Αφηρημένο

Κακοήθη γλοιοβλάστωμα (GBM) είναι μια ιδιαίτερα επιθετική όγκου στον εγκέφαλο με μελαγχολική πρόγνωση και περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές. Γονιδιακό προφίλ των δειγμάτων GBM εντόπισε τέσσερα μοριακά υποτύπους (Προνευρικά, Νευρωνικά, Κλασική και μεσεγχυματικά), οι οποίες μπορεί να προκύψουν από διαφορετικές γλοιοβλάστωμα βλαστικών κυττάρων, όπως (GSC) πληθυσμούς. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι προσκολλημένες καλλιέργειες του GSCS αναπτύσσονται σε πλάκες λαμινίνη-επικαλυμμένες (Ad-GSCS) και καλλιέργειες σφαιροειδές GSCS (Sp-GSCS) είχαν υψηλή έκφραση δεικτών βλαστοκυττάρων (CD133, Sox2 και νεστίνη), αλλά χαμηλή έκφραση δεικτών διαφοροποίησης (βIII-τουμπουλίνης και πρωτεΐνη γλοιακή ινιδική οξύ). Στην παρούσα μελέτη, η οποία χαρακτηρίζεται GBM όγκοι που παράγονται από υποδόρια και ενδοκρανιακή ένεση του Ad-GSCS και Sp-GSCS απομονωθεί από ένα ασθενή xenoline προέλευσης. Παρόλο που σχημάτισαν όγκους με ταυτόσημα ιστολογικά χαρακτηριστικά, η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε ότι ξενομοσχευμάτων Sp-GSCS είχε μια κλασική μοριακό υπότυπο παρόμοια με εκείνη του χύδην καρκινικών κυττάρων. Σε ξενομοσχεύματα αντίθεση του Ad-GSCS εξέφρασε μεσεγχυματικά γονίδιο υπογραφή. Προσκολλημένη GSC που προέρχονται από ξενομοσχεύματα είχαν υψηλή STAT3 και έκφραση ANGPTL4, και τον εμπλουτισμό των δεικτών των βλαστικών κυττάρων, μεταγραφικά δίκτυα και pro-αγγειογενετική δείκτες χαρακτηριστικό του υποτύπου μεσεγχυματικά. Η εξέταση των κλινικών δειγμάτων από ασθενείς GBM έδειξε ότι η έκφραση της STAT3 ήταν άμεσα συσχετίζεται με την έκφραση ANGPTL4, και ότι η αυξημένη έκφραση αυτών των γονιδίων συσχετίζονται με κακή επιβίωση και την απόδοση του ασθενούς. Μια φαρμακολογική αναστολέας STAT3 καταργείται σύνδεση με τον υποκινητή ANGPTL4 STAT3 και παρουσίασαν αντικαρκινική δράση

in vivo

. Ως εκ τούτου, Ad-GSCS και Sp-GSCS παράγεται ιστολογικά πανομοιότυπα όγκους με διαφορετικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης, και ένα μονοπάτι STAT3 /ANGPTL4 προσδιορίζεται στο γλοιοβλάστωμα που μπορεί να χρησιμεύσει ως στόχος για θεραπευτική παρέμβαση

Παράθεση:. Garner JM, Ellison DW, Finkelstein D, Ganguly D, Du Ζ, Sims M, et al. (2015) Μοριακή ετερογένεια σε ένα από ασθενείς με γλοιοβλάστωμα Xenoline ρυθμίζεται από διαφορετικούς πληθυσμούς κυττάρων καρκινικά βλαστικά. PLoS ONE 10 (5): e0125838. doi: 10.1371 /journal.pone.0125838

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Ilya Ulasov, Σουηδικό Ινστιτούτο Νευροεπιστημών, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 18 Δεκεμβρίου, 2014? Αποδεκτές: 25 Μαρτίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2015

Copyright: © 2015 Garner et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα αρχεία μικροσυστοιχιών είναι διαθέσιμα από τη βάση δεδομένων GEO (αριθμός ένταξης: GSE65576).

Χρηματοδότηση: το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας CA133322 (LMP και AMD), το Υπουργείο άμυνας W81XWH-11- 1-0533 (LMP), το Αντικαρκινικό Κέντρο υποστήριξης Grant 21766 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου και του Ιδρύματος Ασίζη της Μέμφις (AMD), από το Muirhead πρόεδρος Endowment (LMP) της UTHSC και από τις αμερικανικές Λιβάνου Συρίας Associated Charities (DWE, AMD). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι όγκοι του εγκεφάλου αντιπροσωπεύουν μια σημαντική αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας του καρκίνου που σχετίζονται με τις Ηνωμένες Πολιτείες, με κακοήθη γλοιώματα είναι μεταξύ των πιο επιθετική και δύσκολη για τη θεραπεία [1]. Αν και σπάνια μεταστάσεις, κακοήθη γλοιώματα είναι τοπικά επεμβατικές, ιδιαίτερα αγγειακών όγκων με εκτεταμένες περιοχές νέκρωσης και υποξία. Η πρόγνωση για τους ασθενείς με γλοίωμα είναι κακή. Οι περισσότεροι ασθενείς με πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (GBM), η πιο σοβαρή βαθμό του γλοιώματος (WHO βαθμού IV) και την πιο κοινή υπότυπο γλοιώματος σε ενήλικες, πεθαίνουν μέσα σε 2 χρόνια από τη διάγνωση και την επιβίωση των ασθενών παρέμεινε πάρα πολύ μικρή για δεκαετίες [1]. Η χειρουργική εκτομή του GBM παραμένει η κύρια μορφή θεραπείας. Παρόν επικουρικές θεραπείες, συμπεριλαμβανομένων της χημειοθεραπείας και της ακτινοθεραπείας, παρέχει μόνο μικρή βελτίωση στην πορεία της νόσου και την έκβαση [2]. Οι ασθενείς με υποτροπιάζουσα GBM έχουν ακόμα πιο θολή πρόγνωση [3].

όγκοι γλοιοβλάστωμα είναι ένα ετερογενές μίγμα των κυτταρικών και μοριακών υποτύπους, που μπορεί να αποτελούν τη βάση της αδυναμίας των συμβατικών και στοχευμένες θεραπείες να επηρεάσει σημαντικά την έκβαση των ασθενών. Γονιδιακό προφίλ εντόπισε τέσσερα μοριακά υποτύπων του γλοιοβλαστώματος: Προνευρικά, Νευρωνικά, Κλασική και μεσεγχυματικά [4]. Ο υπότυπος Προνευρικά σχετίζεται με ανωμαλίες PDGFRA, IDH1 και TP53 μεταλλάξεις, και βρίσκεται συνήθως σε νεότερους ασθενείς. Τα περισσότερα γλοιώματα ταξινομούνται ως Προνευρικά λόγω oligodrendrocytic υπογραφή τους [5-7]. Η έκφραση του γονιδίου της Neural τάξης του γλοιώματος περισσότερο μοιάζει φυσιολογικό εγκεφαλικό ιστό, και έχει ισχυρή εμπλουτισμού για τα γονίδια διαφορικά εκφράζονται από τους νευρώνες. Το Classical γλοίωμα υπότυπος έχει αστροκυτταρικό υπογραφή? ενίσχυση EGFR παρατηρείται συνήθως σε αυτόν τον τύπο όγκου, καθώς και υψηλή έκφραση του νεστίνη (ενός νευρικά πρόδρομα και βλαστικών κυττάρων σημειωτή) και Notch και Sonic hedgehog μονοπάτια σηματοδότησης. Τα γλοιώματα έχουν ταξινομηθεί ως μεσεγχυματικά εμφανίζουν υψηλότερη έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών, ΜΕΤ και CHI3L1, και τα γονίδια στο μονοπάτι ΝΡ-κΒ, όπως TRADD, RELB και TNFSF1A, καθώς και τη διαγραφή των NF1 [8, 9]. Όγκους με μεσεγχυματικά γονίδιο υπογραφή τείνουν να είναι πιο επιθετική, ιδιαίτερα ανθεκτικό στη θεραπεία, να οδηγήσει σε υψηλότερο ποσοστό υποτροπής και να έχουν χειρότερη συνολικά αποτελέσματα από τους όγκους της κλασικής, Προνευρικά και Νευρωνικά υπότυπο [8]. Ως εκ τούτου, μια πιο λεπτομερής μοριακή κατανόηση του υποτύπου μεσεγχυματικά στην GBM είναι ζωτικής σημασίας για τη βελτίωση της θεραπευτικής σχεδιασμό και την έκβαση των ασθενών.

Η ογκογόνο διαδικασία γλοιοβλάστωμα προφανώς ξεκίνησε και υποστηρίζεται από μια σπάνια υποπληθυσμό GBM βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με ( GSCS) [10-12]. Όπως συμβαίνει με φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα, GSCS μπορούν να αυτο-ανανέωση και υφίστανται διαφοροποίηση, αλλά έχουν υψηλή ικανότητα ογκογενή και θεραπευτικές αντίσταση [13]. Αυτά τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν συνήθως απομονώνεται με βάση την ικανότητά τους να αναπτύσσονται ως πολυκύτταρους, μη προσκολλημένα σφαίρες από εναιωρήματα απλού κυττάρου [14, 15], η οποία συμβολίζουμε ως σφαιροειδή GBM βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (Sp-GSCS). Ωστόσο, η επέκταση της Sp-GSCS είναι τεχνικά δύσκολο, και ως σφαίρες μεγέθυνση διαφοροποιημένη απογόνους εμφανίζονται και πεθαίνουν τα κύτταρα συσσωρεύονται μέσα στον πυρήνα της σφαίρας. Ως μια εναλλακτική προσέγγιση, προσκολλημένα GSCS απομονώνεται από GBM (Ad-GSCS) και αναπτύχθηκαν σε χημικά καθορισμένο μέσο για φιάλες καλλιέργειας ιστού λαμινίνη επικαλυμμένα εμφανίζουν ιδιότητες βλαστικών κυττάρων και την κίνηση γλοιώματα υψηλού βαθμού εξής ξενομεταμόσχευση [16].

στην παρούσα έκθεση, Ad-GSCS και Sp-GSCS απομονώθηκαν από GBM ασθενών που προέρχεται xenoline (PDX) που έχει την κλασική γονίδιο υπογραφή. Όταν ενίεται υποδορίως στα πλευρά ή ορθοτοπικά σε εγκεφάλους ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς, Ad-GSCS και Sp-GSCS βρέθηκαν να έχουν σημαντικά αυξημένη δραστικότητα ογκογενή (ΤΙΑ) σε σύγκριση με χύμα κύτταρα όγκου και οι όγκοι μορφή που εμφανίζουν ταυτόσημα ιστολογικά χαρακτηριστικά . Αξίζει να σημειωθεί ότι, ενώ τόσο ΓΓΣ πληθυσμούς

in vitro

έχουν μεσεγχυματικά γονίδιο υπογραφή, Sp-GSCS παράγουν όγκους με μια κλασική γονίδιο υπογραφή? Έτσι ανακεφαλαιώνουν τις μοριακές ιδιότητες του αρχικού PDX GBM. Αντίθετα, Ad-GSCS παράγουν όγκους με μεσεγχυματικά γονίδιο υπογραφή. Εκτός αυξορρυθμίζεται έκφραση πολλών γονιδίων που χαρακτηρίζουν την μεσεγχυματικών υποκατηγορίας, οι όγκοι που παράγονται από Ad-GSCS έδειξε υπερέκφραση των STAT3 και αγγειοποιητίνη σαν-4 (ANGPTL4). STAT3 είναι ένας σημαντικός παράγοντας μεταγραφής που παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση. ANGPTL4 έχει αναφερθεί να ενεργεί όχι μόνο ως καταστολέας όγκου [17], αλλά επίσης και ως ενισχυτής της μετάστασης του όγκου και την αγγειογένεση [18]. Το πιο ενδιαφέρον, μια φαρμακολογική αναστολέας STAT3 μπλοκάρει STAT3 σύνδεση με τον υποκινητή ANGPTL4, και

in vivo

αντικαρκινική δράση σε Ad-GSC ξενομοσχευμάτων.

Υλικά και Μέθοδοι

κυττάρων πολιτισμού

Το ανθρώπινο GBM6 ασθενής που προέρχονται από ξενομόσχευμα (PDX) των ενήλικων ιστών γλοιοβλαστώματος παρασχέθηκε από τον Dr. C. David James, (Τμήμα Νευρολογικής Χειρουργικής του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια, στο σαν Φρανσίσκο) [19], και συνεχώς διατηρηθεί ως υποδόρια ξενομοσχεύματα σε πέντε εβδομάδων αρσενικό NOD.Cg

Prkdc

SCID

Il2rg

tm1Wjl

/SzJ (NSG ) ποντικούς (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ΜΕ). καλλιέργειες κυττάρων του GBM6 PDX προήλθαν από κιμά, πρόσφατα συγκομιδή ιστό του όγκου. Βραχυπρόθεσμες καλλιέργειες GBM6 διαφοροποιημένων κυττάρων όγκου χύμα αναπτύχθηκαν ως προσκολλημένες μονοστιβάδες για 2 έως 5 περάσματα σε ϋΜΕΜ (Cellgro, Herndon, VA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου θερμο-απενεργοποιημένο βοοειδούς (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL) , 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη. Ad-GSCS και Sp-GSCS διατηρήθηκαν σε Neurobasal-A μέσο (Invitrogen, Carlsbad, CA) που περιέχει 2% συμπλήρωμα Β27, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, EGF (20 ng /ml), και βασικό FGF (40 ng /ml). Για την απομόνωση του Ad-GSCS, φιάλες καλλιέργειας επικαλύφθηκαν με 100 μg /mL πολυ ϋ-λυσίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) για 1 ώρα που ακολουθείται από επικάλυψη με 10 μg /mL λαμινίνη (Gibco, Life Technologies Inc. , Grand Island ΝΥ) για 2 ώρες πριν από τη χρήση. Ad-GSCS απλώθηκαν σε 75 εκατοστά

2 φιάλες, που καλλιεργούνται σε συρροή, διασπώνται με HyQTase (Thermo Scientific, Επιστημονική, Rockford, IL), και χωρίζεται σε αναλογία 1: 3. Για την απομόνωση των Sp-GSCS, κύτταρα γλοιώματος διαχωρίστηκαν με HyQtase και τοποθετήθηκαν σε φιάλες εξαιρετικά χαμηλής πρόσφυσης.

Η υποδόρια ξενομοσχεύματα

Τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο μελέτης εγκεκριμένο από την Θεσμική Animal Care και Χρήση επιτροπή του Πανεπιστημίου του Τενεσί Κέντρο Επιστημών Υγείας. ξενομοσχεύματα γλοιοβλαστώματος ιδρύθηκαν σε πέντε εβδομάδων αρσενικό NOD.Cg-

Prkdc

SCID

Il2rg

tm1Wjl

/SzJ (NSG) ποντίκια (Jackson Laboratory, Bar Harbor, μΕ) με άμεση έγχυση πλευρό των κυττάρων (1 × 10

6) μετάγονται με λουσιφεράσης κατασκευάσματα φακοϊό [20]. Οι όγκοι μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα με μια φορητή δαγκάνα. Για την απεικόνιση βιοφωταύγειας, τα ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με d-λουσιφερίνης (το υπόστρωμα λουσιφεράσης), απεικονίζεται στο IVIS

in vivo

σύστημα απεικόνισης (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ), και φωτονικά εκπομπές αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό εικόνας Living . Για να προσδιοριστεί η επίδραση της αναστολής STAT3, άπαξ ανιχνεύσιμους όγκους προσδιορίστηκαν με μέτρηση με παχύμετρο (συνήθως μέσα σε 2 εβδομάδες από την ένεση κυττάρων), WP1066 (40 mg /kg) σε DMSO /Πολυαιθυλενογλυκόλη παραδόθηκε κάθε δεύτερη ημέρα από ενδοογκική ένεση. Αυτή η δόση των WP1066 έχει χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν σε προκλινικές

in vivo

μελέτες [21-23].

ορθοτοπική ενέσεις

Οι μελέτες σε ζώα εκτελέστηκαν σύμφωνα με τις ισχύουσες κατευθυντήριες οδηγίες και την επίβλεψη των Θεσμική φροντίδα ζώων Νοσοκομείο έρευνας του Αγίου Jude Παιδική και επιτροπή χρήση, όπως απαιτείται από το νόμο των Ηνωμένων Πολιτειών καλή μεταχείριση των ζώων και των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας πολιτικής για να διασφαλιστεί η σωστή φροντίδα και χρήση πειραματόζωων για έρευνα. Αναισθητοποιημένοι (κεταμίνη ξυλαζίνη /) ποντίκια CB17 SCID τοποθετήθηκαν σε στερεοτακτική εξοπλισμό, όπου το τριχωτό της κεφαλής έγινε φόντο ετοιμάστηκε χρήση αλκοόλ και επιχρίσματα ιώδιο και τεχνητών δακρύων γέλη εφαρμόζεται στα μάτια. Μετά τριχωτό της κεφαλής εκτομή, ένα ορθογώνιο κρανιακό παράθυρο ήταν διαχωρίζεται και η σκληρή μήνιγγα απομακρύνθηκε πλήρως από την επιφάνεια του εγκεφάλου, και 1×10

6 κύτταρα αιωρούνται σε 10 υί μέσου εγχύθηκαν περίπου 2,5 mm βάθος στο δεξιό κινητικό φλοιό. Η περιοχή εκτομής κλείστηκε με κόλλα δέρμα, και όλα τα ζώα παρακολουθήθηκαν στενά 24 ώρες μετεγχειρητικά. Ιστός όγκου συλλέχθηκε με ακαθάριστο επιθεώρηση σημείο της ένεσης, η οποία οπτικοποιούνται εύκολα χρησιμοποιώντας ένα κρανιακό παράθυρο. Μόλις ολοκληρωθεί αυτή η περιοχή είχε εντοπιστεί, προσεκτική ανατομή επιτρέπεται υποσύνολο αφαίρεση μόνο των ιστών του όγκου? Ωστόσο, δεν χρειάζονται περαιτέρω δοκιμές έγινε για να εξασφαλιστεί καμία κύτταρα ποντικού συμπεριλήφθηκαν στο δείγμα.

Η γονιδιακή έκφραση ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε με κατεργασία ομογενοποίησης ιστών με ΤπζοΙ ακολουθούμενη από απομόνωση με την RNeasy Mini κιτ (Qiagen Inc., Valencia, CA). Τα δείγματα υποβλήθηκαν για την πλήρη προφίλ έκφρασης mRNA στο UTHSC Κέντρο Γονιδιωματική και Βιοπληροφορικής (Memphis, TN) για τη σήμανση και υβριδισμό με την οργάνωση Human-HT12 BeadChips (Illumina Inc.). Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έχουν κατατεθεί στη γονιδιακή έκφραση Omnibus NCBI και είναι προσβάσιμη μέσω του αριθμού ένταξη GEO Σειρά GSE65576 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65576). Η γονιδιακή έκφραση μετρήθηκε επίσης στο Σύστημα nCounter Ανάλυσης (Nanostring Technologies, Seattle, WA) χρησιμοποιώντας ένα πάνελ 230 ανθρώπινα γονίδια σχετίζονται με τον καρκίνο. Εν συντομία, ολικό RNA αναμίχθηκε με ζεύγη δέσμευσης και ρεπόρτερ ανιχνευτών, υβριδοποιήθηκαν στο Σταθμό nCounter Prep, και καθαρισμένα συμπλέγματα μετρήθηκαν στο ψηφιακό αναλυτή nCounter. Για να ληφθούν υπόψη οι διαφορές στην υβριδοποίηση και καθαρισμό, τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν στις μέσες μετρήσεις για όλες τις αιχμές έλεγχο σε κάθε δείγμα και αναλύθηκαν με λογισμικό nSolver. πρότυπα γονιδιακής έκφρασης ήταν η ποιότητα ελέγχεται από Principal Component Analysis (PCA). Γονίδια στατιστικά δοκιμαστεί από άνιση διακύμανση t τεστ. Το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) υπολογίστηκε για τον έλεγχο για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας Partek Γονιδιωματική Σουίτα 6,6. Τα αποτελέσματα έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας STATA /MP 11.2. Επιπλέον, 3-5 (10 μm) μπούκλες κόπηκαν από 24 γλοιοβλάστωμα δείγματα βιοψίας ασθενούς (UTHSC Tissue Services Πυρήνας), RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RecoverAll Σύνολο Nucleic Acid Απομόνωση Kit (Ambion), και γονιδιακή έκφραση προσδιορίστηκε με ποσοτική RT-PCR .

Ingenuity Ανάλυση Pathway (IPA)

IPA (Qiagen Inc., Valencia, CA) χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό κανονικών μονοπατιών σηματοδότησης και λειτουργικά μονοπάτια, καθώς και για την παραγωγή δικτύων σχετικών γονιδίων που προέρχονται από γονίδια αλλάξει στα αναλύθηκαν συγκρίσεις. Εδώ, οι rank-προϊόν που δημιουργείται λίστες γονίδιο χρησιμοποιώντας ένα 5% FDR ανέβηκαν στο διακομιστή ΙΡΑ ως δεδομένα εισόδου. IPA χρησιμοποιεί βιβλιοθήκες μονοπάτι που προέρχεται από την επιστημονική βιβλιογραφία. Στατιστικά στοιχεία για τη λειτουργική ανάλυση διεξήχθησαν με την ακριβή δοκιμή του Fischer.

Η ιστοπαθολογική εξέταση

όγκου ιστού που παράγεται με έγχυση των κυττάρων χύμα όγκου, Ad-GSCS και Sp-GSCS (τέσσερις ξεχωριστές όγκους για κάθε συνθήκη) σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη για 24 ώρες, ενσωματωμένο σε παραφίνη, και τομές των 5 μm πάχος. Για κάθε δείγμα, οι τομές χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) ή άλλης μεθόδου με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντισώματα προς νευρικούς δείκτες: GFAP, S100, OLIG2, ΜΑΡ2 και συναπτοφυσίνη. Εκπρόσωπος εικόνες της κάθε συνδυασμό δείγματος /λεκέ συνελήφθησαν σε 20x αρχική μεγέθυνση σε μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Nikon S1.

Ποσοτική RT-PCR

Η γονιδιακή έκφραση του RNA που χρησιμοποιείται για την ανάλυση μικροσυστοιχιών μετρήθηκε με Q- PCR σε iCyclerIQ (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) χρησιμοποιώντας ένα iScript One-Step RT-PCR kit με SYBR Green (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Οι παράμετροι της αντίδρασης ήταν ως ακολούθως: Η σύνθεση του cDNA στους 50 ° C για 20 λεπτά, η αδρανοποίηση μεταγραφάσης στους 95 ° C για 5 λεπτά, ποδηλασία PCR στους 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα, και 60 ° C για 30 sec για 40 κύκλους. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για RT-PCR: β-ακτίνης 5′-AGAAGGAGATCACTGCCCTG-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-CACATCTGCTGGAAGGTGGA-3′ (αντίστροφο)? CHI31 5’-GTGAAGGCGTCTCAAACAGG-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-GAAGCGGTCAAGGGCATCT-3′ (αντίστροφο)? TRADD 5’-GCTGTTTGAGTTGCATCCTAGC-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-CCGCACTTCAGATTTCGCA-3′ (αντίστροφο)? NF1 5’-AGATGAAACGATGCTGGTCAAA-3 ‘(προς τα εμπρός), 5-CCTGTAACCTGGTAGAAATGCGA-3′ (αντίστροφο)? RelB 5’-CAGCCTCGTGGGGAAAGAC-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-GCCCAGGTTGTTAAAACTGTGC-3′ (αντίστροφο)? CASP4 5’-TTTCTGCTCTTCAACGCCACA-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-AGCTTTGGCCCTTGGAGTTTC-3′ (αντίστροφο)? FGFR3 5’-TGCGTCGTGGAGAACAAGTTT-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-GCACGGTAACGTAGGGTGTG-3′ (αντίστροφο)? PDGFA 5’-GCAAGACCAGGACGGTCATTT-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-GGCACTTGACACTGCTCGT-3′ (αντίστροφο)? EGFR 5’-CTACGGGCCAGGAAATGAGAG-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-TGACGGCAGAAGAGAAGGGA-3′ (αντίστροφο)? ΑΚΤ2 5’-ACCACAGTCATCGAGAGGACC-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-GGAGCCACACTTGTAGTCCA-3′ (αντίστροφο)? Νεστίνης 5’-GGCGCACCTCAAGATGTCC-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-CTTGGGGTCCTGAAAGCTG-3’ (αντίστροφο).

TCGA ανάλυση των δεδομένων

Για να εξεταστεί η σχέση μεταξύ STAT3 και της έκφρασης ANGPTL4 σε ανθρώπινο GBM εγκεφαλικό ιστό, εμείς αμφισβήτησε την πύλη δεδομένων TCGA για όλες τις χαμηλού βαθμού γλοίωμα και δείγματα GBM με τη γονιδιακή έκφραση (BI_HT_HG-U113A Array Data Set) τα διαθέσιμα στοιχεία, καθώς και τα συνοδευτικά κλινικά δεδομένα. Το σύνολο των δεδομένων φιλτράρεται για δείγματα που έχουν τα δεδομένα έκφρασης για STAT3, ANGPTL4 και κλινικά δεδομένα, αποδίδοντας ένα τελικό σύνολο 466 επιμέρους δείγματα γλοίωμα χαμηλής ποιότητας και 328 ανεξάρτητα δείγματα ασθενών GBM. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση GraphPad Prism.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Η επαγωγή απόπτωσης παρακολουθήθηκε με κυτταρομετρία ροής (Accuri Μοντέλο 6C) χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V-FITC (Βϋ Pharmingen, San Diego, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση

χρωματίνης ανοσοκαθίζηση (μάρκας) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ChIP-Ι Express Ενζυμική (Active Motif, Carlsbad, CA) σύμφωνα με με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, χρωματίνη από κύτταρα ήταν διασυνδεδεμένη με 1% φορμαλδεΰδη (10 λεπτά στους 22 ° C), ψαλιδισμένα σε ένα μέσο μέγεθος από ~ 200 bp, και στη συνέχεια ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology). Τσιπ εκκινητές PCR σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν μια περιοχή εγγύς υποκινητή που περιέχει υποτιθέμενη STAT3 (-1,369 έως -1,348) θέση πρόσδεσης στον υποκινητή ANPTL4. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5′-CATTAAAGACCCTGGCGGTA -3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-GGATCACAGTCGTGTGAGGA -3’ (reverse).

Η στατιστική ανάλυση

Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα εις διπλούν, και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. ANOVA και-hoc μετά τουλάχιστον σημαντική ανάλυση διαφοράς ή Φοιτητής

διεξήχθησαν t

δοκιμές.

σ

τιμές & lt? 0,05 (*) θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Οι διαφορές στις μοριακές υπογραφές GSCS αυξηθεί

in vitro

και ως υποδόρια ξενομοσχεύματα

γλοιοβλάστωμα είναι που χαρακτηρίζεται από εκτεταμένη ετερογένεια σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο [24], η οποία μπορεί να αντανακλά την παρουσία διαφορετικών πληθυσμών καρκίνο βλαστικών κυττάρων. Σε προηγούμενη μελέτη, απομονώσαμε Ad-GSCS και Sp-GSCS από την GBM6 PDX, και έδειξε ότι και οι δύο πληθυσμοί είχαν υψηλή έκφραση δεικτών των βλαστικών κυττάρων, όπως CD133, Sox2 και νεστίνη, αλλά χαμηλή έκφραση δεικτών διαφοροποίησης όπως βIII- τουμπουλίνης και νευρογλοιακά πρωτεΐνη ινιδική οξέος σε σύγκριση με χύμα κύτταρα όγκου [25]. Και οι δύο πληθυσμοί διατηρούν υψηλή έκφραση CD133 (& gt? 85%) με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής ακόμα και όταν διατηρήθηκαν σε μέσα που περιείχαν ορό για μια εβδομάδα, το οποίο παρέχει ισχυρή απόδειξη ότι αυτές οι GSCS αντιπροσωπεύουν μια «αληθινή» βλαστικών κυτταρικό πληθυσμό και ότι «βλαστική ικανότητα» δεν είναι ένα κατασκεύασμα των μέσων μαζικής ενημέρωσης (ορό έναντι αυξητικών παραγόντων). Και οι δύο πληθυσμοί είχαν υψηλά συστατική STAT3 και την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ, που είχε σαν αποτέλεσμα προς τα πάνω ρύθμιση του μονοπατιού Notch. Για να χαρακτηριστούν πληρέστερα τις μοριακές υπογραφές αυτών GSC πληθυσμών, RNA παρασκευάστηκε από βιολογικό επαναλήψεις κυττάρων GBM6 αναπτύσσονται είτε ως βραχυπρόθεσμη καλλιέργειες διαφοροποιημένων χύδην κυττάρων όγκου, Ad-GSCS, ή Sp-GSCS, και ολόκληρο προφίλ έκφρασης του γονιδιώματος διεξήχθη σε έκφραση HT-12 Στεφάνη-Chips από την UTHSC Κέντρο Γονιδιωματική και Βιοπληροφορικής. Ιεραρχική ομαδοποίηση χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η διαφορική έκφραση των ~ 840 γονίδια GBM υπότυπο προγνωστικό παράγοντα [4]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, ένας θερμικός χάρτης της διακύμανσης στην έκφραση αυτών των γονιδίων predictor έδειξαν ότι κύτταρα που αναπτύσσονται

in vitro

υπό δύο GSC συνθήκες επέδειξαν πολύ παρόμοιο προφίλ έκφρασης, η οποία ήταν σημαντικά διαφορετική από το προφίλ έκφρασης του άκρως διαφοροποιημένα κύτταρα όγκου χύμα αναπτύχθηκαν σε μέσο που περιέχει ορό. Συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα μας [25], υψηλής νεστίνη, Sox2 και έκφραση CD133 βρέθηκε και στους δύο πληθυσμούς GSC, ενώ βIII-τουμπουλίνης και πρωτεΐνη γλοιακή ινιδική οξύ εκφράστηκε σε σχετικά χαμηλά επίπεδα. Έτσι, αν και οι δύο πληθυσμοί GSC αναπτύχθηκαν υπό διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας (προσφύσεως έναντι καλλιέργεια εναιωρήματος), τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης τους ήταν πολύ παρόμοια. Στη συνέχεια έγινε σύγκριση της μαθηματικής διακύμανση μεταξύ των διαφόρων δειγμάτων δεδομένων από PCA, η οποία είναι μια ανεξέλεγκτη αναλυτική μέθοδο παρόμοια προς τον παράγοντα ανάλυσης που είναι ευαίσθητο σε όλες τις αιτίες της μεταβλητότητας στα δεδομένα. Οπτικοποίηση των τριών πρώτων συστατικών επιτρέπει για τον ποιοτικό έλεγχο και τη σχετική εκτίμηση της διακύμανσης των επαναλήψεων. Αυτή η οπτικοποίηση PCA επιτρέπει επίσης την αξιολόγηση των κατηγορηματική παράγοντες του ενδιαφέροντος με την επίδειξη εάν τα δεδομένα αδρανών φυσικά από τους παράγοντες αυτούς ή με ένα άγνωστο ή συστηματικό παράγοντα, όπως παρτίδα. Όταν γονίδιο έκφραση των GSC πληθυσμών και χύδην καρκινικά κύτταρα αναπτύχθηκαν

in vitro

υποβλήθηκαν σε ανάλυση PCA, τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης στις δύο διαφορετικές καλλιέργειες GSC βρέθηκαν επίσης να είναι σχετικά παρόμοια, ενώ εκείνο του χύδην κυττάρων όγκου καλλιεργούνται

in vitro

ήταν σημαντικά διαφορετικές (Σχήμα 1Β).

RNA παρασκευάστηκε από κύτταρα GBM6 χύδην όγκου, Ad-GSC, και Sp-GSC καλλιέργειες καθώς και από υποδόρια ξενομοσχεύματα όγκου από αυτά εγχέονται κύτταρα. Βιολογικά διπλότυπα έτρεξαν για κάθε δείγμα και τα δεδομένα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν. έκφραση Α Gene μετρήθηκε με συστοιχία Illumina και τα γονίδια που αναφέρθηκαν στη βάση δεδομένων TCGA αναλύθηκαν. B. Η PCA οικόπεδο αντιπροσωπεύει τη σύγκριση των γονιδίων υπογραφών από κάθε κατάσταση.

Η

Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάλυση της έκφρασης του γονιδιώματος σύνολό τους σε όγκους που παράγονται από τους διαφορετικούς πληθυσμούς κυττάρων GBM. Εν συντομία, χύμα καρκινικά κύτταρα, Ad-GSCS και Sp-GSCS (1 Χ 10

6 κύτταρα) ενέθηκαν στα πλευρά του ανοσοκατεσταλμένους NSG ποντικούς και κάποτε φτάνοντας έναν όγκο ~ 200 mm

3, όγκοι ήταν αποκόπηκαν, RNA παρασκευάστηκε και υποβλήθηκε σε ανάλυση μικροσυστοιχιών. Σε αντίθεση με το

in vitro

ευρήματα, οι όγκοι που παράγονται από Ad-GSCS και Sp-GSCS είχε αξιοσημείωτα διαφορετικά προφίλ έκφρασης, όπως αποδεικνύεται από τα θερμικούς χάρτες των προφίλ γονιδιακής έκφρασης (Σχήμα 1Α), καθώς και PCA της μέσης γονιδιακής έκφρασης (Σχήμα 1Β). Τα ξενομοσχεύματα όγκου των διαφοροποιημένων χύδην καρκινικά κύτταρα και Sp-GSCS ήταν εξαιρετικά παρόμοια, η οποία είναι συνεπής με το εύρημα ότι Sp-GSCS ανασυστήσουν πληθυσμιακά τους όγκους GBM με προφίλ γονιδιακής έκφρασης σχεδόν ταυτόσημη με εκείνη του χύδην κύτταρα όγκου [26]. Ως εκ τούτου, ενώ η έκφραση του γονιδίου του Sp-GSCS και Ad-GSCS καλλιεργούνται

in vitro

είναι πολύ παρόμοια, η

in vivo

μοριακή υπογραφή του ιστού του όγκου είναι αρκετά διαφορετική. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι υπάρχουν πληθυσμοί διακριτές βλαστικών κυττάρων στην GBM και την προώθηση της ετερογένειας των όγκων.

Ad-ΓΓΣ και Sp-GSC ξενομοσχευμάτων εκφράζουν διακριτά μοριακό προφίλ

Για να καθοριστεί εάν τα μοριακά χαρακτηριστικά του Ad-GSCS και Sp-GSCS αντιστοιχούσε σε οποιοδήποτε από τα τέσσερα μοριακά υποτύπους γλοιοβλαστώματος συγκρίναμε την έκφραση των ~ 840 GBM γονίδια προγνωστικό σε κυττάρων και ιστών δείγματα μας με αυτή του ιστού του όγκου 202 γλοιοβλαστώματος στη βάση δεδομένων TCGA, οι οποίες αντιπροσωπεύουν Κλασική (λευκό σφαίρες) , Νευρωνικά (μαύρο σφαίρες), Προνευρικά (μπλε σφαίρες) και μεσεγχυματικά (γκρι σφαίρες) υποκατηγορίες. Σχήμα 2Α δείχνει, όπως αναμένεται, ότι τα δείγματα όγκων GBM σχηματίζουν τέσσερις σχετικά διακριτές ομάδες, όπως φαίνεται προηγουμένως [4], αλλά υπάρχει κάποια επικάλυψη στις πρότυπα έκφρασης μεταξύ των τεσσάρων αυτών υποκατηγορίες. Τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης του Ad-GSCS (κόκκινες σφαίρες) και Sp-GSCS (κίτρινες σφαίρες) που καλλιεργούνται

in vitro

μοιάζουν με εκείνη της υποκατηγορίας μεσεγχυματικά GBM. Σε αντίθεση με το προφίλ έκφρασης των χύμα καρκινικών κυττάρων GBM6 αυξηθεί

in vitro

(πορτοκαλί σφαίρες) συνδέεται με την κλασική GBM υποτύπου, η οποία είναι συνεπής με ό, τι είχε προηγουμένως βρεθεί (Υ Gillespie, προσωπική επικοινωνία). Στη συνέχεια εξετάσαμε το πρότυπο έκφρασης γονιδίου σε όγκους πλευρό αυτών των κυττάρων. Το πιο ενδιαφέρον, οι όγκοι που προέκυψαν από την Ad-GSCS εξέφρασε μεσεγχυματικά γονίδιο υπογραφή, η οποία μοιάζει με εκείνη του Ad-GSCS αυξηθεί

in vitro

. Αντίθετα, οι όγκοι που προέκυψαν σε ποντίκια που ενέθηκαν με Sp-GSCS είχε μια κλασική υποτύπου υπογραφή, η οποία μοιάζει πολύ με το γονίδιο υπογραφή των όγκων που προέρχονται από κύτταρα όγκου χύμα. Έτσι, Sp-GSCS και Ad-GSCS έχουν παρόμοιες μοριακές ιδιότητες (μεσεγχυματικά υποκατηγορία)

in vitro

, η οποία είναι διαφορετική από εκείνη των χύμα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσονται (Κλασική υποκατηγορία)

in vitro

. Όταν ενίεται σε ποντικούς, αυτά τα GSCS σχηματίζουν μοριακά διακριτούς όγκους. Ad-GSCS διατηρήσει μια μεσεγχυματικά γονίδιο υπογραφή

in vitro

και

in vivo

, ενώ Sp-GSCS ανασυστήσουν το όγκου με ένα γονίδιο κλασική υπογραφή, παρόμοια με εκείνη του χύδην καρκινικών κυττάρων.

Α. ανάλυση Array πραγματοποιήθηκε και συγκρίθηκε με γλοιοβλάστωμα μοριακό υποτάξεις? PCA χάρτης απεικονίζει την κλασική, μεσεγχυματικά, νευρικά, και προνευρικών υπογραφές γονίδιο και το γονίδιο υπογραφή των κυττάρων GBM6 και καρκινικού ιστού που προέρχεται από χύμα καρκινικά κύτταρα, Ad-GSCS και Sp-GSCS. Β και C. Το RNA απομονώθηκε από τρία επιμέρους όγκους που προέρχονται από κύτταρα όγκων χύδην GBM6, Ad-GSCS και Sp-GSCS (Β), και από αυτά τα κύτταρα αναπτύχθηκαν

in vitro

(C.) για τον προσδιορισμό του γονιδίου έκφραση των μοριακών δεικτών των μεσεγχυματικών (CHI3L1, TRADD, NF1, RelB και CASP4) και Κλασική (FGFR3, PDGFA, EGFR, ΑΚΤ2 και νεστίνη) υποκατηγορία των γλοιοβλαστώματος με qPCR και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση ακτίνης (n = 3). Οι ράβδοι σφάλματος, S.D. * P & lt? 0.05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001.

Η

Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό γονιδιακής έκφρασης στα ξενομοσχεύματα όγκου Ad-GSCS και Sp-GSCS, εξετάσαμε την έκφραση των γονιδίων που ορίστηκαν προηγουμένως να είναι χαρακτηριστικό της Κλασικής (FGFR3, PDFA, EGFR, ΑΚΤ -2 και νεστίνη) και μεσεγχυματικά (CHI3L1, TRADD, NF1, RelB και CASP4) υποτύπους γλοιοβλάστωμα [4]. RNA εκχυλίστηκε και συγκεντρώθηκαν από τρεις επιμέρους υποδόρια ξενομοσχεύματα που προέρχονται από κύτταρα χύδην όγκου, Ad-GSCS ή Sp-GSCS, και η έκφραση αυτών των γονιδίων δεικτών προσδιορίστηκε με qPCR. Το σχήμα 2Β δείχνει ότι η έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών CHI3L1, TRADD και RelB είναι σημαντικά αυξημένα σε Ad-GSCS ξενομοσχευμάτων σε σύγκριση με ξενομοσχεύματα όγκου χύδην καρκινικά κύτταρα και Sp-GSCS. Σε αντίθεση, το ογκοκατασταλτικό NF1, το οποίο είναι προς τα κάτω σε μεσεγχυματικά γλοιοβλάστωμα, εκφράζεται σε σχετικά χαμηλά επίπεδα σε ιστό όγκου από Ad-GSCS σε σύγκριση με τους όγκους που προέρχονται από Sp-GSCS και χύδην καρκινικά κύτταρα. Τα μεσεγχυματικά δείκτη, CHI3L1, σε συνδυασμό με αστροκυτταρικές δείκτες είναι ενδεικτική μιας μετάβασης επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά που έχει συνδεθεί με επιθετική, αποδιαφοροποιημένα όγκους [27]. Γονίδια στις οδούς TNF και ΝΡ-κΒ, όπως TRADD και RelB, είναι εντόνως εκφρασμένη σε μεσεγχυματικών υπότυπο, καθώς, ενδεχομένως, ως συνέπεια της αυξημένης νέκρωσης και συναφείς φλεγμονώδεις διηθήσεις [28]. Επιπλέον, τα Classical γονίδια δείκτες FGFR3, PDGFA, EGFR και νεστίνη εκφράζονται όλα σε σχετικά υψηλά επίπεδα σε ξενομοσχεύματα όγκου των κυττάρων του χύδην όγκου και Sp-GSCS, σε σύγκριση με ξενομοσχεύματα του Ad-GSCS, η οποία είναι συνεπής με την ταξινόμηση ανάλυση PCA των όγκων ως την Κλασική υπότυπο. Σε αντίθεση, EGFR και νεστίνη εκφράζονται σε εξαιρετικά χαμηλά επίπεδα σε ξενομοσχεύματα όγκου Ad-ΓΓΣ, η οποία είναι συνεπής με τον χαρακτηρισμό τους ως όγκοι μεσεγχυματικά. Σημαντική ενίσχυση EGFR παρατηρείται στο 97% των Classical γλοιοβλαστωμάτων στη βάση δεδομένων TCGA αλλά σπάνια σε άλλους υπότυπους. Το ξενομόσχευμα GBM6 προέρχεται από έναν ασθενή με υπερέκφραση της μεταλλαγμένης VIII του EGFR, και το εύρημα μας από υψηλής έκφρασης EGFR χύμα καρκινικά κύτταρα και σε όγκους που προέρχονται από αυτά είναι σύμφωνο με υπερέκφραση EGFR. Ωστόσο, είναι εξαιρετικά ενδιαφέρον ότι οι όγκοι από την Ad-GSCS εκφράζουν σχετικά χαμηλά επίπεδα EGFR παρέχοντας πρόσθετη απόδειξη ότι η Ad-GSCS είναι μια ξεχωριστή ΓΓΣ πληθυσμού. Με βάση αυτά τα ευρήματα στη διαφορική έκφραση του γονιδίου δείκτη σε GSC ξενομοσχεύματα, μπορούμε στη συνέχεια εξετάστηκε η έκφραση των μεσεγχυματικών και τα γονίδια Κλασική δείκτη σε χύμα καρκινικά κύτταρα, Ad-GSCS και Sp-GSCS αυξηθεί

in vitro

. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2C, η έκφραση των γονιδίων κλασικής δείκτη FGF3, PDGFA, EGFR και ΑΚΤ2 είναι σημαντικά προς τα κάτω σε δύο GSC πληθυσμούς σε σχέση με χύδην καρκινικά κύτταρα αναπτύχθηκαν

in vitro

. Επιπλέον, υπάρχει αυξημένη έκφραση των γονιδίων μεσεγχυματικά δείκτη TRADD, NF1 και RelB τόσο Ad-ΓΓΣ και Sp-GSC πληθυσμούς που καλλιεργούνται

in vitro

. Συνολικά οι μελέτες μας δείχνουν ότι η Ad-GSCS είναι μοριακά διακριτές ΓΓΣ υποπληθυσμός από εκείνη των Sp-GSCS. Το Ad-GSCS παρουσιάζουν ένα μεσεγχυματικά γονίδιο υπογραφή

in vitro

, και να προωθήσει το σχηματισμό των όγκων μεσεγχυματικά

in vivo

.

Η ιστοπαθολογική εξέταση των Sp-ΓΓΣ και Ad-GSC ξενομοσχευμάτων

Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της GBM χαρακτηρίζεται μορφολογικά ετερογένεια εντός του ίδιου του όγκου, καθώς και μεταξύ διαφορετικών όγκων GBM. Το μοριακό ετερογένεια που παρατηρείται σε γλοιοβλάστωμα ξενομοσχεύματα μας χύδην κυττάρων όγκου, Ad-GSCS και Sp-GSCS μας οδήγησε να εξετάσει την ιστοπαθολογική αυτών των όγκων. Τέσσερα μεμονωμένα υποδόριους όγκους που προέρχονται από κάθε συνθήκη καλλιέργειας κυττάρων ήταν σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν και. Κάθε δείγμα ήταν Η &? Ε χρώση, και ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε για να μετρηθεί ανοσοαντιδραστικότητα με αντισώματα για τα ακόλουθα νευρικούς δείκτες: GFAP, S100, OLIG2, ΜΑΡ2 και συναπτοφυσίνη. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3Α, οι Κλασική GBM όγκοι χύδην κυττάρων όγκου και ξενομοσχευμάτων Sp-GSCS, και οι όγκοι μεσεγχυματικά του Ad-GSC ξενομοσχεύματα ήταν όλα προσδιορίζεται να είναι γλοιώματα υψηλού βαθμού και ήταν μορφολογικά δυσδιάκριτα. Καρκινικών κυττάρων με υψηλή πυρηνική: κυτταροπλασματική αναλογία και λίγο πυρηνικών πλειομορφισμό έδειξε την μορφολογία των σχετικά μη διαφοροποιημένων γλοιωμάτων υψηλής ποιότητας. Ανοσοϊστοχημεία του ιστού του όγκου έδειξε ένα ομοιόμορφο φαινότυπο μεταξύ των διαφόρων ξενομοσχευμάτων όγκου (Σχήμα 3Β). Υπήρξε ισχυρή ανοσοαντιδραστικότητα για GFAP και OLIG2 σε πολλά κύτταρα όγκου, ενώ όλα τα καρκινικά κύτταρα εξέφρασαν S-100 και ΜΑΡ-2. Δεν υπήρχε ανοσοαντιδραστικότητα για συναπτοφυσίνη. Σε όλο το φάσμα των νευρωνικών όγκων, GFAP, OLIG-2 και ΜΑΡ-2 εκφράζονται γενικά από γλοιώματα, ενώ η νευρωνική synaptophysin δείκτης δεν είναι [29-32]. Αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν την ομοιότητα στο μικροσκοπικό επίπεδο μεταξύ των μοριακά διακριτές ξενομοσχευμάτων των χύμα καρκινικών κυττάρων, Sp-GSCS και Ad-GSCS.

κύτταρα GBM6 χύμα όγκου, Ad-GSCS, και Sp-GSCS έλαβαν υποδόρια ένεση και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε διάμετρο ~ 400 χιλιοστά

3. Οι όγκοι συλλέχθηκαν και ενσωματωμένα σε παραφίνη για ιστολογία. A. H & amp? Χρώση Ε και Β Ανοσοαντιδραστικότητα για GFAP, S100, OLIG2 και ΜΑΡ2. (Όλες οι μικροφωτογραφίες που λαμβάνονται σε 200x).

Η

προσκολλημένα GSCS προωθήσει το σχηματισμό των ενδοκρανιακών όγκων με μεσεγχυματικά υπογραφή

Για να διερευνήσει το ρόλο της μικροπεριβάλλον του όγκου στην έκφραση γονιδίων σε GBM * P & lt? 0.05, ** p & lt? * P & lt? 0.05, ** p & lt? * P & lt? 0.05, ** p & lt? * P & lt? 0.05, ** p & lt? * P & lt? 0.05, ** p & lt?