Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο ρόλος των ουδετερόφιλων στη βιολογία του όγκου είναι σε μεγάλο βαθμό άλυτο. Πρόσφατα, ανεξάρτητες μελέτες έδειξαν είτε ουδετερόφιλων εξωκυττάριο παγίδες (δίχτυα) ή παράγοντα ιστού (TF) συμμετοχή στη βιολογία του καρκίνου και των συναφών θρόμβωση. Ωστόσο, μεμονωμένοι ή σε συνδυασμό ο ρόλος τους στην κολονικό αδενοκαρκίνωμα είναι ακόμα ανεξερεύνητη.

Μέθοδοι

ΚΟΛΕΚΤΟΜΗ δείγματα ιστών και μεταβλητό αριθμό αποστράγγισης λεμφαδένες ελήφθησαν από δέκα ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου. NETs εναπόθεση και η παρουσία των ουδετερόφιλων καθώς και έκφραση TF εξετάστηκαν με ανοσοχρώση. Η επίδραση των διχτυών για ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μελετήθηκε σε

in vitro

συν-καλλιέργειες των Caco-2 κυτταρική γραμμή και οξεία μυελοειδή λευχαιμία πρωτογενή κύτταρα. Πολλαπλασιασμό και την απόπτωση /νέκρωση των καρκινικών κυττάρων αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Αποτελέσματα

TF που φέρουν NETs και ουδετερόφιλων εντοπισμός ήταν εμφανής σε τομές όγκων και των αντίστοιχων μεταστατικούς λεμφαδένες. Είναι ενδιαφέρον, διήθηση των ουδετερόφιλων και συγκέντρωση NETs μειώθηκαν σταδιακά από τη μάζα του όγκου προς το απώτατο περιθώριο. Η

in vitro

παραγομένης NETs εμποδίσει την αύξηση των καλλιεργειών καρκινικών κυττάρων από επαγωγή απόπτωσης ή /και την αναστολή του πολλαπλασιασμού.

Συμπεράσματα

Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω ο ρόλος των ουδετερόφιλων και δίχτυα στη βιολογία του καρκίνου. Προτείνουμε επίσης τη συμμετοχή τους στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Arelaki S, Arampatzioglou Α, Καμπάς Κ, Παπαγόρας C, Μιλτιάδης P, Αγγελίδου I, et al. (2016) Κλίση διείσδυση των ουδετερόφιλων Εξωκυττάρια Παγίδες με τον καρκίνο του παχέος εντέρου και αποδεικτικών στοιχείων για τη συμμετοχή τους στη όγκου Ανάπτυξης. PLoS ONE 11 (5): e0154484. doi: 10.1371 /journal.pone.0154484

Επιμέλεια: Nades Palaniyar, το Νοσοκομείο για τα άρρωστα παιδιά και το Πανεπιστήμιο του Τορόντο, Καναδάς

Ελήφθη: 1 Μαρ 2016? Αποδεκτές: 14 Απριλίου 2016? Δημοσιεύθηκε: 2 Μάη 2016

Copyright: © 2016 Arelaki et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό υποστηρίζεται από το διοικητικό συμβούλιο του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Αλεξανδρούπολης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας σε όλο τον κόσμο, με μετάσταση και του καρκίνου που σχετίζονται με θρόμβωση που περιλαμβάνει τις κύριες αιτίες θανάτου σε ασθενείς με κακοήθεια. Είναι γνωστό ότι η σχέση μεταξύ του καρκίνου και του ανοσοποιητικού συστήματος δεν περιορίζεται μόνο στην επιτήρηση ενάντια στην αυξανόμενη μονοκλωνικά διαταραχών, αλλά επίσης και έναντι καθιερωμένων κακοήθεις όγκους. Η αλληλεπίδραση μεταξύ του ανοσοποιητικού συστήματος και καρκίνος καθορίζει πολλές πτυχές της κλινικής παρουσίαση και την εξέλιξη της νόσου [1]. Ωστόσο, αν και τα ουδετερόφιλα αποτελούν γενικά το πιο σημαντικό πληθυσμό φλεγμονωδών κυττάρων, σχετικά λίγα είναι γνωστά για εμπλοκή τους σε ανθρώπινους όγκους. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι τα ουδετερόφιλα μεσολαβούν την στιχομυθία μεταξύ του καρκίνου και του ανοσοποιητικού συστήματος [2,3]. ουδετερόφιλα όγκου-διηθητικά έχουν επίσης αναφερθεί για τη διευκόλυνση της μετάστασης, κυρίως μεταβάλλοντας το μικροπεριβάλλον της μεταστατικής βλάβης [4-6]. Επιπλέον, ουδετεροφιλία έχει συσχετιστεί με μια χειρότερη πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο [7], ενώ ο ουδετερόφιλων αναλογία λεμφοκυττάρων έχει προταθεί ως προγνωστικός παράγοντας σε διάφορους τύπους καρκίνου, όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου [8].

πρόσφατα, ένας βασικός μηχανισμός των ουδετερόφιλων, των ουδετερόφιλων Εξωκυττάρια Παγίδες (δίχτυα), έχει επαναπροσδιορίσει το ρόλο τους στη βιολογία του όγκου [4-6,9-11]. Δίχτυα είναι εξωκυττάριο δομές της χρωματίνης που αποτελείται από κυτταροπλασματική, κοκκώδη και η πυρηνική συνιστώσες των ουδετερόφιλων, αρχικά περιγράφεται ως μια αντιμικροβιακή απάντηση [12,13]. Ωστόσο, υπάρχουν αύξουσες ενδείξεις για τον καίριο ρόλο των διχτυών σε μη μολυσματικές ασθένειες, όπως η θρόμβωση [14,15], αυτοάνοση [16], αυτοφλεγμονώδους [17], των καρδιαγγειακών παθήσεων [15], η ίνωση [18] και τον καρκίνο [ ,,,0],11]. Μέχρι σήμερα, έχει προταθεί ότι τα δίκτυα μπορεί να ενεργεί στο πλαίσιο της πρωτοβάθμιας προώθηση εξέλιξη του όγκου των όγκων [4,11], ενώ σε απομακρυσμένες περιοχές θα μπορούσαν να απομονώσει κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων που ευνοεί τη μετάσταση [5,6,19]. Επιπλέον, έχουν NET, έχουν εμπλακεί σε καρκίνο που σχετίζεται με θρόμβωση [9,11].

Επιπλέον, παράγοντα ιστού (TF) ο κύριος

in vivo

εμπνευστής της πήξης έχει αναφερθεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο στην βιολογία του καρκίνου [20,21]). άξονας TF-θρομβίνης, εκτός από τη συμμετοχή του σε καρκίνο που σχετίζεται με θρόμβωση, έχει υποδειχθεί ότι έχει μια πολύ ισχυρή αγγειογενετική ιδιότητα μέσω σηματοδότηση των πρωτεασών σερίνης της μέσω PARs. Έτσι, αυτή η οδός έχει ενοχοποιηθεί σε νεοαγγειογένεσης και μετάσταση του καρκίνου [22]. Μεταξύ κύτταρα μπορούν να εκφράζουν TF, τα καρκινικά κύτταρα και ουδετερόφιλα αποτελούν πηγή αυτής της προπηκτικής και προφλεγμονωδών παράγοντα. Ωστόσο, η συνδυασμένη ρόλο της TF και NET στον τομέα της βιολογίας του καρκίνου δεν υπήρξε ποτέ στο παρελθόν αντιμετωπιστεί.

Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η παρουσία των διχτυών σε συμπαγείς όγκους και μεταστατικούς λεμφαδένες των ασθενών αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου και του

στο vitro

επιδράσεις σε καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου και πρωτογενή λευχαιμικά κύτταρα. Έχουμε αποδείξει για πρώτη φορά ότι τα δίκτυα είναι παρόντες σε χειρουργικά δείγματα αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου και των αντίστοιχων μεταστατικούς λεμφαδένες και είναι επίσης διακοσμημένα με TF. Μπορούμε επίσης να αναφέρουμε ότι NET, μπορεί να περιορίσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vitro

από επαγωγή απόπτωσης ή /και την αναστολή του πολλαπλασιασμού

Υλικά & amp.? Μέθοδοι

Για τη μελέτη αυτή, εξετάστηκαν τα Ανθρώπινα δείγματα

σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένο σε παραφίνη χειρουργικά δείγματα ιστών από 10 ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε κολεκτομή για αδενοκαρκίνωμα, συμπεριλαμβανομένων των αποστράγγισης λεμφαδένες. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών φαίνεται στον πίνακα S1. Ελήφθησαν τομές διαδοχικά ανά ένα cm από το κέντρο της μάζας του όγκου μέχρι το χειρουργικό περιθώριο από κάθε δείγμα του αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου. Επιπλέον, εξετάστηκαν τόσο μεταστατικών και μη-μεταστατικών αταξινόμητους λεμφαδένες.

Επιπλέον, 10 υγιείς δότες εγγράφηκαν για δείγματα αίματος προκειμένου να απομονώσουν τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα (PMNs).

Γραπτή συγκατάθεση που χορηγούνται από όλα τα άτομα που εμπλέκονται σε αυτή τη μελέτη. Ο σχεδιασμός πρωτόκολλο της μελέτης ήταν, σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Δεοντολογίας Αναθεώρηση του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Αλεξανδρούπολης.

Η ανοσοϊστοχημεία /ανοσοφθορισμού

Τμήματα αποπαραφινοποιήθηκαν και ανοσοκυτταροχημική χρώση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα LSAB /HRP κιτ (ϋΑΚΟ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Η ουδετερόφιλη ελαστάση ανιχνεύθηκε με IgG κουνελιού πολυκλωνικό αντι ελαστάσης ουδετερόφιλων αντίσωμα (1/50 αραίωση? Santa Cruz, CA, USA? Sc-25621). Οι τομές στη συνέχεια με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται και τοποθετημένα. Mouse IgG1 μονοκλωνικό χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Τα δείγματα έγιναν ορατά κάτω από οπτικό μικροσκόπιο (Nikon, μοντέλο Eclipse E400) και οι εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Nikon (ACT-1 το λογισμικό της Nikon).

Για ανοσοφθορισμό, τομές βάφτηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Η μη ειδική θέσεις σύνδεσης αποκλείστηκαν με 2% ορό κατσίκας σε 2% BSA-PBS. NETs βάφτηκαν με ένα κουνελιού αντι-κιτρουλλινοποιημένα ιστόνης Η3 πολυκλωνικό αντίσωμα (Abcam, UK? Ab5103), ένα αντι-ΝΕ μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Santa Cruz? Sc-55548), ένα κουνελιού αντι-ΝΕ poluclonal αντίσωμα (Santa Cruz? SC- 25621) και ένα αντι-μυελοπεροξειδάση μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Santa Cruz? sc-52707). Για την ανίχνευση TF ένα mAb IgG1-TF (Sekisui Diagnostics, Lexington, USA? 4508) χρησιμοποιήθηκε. Ένας κατσίκας αντι-κουνελιού Alexa fluor 647 αντίσωμα (Invitrogen, Carlsbad, USA? A21244) και ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-ποντικού Alexa fluor 488 αντίσωμα (Invitrogen? A11059) χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα. Ακολούθησε χρώση με DAPI, τοποθετούνται και οπτικοποιούνται σε συνεστιακή μικροσκοπία (Spinning Disk Andor Ομοεστιακή συστήματος, την Ιρλανδία Επανάσταση) σε μια PLAPON 606O /TIRFM-SP, NA 1.45 και UPLSAPO 100XO, NA 1.4 στόχοι (Όλυμπος, Αμβούργο, Γερμανία).

απομόνωση των κυττάρων

Περιφερειακά ουδετερόφιλα αίματος απομονώθηκαν από ηπαρινωμένο αίμα από υγιείς δότες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα οξείας μυελογενούς λευχαιμίας (AML) απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας Biocoll Διαχωρισμός λύση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Biochrom, Βερολίνο, DE) από δείγματα περιφερικού αίματος που προέρχονται από ασθενείς στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Αλεξανδρούπολης, Ελλάδα. AML διάγνωση έγινε σύμφωνα με τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας.

Μελέτες

καλλιέργειας κυττάρων, διέγερση και αναστολή

Caco-2 [Caco2] (ATCC

® ΗΤΒ-37

™) (κύτταρα ATCC, Manassas, USA) καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2, στους 37 ° C, σε L-γλουταμίνη Minimum Essential Medium Eagle (ΕΜΕΜ? Gibco BRL, New York, USA). κύτταρα AML καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2, στους 37 ° C, σε μυελοειδή Long-Term Μέσο Καλλιέργειας (MyeloCult

™ Η5100? Stem τεχνολογίες κυψελών, Βανκούβερ, Καναδάς). Αμφότερες Caco-2 και AML κύτταρα διεγέρθηκαν με δομές ΝΕΤ 500 ng απομονώνεται από ουδετερόφιλα σε επεξεργασία με τις προαναφερόμενες ουσίες, ή ολόκληρο ΡΜΝ προεπεξεργασία με αυτούς τους παράγοντες, για 4 ημέρες. Για ΝΕΤ αναστολή ικρίωμα, απομονωμένες ΝΕΤ δομές προ-επωάστηκαν με DNase1 (10 U /ml? Fermentas, Βίλνιους, Λιθουανία) ή ηπαρίνη (νατριούχος ηπαρίνη, 100 μg /ml? LEO Pharma A /S, Ballerup, Δανία) για 60 λεπτά . Για την αναστολή TF ένα αντι-ανθρώπινο ΤΡ mAb IgG1 ποντικού (10 μg /ml? Sekisui Diagnostics) χρησιμοποιήθηκε

Τέσσερις εικόνες λαμβάνονται τυχαία από διαφορετικές περιοχές του κάθε φρεατίου με 100 χ μεγέθυνση ανά πείραμα αναλύθηκαν.. Μέση επιφάνεια που καλύπτεται από τα κύτταρα υπολογίστηκε με Φίτζι /ImageJ [25].

NET γενιά δομή, την απομόνωση και ποσοτικοποίηση

Για να δημιουργήσετε NET, 1.5 × 10

6 ουδετερόφιλα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των έξι φρεατίων (Corning Incorporated, New York, USA) σε μέσο RPMI χαμηλού ορού (Gibco BRL) όπως περιγράφεται προηγουμένως [13] και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ορό σηψαιμία [14], που απομονώνονται από δείγματα αίματος που προέρχεται από σηπτικούς ασθενείς κατά τη Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Αλεξανδρούπολης, Ελλάδα, για 210 λεπτά. Τα ουδετερόφιλα επωάστηκαν επίσης με φορβόλη 12-μυριστικό 13-οξικό άλας (ΡΜΑ) (40 ng /ml? Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA), ένα γενικό επαγωγέας της ΝΕΤ απελευθέρωσης, για 210 λεπτά. Στη συνέχεια, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με RPMI. Επιπλέον, 1 ml RPMI προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και τα δίχτυα συλλέχθηκαν μετά από έντονη ανάδευση. Το μέσο φυγοκεντρήθηκε στα 20xg επί 5 λεπτά και τα δίχτυα συλλέχθηκαν σε υπερκείμενο φάση. Αυτές οι συγκεντρώσεις και τα χρονικά σημεία ήταν ιδανικοί για διέγερση των ουδετερόφιλων σύμφωνα με βελτιστοποίηση πειράματα. περιεχόμενο DNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Nanodrop.

πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση

Για την ανάλυση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, Caco-2 και AML κύτταρα χρωματίστηκαν με 5 (6) -καρβοξυφλουορεσκεϊνη διοξική Ν-ηλεκτριμιδυλ εστέρα (CFSE? Sigma-Aldrich) [26], CD34 APC (κλώνος 8G12? BD Biosciences, New Jersey, USA) και CD45 PerCP (κλώνος 2D1? BD Biosciences) πριν από τη διέγερση. Πειράματα και αναλύονται σε πειράματα σειρά χρονόμετρο θεωρώντας ως πατρική του πληθυσμού για τη σύγκριση των κυττάρων με την υψηλότερη ένταση CFSE, σύμφωνα με δημοσιεύματα ορόσημο [27,28].

Για την ανάλυση της απόπτωσης /νέκρωσης, Caco-2 και κύτταρα AML βάφτηκαν με ΡΙΤΟ-αννεξίνης V (BD Biosciences) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ? Sigma-Aldrich). κύτταρα AML επίσης χρωματίστηκαν με CD34 APC (κλώνος 8G12? BD Biosciences).

Ο πολλαπλασιασμός και η ανάλυση της απόπτωσης πραγματοποιήθηκαν μετά από 4 ημέρες συγκαλλιέργειας με δίχτυα σε ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD Biosciences). Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν με FlowJo V10.

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση μονόδρομης ανάλυσης της διακύμανσης (ANOVA) με τεστ Scheffe για post hoc συγκρίσεις. Ρ τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με OriginPro 8.

Αποτελέσματα

δίχτυα είναι παρούσα σε αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου παχέος εντέρου και του μεταστατικού λεμφαδένες

Δεδομένου ότι έχει πρόσφατα προταθεί ότι είναι δίχτυα εμπλέκονται στην εξέλιξης του καρκίνου και μετάσταση στον πνεύμονα ποντικών και τα μοντέλα όγκου μαστού [4,11], ερευνήσαμε αν είναι παρούσα σε αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου κόλου και των αντίστοιχων μεταστατικούς λεμφαδένες τους.

για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε ομοεστιακό μικροσκόπιο για να εξετάσει δείγματα όγκων του κολεκτομή για αδενοκαρκίνωμα από δέκα ασθενείς. Παρατηρήσαμε σημαντική απόθεση των διχτυών σε τομές όγκων, καθώς εξωκυτταρικό συνεντόπισης ελαστάσης ουδετερόφιλων με κιτρουλλινοποιημένα H3 (Εικόνα 1ai και 1 ΑΠ) και ουδετερόφιλων ελαστάση με μυελοϋπεροξειδάση (Εικ 1Aiii) σε συνεστιακή μικροσκοπία, σε αντίθεση με την απουσία τους σε φυσιολογικά τμήματα έντερο του ιδίου ασθενείς. Ειδικότερα, δίχτυα εντοπίστηκαν στην εγγύτητα των καρκινικών κυττάρων και στο στρώμα (Εικ 1 ΑΠ) και ακόμη και εντός αδενικό lumens του κύριου κολονικής μάζα. Για την επαλήθευση παρατήρηση μας σε χαμηλότερη μεγέθυνση, τα ίδια δείγματα ιστών εξετάστηκαν για ουδετεροφίλων παρουσία από ελαστάση ουδετεροφίλων ανοσοϊστοχημεία. Τα ουδετερόφιλα χρωματίστηκαν με NE έδειξε παρόμοια εντοπισμό του όγκου ως δίχτυ (Σχήμα 1Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα ουδετερόφιλα ήταν επίσης ορατή με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η & amp? Ε) χρώση χρησιμοποιώντας μεγαλύτερη μεγέθυνση (400x) (S1 σχήμα), παρόλο που ήταν πιο εύκολα ορατή από την ανοσοϊστοχημική μέθοδο

(α) τα δίχτυα οπτικοποιούνται σε. δείγματα αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου ως εξωκυττάριο δομές διακοσμημένα με ελαστάση ουδετερόφιλων και κιτρουλλινικών Η3 ή ελαστάση ουδετερόφιλων και MPO, (συνεστιακή μικροσκοπία). (Β) Αφθονία των ουδετερόφιλων παρουσία σε αδενοκαρκίνωμα κόλου καταδεικνύεται από ελαστάση ουδετεροφίλων ανοσοϊστοχημική χρώση (μικροσκοπία φωτός). Μεγεθυμένο τμήμα δείχνει τα ουδετερόφιλα βάφονται με ελαστάση ουδετερόφιλων. NETs (C) και ουδετερόφιλων (D) παρουσία σε μεταστατικούς λεμφαδένες σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου. (C) NE /cit-H3 και ΒΑ /MPO ανοσοφθορισμού συνεστιακή μικροσκοπία και ανοσοϊστοχημική χρώση (Δ) ελαστάση ουδετερόφιλων. (Α), (C) Ι-ΙΙ Πράσινο: NE, Κόκκινο: cit-H3, Μπλε: DAPI /DNA, iii Πράσινο: MPO, Κόκκινο: NE, Μπλε: DAPI /DNA (Α), (Β), (Γ ), (δ) ένας εκπρόσωπος από δέκα ανεξάρτητα πειράματα. (Α), (C) Αρχική μεγέθυνση 600x, Κλίμακα bar- 5 μm. Αρχική μεγέθυνση (Β) 400x, (D) 200x.

Η

Επιπλέον, τα δίχτυα (σχήμα 1Γ) και των ουδετερόφιλων (Σχήμα 1D) ανιχνεύθηκαν επίσης σε τμήματα των αντίστοιχων μεταστατικούς λεμφαδένες, ενώ απουσίαζαν στις υπόλοιπες κανονικές λεμφαδένες του ίδιου ασθενούς.

Μαζί, αυτά τα δεδομένα δεικνύουν ότι και οι δύο τα ουδετερόφιλα και τα δίχτυα είναι παρόντες στην περιοχή των καρκινικών κυττάρων.

τα ουδετερόφιλα και τα δίχτυα είναι μειώνονται αναλογικά με το απόσταση από την μάζα του όγκου και είναι ένας εξέχων πηγή ΤΡ σε μικροπεριβάλλον του καρκίνου

Λαμβάνοντας υπόψη την παρουσία φλεγμονής στον καρκίνο και ότι η φλεγμονή παράγει μία διαβάθμιση συγκέντρωσης των κυτοκινών και χημειοκινών [29], από την επόμενη διερευνήθηκε αν NETs ακολουθήσει ένα παρόμοιο μοτίβο διαβάθμιση συγκέντρωσης από τον πυρήνα του όγκου προς το γειτονικό υγιή ιστό.

Παρατηρήσαμε μία διαβάθμιση συσσώρευση ουδετερόφιλων σε αναλογία με την απόσταση από το κέντρο της μάζας του όγκου (Σχήμα 2Α), που καθορίζεται από ουδετερόφιλων ανοσοϊστοχημεία ελαστάση (Σχήμα 2Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, μια μικρή παρουσία ουδετερόφιλων παρατηρήθηκε ακόμη σε τομές φυσιολογικού παχέως εντέρου αμέσως δίπλα στον όγκο και σταδιακά μειώθηκε παράλληλα με την απόσταση μέχρι το σημείο της πλήρους απουσίας (Σχήμα 2Β, iv). Για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με την απόσταση βλέπε πίνακα S1. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ΝΕΤ συγκέντρωση μειώθηκε επίσης παρομοίως με ουδετερόφιλα, όπως αξιολογήθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία (Σχήμα 2C).

-Εκπρόσωπος πείραμα όπου NETs και ουδετερόφιλα μειώθηκαν κατά 3 cm από μάζα του όγκου. (Α) Μακροσκοπική φωτογραφία του δείγματος βιοψίας κολεκτομή για την επίδειξη των διαδοχικών δειγματοληψιών ενότητα. (Β) Η ουδετερόφιλη ελαστάση ανοσοϊστοχημική χρώση σε διαδοχικές δείγματα βιοψίας από το κέντρο του όγκου, μέχρι 3-4 cm από τη μάζα του όγκου σε υγιή ιστό σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου. (Γ) Η ουδετερόφιλη ελαστάση και χρώση ανοσοφθορισμού κιτρουλλινοποιημένα H3 σε διαδοχικές δείγματα βιοψίας από το κέντρο του όγκου, μέχρι 3-4 cm από τη μάζα του όγκου σε υγιή ιστό σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου. Πράσινο: NE, Κόκκινο: cit-H3, Μπλε: DAPI /DNA. (Β), (γ) έναν εκπρόσωπο από δέκα ανεξάρτητα πειράματα. Αρχική μεγέθυνση (Β) 200x, (C) 600x, Κλίμακα bar- 5μm.

Η

Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η ένταση της διείσδυσης των ουδετερόφιλων και η καθαρή παραγωγή είναι ανάλογη με την εγγύτητα προς το tumour.Since TF έχει ένα βασικό ρόλο στη βιολογία του όγκου και thromboinflammation και πρόσφατες δημοσιεύσεις καταδεικνύουν ότι, σε θρομβωτικών διαταραχών, δίχτυα εκφράζουν λειτουργικό TF [14,15,16], εξετάσαμε την παρουσία του TF στα δίχτυα βρίσκονται εντός της μάζας του όγκου και των μεταστατικών λεμφαδένων. Πράγματι, TF ανιχνεύθηκε κυρίως στα δίχτυα όπως παρατηρείται από colocalization με εξωκυτταρικό ελαστάση ουδετερόφιλων σε συνεστιακή μικροσκοπία (σχήμα 3Α και 3Β).

TF και ελαστάση ουδετερόφιλων χρώση ανοσοφθορισμού σε δείγματα κολονικού αδενοκαρκινώματος (Α) και (Β) των αντίστοιχων μεταστατικούς λεμφαδένες. Πράσινο: TF, Κόκκινο: NE, Μπλε: DAPI /DNA. Ενας εκπρόσωπος από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. Αρχικό 600x μεγέθυνση, Κλίμακα bar- 5μm.

Η

Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι τα ουδετερόφιλα και τα δίχτυα είναι σημαντικές πηγές TF στο μικροπεριβάλλον του όγκου.

NET δομές αναστέλλουν

in vitro

ανάπτυξη και επάγει την απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

με βάση τα παραπάνω ευρήματα διερευνήσαμε τον πιθανό ρόλο των διχτυών σε στερεά εξέλιξης του όγκου σε

in vitro

συν-καλλιέργειες κυττάρων Caco-2, ένα καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή. Επιπλέον, για να εξετάσει περαιτέρω το ρόλο της TF, TF-αρνητικό (PMA-επαγόμενη) και TF-ρουλεμάν (σήψη ορού που προκαλείται από) τα δίχτυα χρησιμοποιήθηκαν [14].

Τόσο PMA και σήψη NETs ορό που προκαλείται ανέστειλε

in vitro

Caco-2 αναπτύξεως σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Σχήμα 4Α και 4Β), η οποία κατέδειξε επίσης αποπτωτική μορφολογία που μοιάζει. Διάλυση των διχτυών με DNase Ι ή ηπαρίνη καταργηθεί ανασταλτική δράση τους. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης όταν είτε ΡΜΑ ή σήψη ουδετερόφιλα ορό προεπεξεργασμένων χρησιμοποιήθηκαν σε Caco-2 καλλιέργειες (Εικ S2A).

Α) May Grünwald-Giemsa χρώση Caco-2 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με ΡΜΑ ή σήψη ορό που προκαλείται από δίχτυα στη παρουσία ή απουσία αναστολέων ΝΕΤ ικριώματος. Ενας εκπρόσωπος από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. Αρχική μεγέθυνση 100Χ. (Β) Ποσοστό της επιφάνειας που καλύπτεται από τα κύτταρα. (Γ), (Δ) αννεξίνης V /PI κυτταρομετρία ροής του Caco-2 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με ΡΜΑ ή σήψη NETs ορό που προκαλείται από την παρουσία ή απουσία αναστολέων ΝΕΤ ικριώματος. (C) Εκπρόσωπος διαγράμματα διασποράς. (Β), (D) Στοιχεία από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. N.S.-δεν είναι σημαντική σε σύγκριση με τον έλεγχο, * ρ & lt? 0.05.

Η

επόμενο διερευνηθεί αν NET, αναστέλλουν την ανάπτυξη των Caco-2 μέσω απόπτωσης. Έτσι, τα κύτταρα Caco-2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις προαναφερόμενες ουσίες και κατέδειξε αυξημένα επίπεδα των αποπτωτικών και αργά αποπτωτικών κυττάρων, όπως αξιολογήθηκε με αννεξίνη V /PI κυτταρομετρία ροής (Εικόνα 4C και 4D). ΫΝάση Ι ή ηπαρίνη εξασθενημένα αυτό το αποτέλεσμα επί της απόπτωσης (Εικόνα 4C και 4D). Επιπλέον, η επαγωγή απόπτωσης από δίχτυα ήταν εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση (τα δεδομένα δεν δείχνονται) .Οι δεδομένα υποδεικνύουν ότι NET, ανεξάρτητα από το ερέθισμα NET-ροών, δρουν ως ισχυροί αναστολείς της ανάπτυξης του κόλου καρκινικών κυττάρων

in vitro από

επαγωγή απόπτωσης σε αυτά τα κύτταρα.

NET, επίσης αναστέλλουν την οξεία αύξηση κύτταρα μυελοειδούς λευχαιμίας

in vitro

Η

για να διευκρινιστεί περαιτέρω κατά πόσον αυτό το ανασταλτικό ρόλο των διχτυών στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων είναι συγκεκριμένα μόνο για παχέος εντέρου αδενοκαρκίνωμα ή συμβαίνει με άλλους τύπους κακοήθειας, καθώς, ερευνήσαμε επιδράσεις τους σε ανθρώπινα αιμοποιητικά καρκίνου. Έτσι, πραγματοποιήσαμε

in vitro

πειράματα συν-καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων AML με την παρουσία των διχτύων.

Ομοίως με Caco-2 κύτταρα, PMA ή σήψης NET, ή αντίστοιχα προ-διεγείρονται ουδετερόφιλα κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων AML (S2B Σχήμα) και προκαλούμενη απόπτωση (S2C και S2D Εικ). Επιπλέον, ΝΕΤ-κατεργασμένα κύτταρα AML επέδειξαν αξιοσημείωτη μείωση του πολλαπλασιασμού τους σε σύγκριση με τους ελέγχους, όπως αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 5Α και 5Β). Από την άλλη πλευρά, η ΝΕΤ αναστολείς χρωματίνη ικρίωμα (DNase ή ηπαρίνη) κατήργησε NETs επιπτώσεις τόσο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων AML και την απόπτωση (Σχήμα 5Α και 5Β, S2D Σχήμα).

(Α), (Β) κυτταρομετρία ροής CFSE των κυττάρων AML συν-καλλιεργήθηκαν με είτε ΡΜΑ ή σήψη ορό που προκαλείται από δίχτυα στη παρουσία ή απουσία αναστολέων ΝΕΤ ικριώματος. (Α) Εκπρόσωπος διαγράμματα διασποράς. (Β) Τα στοιχεία από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. N.S.-δεν είναι σημαντική σε σύγκριση με τον έλεγχο, * ρ & lt? 0.05.

Η

Αυτά τα δεδομένα λαμβανόμενα μαζί με τα προηγούμενα ευρήματα υποδηλώνουν ότι NET, ανεξάρτητα από το ερέθισμα, έχουν επίσης δυνητικά καθολικής ανασταλτικό ρόλο σε πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, όπως παρατηρήθηκε σε κύτταρα της οξείας μυελοειδούς λευχαιμία.

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, δείξαμε για πρώτη φορά την παρουσία των διχτυών, διακοσμημένο με TF, στα τμήματα αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου τόσο του πρωτογενούς μάζας του όγκου και των αντίστοιχων μεταστατικούς λεμφαδένες . Πρέπει επίσης να παρέχουν ενδείξεις για ένα δυνητικό ρόλο των διχτυών για τον περιορισμό

in vitro

ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω επαγωγής απόπτωσης τόσο σε καλλιέργειες Caco-2 και πρωτογενή κύτταρα AML. Επιπλέον, δίχτυα ανέστειλε

in vitro

πολλαπλασιασμό των κυττάρων AML.

Σύμφωνα με προηγούμενες εκθέσεις υποδεικνύοντας την παρουσία των διχτυών σε βιοψίες καρκίνου [6,19], δείξαμε την αφθονία των διχτυών σε αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου τμήματα τόσο στο εσωτερικό του πρωτογενούς όγκου και στο μεταστατικό λεμφαδένες, όπως εξωκυττάρια colocalizations της ελαστάσης ουδετερόφιλων με κιτρουλλινικών ιστόνης Η3 ή MPO. Επιπλέον, παρατηρήσαμε αυξημένη διείσδυση των ουδετερόφιλων σε αυτά τα τμήματα διευκρίνιση της προέλευσης αυτών των διχτυών. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα ουδετερόφιλα ΝΕΤ ροών έδειξε μια συγκεντρωτική μορφή, πιθανώς ως αποτέλεσμα των ουδετερόφιλων προσάρτηση σε ήδη διαμορφωμένο NET, και την περαιτέρω δημιουργία περισσότερων NETs. Αν και αυξημένη παρουσία των ουδετερόφιλων παρατηρήθηκε επίσης με το πρότυπο ιστοχημικές Η &? Χρώση Ε σε υψηλές μεγεθύνσεις, ανοσοϊστοχημικές μεθόδους ήταν ανώτερες για την ταυτοποίηση των διηθητικών ουδετερόφιλων στον ιστό. Επιπλέον, παρατηρήσαμε μια σταδιακή μείωση της διήθησης των ουδετερόφιλων και ΝΕΤ συγκέντρωση από τον πυρήνα του όγκου έναντι των παρακείμενων ιστών, ενώ, πιο απομακρυσμένο τμήματα μέσα στο κόλον μη εμπλεκόμενο, ουδετερόφιλα και τα δίχτυα ήταν τελείως απούσα. Προφανώς, αυτό αντανακλά μια κλίση της φλεγμονής που προέρχεται από την νεοπλαστική βλάβη και την εξάπλωση στους περιβάλλοντες ιστούς. Από ανοσοϊστοχημική χρώση παρέχει πιο ορατά αποτελέσματα όσον αφορά τη διείσδυση των ουδετερόφιλων και σε συνδυασμό με την απουσία των διχτυών και ουδετερόφιλων σε μια ορισμένη απόσταση από τον όγκο, αυτή η απλή μέθοδος θα μπορούσε να βοηθήσει για να καθορίσουν μια κατάλληλη χειρουργική εκτομή, μαζί με το πρότυπο παθολογική εξέταση των χειρουργικών περιθωρίων εκτομής.

Παρατηρήσαμε ότι είναι δίχτυα τόσο στον πρωτογενή μάζα όγκου και των μεταστατικών λεμφαδένων διακοσμημένα με TF, το κύριο

in vivo

εμπνευστής της πήξης και επίσης μια σημαντική αγγειογενετική παράγοντα. TF έχει αποδειχθεί από την ομάδα μας για να εμφανιστεί σε λειτουργική μορφή στα δίχτυα [14,15]. Αυτό το πολύπλευρο ρόλο του TF σε συνδυασμό με την παρουσία της στα δίχτυα μέσα σε πρωτογενείς και μεταστατικούς κακοήθεις αλλοιώσεις μπορεί να έχει σημαντικές επιπτώσεις για τη βιολογία του όγκου τόσο τοπικά όσο και συστηματικά. Σε τοπικό επίπεδο, η έκφραση TF εντός του όγκου μπορεί να είναι το κλειδί για την θρόμβωση ενδοογκική και νέκρωση συχνά παρατηρείται σε βιοψίες. Από την άλλη πλευρά, μπορεί να υποστεί TF τοπική ανάπτυξη του όγκου με την προώθηση νεοαγγειογένεσης η οποία είναι απαραίτητη για τη μεταβολική υποστήριξη των υψηλά δραστικών κακοήθη κύτταρα. Σε ένα συστημικό επίπεδο, δίχτυα που σχετίζονται με όγκους μπορεί να είναι μία σημαντική πηγή δραστικών TF που μπορεί να αλλάξει το προθρομβωτικών /αντιθρομβωτική ισορροπία του σώματος υπέρ της θρόμβωσης. Πράγματι, η θρόμβωση είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου σε ασθενείς με καρκίνο και απρόβλεπτες θρόμβωση περιστασιακά μια πρώιμη εκδήλωση ενός ακόμη αδιάγνωστο καρκίνο [30,31].

Η βιολογική σημασία των διχτυών του παρόντος, ωστόσο, παραμένει ασαφής. Από τη μία πλευρά, μπορεί να αντιπροσωπεύουν μια αντίδραση του περιβάλλοντος του όγκου κατά την αυξανόμενη καρκίνου. Από την άλλη πλευρά, μπορούν να διαδραματίσουν ρόλο δυσμενή στην ανάπτυξη όγκου προσφέροντας ένα ικρίωμα με μια σειρά από βιολογικά ενεργά μόρια που συνδέονται σε αυτό, το οποίο μπορεί να προωθεί κακοήθη κυτταρική επιβίωση, την ανάπτυξη και, εν τέλει, τοπική επέκταση του όγκου [4,11]. Στα πειράματά μας, τόσο δίκτυα σήψη που προκαλείται από τα οποία είναι σε θέση να εκφράσουν TF και που προκαλείται από ΡΜΑ «γενικές» δίχτυα δεν περιέχουν TF, έδειξε παρόμοια ανασταλτική δράση σε καλλιέργειες μιας κυτταρικής γραμμής καρκινώματος κόλου και πρωτογενή ανθρώπινα λευχαιμικά κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα, τα δίχτυα επήγαγε απόπτωση και στους δύο τύπους καρκινικών κυττάρων και μείωσε την πολλαπλασιασμός πρωτογενών κυττάρων AML. Αυτό το αποτέλεσμα ήταν NET-ειδική και εξαρτάται από την ακεραιότητα της ΝΕΤ χρωματίνης ικρίωμα, δεδομένου ότι η διάλυση των διχτυών με διαφορετικούς παράγοντες (DNase, ηπαρίνη) κατήργησε αυτές τις επιδράσεις. Εφαρμογή του πρωτοκόλλου CFSE σε κύτταρα Caco-2 για τον προσδιορισμό του πολλαπλασιασμού δεν παράγουν αναγνώσιμο αποτελέσματα, δεδομένου ότι δεν λειτουργούν σωστά σε μη πρωτογενείς κυτταρικές σειρές. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι NET, ανεξάρτητα από προκαλώντας ερέθισμα τους και την παρουσία του TF, δρουν ως γενικό ισχυροί αναστολείς των καρκινικών κυττάρων με την πρόκληση της απόπτωσης, ενώ επίσης μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού. Λαμβάνοντας υπόψη μια προηγούμενη έκθεση που αποδεικνύει ότι τα δίκτυα επάγουν πολλαπλασιασμό σε πρωτογενείς ανθρώπινους ινοβλάστες πνεύμονα [18] και όχι απόπτωση, περαιτέρω έρευνα απαιτείται προκειμένου να επαληθεύσει την ειδικότητα του ανασταλτικού αποτελέσματος των διχτυών σε καρκινικά κύτταρα. Μας

in vitro

ευρήματα δεν είναι σύμφωνα με πρόσφατες αναφορές που καταδεικνύουν μια φιλο-ογκογόνο δράση των διχτυών [6,9,19]. Έτσι, θα μπορούσαμε να προτείνουμε ότι τα δίκτυα μπορεί να έχει δύο αντίθετες όψεις στο περιβάλλον του καρκίνου. Το πρώτο δηλώνει την προσπάθεια των διχτυών, ως αρχική φλεγμονώδη απόκριση, για να περιορίσει τον όγκο. Το δεύτερο πρόσωπο μπορεί να αντανακλά την προσαρμογή τους στην νεοπλασματικές μικροπεριβάλλον και «συνεργασία» με καρκινικά κύτταρα. Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι διάφορες φλεγμονώδεις καταστάσεις δημιουργούν NET, διακοσμημένα με διαφορετικά συστατικά [15,17,18,32], όπως TF θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί NET, θα μπορούσε να έχει μια διττή δράση στον καρκίνο, είτε αντι-ογκογόνο ή προ-μεταστατικό. Είτε δρουν προς την κατεύθυνση ή τον άλλο τρόπο, είναι πιθανόν ένα θέμα μικροπεριβάλλον του όγκου, φλεγμονώδη αντίδραση και NET-συνδεδεμένων συστατικών.

Εν κατακλείδι, δείχνουμε εδώ για πρώτη φορά την παρουσία των διχτύων του παχέος εντέρου καρκινικό ιστό και το αντίστοιχες μεταστατικούς λεμφαδένες. Το μοτίβο της ουδετερόφιλων κοντά διανομής στην περιοχή του όγκου και των ουδετερόφιλων ειδικών ανοσοϊστοχημική μέθοδος θα μπορούσε να παρέχει ένα χρήσιμο εργαλείο για τον προσδιορισμό της κατάλληλης χειρουργικής περιθωρίου. Η ανοσοχρώση TF είναι πιο εμφανή στα δίχτυα από ό, τι στα καρκινικά κύτταρα δείχνουν ουδετερόφιλα ως σημαντική πηγή TF στο μικροπεριβάλλον του καρκίνου. Επιπλέον, η επακόλουθη thromboinflammatory και αγγειογενετική δραστηριότητα του TF μπορεί να εμπλέκεται σε θρόμβωση και μετάσταση. Αν και NETs σε

in vitro

πειράματά μας καταστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να φωτιστούν οι μηχανισμοί με τους οποίους τα ουδετερόφιλα που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου. Τα ευρήματα αυτά σε αυτό σε μεγάλο βαθμό παραμεληθεί κυτταρικού πληθυσμού στον καρκίνο παρέχει ένα εφαλτήριο για περαιτέρω έρευνα και να αναφέρει τα ουδετερόφιλα και τα δίχτυα όσο το δυνατόν θεραπευτικών στόχων.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. . Παρουσία των ουδετερόφιλων σε καρκίνο του παχέος εντέρου και μεταστατικούς λεμφαδένες

Η &? Ε χρώση αδενοκαρκινώματος κόλου δείγματα ασθενών και των αντίστοιχων μεταστατικό δείγματα λεμφαδένων. Τα βέλη καταδεικνύουν ουδετερόφιλα. Ενας εκπρόσωπος από δέκα ανεξάρτητα πειράματα. Αρχική μεγέθυνση 400x

doi:. 10.1371 /journal.pone.0154484.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. NETs αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και επάγει την απόπτωση.

(Α) μπορεί Grünwald-Giemsa χρώση Caco-2 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με PMNs προεπεξεργασία με ΡΜΑ ή ορό σήψη. Ενας εκπρόσωπος από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. Αρχική μεγέθυνση 100Χ. (Β) μπορεί Grünwald-Giemsa χρώση των κυττάρων AML συν-καλλιεργήθηκαν με είτε ΡΜΑ ή σήψη προεπεξεργασμένα ΡΜΝ, ή ΡΜΑ ή σήψη ορό που προκαλείται από δίχτυα στη παρουσία ή απουσία αναστολέων ΝΕΤ ικριώματος. Ενας εκπρόσωπος από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. Αρχική μεγέθυνση 100Χ. (C) και κυτταρομετρία ροής (D) αννεξίνης V /ΡΙ κυττάρων AML συν-καλλιεργήθηκαν με ΡΜΑ ή σήψη NETs ορό που προκαλείται από την παρουσία ή απουσία αναστολέων ΝΕΤ ικριώματος. (C) επιδεικνύει αντιπροσωπευτικά διαγράμματα διασποράς. (D) Στοιχεία από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. N.S.-δεν είναι σημαντική σε σύγκριση με τον έλεγχο, * ρ & lt? 0.05

doi:. 10.1371 /journal.pone.0154484.s002

(ΔΕΘ)

S1 πίνακα. Κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο του παχέος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0154484.s003

(DOC)