Αφηρημένο

NEDD9, ένα κομβικό πρωτεΐνη σκαλωσιές πρόσφυσης, έχει πρόσφατα πρότεινε να ρυθμίσει την εισβολή και τη μετάσταση σε ορισμένοι τύποι καρκίνου, αλλά άγνωστη στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί εάν NEDD9 συμμετείχε στην εξέλιξη και τη μετάσταση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν NEDD9 πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας σε σύγκριση με το φυσιολογικό τραχηλικό επιθήλιο ιστούς. Η υπερέκφραση του NEDD9 συσχετίστηκε με ιστολογική διαβάθμιση, λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες, και ΦΥΓΩ στάδιο του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Σίγαση NEDD9 οδήγησε σε αποφωσφορυλίωση τυροσίνης FAK και SRC ογκοπρωτεΐνες και μειωμένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή στην αυχενική καρκίνωμα SiHa και HeLa κύτταρα. Η υπερέκφραση του NEDD9 οδήγησε σε φωσφορυλίωση της τυροσίνης του FAK και SRC ογκοπρωτεϊνών, και την αύξηση της μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση της τυροσίνης της NEDD9 μειώθηκε σημαντικά με την καταστολή της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης του FAK ή SRC, γεγονός που υποδηλώνει μια θετική βρόχος ανάδρασης της φωσφορυλίωσης τυροσίνης μεταξύ NEDD9 και FAK ή SRC. Επιπλέον, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η φίμωση NEDD9 μειώθηκε βιμεντίνης έκφρασης και αυξημένη έκφραση Ε-καντερίνης του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, και το αντίστροφο. E-cadherin ήταν υπόκειται σε ρύθμιση των NEDD9, FAK και SRC, αλλά δεν άλλαξε ούτε τυροσίνης-φωσφορυλιωμένη ούτε συνολικού NEDD9. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι NEDD9 υπερεκφράζεται σε τραχήλου της μήτρας ιστούς και τα κύτταρα του καρκίνου, και υπερεκφράζεται NEDD9 προωθεί τη μετανάστευση και την εισβολή στα κύτταρα του τραχήλου της μήτρας καρκίνωμα, πιθανώς μέσω μιας θετικής ανάδρασης της φωσφορυλίωσης τυροσίνης μεταξύ NEDD9 και ΡΑΚ ή SRC

Αιτιολογική αναφορά.: Sima Ν, Cheng Χ, Ye F, Ma D, Xie Χ, LU W (2013) Η υπερέκφραση των ικριωμάτων πρωτεΐνη NEDD9 Προωθεί τη μετανάστευση και την εισβολή στον Καρκίνο του Τραχήλου της Μήτρας μέσω φωσφορυλιωμένη τυροσίνη FAK και SRC. PLoS ONE 8 (9): e74594. doi: 10.1371 /journal.pone.0074594

Επιμέλεια: Olivier de Wever, Πανεπιστήμιο της Γάνδης, Βέλγιο

Ελήφθη: 19 Φεβρουαρίου του 2013? Αποδεκτές: 5 Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Sima et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η παρούσα μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30.801.227?. 81272862), το Ίδρυμα Zhejiang Provincial Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αριθ Y2100403?. LY12H16020), το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (Αρ 2009CB521808), τα θεμελιώδη Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές πανεπιστήμια της Κίνας και του επαρχιακού Πρόγραμμα Zhejiang για την καλλιέργεια υψηλού επιπέδου ταλέντα Καινοτόμες Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο τρίτος πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος στις γυναίκες παγκοσμίως, ιδίως στις αναπτυσσόμενες χώρες. Ετησίως, περίπου 529.800 γυναίκες αντιμετωπίζουν αυτή την ασθένεια, αντιπροσωπεύοντας το 9% του συνόλου των νέων περιπτώσεων καρκίνου [1]. Παρά το γεγονός ότι οι τρέχουσες στρατηγικές θεραπείας, όπως η ριζική υστερεκτομή και η ακτινοθεραπεία έχουν καλές κλινικές εκβάσεις, σχεδόν 275.100 θανάτων που αποδίδονται σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας κάθε χρόνο. Επιπλέον, η χειρουργική επέμβαση είναι κατάλληλη μόνο για την πρόωρη ασθένειες στάδιο και τα αποτελέσματα της ακτινοθεραπείας σε ανεπιθύμητες παρενέργειες, όπως ωοθηκική ανεπάρκεια, η κολπική στένωση, radiocystitis και πρωκτίτιδα ακτινοβολίας που επηρεάζουν την ποιότητα της ζωής του ασθενούς [2]. Ως εκ τούτου, τα γεγονότα αυτά υπογραμμίζουν την επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών και νέων θεραπευτικών στόχων.

γονίδιο NEDD9, εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε νευρωνικά πρόδρομα κύτταρα, το 1992, ήταν κάτω-ρυθμίζονται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ποντικιού του κεντρικού νευρικού συστήματος [ ,,,0],3]. Στη συνέχεια, αυτό το γονίδιο βρέθηκε επίσης σε άλλα είδη και ιστούς. Law et al [4] σε διαλογή σε βιβλιοθήκη cDNA για τα γονίδια που επάγονται νηματοειδείς μύκητες εκβλάστησης του

S. cerevisiae

προκειμένου να βρεθεί υποψήφια γονίδια που μπορεί να συντονίζει την κυτταρική σηματοδότηση και τη μορφολογία. Μια «νέα» γονίδιο εντοπίστηκε και αποδίδεται ως Ανθρωπίνων Enhancer της νηματοποίηση 1 (HEF1). Μια άλλη ερευνητική ομάδα διαπίστωσε ότι ένα νέο 105 kD p130Cas πρωτεΐνη που σχετίζεται με φωσφορυλιώθηκε τυροσίνης από την εμπλοκή των ιντεγκρινών β1 σε Τ λεμφοκύτταρα και χαρακτηρίστηκε ως λεμφοκυττάρων τύπου Crk σχετιζόμενη υπόστρωμα (CAS-L) [5]. Έτσι, NEDD9 είχε δύο άλλες ανεξάρτητες ονόματα στην ιστορία. NEDD9 πρωτεΐνες ρυθμίζουν πρωτεϊνικά σύμπλοκα ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση, μετανάστευση, χημειόταξη και διαφοροποίηση [6]. FAK και SRC είχαν ενοχοποιηθεί ως σημαντικούς στόχους της NEDD9 και ήταν φωσφορυλιωμένη και ενεργοποιούνται αμοιβαία, το οποίο θεωρείται ως η «βασική διαδικασία ρύθμισης» της NEDD9 [7].

Κατά τα τελευταία αρκετά χρόνια, αλλαγμένη έκφραση των ικριωμάτων πρωτεΐνη NEDD9 έχει αναδειχθεί ως συμβολή στην μετάσταση καρκίνου σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου, όπως ο καρκίνος του μαστού [6,8], γλοιοβλάστωμα [9], το μελάνωμα [10], του πνεύμονα [11,12] και της κεφαλής και του λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (HNSCC) [13]. Ωστόσο, καμία μελέτη μέχρι σήμερα για να προσδιορισθεί εάν NEDD9 σχετίζεται με ανθρώπινο καρκίνωμα του τραχήλου. Πρόσφατες αναφορές έχουν προτείνει ότι NEDD9 υπερεκφράζεται σε κάποιο ανθρώπινο καρκίνωμα όπως μελάνωμα [10] και HNSCC [13]. Εδώ ανιχνεύσαμε την έκφραση NEDD9 σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και να διερευνηθεί ο ρόλος της NEDD9 στην εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγμα ιστού συλλογή

Η δείγματα του τραχήλου της μήτρας και των λεμφαδένων ιστούς και κλινικές παραμέτρους από 67 ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου (38 τραχήλου της μήτρας πλακώδη καρκινώματα και 29 αδενοκαρκινώματα), ο οποίος υποβλήθηκε σε χειρουργική επέμβαση κατά τη διάρκεια του 2005-2009 στο Νοσοκομείο Γυναικών, της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Zhejiang, συλλέχθηκαν και παρουσιάστηκαν αναλυτικά στοιχεία στον πίνακα S1. Επιπλέον, 22 τραχηλικού δείγματα φυσιολογικού ιστού ως μάρτυρες προέρχονται από ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή λόγω των καλοηθών γυναικολογικών παθήσεων. Δεν ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν ελήφθησαν οι ιστοί. Η μελέτη αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Νοσοκομείου Γυναικών, της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Zhejiang. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς ή οι νόμιμοι κηδεμόνες τους.

Η ανοσοϊστοχημεία

Όλοι οι ιστοί ανοσοϊστοχημική χρώση σε 4-μm τμήματα για την αξιολόγηση της έκφρασης NEDD9 σε αυτά τα δείγματα. Mouse μονοκλωνικό αντίσωμα 2G9 έναντι NEDD9 (Abcam, 1: 1000) χρησιμοποιήθηκε ως το πρωτογενές αντίσωμα. EnVision

κιτ ανίχνευσης TM χρησιμοποιήθηκε στις διαδικασίες και 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) εφαρμόστηκε ως χρωμογόνο. Κάθε τμήμα βαθμολογήθηκε τυφλά για ημι-ποσοτικό προσδιορισμό της ανοσοϊστοχημικής ένταση χρώσης από έναν παθολόγο. Χρώση ένταση βαθμολογήθηκε ως εξής: 0, καθόλου χρώση? 1, αδύναμη θετικότητα? 2, μέτρια θετικότητα? και 3, ισχυρή θετικότητα. Τα σύνθετα αποτελέσματα ανοσοϊστοχημείας προέρχεται αθροίζοντας τις βαθμολογίες έντασης πολλαπλασιάζονται με το κύτταρο ποσοστό αυτής της έντασης βαθμολογίας. Για παράδειγμα, εάν το δείγμα έδειξε μέτρια χρώση (σημείωσε 2) σε 20% των κυττάρων και έντονη χρώση (σημείωσε 3) σε 30% των κυττάρων, τα σύνθετα βαθμολογίες ανοσοϊστοχημεία θα είναι (2 χ 0,2) + (3 χ 0,3) = 1,3. Ένας μέσος όρος χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση.

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο τραχηλικό καρκίνο κυτταρικές σειρές SiHa (HPV16-θετικό), CaSki (HPV16-θετικό), HeLa (HPV18-θετικό), C33A (HPV-αρνητικό), ανθρώπινα μη-καρκινική γραμμή κερατινοκυττάρων ανθρώπινες κυτταρικές σειρές νεφρού ΗΕΚ293 εμβρυϊκών και ΗΕΚ293Τ HaCaT και λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco. (ΫΜΕΜ? GIBCO, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C

ανοσοφθορισμού

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επίστρωση σε γυάλινες καλυπτρίδες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 3,7% παραφορμαλδεΰδη και επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού 2G9 (1: 200) έναντι NEDD9 ως πρωτογενές αντίσωμα. Μετά από έκπλυση τρεις φορές με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού συζευγμένο με Alexa Fluor 647 (Invitrogen) αραιωμένο 1: 1500 σε 2% BSA ως δευτερογενές αντίσωμα. Οι πυρήνες που σημειώνονται με Hoechest33342 (Sigma).

siRNAs Προετοιμασία και διαμόλυνση

Με βάση την βιβλιογραφία [14], καθώς και ένα δωρεάν web-based εργαλείο (https://www.dharmacon.com) , τρία ζεύγη siRNAs σχεδιάστηκαν έναντι NEDD9 mRNA. siRNAs κατά HPV16 Ε6 /Ε7 και Ε-καδερίνης σχεδιάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Όλα τα siRNA διπόλων (Πίνακας S2) συντέθηκαν χημικά με GeneChem Co., Ltd. (Σαγκάη, Κίνα). Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και χρησιμοποιώντας Lipofectamine ™ 2000 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

λεντοϊών

Παραγωγή

Η πλήρης αλληλουχία κωδικοποίησης της NEDD9 ενισχύθηκε με PCR από τα πλασμίδια που περιέχουν cDNA κλώνο του NEDD9 (ΟηΟεηε, USA) και εισάγεται σε ένα φακοϊό φορέα μεταφοράς γονιδίου pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen, USA). Η κωδικοποιητική αλληλουχία του μικρού RNAs φουρκέτας (Τα siRNAs) που στοχεύουν πρωτεΐνη πράσινου φθορισμού (GFP) ή NEDD9 (Πίνακας S2) κλωνοποιήθηκαν αμέσως μετά από μια ροΙ III προαγωγού U6 σε ένα φακοϊό φορέα μεταφοράς γονιδίου (Invitrogen, USA). Οι φορείς στη συνέχεια συσκευάστηκαν σε σωματίδια λεντοϊού σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Οι φακοϊούς χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν τραχήλου καρκινικών κυττάρων, όπως περιγράφεται προηγουμένως [16]. Παράγεται φακοϊούς τιτλοδοτήθηκαν και αποθηκεύθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ποσοτική PCR

Ολικά RNAs παρασκευάσθηκαν από τα κύτταρα που κατεργάστηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, USA). Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR (qPCR) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα PCR 7300 πραγματικού χρόνου (Applied Biosystems) και εκτελείται από SYBR Green χρωστική σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές συντέθηκαν από Sangon Biotech Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα). όπως απαριθμούνται στον Πίνακα S2. Σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης mRNA υπολογίστηκε με την 2

-ΔΔCT μέθοδο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17].

κηλίδες Western και ανοσοκαταβύθιση

στυπώματα Western διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [18] . Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για εκχύλιση των πρωτεϊνών. Πενήντα μικρογραμμάρια συνολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα SDS-PAGE 10%. Για ανοσοκατακρήμνιση, τα κύτταρα διασπάστηκαν σε 250 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος ανοσοκατακρήμνισης. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (300 μg) υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος Western. Σωρευτική γκρι επίπεδο των ζωνών κηλίδος Western λήφθηκε με χρήση λογισμικού ImageJ (ΝΙΗ, USA) για σχετική ποσοτικοποίηση ποσοτική ανάλυση. Πρωτογενή αντισώματα ήταν ειδικά για ακόλουθες πρωτεΐνες: NEDD9 (ab18056) από Abcam, FAK (3285), pFAK (3283), Src (2109), pSRC (2101), Phospho-τυροσίνη (9411), βιμεντίνη (3932) και Ε-καδερίνης (3195) έντυπο Cell Signaling, HPV16 Ε6 (MAB874), Ε7 (MAB8680) από Millipore, GAPDH (SC-59540) και β-ακτίνη (SC-1616-R) από την Santa Cruz. Οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ECL κιτ (Pierce, USA).

Scratch επούλωση της πληγής δοκιμασία

δοκιμασία επούλωση της πληγής Scratch διεξήχθη για να προσδιοριστεί η κυτταρική μετανάστευση. Τα κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό, και 72 ώρες αργότερα αναπτύχθηκαν μέχρι πλήρους συρροή. Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν πληγές (περίπου 1 mm πλάτος) χρησιμοποιώντας ένα άκρο μικροπιπέτας γδαρμένο μέσα από τα πηγάδια. Η ταχύτητα μετανάστευσης των κυττάρων υπολογίστηκε με μέτρηση της απόστασης μετανάστευσαν σε 24 ώρες. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν με τη χρήση μικροσκοπίου αντίθεσης φάσης (Olympus, Japan) σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από το μηδέν.

Transwell δοκιμασίες

In vitro δοκιμασίες κυτταρικής εισβολής διεξήχθησαν σε πλάκες Transwell Matrigel που βασίζεται ουσιαστικά ως περιγράφηκε προηγουμένως από Pelletier et al [19] με ελαφρές τροποποιήσεις. 5 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν στα επικαλυμμένα με Matrigel άνω θαλάμους των 24 φρεατίων πλάκες Transwell (Corning Costar, Cambridge, ΜΑ) με μέγεθος πόρων 8 μm. Τα κατώτερα διαμερίσματα γεμίστηκαν με μέσο συμπληρωμένο με 20% ορό εμβρύου μόσχου. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα που δεν μετανάστευσαν στην επάνω επιφάνεια των μεμβρανών αποξέστηκαν ηπίως μακριά με μπατονέτες και τα μεταναστεύσει κύτταρα που είχαν εισβάλει στην κάτω επιφάνεια χρώσθηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν. δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης πραγματοποιήθηκαν με παρόμοιο τρόπο, αλλά χωρίς Matrigel.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το πακέτο λογισμικού SPSS 12.0. Ένας τρόπος ANOVA και έλεγχος τ χρησιμοποιήθηκαν για σύγκριση των δεδομένων.

σ

τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε σημαντική στατιστική.

Αποτελέσματα

NEDD9 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους ιστούς του τραχήλου της μήτρας καρκίνου και κυτταρικές σειρές

Για να βρείτε μια ένδειξη της σχέσης μεταξύ πρωτεΐνης NEDD9 και ανθρώπινου τραχηλικού καρκινώματος, χρησιμοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική ανάλυση για τον προσδιορισμό της έκφρασης των NEDD9 πρωτεΐνης σε ιστούς ανθρώπινου τραχηλικού καρκινώματος και αναλύθηκαν με τη σύνδεση της έκφρασης NEDD9 με την εξέλιξη ανθρώπινου τραχηλικού καρκινώματος. Βρήκαμε ότι NEDD9 πρωτεΐνη υπερεκφράζεται στους περισσότερους ιστούς καρκινώματος του τραχήλου αλλά κακώς εκφράζεται σε φυσιολογικό τραχηλικό επιθήλιο ιστούς (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, NEDD9 πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε μεταστατικούς λεμφαδένες (Σχήμα 1Β). Επιπλέον, NEDD9 υπερέκφραση συσχετίστηκε με ιστολογική βαθμό, μετάσταση, και το στάδιο της νόσου (σχήμα 1Γ). Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, NEDD9 το mRNA υπερεκφράζεται σε τέσσερα κοινά τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές (SiHa, HeLa, C33A και CaSki) ανεξάρτητα από HPV-θετικών ή -αρνητική αλλά σχετικά φτωχά εκφράζεται σε ανθρώπινα γραμμή κερατινοκυττάρων HaCaT και ανθρώπινων εμβρυϊκών νεφρικών κυττάρων γραμμή ΗΕΚ293. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι NEDD9 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται στην αυχενική καρκινικές κυτταρικές γραμμές, παρόμοια με εκείνα του qPCR. Ανάλυση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι η πρωτεΐνη του NEDD9 υπερεκφράστηκε σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές και διανέμονται κυρίως σε κυτόπλασμα (Σχήμα 1 Ε).

(Α) Ανοσοϊστοχημική χρώση NEDD9 σε πλακώδες καρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας (SCC), αδενοκαρκίνωμα του ο τράχηλος (AC) και φυσιολογικό ιστό του τραχήλου. Αρχική μεγέθυνση, × 400. (Β) Ανοσοϊστοχημική χρώση των NEDD9 στο μεταστατικό αριστερή εξωτερική λαγόνια λεμφαδένες της SCC και μεταστατικών δεξιά επιπωματικό λεμφαδένες της AC. Αρχική μεγέθυνση, × 400. (Γ) Η στατιστική ανάλυση έδειξε NEDD9 υπερέκφραση συσχετίστηκε με το στάδιο της νόσου, ιστολογική διαβάθμιση και μετάσταση. (D) Έκφραση NEDD9 mRNA και πρωτεΐνης σε αρκετές κυτταρικές σειρές εκτιμήθηκε με ποσοτική PCR και ανάλυση στυπώματος Western. (Ε) NEDD9 (κόκκινο) εντοπισμός και η έκφραση αξιολογήθηκαν με ανοσοφθορισμού ανάλυση σε τραχηλικό καρκίνωμα SiHa, CaSki, HeLa, κύτταρα C33A και ανθρώπινων HaCaT κερατινοκύτταρα. Τα κύτταρα αντι-χρωματίστηκαν με Hoechest33342 (μπλε) και εμφανίσθηκε σε 60 × μεγέθυνση.

Η

Η αλλαγμένη έκφραση NEDD9 επιρροές της μετανάστευσης, και την εισβολή του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα

Για τον προσδιορισμό της λειτουργίας NEDD9 στην του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, που γκρέμισε NEDD9 σε κύτταρα SiHa και HeLa χρησιμοποιώντας ένα ειδικό siRNA (S: 5 ‘GAG ACA CCA UCU ACC Α.Ε.Ε. U [dT] [dT] 3’, AS: 5 ‘ACU UGG UAG Αύγουστο GUG UCU C [ ,,,0],dT] [dT] 3 ‘), η οποία επιλέχθηκε από τρεις υποψηφίους με qPCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, 2Β και 2C, το siRNA έδειξε ισχυρή επιδράσεις παρεμβολών κατά NEDD9 mRNA και πρωτεΐνης σε καρκίνο του τραχήλου SiHa και HeLa κύτταρα. Περαιτέρω, προσπαθήσαμε να αποφασίσει εάν η μετανάστευση και εισβολή του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα θα είναι μικρότερη από την μείωση της έκφρασης NEDD9 μέσω φακοϊό διεξάγεται shRNA. Τα αποτελέσματα της επικοινωνούντα αναλύσεις έδειξαν ότι NEDD9 shRNA περικόψει επεμβατική και μεταναστευτικών ικανότητα του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας SiHa και HeLa κύτταρα (Εικόνα 2D και 2Ε). Επιπλέον, τα αποτελέσματα των δοκιμασιών για επούλωση της πληγής έδειξαν κλείσιμο σημαντικά αργή πληγή στο NEDD9 shRNA αγωγή έναντι του ελέγχου SiHa και HeLa κύτταρα σε 24 ώρες μετά το μηδέν (Σχήμα 2F, 2G και 2Η). Έχουμε καθορίζεται περαιτέρω τις επιπτώσεις της αυξημένης NEDD9 για τη μετανάστευση κυττάρων και εισβολή. Lentivirus φορείς χρησιμοποιήθηκαν για να υπερεκφράζουν NEDD9 σε HaCaT κύτταρα (Σχήμα 3Α). ΤΟΡβ (5ng /ml) αύξησε επίσης την έκφραση της NEDD9 σε κύτταρα HaCaT (Σχήμα 3Β). Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας Transwell έδειξαν ότι η εξωγενής υπερέκφραση του NEDD9 οδήγησε σε αυξημένη εισβολή κυττάρων και μετανάστευση σε κύτταρα HaCaT χωρίς ΤΟΡβ διέγερση (Σχήμα 3C και 3D).

NEDD9 χτυπήθηκε κάτω από siRNAs ή Τα siRNAs σε καρκίνωμα του τραχήλου SiHa και κύτταρα HeLa. (Α) Τα αποτελέσματα παρεμβολής επιβεβαιώθηκαν με ποσοτική PCR σε κύτταρα SiHa και HeLa. Η έκφραση του NEDD9 εξετάστηκε με στύπωση Western σε SiHa (Β) και κύτταρα HeLa (C). Τα κύτταρα μολύνθηκαν με φορείς λεντοϊού που κωδικοποιεί shRNA έναντι NEDD9. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας Transwell έδειξε ότι λεντοϊού παράδοση shRNA στόχευσης NEDD9 οδήγησε σε μειωμένη εισβολή κυττάρων (D) και τη μετανάστευση (Ε) σε κύτταρα SiHa και HeLa. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης επούλωση της πληγής Scratch επαληθεύεται περαιτέρω ότι φίμωση NEDD9 οδήγησε σε μειωμένη κυτταρική μετανάστευση (F, G και H). μπαρ κλίμακα, 100 μm. *

P

& lt? 0.05.

Η

Lentivirus φορείς χρησιμοποιήθηκαν για να υπερεκφράζουν NEDD9 σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα HaCaT (Α). ΤΟΡβ (5ng /ml) αύξησε επίσης την έκφραση του NEDD9 σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα HaCaT (Β). Αποτελέσματα της δοκιμασίας Transwell έδειξε ότι λεντοϊού παράδοση NEDD9 οδήγησε σε αυξημένη εισβολή κυττάρων (C) και τη μετανάστευση (D) σε κύτταρα HaCaT χωρίς ΤΟΡβ διέγερση. μπαρ κλίμακα, 100 μm.

Η

Αμοιβαία ρύθμιση μεταξύ NEDD9 και ΡΑΚ ή SRC

Επιπλέον, οι εκφράσεις της FAK και SRC, δύο NEDD9 πρωτεΐνες που συνδέονται [4], σε μολυσμένα SiHa και τα κύτταρα HeLa προσδιορίσθηκαν με στύπωση Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι εκφράσεις του φωσφο-ΡΑΚ (Tyr397) και φωσφο-Src (Tyr416), αλλά όχι συνολική FAK και ολικής πρωτεΐνης SRC, μειώθηκαν σημαντικά μετά knockdown του NEDD9 (Σχήμα 4Α και 4Β). Σε πειράματα υπερέκφρασης, τυροσίνη-φωσφορυλιωμένη FAK και SRC, αντί συνολικού FAK και συνολική SRC, ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω ενώ NEDD9 ήταν εξωγενώς υπερεκφράζεται σε κύτταρα HaCaT (Σχήμα 4C και 4D). Επιπλέον, ανοσοκαταβύθιση χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί εάν FAK αναστολέα PF-228 (Sigma, 10 μΜ) ή αναστολέα SRC ΡΡ2 (Sigma, 10 μΜ) ρυθμίζεται η έκφραση του NEDD9. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του τυροσίνης-φωσφορυλιωμένη NEDD9, αντί συνολικού NEDD9, μειώθηκε σημαντικά, ενώ FAK ή SRC καταστάλθηκε από PF-228 ή ΡΡ2 σε SiHa και ΤGFβ-διέγερσης κυττάρων HaCaT (Σχήμα 4Ε και 4F). Επιπλέον, PF-228 (10 μΜ) ή ΡΡ2 (10 μΜ) μείωσε τη φωσφορυλίωση του ΡΑΚ ή SRC σε ΤGFβ-διέγερση κυττάρων HaCaT (Σχήμα S1). PF-228 ή ΔΜΠ2 κατέστειλε την εισβολή και τη μετανάστευση των SiHa και TGFβ-τόνωση κύτταρα HaCaT (Σχήμα S2). Παρομοίως, τα αποτελέσματα της δοκιμασίας Transwell έδειξαν ότι και οι δύο αναστολείς κατέστειλε κύτταρο εισβολή και τη μετανάστευση αυξήθηκε από εξωγενή υπερέκφραση NEDD9 σε κύτταρα HaCaT (Σχήμα 4G).

(Α και Β) Έκφραση NEDD9 σχετιζόμενη ογκοπρωτεΐνες, FAK και SRC, εξετάστηκε με στύπωση Western. Τυροσίνης-φωσφορυλιωμένη FAK και SRC, παρά FAK και SRC, ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται ενώ NEDD9 σίγησε στα κύτταρα SiHa και HeLa. (Γ και Δ) Επιπλέον, τυροσίνη-φωσφορυλιωμένη FAK και SRC ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω ενώ NEDD9 ήταν εξωγενώς υπερεκφράζεται σε κύτταρα HaCaT. (Ε και F) Τα αποτελέσματα της ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι η τυροσίνη-φωσφορυλιωμένη NEDD9, αντί NEDD9, ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω ενώ FAK ή SRC καταστάλθηκε από FAK αναστολέα PF-228 ή αναστολέα SRC ΡΡ2 σε SiHa και ΤΟΡβ διέγερσης κυττάρων HaCaT. (G) Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας Transwell έδειξε ότι η αυξημένη εισβολή των κυττάρων και τη μετανάστευση από εξωγενείς υπερέκφραση NEDD9 κατεστάλησαν από ΡΑΚ αναστολέας PF-228 ή SRC αναστολέας ΡΡ2 στα κύτταρα HaCaT. Ράβδος κλίμακας, 100 μm.

Η

NEDD9 ρυθμίζει βιμεντίνης και Ε-καδερίνης σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα

βιμεντίνης και Ε-καδερίνης ήταν σημαντικές πρωτεΐνες σε σχέση με τα κινητά εισβολή και τη μετανάστευση. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι βιμεντίνης ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω και Ε-καδερίνης ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω ενώ NEDD9 καταστάλθηκε από shRNA σε κύτταρα SiHa και HeLa (Σχήμα 5Α). Επιπλέον, βιμεντίνης ρυθμίζεται αυξητικά και Ε-καδερίνης ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω ενώ NEDD9 υπερεκφράστηκε σε κύτταρα HaCaT (Σχήμα 5Β). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι βιμεντίνης και Ε-καδερίνης εμπλέκονται στην ρυθμιστικό ρόλο του NEDD9 στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας Transwell έδειξε ότι η μειωμένη κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση που προκαλείται από shRNA ειδικά για NEDD9 αυξήθηκαν με επιμόλυνση του siRNA έναντι Ε-καδερίνης (Εικόνα 5C και 5D). Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν επίσης ότι E-cadherin ήταν μια κατασταλτική ρυθμιστικών πρωτεϊνών σε NEDD9 προώθηση της μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, το κάτω-ρυθμιζόμενη Ε-καδερίνης μέσω υπερέκφραση NEDD9 σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω λόγω της PF-228 ή ΡΡ2 σε κύτταρα HaCaT, εν τω μεταξύ, ο επάνω ρυθμισμένη έκφραση βιμεντίνης ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω (Σχήμα 5Ε). Στο αντίστροφο πείραμα, ούτε τυροσίνη-φωσφορυλιωμένη ούτε σύνολο NEDD9 μεταβλήθηκε σημαντικά, ενώ Ε-καδερίνης καταστάλθηκε από siRNA σε κύτταρα HaCaT (Σχήμα 5F).

έκφραση δεικτών EMT, βιμεντίνη και Ε-καδερίνη, εξετάστηκε με κηλίδωση Western. (Α) βιμεντίνης ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω και Ε-καδερίνης ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω ενώ NEDD9 σίγησε σε κύτταρα SiHa και HeLa. (Β) βιμεντίνης ρυθμίζεται αυξητικά και Ε-καδερίνης ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω ενώ NEDD9 υπερεκφράστηκε σε κύτταρα HaCaT. Αποτελέσματα της δοκιμασίας Transwell έδειξε ότι η μειωμένη κυτταρική εισβολή (C) και τη μετανάστευση (D) με shRNA του NEDD9 αυξήθηκαν κατά siRNA έναντι Ε-καδερίνης σε κύτταρα SiHa και HeLa. μπαρ κλίμακα, 100 μm. (Ε) Ε-καδερίνης ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω και βιμεντίνης ήταν κάτω ρυθμισμένα δυνάμει της FAK αναστολέα PF-228 ή αναστολέα SRC ΡΡ2 σε κύτταρα HaCaT με εξωγενή NEDD9. (F) Τα αποτελέσματα της ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι η φωσφορυλιωμένη στην τυροσίνη NEDD9 και συνολική NEDD9 δεν ρυθμίζονται σημαντικά, ενώ E-cadherin κατεστάλη από siRNA σε κύτταρα HaCaT.

Η

Ε6 /Ε7 ογκοπρωτεΐνη δεν ρυθμίζει NEDD9 σε τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα

είναι γνωστό ότι ο HPV Ε6 και Ε7 γονίδια είναι βασικά ογκογονίδια στην έναρξη της ανάπτυξης του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, αλλά το αποτέλεσμα των Ε6 και Ε7 τα γονίδια ξενιστές που συνδέονται με την εξέλιξη του καρκίνου παραμένει αβέβαιη. Έτσι, παρατηρείται πιθανή σχέση μεταξύ Ε6 /Ε7 και NEDD9 του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, η στέρηση του HPV16 Ε6 /Ε7 με siRNA δεν αλλάζει την έκφραση των NEDD9 σε HPV16-θετικά SiHa και CaSki κύτταρα (Εικόνα 6Α και 6Β), αντίστροφα, προς τα κάτω ρύθμιση των NEDD9 δεν επηρέασε την έκφραση των Ε6 /Ε7 (Σχήμα 6C και 6D). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι NEDD9 είναι αργά μοριακό γεγονός που συμμετέχει κυρίως στην εξέλιξη ή την μετάσταση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

(Α και Β) Το αποτέλεσμα της qPCR και κηλίδες Western έδειξαν ότι η στέρηση των Ε6 /Ε7 με siRNA didn ‘t να αλλάξει την έκφραση των NEDD9 σε HPV-θετικά SiHa και CaSki κύτταρα. (Γ και Δ) Παρέμβαση της NEDD9 δεν επηρέασε την έκφραση των Ε6 /Ε7 στα κύτταρα SiHa και CaSki.

Η

Συζήτηση

Αν και NEDD9 αρχικά αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως μία από τις νέες γονίδια που εκφράζονται από νευρικά πρόδρομα κύτταρα αλλά ρυθμίζεται προς τα κάτω εξής εμβρυϊκής ανάπτυξης [3], αρκετές πρόσφατες μελέτες βρέθηκε ότι η υπερέκφραση NEDD9, ως ογκογόνο ανωμαλίες σηματοδότησης, συνδέθηκε με τη μετάσταση καρκίνου στον καρκίνο του μαστού [6,20,21], γλοιοβλάστωμα [9] , καρκίνωμα μελάνωμα [10] και κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων (HNSCC) [13], καθώς επίσης και συνδέονται με αντοχή φαρμάκου στο γαστρεντερικό στρωματικό όγκο (GIST) [22]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι NEDD9 ρυθμίζει TGFβ μονοπάτι στον καρκίνο του μαστού [23,24] και ηπατοκυτταρικό καρκίνο [25] και σηματοδότηση Wnt σε καρκίνο του παχέος εντέρου [26]. Επιπλέον, ΤΟΡβ είναι ένας ισχυρός αναστολέας του κυτταρικού κύκλου σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα κύτταρα HaCaT, όμως έχει αποδειχθεί επίσης για την προώθηση εισβολή και τη μετανάστευση σε κύτταρα HaCaT [27,28]. Έτσι χρησιμοποιήσαμε κύτταρα HaCaT ως μοντέλο για τη μελέτη επαγόμενης μετανάστευσης φαινότυπο /εισβολή.

Θα είχε αποδειχθεί από την ανοσοϊστοχημική ανάλυση, ότι NEDD9 εκφράστηκε σε ανθρώπινο βρογχικού επιθηλίου [29], τα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα στη ρευματοειδή αρθρίτιδα αρθρικό υμένα [30 ], εγκεφαλικός φλοιός αρουραίου και τον ιππόκαμπο νευρώνες [31], τα ανθρώπινα σπίλοι και μελάνωμα [10], ποντικού εμβρυϊκών εγκεφαλικών και σωλήνας κορμό νευρικών [32], τα ανθρώπινα όψιμη έναρξη της νόσου του Alzheimer [33], το ποντίκι και ρεβίθια εμβρυϊκών νευρική ακρολοφία [34] , ανθρώπινο καρκίνωμα κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων (HNSCC) [13]. Επιπλέον, ανοσοϊστοχημική ανάλυση αποκάλυψε επίσης ότι NEDD9 υπερέκφραση συσχετίζεται με HNSCC και την εξέλιξη του μελανώματος [10,13]. Ο καρκίνος του τραχήλου διαθέτει ένα κλινικό χαρακτηριστικό ότι η μετάσταση σε λεμφαδένα συνήθως συμβαίνει σε πρώιμο στάδιο και παρουσιάζει κακή πρόγνωση. Έτσι, ανιχνεύθηκε και συγκρίθηκε η έκφραση NEDD9 με ανοσοϊστοχημική ανάλυση σε 67 καρκίνο του τραχήλου και του τραχήλου της μήτρας 22 φυσιολογικούς ιστούς, καθώς και του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές γραμμές και γραμμή κερατινοκυττάρων μη-όγκου. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι NEDD9 πρωτεΐνη υπερεκφράζεται στους περισσότερους ιστούς και τα κύτταρα του τραχήλου της μήτρας καρκίνωμα σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς επιθήλιο και κερατινοκύτταρα μη-όγκου. Περαιτέρω, βρήκαμε ότι NEDD9 υπερέκφραση συσχετίστηκε με μετάσταση λεμφαδένα, ιστολογική διαβάθμιση, και FIGO στάδιο των ασθενών καρκινώματος του τραχήλου. Τα αποτελέσματά μας ήταν παρόμοια με εκείνα που αναφέρθηκαν από Lucas JT, Jr. et al [13] σε HNSCC και από τους Kim Μ κ.ά. [10] σε μελάνωμα και υποδηλώνουν ότι NEDD9 υπερέκφραση μπορεί να περιλαμβάνει στην πρόοδο και μετάσταση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

NEDD9 πρωτεΐνη διατηρεί έναν τομέα ΝΗ2-τερματική Src ομολογίας 3 (SH3), που συνδέεται με την πρωτεΐνη που περιέχει μοτίβα πολυπρολίνη όπως FAK. ΡΑΚ είναι ένα από τα πιο σημαντικά συνδεδεμένες πρωτεΐνες του NEDD9 ειδικά στο εστιακό προσκόλληση [4]. Natarajan Μ et al [9] Θεωρείται ότι NEDD9 ενήργησε ως ειδική κατάντη δράστες της FAK που προωθείται μετανάστευση γλοιοβλαστώματος κυττάρων και εισβολή. Βρήκαμε στη μελέτη ότι NEDD9 και FAK ομοίως διανέμονται σε κυτταρόπλασμα του τραχήλου της μήτρας κυττάρων καρκινώματος SiHa HPV16-θετικά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), υποδεικνύοντας υπάρχει ίσως είναι μερικές ειδικές σχέσεις μεταξύ NEDD9 και FAK. Παρεμβολή RNA (RNAi) είναι ένα ισχυρό εργαλείο για τη φίμωση συγκεκριμένων γονιδίων. Αρκετές μελέτες [9,10,14,25,34-38] έχουν δείξει ότι η ειδική στόχευση siRNAs mRNA του γονιδίου NEDD9 είναι σε θέση να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση του NEDD9. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε RNAi ως εργαλείο για τη διερεύνηση του ρόλου της NEDD9 στην εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Επιπλέον, μια lentivirus φορέας μεταφοράς γονιδίου χρησιμοποιήθηκε για να υπερεκφράζουν εξωγενώς NEDD9 στη μελέτη. Στα πειράματά μας, siRNAs που στοχεύουν γονίδιο NEDD9 ανέστειλε αποτελεσματικά τόσο mRNA και πρωτεΐνης έκφραση του NEDD9. FAK και SRC είχαν ενοχοποιηθεί ως σημαντικούς στόχους της NEDD9 και ήταν φωσφορυλιωμένη και ενεργοποιούνται αμοιβαία, το οποίο θεωρείται ως η «βασική διαδικασία ρύθμισης» της NEDD9 [7]. Στην πραγματικότητα, οι λειτουργίες των πρωτεϊνών FAK και SRC εξαρτώνται από φωσφορυλίωση τυροσίνης τους σε ορισμένες ειδικές υπολείμματα αμινοξέων στις πρωτεΐνες (για παράδειγμα, Tyr416 του SRC και Tyr397 του ΡΑΚ). Έτσι, εντοπίστηκε φωσφορυλίωση τυροσίνης του FAK και SRC πρωτεΐνη μετά από ρύθμιση προς τα κάτω ή προς τα πάνω ρύθμιση NEDD9 και διαπίστωσε ότι αποσιώπηση της NEDD9 οδήγησε σε αποφωσφορυλίωση τυροσίνης, όχι μειωμένη έκφραση των δύο FAK και SRC. Είναι ενδιαφέρον ότι, η υπερέκφραση του NEDD9 οδήγησε σε φωσφορυλίωση τυροσίνης του FAK και SRC. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης τυροσίνης φωσφορυλίωση και όχι έκφραση του NEDD9 ανεστάλη ενώ η τυροσίνη-φωσφορυλίωση της FAK ή SRC κατεστάλη με εκλεκτικούς αναστολείς όπως PF-228 και ΡΡ2. Πολλές ομάδες έχουν βρει NEDD9 είναι μεταγενέστερος μόριο της FAK και SRC που προωθούν τη μετανάστευση και τη σηματοδότηση εισβολή που σχετίζονται με [39,40]. Ωστόσο, αρκετές μελέτες έχουν δείξει πρόσφατα ότι NEDD9 μάλλον ενήργησε ως ανάντη σήμα της FAK και της SRC [6,41]. Επίμονα μειωμένη FAK [6] και SRC [41] ενεργοποίησης δείχθηκε σε κύτταρα που προέρχονται από το στέλεχος NEDD9 νοκ-άουτ. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι μπορεί να υπάρξει μια θετική βρόχος ανάδρασης της φωσφορυλίωσης τυροσίνης μεταξύ NEDD9 και FAK ή SRC. Ως εκ τούτου, η φωσφορυλίωση της τυροσίνης ήταν συνεχής ενισχυθεί μέσω της λεγόμενης «διαδικασίας ρύθμισης πυρήνα» και τελικά σχηματίζουν τα σήματα της εισβολής και της μετάστασης.

Από την αρχική λειτουργική ανάλυση του το 1996 [4,5], NEDD9 συνδέθηκε με τη μετανάστευση , εισβολή, και μετάσταση σε διαφορετικές μελέτες. Law et al. ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά NEDD9 μπορεί να ρυθμίσει κυτταρική πόλωση [4], η οποία ήταν ένα απαραίτητο βήμα στη διαδικασία της κυτταρικής μετανάστευσης. Η μετανάστευση των κυττάρων είναι η βάση της εισβολής καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση. Μέχρι τώρα, NEDD9 βρέθηκε να συμμετέχει στη μετάσταση του καρκίνου σε γλοιοβλάστωμα [9], το μελάνωμα [10], και του καρκίνου του μαστού. Επί του παρόντος, πιστεύεται ότι NEDD9 πρωτεΐνη συνδέεται με τη μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [7,42]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι NEDD9 πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε τραχηλικό καρκινικούς ιστούς με μετάσταση. Επιπλέον, αναστολή της έκφρασης NEDD9 με RNAi εξασθενημένα μετανάστευση και εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων. Τα κύτταρα που υποβάλλονται σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) χάνουν επιθηλιακή μορφολογία τους και να αποκτήσουν ένα κινητικό φαινότυπο, η οποία διαδραματίζει έναν βασικό ρόλο στην εισβολή καρκίνου και μετάσταση [43]. Βιμεντίνης και Ε-καδερίνης ήταν σημαντικά βιοδείκτες της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ). Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι shRNA έναντι NEDD9 μειωμένη έκφραση του βιμεντίνης και αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και NEDD9 υπερέκφραση ρυθμίζεται αυξητικά βιμεντίνης και κάτω-ρυθμιζόμενες E-cadherin, η οποία είναι παρόμοια με εκείνα που αναφέρθηκαν από Tikhmyanova N [21]. Επιπλέον, κάτω-ρυθμιζόμενη Ε-καδερίνης μέσω υπερέκφραση NEDD9 σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω λόγω της αναστολέας της FAK ή SRC. Ούτε τυροσίνης-φωσφορυλιωμένη ούτε συνολικού NEDD9 σημαντικά ρυθμίζεται ενώ E-cadherin κατεστάλη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η υπερέκφραση NEDD9 προάγει τη μετανάστευση και την εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων πιθανώς μέσω, τουλάχιστον εν μέρει, επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) οδό. E-cadherin είναι μεταγενέστερος πρωτεΐνη NEDD9 και μπορεί να είναι ένα βασικό διαμορφωτής του NEDD9 μεσολάβηση μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή.

Είναι γνωστό ότι ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) είναι ο πιο σημαντικός αιτιολογικός παράγοντας στην αυχενική του καρκίνου [44]. Η μόλυνση με HPV υψηλού κινδύνου (HR-HPV), ιδιαίτερα τους τύπους HPV 16 και 18, είναι αιτιακή σχέση με την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Πολυάριθμες αναφορές έχουν αποδείξει ότι HPV υψηλού κινδύνου (HR-HPV) στελέχη ιδιαίτερα τους τύπους HPV 16 και 18 είναι ογκογόνοι, η οποία εξαρτάται από τις ιικές Ε6 και Ε7 ογκογονίδια που στοχεύουν p53 και pRb πρωτεΐνες καταστολής όγκου [45]. Δεδομένης της σημασίας της Ε6 /Ε7, υποθέσαμε ότι υπήρχαν κάποιοι δεσμοί μεταξύ Ε6 /Ε7 και NEDD9 στην αρχή της μελέτης. Ωστόσο, δεν είχαμε δημιουργήσει μια σύνδεση μεταξύ των Ε6 /Ε7 και NEDD9.