Abstract

ογκοκατασταλτικό γονίδιο του Wilm (WT1) έχει αναγνωριστεί ως ένα ογκογονίδιο σε πολλές κακοήθεις ασθένειες, όπως λευχαιμία, καρκίνος του μαστού, μεσοθηλίωμα και καρκίνο των πνευμόνων. Ωστόσο, ο ρόλος του WT1 στον καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (NSCLC) καρκινογένεση παραμένει ασαφής. Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε τα επίπεδα WT1 mRNA σε ιστούς NSCLC με συζευγμένες αντίστοιχες παρακείμενους ιστούς και αναγνωρίστηκαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση σε δείγματα NSCLC. Κυτταρικό πολλαπλασιασμό των τριών κυτταρικών γραμμών NSCLC συσχετίζεται θετικά με την έκφραση WT1? Επιπλέον, οι ενώσεις αυτές αναγνωρίσθηκαν και στις δύο κυτταρικές σειρές και ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι πάνω ρύθμιση Κυκλίνης D1 και την φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος (ρ-pRb) ήταν μηχανιστικά συναφή προς WT1 επιτάχυνση κυττάρων σε S-φάση. Εν κατακλείδι, τα ευρήματά μας έδειξαν ότι WT1 είναι ένα ογκογονίδιο και προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC από up-ρύθμιση κυκλίνης D1 και την έκφραση p-pRb

Παράθεση:. Xu C, Wu C, Xia Υ, Zhong Ζ, Liu X , Xu J, et al. (2013) WT1 Προωθεί πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών γραμμών μέσω Up-Ρύθμιση κυκλίνης D1 και π-pRb In Vitro και in vivo. PLoS ONE 8 (8): e68837. doi: 10.1371 /journal.pone.0068837

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Δεκ 2012? Αποδεκτές: 4 Ιούν 2013? Δημοσιεύθηκε: 1 Αυγούστου του 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας [81170158] (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα εξακολουθεί να αποτελεί μείζον πρόβλημα για τη δημόσια υγεία σε άνδρες και γυναίκες, είναι σήμερα ο τύπος του καρκίνου με την υψηλότερη θνησιμότητα σε όλο τον κόσμο. Η συχνότητα έχει αυξηθεί ταχύτατα λόγω της εκτεταμένης κάπνισμα καπνού [1] – [3], και η Κίνα υπήρξε αύξηση 26,9% στους άνδρες και 38,4% στις γυναίκες κατά τα τελευταία πέντε έτη [4]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) περιλαμβάνει πολλά ιστολογική υποομάδες, αδενοκαρκίνωμα, πλακώδους κυττάρου και καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου, που περιλαμβάνουν 80-85% της συνολικής επίπτωσης, ενώ οι υπόλοιπες περιπτώσεις περιλαμβάνουν την πιο διακριτή ομάδα του καρκίνου του πνεύμονα μικρού κυττάρου ( SCLC) [2], [5] – [7]. Σε αυτή τη μελέτη, θα επικεντρωθεί στο ρόλο του WT1 στην ανάπτυξη και καρκινογένεση του NSCLC.

γονιδίου του όγκου του Wilms ‘(WT1), η οποία βρίσκεται σε 11p13q, κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 52-54 kDa που περιέχει τέσσερις ψευδαργύρου δάχτυλο μεταγραφικοί παράγοντες και αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως ένα γονίδιο καταστολέα όγκου σε νεφροβλάστωμα ή όγκο Wilms, παιδιατρική καρκίνο του νεφρού [8], [9]. Η υπερέκφραση αυτού του γονιδίου ανακαλύφθηκε επίσης σε αρκετές λευχαιμίες και στερεούς όγκους, όπως ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του πνεύμονα και μεσοθηλίωμα, και έγινε η υπόθεση ότι αυτό το γονίδιο διαδραματίζει έναν ογκογόνο ρόλο [10], [11]. Oji Y et al πρότειναν ότι WT1 παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των φυσιολογικών κυττάρων του πνεύμονα? υπερέκφραση του WT1 διαταράσσουν την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των φυσιολογικών κυττάρων του πνεύμονα και, σύμφωνα με τα ευρήματά τους, να οδηγήσουν σε καρκίνο του πνεύμονα [11]. WT1 έχει αποδειχθεί ότι παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απόπτωσης σε πολλές βιολογικές και παθολογικές μηχανισμούς. Πρόσφατα, έχει διερευνηθεί ως ένα δυνητικό στόχο της ανοσοθεραπείας για διάφορους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των NSCLC και το μεσοθηλίωμα [12].

Signal έχουν μορφοτροπείς και ενεργοποιητές μεταγραφής 3 (STAT3) έχουν αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται σε πολλούς ανθρώπινους κακοηθειών και ενεργοποιούνται από διάφορες κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες κατά την ανάπτυξη και την εξέλιξη [13], [14] του καρκίνου. Έχει αποδειχθεί ότι STAT3 προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μέσω πάνω ρύθμιση των γονιδίων που κωδικοποιούν αναστολείς της απόπτωσης, όπως Mcl-1 και Bcl-xL και του κυτταρικού κύκλου ρυθμιστές συμπεριλαμβανομένων των κυκλινών D1 /D2 και C-Myc [13] – [17 ]. Είναι ενδιαφέρον Rong et al κατέδειξαν στοιχεία ότι WT1enhanced την μεταγραφική δραστικότητα φωσφορυλιωμένης STAT3 (ρ-STAT3) που οδηγεί σε συνεργική πάνω ρύθμιση των κατάντη γονιδίων συμπεριλαμβανομένων κυκλίνης D1 και Bcl-xL, σε ινοβλάστες ποντικού, το μελάνωμα και ηπατικά κύτταρα, καθώς και τα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα [18]. Ωστόσο, WT1 δεν έχει προηγουμένως αναφερθεί σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα.

Σε αυτή τη μελέτη, με στόχο να προσδιοριστεί η έκφραση του WT1 πρωτεΐνης σε δείγματα NSCLC σε σύγκριση με παρακείμενους ιστούς, διερευνήσει τον πολλαπλασιασμό προώθηση λειτουργία του WT1 in vitro και in vivo και να προσδιορίσει τη σχέση της με π-STAT3 μεταγραφική ενεργοποίηση.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

NSCLC και τα αντίστοιχα γειτονικούς ιστούς που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από 85 συνεχόμενες ασθενείς που είχαν de novo ασθένεια και υποβληθεί σε χειρουργική εκτομή. Είχαν συμπεριληφθεί μεταξύ Δεκεμβρίου 2010 και Απριλίου 2011 το Πρώτο Ενταγμένο Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing (Nanjing, Κίνα). Η σωστή διάγνωση αξιολογήθηκε από έναν έμπειρο παθολογοανατόμο και την σταδιοποίηση του ΜΜΚΠ από ένα κλινικό ογκολόγο, σύμφωνα με τη Διεθνή Ένωση για τη Μελέτη του Καρκίνου του Πνεύμονα (IASLC) 7η ΤΝΜ ταξινόμηση. Γειτονικό ιστό βρισκόταν εντός 3 cm από την άκρη του ιστού του όγκου.

RT-PCR

RNA ελήφθη από snap-κατεψυγμένα ιστούς και κυτταρικές σειρές NSCLC χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA , μέθοδος USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις RNA και ποιότητες εξετάστηκαν από την Beckman Coulter DU800 φασματοφωτόμετρο (Beckman, Brea, CA, USA). cDNA συντέθηκαν με ένα κιτ αντιδραστηρίων Primescript ™ RT (Takara, Ιαπωνία). 12 μί του ολικού RNA αναμίχθηκαν με 8 μL Primescript ρυθμιστικού και 20 μι νερό επεξεργασμένο με DEPC επωάστηκε στους 37 ° C για 15 λεπτά, 85 ° C για 5 s και αποθηκεύεται στους 4 ° C μέχρι τη χρήση.

qRT -PCR

ΑΒΙ Prism7500 Sequence Detector System (ΑΒΙ, USA) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το σχετικό επίπεδο του mRNA σε ιστούς όγκων και των παρακείμενων ιστών. ανάλυση ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-) για WT1 και β-ακτίνη διεξήχθη με SYBR® πρόμιγμα ExTaq ™ (Takara, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 10 μΙ 2 χ ρυθμιστικού διαλύματος πρόμιγμα, 0.5 μΐ κάθε 5 ‘και 3’ εκκινητή, και τα δείγματα 1 μλ ή αποσταγμένο νερό σε ένα τελικό όγκο 20 μΙ. Κάθε φιαλίδιο μετουσιώθηκε στους 95 ° C για 1 λεπτό. μετουσιωμένο στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 60 ° C για 15 sec και επεκτάθηκε στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: πρόσθιος εκκινητής WT1, 5’GCTATTCGCAATCAGGGTTACAG3 »? WT1 αντίστροφο εκκινητή, 5’TGGGATCCTCATGCTTGAATG3 ». β-ακτίνης προς τα εμπρός εκκινητή, 5’CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT3 »? β-ακτίνη αντίστροφο εκκινητή: 5’ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA3 ‘? στο τέλος της φάσης επέκτασης, ανίχνευση φθορισμού διεξήχθη. Για τη διάκριση συγκεκριμένων από μη ειδικά προϊόντα cDNA, μια καμπύλη τήξης λήφθηκε στο τέλος κάθε γύρου.

Cell Culture

Α549, Η1299, H1650 και 293Τ κυτταρικές σειρές (ATCC) χρησιμοποιήθηκαν για την παρούσας μελέτης. Α549, Η1299 και H1650 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ενώ 293Τ καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο υψηλής γλυκόζης συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή 37 ° C με 5% CO

2.

Lentivirus Παραγωγή και Μεταγωγή

WT1A (-17aa-KTS ισομορφή) γονίδιο συντέθηκε (αγοράστηκε από Genscript, Piscataway, NJ) με περιοριστική πέψη χρησιμοποιώντας Μία Ι και υποκλωνοποιήθηκαν πλασμίδιο PLV-GFP (δώρο από τον D. Beicheng Sun, Πανεπιστήμιο Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Κίνα), και το όνομά του PLV-GFP-WT1. Για να δημιουργηθεί πλασμίδιο που εκφράζει WT1-shRNA, δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια κλωνοποιήθηκαν σε φορέα pLL3.7 (δώρο από τον D. Yun Chen, Πανεπιστήμιο Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Κίνα) και ονομάστηκε pLL3.7-WT1-shRNA. Οι ακολουθίες των WT1-shRNA που χρησιμοποιούνται είναι aac TCAGGGTTACAGCACGGTC ttcaagaga GACCGTGCTGTAACCCTGA tttttt γ. Τα κεφαλαία γράμματα αντιπροσωπεύουν συγκεκριμένη ακολουθία WT1 και πεζά γράμματα αντιπροσωπεύουν φουρκέτα ακολουθίες. Η ανασυνδυασμένη φακοϊό παρήχθη από κύτταρα 293Τ χρησιμοποιώντας καθίζηση φωσφορικού ασβεστίου. Α549, Η1299, H1650 επιμολύνθηκαν με φακοϊό χρησιμοποιώντας πολυβρένιο (8 μg /ml). Αντιπροσωπευτικά εικόνες του άγριου τύπου και μορφομετατραπέντα κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα S1.

Western-blotting Δοκιμασία

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από καλλιεργημένα κύτταρα και ιστούς ποντικών, ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό πρωτεΐνης (BCA μέθοδο, Beyotime, Κίνα). Οι πρωτεΐνες κλασματώθηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF, αποκλείστηκε σε 4% ξηρό γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και ανοσοχρώση με πρωτεύοντα αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα χρησιμοποιώντας αντι-WT1 (1:1000, 6F-H2, Millipore, USA), αντι-STAT3 /p-STAT3 (1:2000, Cell σηματοδότηση Τεχνολογίας, Beverly, MA, USA), αντι-κυκλίνη D1 (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Λεωφόρος Delaware, CA, USA), αντι-p -pRb (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA), αντι-caspase3 (1:3000, Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA), αντι-ΒοΙ-2L (1:1000, Abcam, Cambridge, ΜΑ , USA) και αντι-GAPDH (1:1000, Kangchen, Κίνα). Τα αποτελέσματα οπτικοποιήθηκαν μέσω ενός συστήματος ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (σύστημα ανίχνευσης στυπώματος Pierce ECL υποστρώματος Western, Θέρμο, Pittsburgh, ΡΑ, USA) και εκτέθηκαν σε Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8) Δοκιμασία

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες των 96 φρεατίων (6.0 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με CCK-8 δοκιμασίας (Beyotime ινστιτούτο της βιοτεχνολογίας, Κίνα). Η απορρόφηση εκάστου φρεατίου αναγνώσθηκε σε φασματοφωτόμετρο (Thermo, Pittsburgh, ΡΑ, USA) στα 450 nm (Α450). Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν σε quintuplicate.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής ελήφθη για την ανίχνευση της κατάστασης απόπτωσης και κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές, και επαναιωρήθηκαν σε 100 μL PBS που περιείχε 3 μΐ αννεξίνης V και 3 μί του PI (KeyGen, Κίνα) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Η απόκτηση και ανάλυση των δεδομένων απόπτωση διεξήχθησαν από την κυτταρομετρία ροής εγκατάσταση (BD Biosciences, San Jose, CA).

ανάλυση κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με περιεχόμενο DNA ανιχνεύθηκε με τη χρήση της κυτταρομετρίας ροής εγκατάσταση (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Μετά συλλέγονται με θρυψινοποίηση, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν με 70% αιθανόλη και φυλάσσονται στους 4 ° C για 30 λεπτά. Φιλτράρεται μέσω του πλέγματος, και το περιεχόμενο DNA των χρωματισμένων πυρήνων αναλύθηκε. Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές για να εξασφαλίσει την πλαστότητα αποτελέσματα.

Ογκογονικότητα σε άτριχα ποντίκια

Για να διερευνήσει τις επιπτώσεις της WT1 στην ανάπτυξη του όγκου in vivo, ιδρύσαμε το μοντέλο ξενομοσχεύματος σε 4-εβδομάδα- παλιά Balb /c

nu /nu ποντικών. Χρησιμοποιήσαμε 90 Balb /c

ηυ /ηυ ποντίκια (που αγοράζονται από το κέντρο της έρευνας μοντέλο ζώου του Πανεπιστημίου Nanjing στην Κίνα) σε αυτή τη μελέτη και τους χωρίζονται σε 5 ομάδες τυχαίως (η = 6 ανά ομάδα) για κάθε κυτταρική γραμμή (Α549 /Η1299 /H1650). Όλα τα κύτταρα tripsinized και επαναιωρήθηκαν με 100 μL PBS (που περιέχει 50 μλ Matrigel) αντίστοιχα και υποδόρια ένεση σε μασχάλη του κάθε γυμνού ποντικού (5 × 10

6 κύτταρα ανά ποντικό). Μία εβδομάδα μετά την ένεση, οι όγκοι μετρήθηκαν οι διαστάσεις κάθε 4 ημέρες και μετά από ένα μήνα όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν και ελήφθησαν οι όγκοι (Σχήμα S2). Ο όγκος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ακόλουθο τύπο: όγκος = μήκος Χ πλάτος

2 × 0,5

Η ανοσοϊστοχημεία

Οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και κόβονται από μπλοκ παραφίνης 5 μm πάχους.. Μετά την αποκήρωση με ξυλόλιο και επανυδάτωση με μια διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης, τα πλακίδια θερμάνθηκαν στο αυτόκλειστο για τρία λεπτά χρησιμοποιώντας κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 6,0) και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα WT1 (1:100, 6F-H2, Millipore, USA), p-STAT3 (1:400, Cell σηματοδότηση Τεχνολογίας, Beverly, MA, USA), κυκλίνη D1 (1:50, Σάντα Κρουζ Βιοτεχνολογίας, Λεωφόρος Delaware, CA, USA) και p-pRb (1:100, Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού ορού ή αραίωση αντισώματος παρασκευάστηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν όλα το ίδιο όπως και για ανάλυση Western blot. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν από microcope (Nikon, ECLIPSE 50i) και το λογισμικό ΝΑΚ-Στοιχεία v4.0. Μέσες τιμές της ολοκληρωμένης οπτικής πυκνότητας (IOD) ελήφθησαν από πέντε τυχαία πεδία ανά slide χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus λογισμικό (v5.0). Κάθε δεδομένων ανιχνεύθηκε τρεις φορές τουλάχιστον.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD βασίζεται σε τρεις χωρίζονται πειράματα. t-test του Student, ANOVA και δύο όψεων ακριβής δοκιμή Fisher χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της στατιστικής σημασίας των διαφορών σε όλα τα σχετικά πειράματα. Μια τιμή της P & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική, και η P & lt? 0.001 θεωρήθηκε ιδιαίτερα σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το v17.0 πρόγραμμα SPSS (SPSS, Chicago, IL, USA).

Αποτελέσματα

1. Επίπεδα WT1 mRNA ήταν υπερεκφράζεται σε NSCLC Δείγματα

Ερευνήσαμε 85 ζεύγη NSCLC και τα αντίστοιχα γειτονικά δείγματα χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία και σε πραγματικό χρόνο PCR. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών φαίνονται στον Πίνακα S1. WT1 έκφραση σε όγκους ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με παρακείμενους ιστούς. Αντιπροσωπευτικές εικόνες φαίνεται στο Σχήμα 1Α. Η στατιστική ανάλυση των αξιών IOD 85 διαφάνειες που βάφονται με WT1 φαίνεται στο ιστόγραμμα στην Εικόνα 1Β (* ρ & lt? 0,05). Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1 C, το επίπεδο του mRNA του WT1 ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε δείγματα NSCLC (** ρ & lt? 0.001). Επιπλέον, τα ευρήματά μας έδειξαν ότι το επίπεδο WT1 mRNA συνδέθηκε τόσο με όγκο σε σχέση με την κανονική και με το στάδιο του όγκου, βλέπε πίνακα S1 (** p & lt? 0.001). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα δείχνουν ότι υψηλότερη έκφραση του WT1 συνδέεται με NSCLC.

Α, Ανοσοϊστοχημική χρώση WT1 στον όγκο (αριστερά) και παρακείμενα (δεξιά) δείγματα. Β, Μέση αξία της ολοκληρωμένης οπτικής πυκνότητας (IOD) εκτιμήθηκε με ανάλυση πέντε πεδία για κάθε πλάκα και καταγράφονται στο ιστόγραμμα. C, σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση του επιπέδου WT1 mRNA σε όγκο και των παρακείμενων ιστών σε σχέση με την β-ακτίνη. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD.

* P & lt? 0,05,

** P & lt?. 0.001

Η

2. Έκφραση WT1 Προωθείται η βιωσιμότητα του NSCLC Γραμμές κυττάρων in vitro

Για να βρείτε ένα WT1-shRNA που θα μπορούσε αποτελεσματικά κάτω-ρυθμίζουν την έκφραση του WT1 σε κυτταρικές σειρές NSCLC, τρεις υποψήφιες WT1-shRNA (Πίνακας S2) συντέθηκαν και δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση Western-blot και PCR πραγματικού χρόνου. Βρήκαμε ότι WT1-shRNA3repressed η έκφραση του WT1 σε Α549 /Η1299 /H1650 με τη μέγιστη αποτελεσματικότητα (Σχήμα 2Α). Στη συνέχεια, ανιχνεύσαμε την έκφραση του WT1 σε όλες τις κυτταρικές σειρές για την επιβεβαίωση της φακοϊό με ανάλυση Western κηλίδας και σε πραγματικό χρόνο PCR. Βρήκαμε ότι η έκφραση του WT1 στα Α549 /Η1299 /H1650 μεταγωγή με pLL3.7-WT1-shRNA ήταν πολύ χαμηλότερη σε σύγκριση με τους ελέγχους? ταυτόχρονα, η έκφραση του WT1 σε Α549 /Η1299 /H1650 μεταγωγή με PLV-GFP-WT1 ήταν πολύ υψηλότερη σε σύγκριση με τους ελέγχους. Βρήκαμε επίσης ότι οι δύο φορείς (pLL3.7-WT1 και PLV-GFP) δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του WT1 (Σχήμα 2Α και Σχήμα S3). Στη συνέχεια, διεξήχθη CCK-8 προσδιορισμό για να δοκιμαστεί η βιωσιμότητα? Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση του WT1 ενισχυμένη βιωσιμότητα του κυττάρου, ενώ ρύθμιση προς τα κάτω του WT1 εμφάνισε το αντίθετο αποτέλεσμα και η διαφορά ήταν όλο και περισσότερο εμφανές πάροδο του χρόνου (Σχήμα 2Β). Ως εκ τούτου, αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι WT1 προωθείται η βιωσιμότητα των κυττάρων NSCLC in vitro.

Μια έκφραση WT1 κυττάρων άγριου τύπου NSCLC και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με NSCLC λεντοϊού που περιέχει pLL3.7 (GFP1), PLV-GFP (GFP2), pLL3.7-WT1-shRNA (WT1-shRNA1, WT1-shRNA2, WT1-shRNA3) και PLV-GFP-WT1 (WT1) από δυτικές-κηλίδα. Β, η βιωσιμότητα των κυττάρων NSCLC εκτιμήθηκε με CCK-8 δοκιμασία: η υπερέκφραση του WT1 προάγει την βιωσιμότητα του κυττάρου, ενώ η αναστολή της έκφρασης WT1 μειώνει την επίδραση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD.

* P & lt? 0,05,

** P & lt?. 0.001

Η

3. Έκφραση WT1 Entry Επιταχυνόμενη φάση S του κυτταρικού κύκλου με Up-ρύθμιση Κυκλίνη D1 και ρ-pRb Protein

Για να διερευνηθεί η μηχανισμός με τον οποίο προωθούνται WT1 κυτταρικό πολλαπλασιασμό NSCLC, μελετήσαμε τα αποτελέσματα της έκφρασής WT1 επί του κυτταρικού κύκλου μέσω ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ποσοστό των S-φάσης σε ομάδα υπερέκφραση WT1 ήταν υψηλότερο σε σύγκριση με τον μάρτυρα, ενώ η ομάδα knockdown WT1 ήταν χαμηλότερη (Σχήμα 3Α & amp? 3Β). Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι WT1 δυνητικά προωθείται κυτταρικού πολλαπλασιασμού NSCLC επιταχύνοντας την είσοδο S-φάση του κυτταρικού κύκλου.

Α, ανάλυση κυτταρικού κύκλου των κυττάρων άγριου τύπου NSCLC και μεταγωγή με WT1-shRNA ή WT1. κύτταρα φυσικού τύπου χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Β, Ανάλυση S-φάσης /G1-φάση υπολογίζεται και καταγράφεται στα ιστογράμματα. C, ανάλυση κυττάρων απόπτωση των κυττάρων άγριου τύπου NSCLC και εκείνων μεταγωγή με WT1-shRNA ή WT1. κύτταρα φυσικού τύπου χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. D, ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης του WT1, STAT3, ρ-STAT3 (S727 και Y705), Κυκλίνη D1, ρ-pRb, caspase3, Bcl-2L σε κύτταρα υποδεικνύεται NSCLC. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD.

* P & lt? 0,05,

** P & lt?. 0.001

Η

Για την περαιτέρω διαλεύκανση του μηχανισμού, ανιχνεύσαμε την έκφραση της κυκλίνης D1 και π-pRb, επειδή η δραστηριότητα αυτή απαιτείται για G1 του κυτταρικού κύκλου /S μετάβαση από τη Western κηλίδας. Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 3D, η κυκλίνη D1 και ρ-pRb πρωτεΐνης τόσο αυξημένη σε κύτταρα που υπερεκφράζουν WT1 και μειωμένη σε WT1 ρυθμισμένα προς τα κάτω κύτταρα. Βασισμένο σε WT1, αυξημένη μεταγραφική δραστηριότητα του p-STAT3, και άλλα ευρήματα από τον Rong et al, ανιχνεύσαμε τη δραστηριότητα της STAT3 και π-STAT3 (S727 και Y705) και διαπίστωσε ότι η φωσφορυλίωση των δύο S727 και Y705 ήταν υπερεκφράζεται σε όλες τις κυτταρικές σειρές . Ωστόσο, μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν αναφορές οι οποίες έχουν εξετάσει αν WT1 συνδέεται με την φωσφορυλίωση του STAT3. Επιπλέον, ανιχνεύσαμε επίσης την απόπτωση και δεν βρήκε καμία επίδραση της WT1 (Σχήμα 3C & amp? 3D). Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι WT1 επιταχύνει την είσοδο S-φάση του κυτταρικού κύκλου με up-ρύθμιση Κυκλίνη D1 και η έκφραση πρωτεΐνης ρ-pRb.

4. Έκφραση WT1 Προώθησε την ανάπτυξη των όγκων ξενομοσχευμάτων in vivo

Για να προσδιορίσετε αν WT1 επηρεάζονται εξέλιξη NSCLC in vivo, έχουμε δημιουργήσει ένα μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος χρησιμοποιώντας Balb /c

nu /nu ποντικών. Οι ποντικοί εγχύθηκαν υποδορίως με σταθερά PLV-GFP-WT1 και pLL3.7-WT1-shRNA μολυσμένα Α549 /Η1299 /H1650 κυττάρων σε ένα μόνο σημείο, αντίστοιχα με κενό πλασμίδιο και άγριου τύπου WT1 ως έλεγχοι. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 4Α, βρήκαμε ότι δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των κυττάρων άγριου τύπου και τα κύτταρα μεταδιεγείρονται με PLV-GFP και pLL3.7-GFP? Αυτό έδειξε ότι η καμπύλη ανάπτυξης όγκου σε κύτταρα μεταχθέντα με PLV-GFP-WT1 αυξήθηκε αξιοσημείωτα σε σύγκριση με τον έλεγχο, ενώ η καμπύλη ανάπτυξης όγκου σε κύτταρα που μεταδιεγείρονται με pLL3.7-WT1-shRNA ήταν ανέστειλε σημαντικά. ιστοί όγκων που λαμβάνονται από γυμνά ποντίκια υποβλήθηκαν σε έντονο φως (Σχήμα 4Β αριστερά) και in vivo φθορισμού σύστημα εικόνας (Σχήμα 4Β δεξιά). Σημαντικές αυξήσεις στον όγκο του όγκου αποτελέσματα όταν τα κύτταρα μετάγονται με PLV-GFP-WT1 σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου? Σε αντίθεση, ο όγκος του όγκου των κυττάρων που μεταδιεγείρονται με pLL3.7-WT1-shRNA ήταν σημαντικά μειωμένη. Επιπλέον, ανιχνεύσαμε την έκφραση του WT1 πρωτεΐνης σε όγκους που προέρχονται από γυμνούς ποντικούς με ανάλυση Western-κηλίδος. Βρήκαμε ότι δεν υπήρξε καμία αλλαγή σε σύγκριση με κύτταρα in vitro (Σχήμα 2Α δεξιά και το σχήμα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι WT1 προάγει την ανάπτυξη του υποδόριου όγκου εμφυτεύματος in vivo.

Α, μέγεθος όγκου Balb /c

ηυ /ηυ γυμνά ποντίκια 31 ημέρες μετά την ένεση NSCLC κύτταρα. Β, ιστοί όγκου που λαμβάνονται από γυμνούς ποντικούς που παρουσιάζονται σε έντονο φως (αριστερά) και σε σύστημα φθορισμού εικόνα vivo. C, η έκφραση WT1 σε ιστούς όγκων από γυμνούς ποντικούς με ανάλυση Western-blotting. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD.

* P & lt? 0,05,

** P & lt?. 0.001

Η

5. WT1 επηρεάζουν την έκφραση της κυκλίνης D1 και π-pRb in vivo

In vivo, εμείς περαιτέρω επικυρωμένες μας in vitro αποτελέσματα στα οποία WT1 επιταχυνόμενη είσοδο στη φάση S του κυτταρικού κύκλου με up-ρύθμιση Κυκλίνη D1 και ρ-pRb . Ερευνήσαμε την έκφραση του STAT3, ρ-STAT3 (S727), Κυκλίνη D1 και π-pRb σε όγκους που προέρχονται από γυμνούς ποντικούς μέσω ανοσοϊστοχημική χρώση και ανάλυση Western κηλίδας. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 5Α και 5Β, το Κυκλίνη D1 και ρ-pRb επίπεδα ήταν αυξημένα σε WT1 υπερεκφράζουν ιστούς σε σύγκριση με το WT1 κάτω ρυθμισμένα ιστούς. Εν τω μεταξύ, π-STAT3 (S727) ήταν υπερεκφράζεται σε δύο ιστούς. Η στατιστική ανάλυση των αξιών IOD ιστών όγκου εμφανίζεται στο ιστόγραμμα (Σχήμα 5Α, ρ & lt? 0,05). Συμπερασματικά, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η WT1 προάγει την ανάπτυξη του όγκου in vivo και εξαρτάται επίσης από τα άνω ρύθμιση της έκφρασης κυκλίνης D1 και ρ-pRb.

Α, Ανοσοϊστοχημική χρώση WT1, ρ-STAT3 (s727) , Κυκλίνη D1 και π-pRb σε WT1 υπερεκφράζεται (WT1) σε ιστούς όγκου και WT1 ρυθμισμένα προς τα κάτω (WT1-shRNA) ιστούς όγκων in vivo. Μέση τιμή του ολοκληρωμένου οπτικής πυκνότητας (IOD) ελήφθη όπως περιγράφηκε παραπάνω, έδειξαν ότι η έκφραση της κυκλίνης D1 και ρ-pRb ήταν σημαντικά τα πάνω ρυθμισμένη. Β, ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης του WT1, STAT3, ρ-STAT3 (S727 και Y705), Κυκλίνη D1, ρ-pRb σε υποδεικνύεται όγκους. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD.

* P & lt?. 0.05

Η

6. Έκφραση WT1 επηρεάζουν την έκφραση της κυκλίνης D1 και π-pRb σε NSCLC Δείγματα

Εμείς αξιολογηθούν περαιτέρω τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης WT1 και το επίπεδο της κυκλίνης D1 και π-pRb με 85 ενσωματωμένα σε παραφίνη διαφάνειες ανθρώπινου ιστού ΜΜΚΠ. Δύο περιπτώσεις με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης WT1 φαίνεται στο Σχήμα 6: Περίπτωση 1 (ισχυρή θετική) και 2η Περίπτωση (ασθενές θετικό). Το επίπεδο της Κυκλίνης D1 και ρ-pRb ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε σχέση με το Περίπτωση 1 2η Περίπτωση. Όπως ήταν αναμενόμενο, π-STAT3 (S727) ήταν έντονα χρωματισμένο τόσο Περίπτωση 1 και 2η Περίπτωση. Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίζει την υπόθεση ότι το WT1 θα μπορούσε να αυξήσει την έκφραση της κυκλίνης D1 και π-pRb και ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο.

Η ανοσοϊστοχημική χρώση του WT1, ρ-STAT3 (s727), Κυκλίνη D1 και π-pRb σε WT1 υπερέκφραση (περίπτωση 1) καρκινικών ιστών και WT1 χαμηλή έκφραση (περίπτωση 2) ​​ιστούς όγκων in vivo. Μέση τιμή του ολοκληρωμένου οπτικής πυκνότητας (IOD) ελήφθη όπως περιγράφηκε παραπάνω, έδειξαν ότι η έκφραση της κυκλίνης D1 και ρ-pRb ήταν σημαντικά τα πάνω ρυθμισμένη. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD.

* P & lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Κατά τη διάρκεια των προηγούμενων αρκετών δεκαετιών, αν και ορισμένες μελέτες έχουν διερευνήσει το ρόλο των WT1 στον NSCLC, η λειτουργία του δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η έκφραση του WT1 γονιδίου και της πρωτεΐνης σε δείγματα NSCLC ήταν εμφανώς πάνω ρυθμισμένα σε σύγκριση με γειτονικούς ιστούς? WT1 προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC in vitro και σε in vivo, και έκφραση WT1 επηρέασε το επίπεδο της κυκλίνης D1 και ρ-pRb οποία επιταχύνθηκε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα NSCLC και κλινικά δείγματα. Με όλα τα συμπεράσματα λαμβάνονται μαζί, υποθέσαμε ότι WT1 παίζει δυνητικά ογκογόνο ρόλο στην προώθηση της καρκινογένεση και της εξέλιξης του NSCLC.

WT1 ταυτοποιήθηκε αρχικά ως ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε όγκο Wilm, και στη συνέχεια βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε μια ποικιλία στερεών όγκων [19]. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ της έκφρασης και την καρκινογένεση του WT1 στον NSCLC παραμένει αμφιλεγόμενη. Oji et al. πρότεινε ότι WT1 μπορεί να διαταράξει την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των φυσιολογικών κυττάρων του πνεύμονα και να συμβάλλουν στην ογκογένεση του καρκίνου του πνεύμονα [11]. Πιο πρόσφατα, Hayashi S et al ανέφεραν ότι η γονιδιακή έκφραση χαμηλή WT1 σε όγκους NSCLC ήταν ένα αρνητικό προγνωστικό σημείο και συσχετίστηκε επίσης με λεμφαδένα μετάσταση [20]. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι η απώλεια WT1 προκαλούμενη γήρανση και μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα κατάντη ογκογόνο KRAS σηματοδότησης [21] .STAT3 ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένα σε πολλούς ανθρώπινους όγκους όπως του προστάτη, του πνεύμονα, του εγκεφάλου, του μαστού και τον καρκίνο του παγκρέατος [13], [15], [22], [23]. Οι μεταγενέστεροι γονίδια συμπεριλαμβανομένων Κυκλίνη D1, c-myc, και Bcl-xL των STAT3, είναι δυνητικά up-ρυθμίζεται από φωσφορυλιωμένο STAT3. Η κυκλίνη D1 είναι ένας ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου που προωθεί κύτταρα από G1 φάσης σε S-φάση, και φωσφορυλιώνει pRb πρωτεΐνη [24], η οποία είναι μια πυρηνική φωσφοπρωτεΐνη που ρυθμίζει την κυτταρική ανάπτυξη σε G1-φάση. Υποφωσφορυλιωμένη pRb για S780 στη συνέχεια απελευθερώνει E2F από μία ανασταλτική συγκρότημα και τη δυνατότητα να προωθήσει την αναγκαία για την εξέλιξη της μεταγραφής σε τέλη G1 φάσης και S-φάσης [24] – [26]. Έχει αναφερθεί ότι η κυκλίνη D1 και κυκλίνη εξαρτιόταν-κινάσης 4 (CDK4) φωσφορυλιωμένου pRb και ότι pRb χάσει την ικανότητά του να δεσμεύεται με E2F [27]. Έτσι, όταν Κυκλίνη D1 είναι up-ρυθμίζεται από STAT3 αυτό μπορεί να φωσφορυλιώσει pRb και την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων με την απελευθέρωση E2F.

Rong et al ανέφερε ότι η λειτουργία του WT1 ως καταστολέα όγκων ή ογκογονιδίου ήταν εξαρτάται κυρίως από τις δραστηριότητες του STAT3. Κατά συνέπεια, όταν ενεργοποιήθηκε STAT3, WT1 λειτουργούσε ως καταστολέας όγκου, αλλά όταν STAT3 ήταν απενεργοποιηθεί, WT1 λειτούργησε ως ογκοπρωτεϊνης [18]. Πρότειναν επίσης ότι WT1 και STAT3 συνεργικά προωθείται πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέχρι ρύθμισης γονιδίων όπως Κυκλίνη D1 και Bcl-XL. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, υποθέσαμε ότι το WT1 θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο σε NSCLC.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι WT1 υπερεκφράστηκε σε ιστούς NSCLC σύγκριση με γειτονικούς ιστούς. WT1 παρουσίασαν επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων NSCLC in vitro και vivo: υπερέκφραση του WT1 προωθείται κυτταρικής ανάπτυξης ενώ ρύθμιση προς τα κάτω ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC. Διαπιστώσαμε επίσης έκφραση της STAT3 σε δείγματα και τα κύτταρα NSCLC, σύμφωνα με Fernandes et al, οι οποίοι βρέθηκαν STAT3 υπερεκφράζεται σε ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα [23]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι WT1 επιταχυνόμενη είσοδο κυττάρων φάσης S? Έτσι, αξιολόγησε τα γονίδια ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου, όπως Κυκλίνη D1 και π-pRb και βρήκαμε ότι η έκφραση της κυκλίνης D1 και ρ-pRb πράγματι πάνω ρυθμισμένα όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D. Λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα μας και τα προηγούμενα ευρήματα της Rong et al, διαπιστώσαμε ότι WT1 και STAT3 προώθηση συνεργικά την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC από up-ρύθμιση των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου κυκλίνης D1 και π-pRb. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η έκφραση WT1 συνδέθηκε τόσο με λεμφαδένα μετάσταση και το στάδιο του όγκου. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η έκφραση WT1 μπορεί να είναι σχετικές με εισβολή και μετάσταση όγκου. Επιθηλιακά να μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) θεωρείται απαραίτητη διαδικασία για την μετάσταση του καρκινώματος και τη διάδοση των καρκινικών κυττάρων από τον πρωτογενή όγκο και τη μετανάστευση σε διαφορετικές θέσεις του σώματος [28]. Είναι ενδιαφέρον, WT1 θα μπορούσαν δυνητικά να οδηγήσουν EMT μέσω EMT που σχετίζονται με τους στόχους, όπως σαλιγκάρι, γυμνοσάλιαγκας και E-cadherin [29] – [31]. Αυτό θα απαιτήσει περαιτέρω έρευνα για να προσδιοριστεί η λειτουργία του WT1 στην εισβολή και μετάσταση όγκων.

Απροσδόκητα, δεν βρήκαμε ότι WT1 είχε καμία επίδραση στην απόπτωση των κυττάρων NSCLC σύμφωνα με κυτταρόμετρο ροής δοκιμασία, αλλά και από τη Δυτική -blot δοκιμασία? Αυτό είναι διαφορετικό από τα ευρήματα Rong Y et al οποίο να προέκυπτε WT1 αύξησαν την έκφραση των Bcl-xL [18]. Αναφέρθηκε επίσης ότι WT1 απαιτείται για την αναστολή της απόπτωσης στον καρκίνο του μαστού και τον καρκίνο ραβδοειδή με τη μείωση Bcl-2 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης [32], [33]? Ωστόσο, άλλες εκθέσεις έδειξαν ότι WT1 ρυθμίζεται αρνητικά τον προαγωγό Bcl-2 στην κυτταρική σειρά προστάτη [34]. Vincent S et al. ανέφερε ότι δεν εντόπισε καμία διαφορά σε απάντηση στην εξάντληση WT1 σε κυτταρικές σειρές NSCLC [21], η οποία ήταν σύμφωνα με τα ευρήματά μας. Ο λόγος για αυτές τις διαφορές παραμένει άγνωστη, αλλά η περαιτέρω διευκρίνιση, γιατί WT1 και STAT3 συνεργικά προάγουν το επίπεδο της κυκλίνης D1, αλλά δεν έχουν καμία επίδραση στο επίπεδο των Bcl-2L σε NSCLC, είναι δικαιολογημένη. Τα πρόσφατα εντοπίστηκαν μεταγραφική WT1 συν-παράγοντες, όπως BASP1 (οξύ-διαλυτής πρωτεΐνης εγκεφάλου 1) και WTIP (WT1 πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης) θα μπορούσαν να συμμετάσχουν σε αυτές τις διαφορές στη WT1 μεσολάβηση μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων στόχων όπως Bcl-2L [35] – [37].

Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ένα σημαντικά υψηλότερο επίπεδο έκφρασης WT1 σε δείγματα NSCLC σε σύγκριση με παρακείμενους ιστούς μη καρκινικών, δείξαμε τον πολλαπλασιασμό προώθηση λειτουργία του WT1 in vitro και in vivo και προσδιορίσαμε ογκογόνο ρόλο της στην NSCLC μέσω ενίσχυσης της μεταγραφικής δραστικότητας του ρ-STAT3 ότι up-ρυθμίζει καθοδικά γονίδια, συμπεριλαμβανομένων Κυκλίνη D1 και την υπο-φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος (ρ-pRb). Έτσι, WT1 δυνητικά να χρησιμεύσει ως θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του NSCLC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

η εικόνα των κυττάρων άγριου τύπου NSCLC και άλλοι επιμολυσμένα με φακοϊό σε έντονο φως (άνω) και στο πράσινο φως (κάτω). NSCLC κύτταρα άγριου τύπου που αναφέρεται ως έλεγχος? κύτταρα που μετατρέπονται με pLL3.7 και PLV-GFP αναφέρεται ως GFP1 και GFP2? κύτταρα που μετατρέπονται με pLL3.7-WT1-shRNA αναφέρεται ως WT1-shRNA και μεταγωγή με PLV-GFP-WT1 αναφέρεται ως WT1 στην εικόνα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068837.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

όγκοι που λαμβάνονται από τα γυμνά ποντίκια. Οι όγκοι που λαμβάνεται από την γυμνούς ποντικούς όλα παρουσιάζονται σε αυτό το σχήμα. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι εντοπίστηκε μόνο 4 όγκους σε Η1299-WT1-shRNA ομάδα και 5 όγκων σε H1650-WT1-shRNA ομάδα στην ένεση ιστοσελίδα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068837.s002

( TIF)

Εικόνα S3. έκφραση

WT1 mRNA των κυττάρων NSCLC. WT1 έκφραση των κυττάρων άγριου τύπου NSCLC και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με NSCLC λεντοϊού που περιέχει pLL3.7 (GFP1), PLV-GFP (GFP2), pLL3.7-WT1-shRNA (WT1-shRNA1, WT1-shRNA2, WT1-shRNA3) και PLV-GFP-WT1 (WT1) από την Real-time PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. * P & lt? 0,05

doi: 10.1371 /journal.pone.0068837.s003

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1..

Σχέση της έκφρασης WT1 και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά του NSCLC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068837.s004

(DOC)

Πίνακας S2.

Η ακολουθία του WT1-shRNA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068837.s005

(DOC)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω όλα τα άτομα που εθελοντικά συμμετείχαν στη μελέτη και Δ Beicheng Ήλιος και Δ Yun Chen (Πανεπιστήμιο Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Nanjing, Κίνα) για τα πλασμίδια τους.