάτιο σε διάφορα χρονικά σημεία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [15 ]. Πωλείται κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία απόπτωσης κυτταρικού θανάτου ELISA. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ποσοστώθηκε με alarmar μπλε χρώση (Invitrogen) και μετέπειτα ανάγνωση φθορισμού (μήκος κύματος διέγερσης 485 nm και 520 nm μήκος κύματος εκπομπής) χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη μικροπλάκας (BioTek Instruments). δοκιμασίες άγαρ

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και των μαλακών

Anchorage-εξαρτώμενη ανάπτυξη προσδιορίστηκε με επίστρωση κυττάρων σε έναν όγκο 150 μΙ με πυκνότητα 2000 κυττάρων ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Σε κάθε προκαθορισμένο χρόνο, ο αριθμός των μεταβολικά δραστικών κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Εν συντομία, δέκα μικρολίτρα του αντιδραστηρίου ΜΤΤ στα 5 mg /ml (Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο σε μία πλάκα 96 φρεατίων. Η πλάκα στη συνέχεια επωάστηκε στους 37 ° C, 5% CO2 για 3 ώρες. Στη συνέχεια, το προκύπτον ΜΤΤ ίζημα διαλύθηκε σε 100 μΐ ενός διαλύματος 50%% DMSO MeOH-50 και υποβλήθηκε σε μία ανάγνωση απορρόφησης 550 nm μέσω ενός αναγνώστη μικροπλάκας (BioTek Instruments). Η αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων επιβάρυνση προκύψει χρησιμοποιώντας τη μορφή πλάκας 96-φρεατίων [15]. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, 5000 κύτταρα σε διάλυμα άγαρ 0,3% επιστρώθηκε σε φρεάτια προεπικαλυμμένα με 0,6% άγαρ σε μέσο καλλιέργειας. Η ανάπτυξη των αποικιών που προκύπτουν ποσοτικοποιήθηκε με alarmar μπλε χρώση (Invitrogen) και ανάγνωση φθορισμού στα 485 nm μήκος κύματος διέγερσης και 520 nm μήκος κύματος εκπομπής με μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας μικροπλακών.

Caspase δοκιμασία ενεργοποίησης

Caspase -3 δραστικότητα προσδιορίστηκε φθορομετρικά χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα Ac-DEVD-AFC υπόστρωμα και διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Roche Applied Science).

παρασκευάσματος πρωτεΐνης και ποσοτικοί προσδιορισμοί κηλιδώσεως Western

παρασκευάσματος πρωτεΐνης και τη δυτική κηλίδωση πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [15]. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24-48 ώρες μετά την επιμόλυνση με διάφορα κατασκευάσματα ή siRNAs με προσθήκη παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ΝΡ-40 (1% ΝΡ-40? 20 mM Tris-HCL [ρΗ 7,4]? 150 mM NaCl? 10% γλυκερόλη , 2 mM βαναδικό νάτριο? 1 mM φθοριούχο henylmethylsulfonyl? 10 μg /ml λευπεπτίνη? και 5 μg /ml απροτινίνης) και επωάστηκε στους 4 ° C για 20 λεπτά. Για ανάλυση ανοσοστυπώματος, ίσες ποσότητες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε 4-20% κλίση Τρις-γλυκίνης πηκτώματα (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C που ακολουθείται από δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση ραδικιού. Οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης ECL.

Υποκυτταρική κλασματοποίηση

Υποκυτταρική κλασμάτωση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Εν συντομία, επιμολυσμένα κύτταρα καλλιεργούνται σε συνδέεται ή αποσυνδέεται συνθήκες στους χρόνους που υποδεικνύονται συλλέχθηκαν πλύθηκαν μία φορά με PBS, επαναιωρήθηκαν σε 1 ml ισοτονικού μιτοχονδριακής ρυθμιστικού διαλύματος (250 mM μαννιτόλη, 70 mM σακχαρόζη, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES [ρΗ 7,5]) , και ομογενοποιούνται με 40 κτυπήματα σε ομογενοποιητή Dounce. Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 500 χ g για 5 λεπτά για την εξάλειψη των πυρήνων και αδιάσπαστη κύτταρα. Το υπερκείμενο περαιτέρω φυγοκεντρήθηκε σε 10,000 χ g για 30 λεπτά στους 4 ° C για την απομόνωση του μιτοχονδριακού εμπλουτισμένο σφαιρίδιο. Το προκύπτον κυτοσολικό υπερκείμενο υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση. Για το διαχωρισμό των κυτταρόπλασμα και το πυρηνικό κλάσμα, το NE-PER κιτ πυρηνική απομόνωση (Pierce, αρ 78833) χρησιμοποιήθηκε και εκτελούνται, όπως καθορίζεται από τον κατασκευαστή [15]. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης στα διαφορετικά κλάσματα μετρήθηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτείνης Bio-Rad με BSA ως πρότυπο.

Coimmunoprecitation

δοκιμασία προσδιορισμού

Συνανοσοκατακρήμνιση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Εν συντομία, επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν με πλύσιμο μια φορά με PBS και επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο Nonidet Ρ-40 ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (1% Nonidet Ρ-40, 20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 10% γλυκερόλη, 2 mM βαναδικό νάτριο, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 10 μg /ml λευπεπτίνη, και 5 μg /ml απροτινίνης) που ακολουθείται από 20 λεπτών επώαση στους 4 ° C. Τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση. Μγο-tagged Bit1 ανοσοκαταβυθίστηκε με συζυγές αντι-Μγο-αγαρόζης (Abcam), ενώ GFP-tagged TLE1 ανοσοκαταβυθίστηκε με αντι-ΟΡΡ-αγαρόζη (Medical and Biological Laboratories). Το ανοσοΐζημα πλύθηκε επιμελώς με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE, κηλίδωση Western και διεξήχθη χρησιμοποιώντας το αντίστοιχο αντίσωμα.

In vivo

ογκογένεση δοκιμασία

Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από η Επιτροπή Θεσμικών για τη χρήση και τη φροντίδα των πειραματόζωων από τον Xavier Πανεπιστημίου της Λουιζιάνα Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (IACUC, αριθμός έγκρισης 060911-001BI). Οκτώ εβδομάδων θηλυκών αθυμικών γυμνών ποντικών (BALB /c) χρησιμοποιήθηκαν για τις δοκιμασίες ογκογένεση. Τα παράγωγα Α549 ελέγχου shRNA και Bit1 shRNA κύτταρα (1.0 × 10

6) έλαβαν υποδόρια ένεση. Τα μεγέθη του όγκου μετρήθηκαν περιοδικά με ένα παχύμετρο, και ο όγκος του όγκου προσδιορίστηκε με τον τύπο (d1 × d2

2) /2, όπου D1 αντιπροσωπεύει τη μεγαλύτερη διάμετρο και d2 τη μικρότερη διάμετρο. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν όταν οι πρωτογενείς όγκοι έφθασαν 2 εκατοστά σε διάμετρο.

επί τόπου ανίχνευση απόπτωση

Ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων στον έλεγχο shRNA και Bit1 τομές όγκων shRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας το αδιέξοδο Χρωματομετρική TUNEL System ( Promega) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τομές αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και επωάστηκαν με πρωτεϊνάση Κ για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με PBS, οι τομές επωάστηκαν με συγκέντρωση εργασίας ανασυνδυασμένης τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης (ΕΤΑΕ) στους 37 ° C για 1 ώρα. Οι τομές ο πλύθηκαν με PBS και εμβαπτίζονται σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης. Οι τομές στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με στρεπταβιδίνη-ΗΚΡ διάλυμα. Το προκύπτον σκούρο καφέ σήμα οπτικοποιήθηκε με διαμινοβενζιδίνη (DAB) ως χρωμογόνο.

Ανθρώπινο όγκου πνεύμονα ανάλυση ιστικής συστοιχίας

Ανθρώπινα καρκινικά διαφάνειες συστοιχίας ιστού που περιέχει καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, αδενοκαρκίνωμα, καρκίνωμα μεγαλύτερο, και συμφωνημένα φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα ελήφθησαν από την US Biomax, Inc. (Rockville, MD). Η διαδικασία ανοσοϊστοχημείας εκτελέσθηκε με Biomax Inc. σε δύο πλακίδια μικροσυστοιχιών ιστού. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [15], τα πλακίδια συστοιχίας ιστού αφαιρείται η παραφίνη, ενυδατωμένο και υποβλήθηκαν σε ανάκτηση αντιγόνου. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν σε 2.5% φυσιολογικό ορό αλόγου για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ακολουθούμενη από επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα (αραίωση 1:100) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το αντι-αντίσωμα Bit1 συγγένεια καθαρισμένο κουνελιού (HPA012897) το οποίο είχε προηγουμένως ελεγχθεί για την ειδικότητα του [14], [15] αγοράστηκε από την Sigma. Κουνέλι φυσιολογικό ορό χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος αντίσωμα για να αντικαταστήσει το πρωτογενές αντίσωμα σε πλακίδιο ελέγχου με 1 ώρα επώαση. slides συστοιχία ιστών στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με αντιδραστήριο ImmPRESS (Vector Laboratories) που ακολουθείται από κατεργασία με διάλυμα DAB υπόστρωμα peroxidise (ϋΑΚΟ Cytomation). Οι πλάκες σκόραρε για το μέσο όρο Bit1 ένταση χρώσης από δύο ερευνητές χωρίς τη γνώση της παθολογικής κατάστασης των δειγμάτων. Η μέση χρώση βαθμολογήθηκε ως 0, χωρίς χρώση? 1, ελαφρά χρώση? 2, μέτρια χρώση? και 3, ισχυρή χρώση.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσα (± S.E.). Για κηλίδες Western και δοκιμασίες anoikis, τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές με τριπλότυπα. Στατιστικές διαφορές μεταξύ των ομάδων είχαν συσταθεί σε τιμή P & lt? 0,05 χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του two-tailed του Student. Για όγκου πνεύμονα ανάλυση ιστικής συστοιχίας, μια μονόδρομη ANOVA με επακόλουθη post hoc δοκιμασία χρησιμοποιώντας το τεστ πολλαπλής σύγκρισης Tukey-Kramer χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η μέση ένταση χρώσης του κάθε τύπου περίπτωση [14], [15]. Όλοι οι υπολογισμοί έγιναν με τη χρήση του στατιστικού λογισμικού ΕΚΚΑ (ΕΚΚΑ, Kasville, UT)

Αποτελέσματα

Η Αντίσταση Anoikis των κυττάρων Α549 συνδέεται με έλλειψη σημαντικών κασπάσης Δραστηριότητα

NSCLC τα κύτταρα εμφανώς γνωστό ότι είναι ανθεκτικά σε διάφορες μορφές αποπτωτικών ερεθισμάτων συμπεριλαμβανομένης της διέγερσης του υποδοχέα του θανάτου, κυτταροτοξικά φάρμακα, και την ακτινοβολία. Η ικανότητα των NSCLC, προκειμένου να αποφύγει την απόπτωση έχει αποδοθεί εν μέρει στην αναποτελεσματική κασπάσης-ανεξάρτητη μηχανή [17], [18]. Ωστόσο, δεν έχουν εξεταστεί διεξοδικά οι μηχανισμοί του τρόπου με τον NSCLC μπλοκ anoikis. Για να αντιμετωπιστεί η πιθανή χρησιμότητα των μηχανισμών της κασπάσης-ανεξάρτητο με την παράκαμψη της αντίστασης anoikis των κυττάρων NSCLC, εξετάσαμε πρώτα τη συμβολή της οδού κασπάσης σε anoikis. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [20], ο NSCLC κυτταρική γραμμή Α549 έδειξε πολύ χαμηλό επίπεδο απόπτωσης όταν καλλιεργούνται σε εναιώρημα (Σχήμα 1Α). Σταυροσπορίνη (STS), ένας ισχυρός αναστολέας της κινάσης, που επάγεται σημαντικά απόπτωση σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 1Α). Για την αντιμετώπιση του ρόλου των εξαρτώμενων κασπάσης οδού στον αποκλεισμό anoikis σε κύτταρα Α549, εξετάσαμε την κυτοσολική απελευθέρωση των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών κυτοχρώματος c (κεντρικό παράγοντα για την ενεργοποίηση των κατάντη δράστες της κασπάσης) κατά τη διάρκεια της απόσπασης. Σε αντίθεση με τα STS επεξεργασμένα κύτταρα τα οποία έδειξαν σημαντικές ποσότητες κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα, ανεξάρτητο κύτταρα εμφάνισαν μόνο ίχνη του κυτοχρώματος c στο κυτταροπλασματικό κλάσμα (Εικόνα 1Β). Στη συνέχεια, παρακολουθείται η ενεργοποίηση του κατάντη ή εκτελεστή κασπάσης 3 μέσω της διάσπασης του φθορίζοντος υποστρώματος κασπάσης-3 (Σχήμα 1C) και την επεξεργασία των προ-κασπάσης 3 μέσω ανοσοκηλίδωση (Εικόνα 1D). Σύμφωνα με την έλλειψη σημαντικών κυτοσολικής απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, ανεξάρτητο κύτταρα Α549 δεν έδειξε καμία σημαντική κασπάσης 3 ενεργοποίηση (Σχήμα 1C) και εμφανίζεται καμία επεξεργασία του προ-κασπάσης 3 (Σχήμα 1D). Το τέλος στόχος της μηχανής κασπάσης είναι να διασπαστεί η πυρηνική πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) πρωτεΐνη [5], [6]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Ε, PARP παρέμεινε σχετικά ανέπαφη στη φυσική του μορφή 116 kDa σε αποκολλημένα κύτταρα Α549 (Εικόνα 1 Ε). Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η αντίσταση των κυττάρων anoikis Α549 συνδέεται με μια αναποτελεσματική κυτοχρώματος c /κασπάσης-εξαρτώμενη οδό κυτταρικού θανάτου.

A. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν είναι προσαρτημένο (Α) ή αποσπάται από το ECM για 24 ώρες (D24) και 48 ώρες (D48) και συλλέχθηκαν για ανάλυση απόπτωσης χρησιμοποιώντας τον κυτταρικό θάνατο Elisa ELISA. Παράλληλα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με 1 μΜ σταυροσπορίνη (STS) επί 24 ώρες και υποβλήθηκε σε κυτταρικό θάνατο Elisa ELISA. κλάσματα κυτοσολίου Β λήφθηκαν από κύτταρα σε Α και αναλύθηκαν για την παρουσία του κυτοχρώματος c με κηλίδα western. C. Η παρουσία της δραστικότητας κασπάσης-3-σαν στα κυτταρικά λύματα από κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία προσδιορίστηκε με τη διάσπαση του φθορίζοντος υποστρώματος Ζ-DEVD-AFC (DEVD). Δ και Ε κυττάρων σε ένα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για να ανιχνευθεί η επεξεργασία των προ-κασπάσης 3 (D) και PARP (Ε). Σε Α και C, τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, * υποδηλώνει ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τους σχετικούς όρους (t test Student)

Η

Bit1 μειώνει την αντίσταση Anoikis των κυττάρων του πνεύμονα

Λαμβάνοντας υπόψη την έλλειψη σημαντικής αποκόλλησης που προκαλείται ενεργοποίηση της κασπάσης σε κύτταρα Α549, μπορούμε τότε διερευνηθεί ο ρόλος του Bit1 μονοπατιού κυτταρικού θανάτου στην αγκύρωση ανεξάρτητη επιβίωση αυτών των κυττάρων. Εμείς αύξησε την έκφραση του μιτοχονδριακού Bit1 σε κύτταρα Α549 μέσω διαμόλυνσης με ένα κατασκεύασμα Bit1 που εκφράζει την πρωτεΐνη Bit1 αποκλειστικά στα μιτοχόνδρια (Bit1 Mito) [11], [15], και δοκιμάστηκε η ικανότητα των κυττάρων να επιβιώσουν απουσία προσκόλλησης από την ECM. Η Mito Bit1 και κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν είχε το ίδιο επίπεδο της αυθόρμητης απόπτωσης όταν αναπτύσσονται συνδέεται σε ένα δίσκο καλλιέργειας (Σχήμα 2Α). Σε έντονη αντίθεση, οι Mito επιμολυσμένα κύτταρα Bit1 παρουσίασαν σημαντική αύξηση της απόπτωσης από τα κύτταρα ελέγχου κατά την αποκόλληση. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν όταν Bit1 Mito εισήχθη σε ανθρώπινη κυτταρική γραμμή Η460 NSCLC (Σχήμα S1). Για την αντιμετώπιση της ειδικότητα της επαγωγής anoikis από Bit1 Mito, έχουμε στοχευμένη έκφραση Bit1 στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων Α549 με την χρήση ενός κατασκευάσματος Bit1 που περιέχει μια ετικέτα στο Ν-τερματική περιοχή της πρωτεΐνης Bit1 (Bit1 κυτταροπροστατευτικές) [11] , [15]. Η εξωγενής έκφραση κυτοπλασμικών εντοπισμένη Bit1 (Bit1 κυτταροπροστατευτικές) σε Α549 (Εικόνα 2Β) και τα κύτταρα Η460 (Σχήμα S2) ενεργοποιείται απόπτωση. Ο τομέας κυτταρικού θανάτου (CDD) του Bit1 πρόσφατα χαρτογραφήθηκε στο Ν-τερματικό 62 αμινοξέα και δείχθηκε να είναι αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [19]. Εισαγωγή του πεπτιδίου CDD οδήγησε επίσης σε απόπτωση στα Α549 (Σχήμα 2C) και τα κύτταρα Η460 (Σχήμα S3). Περαιτέρω χαρακτηρισμός της Bit1 anoikis μονοπάτι σε κύτταρα Α549 επιβεβαίωσε ότι Bit1 ενεργοποιείται κυτταρικό θάνατο ανεξάρτητη κασπασών. Πρώτον, βρήκαμε καμία σημαντική επεξεργασία του δημίου κασπάσης 3 σε Bit1 επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2D). Δεύτερον, ο μεταγενέστερος πυρηνική υπόστρωμα των κασπασών, PARP, παρέμεινε ανέπαφη (Εικόνα 2D). Τρίτον, ο αναστολέας παν-κασπάσης z-Vad-fmk ήταν αναποτελεσματικό στον αποκλεισμό της Bit1 που προκαλείται anoikis (Σχήμα 2Ε). Συνεπής με την έλλειψη Bit1 επίδραση στην ενεργοποίηση της κασπάσης, η έκφραση της οικογένειας απόπτωση των ρυθμιστών που ελέγχουν τη κασπάση-εξαρτώμενη μιτοχονδριακό αποπτωτικό μονοπάτι δεν αλλοιώνεται από Bit1 (Σχήμα 2D). Ειδικότερα, τα επίπεδα σταθερής κατάστασης των αντι-αποπτωτικών Bcl-2 και Bcl-xl πρωτεϊνών καθώς και την προ-αποπτωτική Bax και Bad πρωτεΐνες παρέμειναν αμετάβλητες από έκτοπη Bit1 στα δύο συνδέεται και να αποσυνδέεται συνθήκες. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι Bit1 μπορεί να παρακάμψει την αντίσταση anoikis του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων μέσω της επαγωγής ενός αποπτωτικό μονοπάτι κασπάσης-ανεξάρτητη.

Α. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με το C-τερματικά myc-tagged μιτοχονδριακή εντοπισμένη Bit1 (Bit1 Mito) ή τον κενό κατασκεύασμα φορέα. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν είναι συνδεδεμένη ή αποσπάται από το ECM. Μετά 48 ώρες σε καλλιέργεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για απόπτωση με μέτρηση της ποσότητας θραυσμάτων DNA ιστόνης (Cell Death Elisa). Β και C. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με το Ν-τερματικά myc tagged κυτταροπλασματική εντοπισμένη Bit1 (Bit1 κυτταροπροστατευτικές) (Β), Bit1 τομέα κυτταρικό θάνατο (CDD) (C), ή κατασκεύασμα φορέως και 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε κυτταρικό θάνατο ELISA. Mito επιμολυσμένα κύτταρα D. Vector ή Bit1 καλλιεργήθηκαν είναι προσαρτημένο (Α) ή αποσπάται (D) από την ECM για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western έναντι ειδικών αντισωμάτων σε κασπάση-3, PARP, Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad, myc, και Β-ακτίνης. Ε Bit1 Mito επιμολυσμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε συνδέεται ή αποσυνδέεται συνθήκες παρουσία του z-νΑΟ-fmk (50 μΜ) ή DMSO για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε κυτταρικό θάνατο ELISA. Στο Α, Β, και Γ, τρία ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν, * υποδηλώνει ρ & lt?. 0.05 με δοκιμασία t του Student

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το ρόλο της Bit1 ως τελεστής anoikis στον καρκίνο του πνεύμονα, εξετάσαμε αν νοκ ντάουν της ενδογενούς έκφρασης Bit1 θα επηρεάσουν το anoikis αναισθησία των κυττάρων Α549. Εμείς αιτιολογημένη ότι τα κύτταρα Α549 θα υποβληθούν anoikis κατά την παρατεταμένη καλλιέργεια σε αναστολή και αν κατάλυση της οδού αποπτωτικών Bit1 μπορεί να παρέχει προστασία anoikis. Πράγματι, μετά από μια παρατεταμένη καλλιέργεια 72 ωρών σε εναιώρημα, τα αποσπασθέντα κύτταρα Α549 τελικά έδειξε ένδειξη απόπτωσης (Εικόνα 3Α). Η παρατηρούμενη επαγωγή anoikis συσχετίστηκε με καμία σημαντική επεξεργασία της κασπάσης 3 και PARP (Εικόνα 3Β), δεικνύοντας ότι ο μηχανισμός (-α) εναλλακτικό κυτταρικό θάνατο, εκτός από την κασπάση-εξαρτώμενο μονοπάτι εμπλέκεται. Στη συνέχεια κατιούσα ρύθμιση της έκφρασης Bit1 σε κύτταρα Α549 μέσω μικρής παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA που) και υποβλήθηκαν τα κύτταρα αντιμετωπίζονται siRNA Bit1 και ελέγχου σε δοκιμασία anoikis. Δύο Bit1 ειδικές siRNAs # 1 και # 2 παρουσίασαν σημαντική 70-80% προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Bit1 (Σχήμα 3C). Σε σύγκριση με τις Α549 γονικής ή ελέγχου κύτταρα κατεργασμένα siRNA, τα Bit1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα παρουσίασαν μειωμένη απόπτωση μετά από καλλιέργεια 72 ώρες σε εναιώρημα (Σχήμα 3D). Για να συμπληρώσει αυτά τα αποτελέσματα, που παράγεται επίσης δύο σταθερά Bit1 νοκ ντάουν Α549 προέρχεται κλώνους, δηλαδή Bit1 shRNA1 και Bit1 shRNA2, με κάθε κλώνο που εκφράζει μια ξεχωριστή Bit1 shRNA που στοχεύει μια διαφορετική ακολουθία στην κωδικεύουσα περιοχή 3 ‘του Bit1 mRNA. Παράλληλα, σταθερό έλεγχο shRNA κλώνοι 1 και 2 παρήχθησαν από το nontargeting ομελέτα Τα siRNAs. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Ε, η σταθερή Bit1 shRNA1 και shRNA2 έδειξαν μείωση στην έκφραση Bit1 κατά 70% και 80% αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον έλεγχο shRNA κλώνους. Η σταθερή Bit1 shRNA1 και shRNA2 στη συνέχεια συνδυάζονται για να δημιουργήσουν την πισίνα Bit1 shRNA, ενώ ο έλεγχος shRNA κλώνοι 1 και 2 περιελάμβανε τον έλεγχο shRNA πισίνα (Σχήμα 3Ε). Σύμφωνα με τα στοιχεία που προκύπτουν από μελέτες siRNA, η πισίνα Bit1 shRNA εμφανίζεται σημαντικά μειωμένο επίπεδο απόπτωσης από το shRNA πισίνα έλεγχο μετά από μια κουλτούρα 72 h σε αναστολή (Σχήμα 3F). Σε συμφωνία με την έλλειψη αποτελέσματος της έκτοπης Bit1 στο μιτοχονδριακό μονοπάτι (Εικόνα 2D), η παρατηρούμενη ενισχυμένη αντίσταση anoikis σε κύτταρα knockdown Bit1 δεν συσχετίστηκε με αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης του Bcl-2 οικογένεια των ρυθμιστών της απόπτωσης (Εικόνα S4). Τα ευρήματα αυτά, σε συνδυασμό με τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η εξωγενής μιτοχονδριακή Bit1 μπορεί να προκαλέσει anoikis, παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η οδός αποπτωτική Bit1 αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό κασπάσης-ανεξάρτητο μηχανισμό anoikis σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

A. και Β κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο συνημμένο (Α) ή αποσπάται (D) συνθήκες για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και στη συνέχεια υποβάλλεται σε υποβάλλεται σε κυτταρικό θάνατο ELISA (Α) ή κηλίδωση Western (Β) με αντισώματα έναντι της κασπάσης-3, PARP, και Β ακτίνης. Στο Α, τρία ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν? *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με συνδεδεμένα κύτταρα (δοκιμασία t Student). Γ και Δ κύτταρα επιμολύνθηκαν με Έλεγχος-ή Bit1 συγκεκριμένες siRNAs, και 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανοσοστύπωση (C) με αντισώματα έναντι Bit1 και Β-ακτίνης για την επιβεβαίωση της έκφρασης knockdown Bit1.