Αφηρημένο

Ιστορικό

miR-26a διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση, είτε ως καταστολέας των όγκων ή ως ογκογόνο miRNA, ανάλογα με διαφορετικά είδη όγκων. Ωστόσο, η λειτουργία του miR-26a σε καρκίνο του παγκρέατος δεν έχει σαφώς καθορισθεί. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να καθορίσει τους ρόλους του miR-26a στον καρκίνο του παγκρέατος και η σύνδεσή της με την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος.

Μέθοδοι

Η έκφραση του miR-26a εξετάστηκε 15 ζεύγη αδενοκαρκινώματος παγκρεατικού πόρου (PDAC) και των παρακείμενων καλοήθη παγκρεατικούς ιστούς τους (ABPT), με qRT-PCR. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με

in situ υβριδισμό χρησιμοποιώντας

δύο φύλλα 106 PDACs και ABPT μικροσυστοιχιών τους. Η συσχέτιση της έκφρασης miR-26a με συνολική επιβίωση προσδιορίστηκε. Ο πολλαπλασιασμός και η κυτταρική κατανομή του κύκλου του Capan-2, SW-1990, και τα κύτταρα Panc-1, επιμολυσμένα με μιμείται miR-26a ή αναστολέα miR-26a, αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την κυτταρική Μετρώντας Kit-8 δοκιμασίας και κυτταρομετρία ροής, αντίστοιχα. Η ογκογονικότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε μέσω πειραμάτων ξενομοσχεύματος ποντικού. Κυκλίνης D2, Ε2, ΕΖΗ2, και PCNA επίπεδα αναλύθηκαν με κηλίδα Western και ανοσοϊστοχημεία.

Αποτελέσματα

miR-26a εκφράστηκε στο κυτταρόπλασμα του παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα, ενώ η έκφρασή του ήταν σημαντικά μειωτικά σε PDAC ιστούς σε σύγκριση με εκείνη του ABPT. Οι ασθενείς με χαμηλή έκφραση του miR-26a είχαν σημαντικά μικρότερη επιβίωση από αυτούς με υψηλή έκφραση του miR-26a. Η

in vitro

και

in vivo δοκιμασίες

έδειξε ότι η υπερέκφραση του miR-26a οδήγησε σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ανέστειλε, και μειωμένη ανάπτυξη του όγκου, η οποία σχετίζεται με τη κυκλίνη Ε2 μειορύθμιση.

Συμπεράσματα

miR-26a είναι ένα σημαντικό καταστολέας του καρκινώματος παγκρεατικού πόρου, και μπορεί να αποδειχθεί μια νέα προγνωστικός παράγοντας και θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Ντενγκ J, Ο Μ, Chen L, Chen C, Zheng J, Cai Ζ (2013) Η απώλεια του miR-26a-Mediated Μετα-μεταγραφική ρύθμιση της κυκλίνης Ε2 σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικού πολλαπλασιασμού και μειωμένη επιβίωση των ασθενών. PLoS ONE 8 (10): e76450. doi: 10.1371 /journal.pone.0076450

Επιμέλεια: Vincenzo Coppola, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Νοεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 27 Αύγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Deng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Έργο Νο 81172077) και τη Σαγκάη δίκτυο βιοτράπεζας του αμοιβαίου κεφαλαίου ανθρώπινο ιστό του όγκου (Σχέδιο Νο 12DZ2295102). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος, αδενοκαρκίνωμα ιδιαίτερα παγκρεατικού πόρου (PDAC), είναι η τέταρτη πιο κοινή αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Με μέσο χρόνο επιβίωσης λιγότερο από 6 μήνες και ένα μέσο ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μικρότερη από 5%, η αναλογία θνησιμότητας-συχνότητα για ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος είναι περίπου 99%, με εξαιρετικά φτωχή πρόγνωση [1], [2] . Ως εκ τούτου, μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στη διαδικασία μετασχηματισμού κακοήθης όγκος, συμπεριλαμβανομένου του ρόλου της microRNAs (miRNAs), πρέπει να γίνει κατανοητό για τη βελτιωμένη διάγνωση και τη διαχείριση του καρκίνου του παγκρέατος [3], [4].

miRNAs είναι φυσικά συμβαίνουν, μικρό, μονόκλωνο, μη κωδικοποιητική RNAs που διαμεσολαβούν την έκφραση του γονιδίου στα μετα-μεταγραφικά και μεταφραστικά επίπεδα και στις δύο φυτά και ζώα [5], [6]. Αυτά τα μόρια παίζουν κρίσιμους ρόλους σε ανθρώπινους καρκίνους όπως ο καρκίνος του παγκρέατος [7], [8], καθώς και στη συμπεριφορά του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού της, εισβολή, τη μετανάστευση, την απόπτωση, και της αντίστασης στα φάρμακα. Το λειτουργικό δίκτυο miRNA του καρκίνου σχετίζεται με διάφορες πτυχές της παθογένεσης των όγκων [9]. Το δίκτυο αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση της διάγνωσης και στην πρόγνωση του καρκίνου, καθώς και να αξιολογήσει τις πιθανές θεραπευτικές επιλογές.

miR-26a είναι μια δοκιμασμένη ογκοκατασταλτικό που είναι σημαντικά προς τα κάτω σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) [10]. Μειωμένα επίπεδα miR-26a έχουν συσχετιστεί με κακή πρόγνωση? Αυτά τα επίπεδα είναι προγνωστικά της θεραπευτικής απόκρισης των ασθενών με HCC στην ιντερφερόνη-α. Επιπλέον, miR-26a υπερέκφραση έχει συσχετιστεί με σημαντική υποχώρηση του όγκου, υποδεικνύοντας ότι miR-26a επαναφορά σε ασθενείς με καρκίνο μπορεί να είναι μια αποτελεσματική στρατηγική αγωγή [11]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η όγκο-ειδικό miR-26a υπερέκφραση, οδηγείται από έναν υποκινητή διπλής hAFP-TERT, μείωσε την βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων σε HCC με τη ρύθμιση της έκφρασης του υποδοχέα οιστρογόνου (ER) -α, υποδοχέα προγεστερόνης (PR) , ρ53, κυκλίνη D2, και Ε2 [12]. Ωστόσο, η ακριβής σχέση μεταξύ miR-26a και τον καρκίνο του παγκρέατος παραμένει άγνωστη.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης του miR-26a σε ανθρώπινους ιστούς PDAC. Θα προσδιορίζεται η κλινική σημασία του miR-26a ρύθμιση προς τα κάτω και τους ρόλους της στην ανάπτυξη των κυττάρων και την κατανομή του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο ποντικού για να διερευνήσει τον πιθανό ρόλο των miR-26a σε παγκρεατικά ογκογένεση. Τα ευρήματά μας παρέχουν βασικές πληροφορίες για την καλύτερη κατανόηση της παθογένειας του καρκίνου του παγκρέατος και τις πιθανές θεραπευτικές στρατηγικές της.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με το Ελσίνκι κατευθυντήριες γραμμές για το θέμα μελέτες ανθρώπινων και εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της δεύτερης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Σαγκάη της Κίνας. Υπεγράφη ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη για τη συλλογή και την ανάλυση των δειγμάτων. Όλες οι διαδικασίες για τα ζώα που είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care και χρήση του δεύτερου Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

Ασθενείς και δείγματα ιστών

Τα δεδομένα για ασθενείς με PDAC ανακτήθηκαν πάνω από ένα 3-ετή περίοδο (Ιανουάριος 2008 – Δεκέμβριος 2010) από το Τμήμα Αρχειονομίας Παθολογίας του Changhai Νοσοκομείου, Δεύτερη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο στη Σαγκάη της Κίνας και της Σαγκάης Βιοτράπεζα Δίκτυο των κοινών ιστού ανθρώπινου όγκου. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χειρουργική επέμβαση, και συνολικά, περιελήφθησαν 106 ζεύγη δειγμάτων από PDACs και ABPT τους. Επιπλέον ένα επιπλέον 15 ζεύγη PDAC και τα δείγματα τους ABPT συλλέχθηκαν από ασθενείς κατά τη διάρκεια χειρουργικής εκτομές και αποθηκεύεται σε υγρό άζωτο. Τα χαρακτηριστικά του ασθενούς, την κλινική εικόνα, σταδιοποίηση, εργαστηριακά ευρήματα, η θεραπεία, αντικειμενική ανταπόκριση, την επιβίωση, και άλλες σχετικές πληροφορίες ελήφθησαν από το σύστημα πληροφοριών του νοσοκομείου. Οι ασθενείς αξιολογήθηκαν με πρότυπες μεθόδους, που περιλαμβάνουν την ιστορία τους, τη φυσική εξέταση, και βιοχημικές-αιματολογικές εξετάσεις. Το σύστημα ΤΝΜ σταδιοποίηση αυτή χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της κατάστασης της νόσου του ασθενούς.

Μορφολογική Ανάλυση και κατασκευή του ιστού μικροσυστοιχιών

Όλα τα δείγματα ελήφθησαν από τη χειρουργική επέμβαση, που καθορίζεται στο φορμόλη, και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Τμήματα πάχους 4-μm χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και εοσίνη πριν αξιολογηθεί από τρεις παθολόγους για τα μορφολογικά χαρακτηριστικά του καρκίνου του παγκρέατος, σύμφωνα με την κατάταξη της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας του πεπτικού συστήματος [13]. μικροσυστοιχίες ιστού (TMAs) κατασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [14]? κάθε μικροσυστοιχία περιείχε δύο πάνελ των 106 PDACs και ABPT τους, που ήταν τοποθετημένα σε πυρήνες 2,0 χιλιοστών διαμέτρου.

Αντίστροφη μεταγραφή Αντίδραση και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR)

Συνολικά , 15 ζεύγη των κατεψυγμένων PDACs και δείγματα ABPT τους (μακρο-τεμαχίζεται) χρησιμοποιήθηκαν για qRT-PCR σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Invitrogen. U6 χρησιμοποιήθηκε ως το ενδογενές ελέγχου για την ομαλοποίηση της ποσότητας του ολικού RNA σε κάθε δείγμα. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν, με nontemplate ελέγχους. Η σχετική έκφραση υπολογίστηκε με βάση τη συγκριτική μέθοδο Ct (2

-ΔΔ

Ct

) [12]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1

miRCURY LNA microRNA Ανίχνευση

in situ υβριδισμός

και Ανάλυση Επιβίωσης

Κλειδωμένο νουκλεϊκών οξέων (LNA) -.

in situ

υβριδισμού (ISH) διεξήχθη σε PDAC TMA χρησιμοποιώντας το αντίστοιχο miRCURY LNA ™ ανιχνευτές ενάντια έχει-miR-26a ή έχει-miR-21 (ως θετικός έλεγχος) (Exiqon, Vedbaek, Δανία). Αυτοί οι ανιχνευτές χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Χρωματομετρική ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με επώαση των δειγμάτων για 30 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα υποστρώματος-χρωμογόνου, με 0,04% DAB (DAKO, Denmark) και 0,05% Η

2O

2. Οι τομές με αιματοξυλίνη πριν από την εξέταση χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο (Leica, Γερμανία) [16].

Τα αποτελέσματα LNA-ish ήταν ημιποσοτικά αξιολογηθεί. Με βάση την ένταση του υβριδισμού, τα δείγματα βαθμολογήθηκαν ως «0» για αρνητική? «1» για ασθενώς θετικό? «2» για μέτρια θετική? και «3» για την έντονα θετική. Το ποσοστό των θετικών επιθηλιακών κυττάρων βαθμολογήθηκε ως «0» για ≤10%? «1» για το 11% -25%? «2» για το 25% -50%? και «3» για ≥50%. Οι βαθμολογίες έντασης και το ποσοστό αθροίστηκαν για να ληφθεί το τελικό σκορ ISH, η οποία είχε χαρακτηριστεί ως «αρνητική» (& lt? 3) ή «θετική» (≥3) [17]

Οι LNA-ish αποτελέσματα για. miR-26a ή miR-21 και τα δεδομένα των κλινικών θεραπεία 106 ασθενείς αναλύθηκαν περαιτέρω. Η ανταπόκριση στη θεραπεία με χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, συμπεριλαμβανομένων των κλινικών εκδηλώσεων του ασθενούς, αξονική τομογραφία (CT), μαγνητική τομογραφία (MRI) τα ευρήματα και τα επίπεδα CA19-9, ήταν αντικειμενικά αξιολογηθεί. Έτσι, όλοι οι ασθενείς που συμπεριελήφθησαν στη μελέτη αξιολογήθηκαν για την ανταπόκρισή τους στη θεραπεία, η οποία βαθμολογήθηκε ως «πλήρης απόκριση», «μερική απόκριση», «σταθερή ασθένεια», «προοδευτική ασθένεια», «πρόωρο θάνατο από ασθένεια ή τοξικότητα», και ούτω καθεξής.

κυκλίνης D2, κυκλίνη Ε2, και PCNA Immunochemistry σε καρκίνο του παγκρέατος ιστοί

Οι τομές προκατεργάστηκαν στους 65 ° C για 2 ώρες, ακολουθούμενη από διαβαθμισμένης αποπαραφινώσεως. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη πριν από την επώαση με τα πρωτογενή αντισώματα της κυκλίνης D2 (1:300 αραίωση? Millipore), η κυκλίνη Ε2 (1:300 αραίωση? Millipore), και πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) (1:300 αραίωση? Dako) , όλη τη νύκτα στους 4 ° C, με φυσιολογική IgG ως αρνητικός μάρτυρας. Στη συνέχεια, τα πλακίδια επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με το συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (1:100? ΫΑΚΟ). δραστικότητα HRP ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα υγρό DAB + Substrate-Chromogen System (ϋΑΚΟ). Τέλος, οι τομές με αιματοξυλίνη και φωτογραφήθηκαν. Τα αποτελέσματα ανοσοϊστοχημικές αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μία ημιποσοτική μέθοδο, με τα τελικά αποτελέσματα με βάση την ένταση και το ποσοστό των θετικών επιθηλιακών κυττάρων προσδιορίστηκε με ανοσοχημείας τους? Αυτά τα αποτελέσματα ταξινομήθηκαν ως «αρνητική» (& lt? 3) ή «θετική» (≥3) [17]. Τα επίπεδα PCNA βαθμολογήθηκαν σύμφωνα με το ποσοστό των θετικών επιθηλιακών κυττάρων ως «0» για ≤5%? «1» για το 5% -25%? «2» για το 25% -50%? «3» για ≥50%. Τα δείγματα ταξινομήθηκαν σε ομάδες με «χαμηλή πολλαπλασιαστική δείκτη» (& lt? 2) ή «υψηλό δείκτη πολλαπλασιασμού» (≥2) [13], [17]. Οι ανοσοϊστοχημικές αποτελέσματα στη συνέχεια αναλύονται περαιτέρω με τα δεδομένα παρακολούθησης.

Cell Culture

Οι κυτταρικές σειρές PDAC Capan-2, SW-1990, και Panc-1, για καλά (Grade 1) , μέτρια (βαθμός 2), και κακώς (βαθμού 3) διαφοροποιούνται καρκίνο του παγκρέατος, αντίστοιχα, ελήφθησαν από το κινεζικό Κέντρο για Type Culture Collection (Wuhan, Κίνα). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο Dulbecco (συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό) και διατηρήθηκαν σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C σε έναν επωαστήρα.

Πλασμίδια και διαμόλυνσης κυττάρων

Οι κυτταρικές σειρές PDAC Capan-2, SW-1990, και Panc-1 σπάρθηκαν σε 3 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων, και επιμολύνθηκαν με μιμείται miR-26a, αναστολείς, ή κυκλίνη Ε2 siRNA (Dharmacon) σε τελική συγκέντρωση 100 ηΜ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

miR-26a φορέα υπερέκφραση ρ-hTERT-miR-26a (ρΤΜ) και φορέα ελέγχου του ρ-hTERT (pT) κατασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [12]. Για να δημιουργηθούν σταθερές κυτταρικές σειρές, 4 × 10

5 κύτταρα σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 6-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με 2 μα πλασμιδίων (ρΤΜ ή pT) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Θετικές καλλιέργειες επιλέχθηκαν με 800 μg /ml G418 για 2 εβδομάδες.

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS, λύθηκαν, και αιωρούνται σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Promega). Το προκύπτον ολικό εκχύλισμα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη επί πολυβινυλιδενο φθορίδιο μεμβράνες. Οι πρωτογενείς και δευτερογενείς αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα κουνελιού και μια IgG αντι-κουνελιού κατσίκας, αντίστοιχα (Sigma). Ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός χημειοφωταύγειας υποστρώματος HRP-based [18]. Πίνακας S2 απαριθμεί τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού κύκλου Δοκιμασίες

Το πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων αναλύθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κυττάρου Μετρώντας Kit-8 (CCK-8 ) δοκιμασία (Dojindo, Ιαπωνία). Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, συλλέγονται με φυγοκέντρηση, σταθεροποιήθηκαν σε 70% ψυχρής αιθανόλης, επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και αναλύθηκαν με κύτταρο ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή (Miltenyi, Germany).

Σε vivo

Ογκογένεση Δοκιμασία

SW-1990 κύτταρα από μετρίως διαφοροποιημένων PDAC ήταν σταθερά επιμολυσμένα με ρΤΜ (p-hTERT-miR-26a) ή pt (φορέας ελέγχου). Τα επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν, εναιωρήθηκαν σε 200 μΙ PBS (1 χ 10

7 κύτταρα), και ενέθηκαν υποδορίως σε 4 εβδομάδων αρσενικά BALB /c γυμνά ποντίκια (

n

= 8). Για να αποφευχθούν οι διαφορές μεταξύ των επιμέρους προϋπάρχουσες ποντίκια, τόσο τις σταθερές κυτταρικές σειρές (ρΤΜ ή pT) μεμονωμένα ένεση σε απέναντι πλευρές του ίδιου ποντικού? κύτταρα επιμολυσμένα με ρΤΜ εγχύθηκαν μέσα στην αριστερή πλευρά, ενώ οι έλεγχοι (επιμολυσμένα με τον φορέα pT) εγχύθηκαν στο δεξί πλευρό. Οι ποντικοί διατηρήθηκαν σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο περιβάλλον χωρίς για 5 εβδομάδες και στη συνέχεια θυσιάστηκαν. Ο όγκος του όγκου

V

υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το μήκος του

L

και πλάτος

W

, σύμφωνα με την εξίσωση

V

= 0,4

LW

2. Οι όγκοι ξενομοσχεύματος ποντικού μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε κερί παραφίνης για την ανοσοχημική ανάλυση της κυκλίνης D2, Ε2, και PCNA.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση ( SD). Οι ενώσεις της έκφρασης miR-26a με τα κλινικά παθολογικά χαρακτηριστικά αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Chi-τετράγωνο ή Mann-Whitney τεστ. Η καμπύλη επιβίωσης κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Ομάδες συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μαθητή

t-test

. ανάλυση συσχέτισης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση συσχέτισης Pearson. Όλες οι τιμές πιθανοτήτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα two-tailed test και θεωρείται σημαντική όταν

P

& lt? 0,05. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS (έκδοση 17.0) του λογισμικού (SPSS Inc., Chicago, ΗΠΑ).

Αποτελέσματα

Ελάττωση του miR-26a σε καρκίνο του παγκρέατος ιστούς συνδέεται με την επιβίωση

τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των 106 περιπτώσεων PDAC παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Η πλειοψηφία αυτών των ασθενών ήταν Στάδιο II (70,8%), υποδεικνύοντας ότι τα ευρήματα είναι σημαντικά για τους ασθενείς οι οποίοι εξακολουθούν να είναι χειρουργικά χειρουργήσιμη με την καλύτερη ευκαιρία για μια 5-ετή επιβίωση. qRT-PCR ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση miR-26a ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ιστούς PDAC ό, τι σε φυσιολογικούς ιστούς (

n =

15,

P

& lt? 0,05? Εικ. 1Α), η οποία ήταν ακόμη επιβεβαιώνεται από την ανάλυση LNA-ish των 106 περιπτώσεων PDAC. LNA-ISH έδειξαν ότι miR-26a ήταν παρούσα στο κυτταρόπλασμα του παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα (Σχ. 1C και 1D). Σύμφωνα με τις βαθμολογίες έντασης και το ποσοστό των κριτηρίων βαθμολογίας ISH [17], 44 του 106 (41.5%) του παγκρέατος καρκινικούς ιστούς και 84 του 106 (79%) πλησίον φυσιολογικούς ιστούς (ISH ≥3?

P

& lt? 0.001) ήταν θετικά για miR-26a. έκφραση miR-21 ως θετικός έλεγχος αναλύθηκε στους ίδιους ασθενείς. miR-21 ήταν θετική σε 99 από τα 106 (93,4%) σε ιστούς PDAC και σε 25 από τα 106 (23,6%) πλησίον των φυσιολογικών ιστών, με βάση τα κριτήρια βαθμολόγησης ISH (Σχήματα 1Ε και 1Ρ?. ISH ≥3?

P

& lt? 0,01). Η σχέση των κλινικών χαρακτηριστικών με την έκφραση του miR-26a σε ιστούς PDAC, όπως καθορίζεται από LNA-ish, παρουσιάζεται στον Πίνακα 2.

(α) Μέσο επίπεδο έκφρασης του miR-26a σε ανθρώπινα δείγματα PDAC (

n

= 15) και η κανονική του παγκρέατος ιστούς (

n

= 15). miRNA αφθονία εκτιμήθηκε με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς U6 RNA. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. (Β) Η συνολική επιβίωση μετά από εκτομή του καρκίνου του παγκρέατος με το miR-26a-αρνητικά έναντι miR-26a-θετική ομάδες. Το miR-26a-αρνητική ομάδα είχαν σημαντικά μικρότερη επιβίωση από το miR-26a-θετική ομάδα (

P

= 0,029). (C, D)

In situ υβριδισμού

για miR-26a σε παγκρεατικά βλάβες.

Η in situ υβριδοποίηση έδειξε

πολύ χαμηλότερη έκφραση miR-26a σε PDAC ιστούς (C) σε σχέση με ABPT (D). Το ένθετο δείχνει τον αρνητικό μάρτυρα (ομελέτα ανιχνευτής ακολουθίας). Κυτταροπλασματική χρώση στα επιθηλιακά κύτταρα του πόρου έρχεται σε αντίθεση με την αρνητική χρώση με το περιπλεγμένο ανιχνευτή. (Ε, F)

Η in situ υβριδοποίηση

για miR-21 (θετικός έλεγχος) σε παγκρεατικά αλλοιώσεις.

Η in situ υβριδοποίηση έδειξε

πολύ ισχυρότερη έκφραση miR-21 σε ιστούς PDAC (Ε) από ό, τι σε ABPT (F). Το ένθετο δείχνει τον αρνητικό μάρτυρα (ομελέτα ανιχνευτής ακολουθίας). Κυτταροπλασματική χρώση σε κύτταρα όγκου έρχεται σε αντίθεση με την αρνητική χρώση του κωδικοποιημένα ανιχνευτή. Αρχική μεγέθυνση, 100 ×.

Η

Η

Συνέχεια δεδομένα που προέκυψαν από 73 από τους 106 ασθενείς έδειξε ότι συνολικά 18 ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με επικουρική χημειοθεραπεία γεμσιταβίνης και οξαλιπλατίνη, ενώ οι υπόλοιποι 55 ασθενείς δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Μεταξύ των 73 ασθενών που έλαβαν παρακολούθησης, 68 πέθαναν, με 16 ασθενείς που λαμβάνουν χημειοθεραπεία και 52 χωρίς επιπρόσθετη θεραπεία. Ωστόσο, 5 από τους ασθενείς 73 παρακολούθησης επέζησε. Η μετρούμενη συνολική επιβίωση ήταν ειδική για τον καρκίνο? ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης ήταν 8,7 μήνες στην miR-26a-αρνητική ομάδα (& lt? 3?

n

= 43) και 12 μήνες στην miR-26a-θετική ομάδα (≥3?

n

= 30). Τα ποσοστά επιβίωσης 1- και 3-χρόνου ήταν 39.5% και 0%, αντίστοιχα, σε ΜΙΚ-26α-αρνητικών ομάδα, αλλά ήταν 50% και 6,3%, αντίστοιχα, σε ΜΙΚ-26α-θετική ομάδα. Η συνολική ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι το miR-26a-αρνητική ομάδα είχαν σημαντικά μικρότερη επιβίωση από την θετική ομάδα (

P

= 0,029, σχ. 1Β). Επικουρική χημειοθεραπεία δεν συσχετίστηκε με την επιβίωση των ασθενών με PDAC (

P =

0,417). Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης miR-26a και άλλες παραμέτρους (όπως η ηλικία, το φύλο, όγκο μάζα θέση, το μέγεθος του όγκου, της διαφοροποίησης των κυττάρων του όγκου, νευρικά εισβολή, αριθμός κόμβου λέμφου, μακρινή μετάσταση) δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Πίνακας 2). Το (μοντέλο παλινδρόμησης Cox) πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης των συμβατικών κλινικών προγνωστικών παραγόντων και miR-26a ισχυρίστηκε ότι το miR-26a είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τον καρκίνο του παγκρέατος (

P =

0.001? 95% CI, 0,185 έως 0,650? Πίνακας 3).

η

κυκλίνης D2, κυκλίνη Ε2, και PCNA Immunochemistry σε καρκίνο του παγκρέατος ιστούς και την ένωσή τους με την επιβίωση

τα ανοσοχρωματισμένη δείγματα ιστού αποκάλυψε ότι τόσο τα κύτταρα του όγκου και του αγωγού επιθηλιακών κύτταρα των παρακείμενων καλοήθεις παγκρεατικούς ιστούς δεν εκφράζουν κυκλίνη D2 (Σχ. 2Α και 2D). Ωστόσο, η κυκλίνη Ε2 εμφανίζεται ισχυρή θετική χρώση στα κύτταρα όγκου (90/106) και αγωγός επιθηλιακά κύτταρα των παρακείμενων καλοήθους παγκρεατικών ιστών (76/106?

P

= 0.024? Τα Σχ. 2Β και 2Ε). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο συνολικό ποσοστό επιβίωσης μεταξύ των ασθενών 73 παρακολούθησης οι οποίοι ήταν θετικοί (

n =

61) ή αρνητικά (

n =

12) για την κυκλίνη Ε2 (

P

= 0,676? Σχ. 2G). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται PCNA-θετική χρώση για κύτταρα όγκου (93/106) και για αγωγό επιθηλιακά κύτταρα των παρακείμενων καλοήθους παγκρεατικών ιστών (68/106?

P

& lt? 0,01). Η ισχυρή θετική χρώση PCNA σε PDAC ιστούς έδειξε μια υψηλότερη πολλαπλασιαστική δραστικότητα των κυττάρων σε καρκίνο του παγκρέατος (σχ. 2C και 2F), σε σύγκριση με αρνητική χρώση σε παρακείμενα φυσιολογικούς ιστούς. Η συνολική ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι οι περιπτώσεις των οποίων ο δείκτης PCNA υψηλή πολλαπλασιαστική (

n

= 51) σε ιστούς PDAC είχαν σημαντικά μικρότερη επιβίωση από τις περιπτώσεις που με PCNA χαμηλή πολλαπλασιαστική δείκτη (

n =

22?

P

= 0,007, σχήμα 2Η).. Οι ασθενείς με υψηλό δείκτη πολλαπλασιασμού PCNA ήταν επίσης θετικός κυκλίνης Ε2.

Οι ιστοί όγκου PDAC (PDAC) ήταν αρνητικά για κυκλίνη D2 (Α) και ισχυρά θετικά για κυκλίνη Ε2 (Β), με μία πολλαπλασιαστική υψηλό δείκτη PCNA (ΝΤΟ). Τα παρακείμενα καλοήθη παγκρεατικών ιστών (ABPT) ήταν αρνητικά για κυκλίνη D2 ήταν (D), και θετικά για κυκλίνη Ε2, όπως παρατηρείται στα επιθηλιακά κύτταρα του πόρου του ABPT (Ε). PCNA ήταν πολύ χαμηλή σε φυσιολογικούς ιστούς του παγκρέατος (F). Τα ένθετα των Α, Β, και Γ δείχνουν τις αρνητικούς μάρτυρες. Το ένθετο στο D δείχνει ότι η κυκλίνη D2 είναι ένας θετικός έλεγχος του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Αρχική μεγέθυνση, 200 ×. Συνολική επιβίωση μετά την εκτομή του καρκίνου του παγκρέατος με την cyclinE2-θετικά έναντι αρνητικών cyclinE2 ομάδες δεν ήταν σημαντική (

P

= 0,676) (G), υπόψη ότι η συνολική επιβίωση μετά από εκτομή του καρκίνου του παγκρέατος με το δείκτη υψηλή πολλαπλασιαστική PCNA έναντι PCNA ομάδες χαμηλό δείκτη πολλαπλασιασμού είχαν σημαντικά μικρότερη επιβίωση (

P

= 0,007) (H).

Η

μια ανάλυση συσχέτισης τόσο για miR-26a και της έκφρασης της κυκλίνης Ε2 (συντελεστής Pearson,

R

2

= 0.004) και για miR-26a και έκφραση PCNA (

R

2

= 0.024), έδειξε μια σημαντική σχέση. Τα διαγράμματα διασποράς της ανάλυσης συσχέτισης παρουσιάζονται στο Σχήμα S1.

miR-26a υπερέκφραση ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος από τη ρύθμιση προς τα κάτω της κυκλίνης Ε2 και ΕΖΗ2 Έκφραση

Για να διερευνήσει την επίδραση της miR-26a επί του παγκρέατος ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, οι κυτταρικές σειρές PDAC με διαφορετικές ποιότητες Capan-2, SW-1990, και Panc-1 επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα μιμητικό miR-26a ή αναστολέα. Η ανάλυση qRT-PCR έδειξε ότι η μεταγραφή του miR-26a στην μιμητικό ομάδα ήταν σημαντικά αυξημένη (4,44-φορές σε Capan-2, 3.45-φορές σε SW-1990, και 3,59-φορές σε Panc-1), ενώ η μεταγραφή του miR-26a στην ομάδα αναστολέας ήταν σημαντικά μειωμένη (0,35-φορές σε Capan-2, 0.43-φορές σε SW-1990, και 0,44-φορές σε Panc-1), σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου γραμμών (

P

& lt? 0,05?. τα Σχ. 3A-3C)

η ανάλυση qRT-PCR έδειξαν την μεταγραφή του miR-26a σε μιμείται, αναστολέα, και ομάδες ελέγχου (Α, Β, C), και ο έκφραση της κυκλίνης Ε2 σε κυκλίνης Ε2 siRNA, ελέγχουν siRNA, και ομάδες ελέγχου (D, E, F). Ο πολλαπλασιασμός των κυτταρικών σειρών PDAC παροδικά επιμολυσμένα με μιμείται miR-26a, αναστολέας miR26a ή κυκλίνης Ε2 siRNA αναλύθηκε με την δοκιμασία πολλαπλασιασμού CCK-8 (G, H, I). Η ρύθμιση της κυκλίνης έκφρασης Ε2 ή ΕΖΗ2 με miR-26a αναλύθηκε με κηλίδα Western (J, K, L), και ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε επίσης την αναμενόμενη αποτελεσματικότητα της κυκλίνης Ε2 siRNA σε τρία PDAC κυτταρικές γραμμές (Μ, Ν, Ο) .

η

για να διερευνήσει την επίδραση της κυκλίνης Ε2 επί του παγκρέατος ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, η κυκλίνη Ε2 siRNA διαμολύνθηκε σε καθένα από τα τρία PDAC κυτταρικές σειρές, και ο knockdown επιβεβαιώθηκε με ανάλυση qRT-PCR, η οποία έδειξε ότι η έκφραση της κυκλίνης Ε2 στην ομάδα siRNA επιμολυσμένα ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (0,201-φορές σε Capan-2, 0.274-φορές σε SW-1990, και 0.327-φορές σε Panc-1) (Σχ. 3D -3F).

Για να καθοριστεί ο ρόλος του miR-26a σε παγκρεατικά ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, η δοκιμασία πολλαπλασιασμού CCK-8 διεξήχθη σε Capan-2, SW-1990, και τα κύτταρα Panc-1 που επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα μιμητικό miR-26a ή αναστολέα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miR-26a-μιμείται ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου, ενώ η miR26a αναστολέα προωθείται ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου. Επιπλέον, η κυκλίνη Ε2 siRNA είχε έναν παρόμοιο ρόλο ως miR-26a-μιμούνται στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου (Σχ. 3G-3θ).

miR-26a αναφέρθηκε ότι μεσολαβεί άμεσα την κυκλίνη Ε2 και κυκλίνη λειτουργίες D2 σε HCC [12] και του καρκίνου του μαστού [19]. Η έκφραση της πρωτεΐνης Polycomb ΕΖΗ2 αυξήθηκε σε PDAC, η οποία κατά συνέπεια αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και χημειοαντίσταση [20]. Ωστόσο, οι μελέτες μας έδειξαν ότι η κυκλίνη D2 χρώση ήταν σχεδόν αρνητικός σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς. Έτσι, η σχέση μεταξύ miR-26a και κυκλίνης Ε2 ή ΕΖΗ2 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδες Western. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η κυκλίνη Ε2 επίπεδα και ΕΖΗ2 ήταν και οι δύο μειώθηκαν στα κύτταρα μιμούνται-επιμολυσμένα miR-26a, αλλά αυξήθηκαν σε ΜΙΚ-26α αναστολέα-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 3J-3L) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Η ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε την αναμενόμενη αποτελεσματικότητα της κυκλίνης Ε2 siRNA στις τρεις PDAC κυτταρικές γραμμές (Σχ. 3Μ-3Ο).

Στη συνέχεια, αναλύσαμε την κατανομή κυτταρικού κύκλου του Capan-2, SW-1990, και Panc-1 κύτταρα που επιμολύνθηκαν με μιμείται miR-26a ή τον αναστολέα miR-26a, καθώς και τους ελέγχους. Τα κύτταρα επιμολυσμένα με το μιμητικό miR-26a συσσωρευτεί στο

1 φάση G, ενώ πληθυσμού φάση S μειωθεί. Ωστόσο, ένα αντίθετο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον αναστολέα miR-26a (Εικ. 4). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η πολλαπλασιαστική αναστολή της miR-26a ήταν εν μέρει οφείλεται σε μια G

σύλληψης 1-φάση των τριών παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές.

Τα κύτταρα είτε επιμολύνθηκαν με μιμείται miR-26a ή αναστολείς. Οι έλεγχοι αφέθηκαν χωρίς θεραπεία. D, H, και L δείχνουν την κατανομή του κύκλου στατιστική κυττάρων για Capan-2, SW-1990, και Panc-1, αντίστοιχα.

Η

έκτοπη έκφραση του miR-26a Αναστολή του παγκρέατος ανάπτυξη του καρκίνου σε άτριχα ποντίκια

Ο

in vivo δοκιμασία

ογκογένεση αποκάλυψε ότι η ανάπτυξη του όγκου ήταν σημαντικά βραδύτερη σε άτριχα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με τα ρΤΜ-επιμολυσμένα SW-1990 κύτταρα, σε σύγκριση με άτριχα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με το pT-επιμολυσμένα SW -1990 κύτταρα (Σχ. 5Α). Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε από τις μετρήσεις του όγκου του όγκου σε 5 εβδομάδες (Εικ. 5Β). Το επίπεδο Ε2 κυκλίνης ήταν πολύ χαμηλότερη σε ιστούς όγκων που υπερεκφράζουν το miR-26a και η έκφραση PCNA ακολούθησε παρόμοια τάση. Κυκλίνη D2 παρέμεινε απαρατήρητα στους όγκους (Σχήματα 5C-5Η.)

(Α) Nude ποντίκια εμβολιάστηκαν υποδορίως με SW-1990 κύτταρα επιμολυσμένα με ρΤΜ (PTM: πλασμίδιο hTERT-miR-26a). Ή Pt ( pT: Η hTERT πλασμίδιο ελέγχου), στην πλευρά τους. Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική των όγκων που σχηματίζονται σε 8 ποντίκια. καμπύλες (Β) αύξηση του όγκου του όγκου. Το γράφημα είναι αντιπροσωπευτική της ανάπτυξης του όγκου, 5 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε και όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± S.D. (

n

= 8). (C-H) έκφραση της κυκλίνης D2, κυκλίνη Ε2, και PCNA μετρήθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε ιστούς ποντικών εμβολιάστηκαν με pTM- επιμολυσμένα SW-1990 κύτταρα ή τα κύτταρα ελέγχου. Τα ένθετα σχήμα σε C, Ε και G δείχνουν ένα αρνητικό πεδίο ελέγχου. Κύτταρα χρωματισμένα καφέ δείχνουν θετική χρώση. Αρχική μεγέθυνση, 200 ×.

Η

Συζήτηση

Η ώριμη αλληλουχία του miR-26a παρατηρείται σε 3

σ

23, το οποίο είναι ένα εύθραυστο χρωμοσωμική περιοχή που σχετίζεται με διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [21] – [23]. Περίπου το ήμισυ όλων των ανθρώπινων miRNAs βρίσκονται σε περιοχές του γονιδιώματος που συνδέεται με καρκίνο? Έτσι, μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκοκατασταλτικού ή ογκογόνο miRNAs, ανάλογα με τους στόχους τους [3] – [5]. Έτσι, miR-26a μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο σε γλοιώματα, αλλά χρησιμεύει ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του ήπατος [12], [23] – [26]. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, υπάρχουν περιορισμένες αναφορές σχετικά με το ρόλο και την ογκογένεση του miR-26a στον καρκίνο του παγκρέατος.

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η έκφραση του miR-26a σημαντικά προς τα κάτω σε ιστούς PDAC σε σύγκριση με το εκείνη του ABPT. Για την περαιτέρω διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών προώθησης της ανάπτυξης των κυττάρων με miR-26a προς τα κάτω ρύθμιση στον παγκρεατικό ιστό καρκίνου, αναλύσαμε το ρόλο του miR-26a υπερέκφραση ή downexpression στον πολλαπλασιασμό παγκρεατικού καρκίνου των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου, και την ανάπτυξη του όγκου ,. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης της miR-26a επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των τριών κυτταρικών γραμμών PDAC διαφορετικών ποιοτήτων. επίπεδα miR-26a συνδέθηκαν με G

1 σύλληψης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, miR-26a υπερέκφραση SW-1990 κύτταρα καταστέλλονται παγκρεατικών ογκογένεση σε γυμνά ποντίκια, τα οποία αποδεικνύουν ότι λειτουργεί miR-26a ως καταστολέας όγκου σε αυτόν τον τύπο καρκίνου.

Η κυκλίνη D2 και της κυκλίνης Ε2 είναι απαραίτητες ρυθμιστικές του G

1-προς-S μετάπτωσης φάσης κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Αυτές οι κυκλίνες παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον σε καρκίνο του παγκρέατος. Kota [11] και Zhou [27] ανέφεραν ότι miR-26a ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση άμεσα της κυκλίνης D2 και Ε2 mRNA κυκλίνης σε HCC. Έτσι, και τα δύο γονίδια είναι πιθανοί στόχοι miR-26a σε καρκίνο του παγκρέατος. Από την άλλη πλευρά, τα επίπεδα ΕΖΗ2 αυξήθηκαν σε PDAC να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και χημειοαντίσταση [20]. Ως εκ τούτου, προσδιορίσαμε αν miR-26a θα μπορούσε να ρυθμίσει τον καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικού κύκλου μέσω των γονιδίων στόχων του, κυκλίνη D2 και κυκλίνης Ε2. Η κυκλίνη D2 δεν ανιχνεύθηκε στα καρκινικά κύτταρα και αγωγός επιθηλιακά κύτταρα του ABPT, ενώ κυκλίνης Ε2 συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση miR-26a σε καρκίνο του παγκρέατος. Κυκλίνης Ε2 μειώθηκε με miR-26a αυξητική ρύθμιση στο Capan-2, SW-1990, και τα κύτταρα Panc-1. Οι επιδράσεις που παρατηρήθηκαν στην έκφραση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυκλίνης Ε2 ήταν σύμφωνες με αυτές που παρατηρούνται για ΕΖΗ2 σε PDAC κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι miR-26a προς τα κάτω ρύθμιση οδήγησε στην προς τα πάνω ρύθμιση της κυκλίνης Ε2 και ΕΖΗ2, αλλά όχι από την κυκλίνη D2, σε PDAC ιστούς. Έτσι, η μειωτικά miR-26a συνέβαλε στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την κακή επιβίωση στον καρκίνο του παγκρέατος. Αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με τις μελέτες επί άλλων όγκων, όπως HCC, ο καρκίνος του μαστού, NPC και λεμφωμάτων [12], [27] – [30]. Η αλλαγμένη έκφραση ειδικών miRNAs σε όγκους φέρεται συνδέεται με τη μετάσταση καρκίνου και φτωχή πρόγνωση [29] – [32]. Heinzelmann et al., [33] εντόπισε μια υπογραφή miRNA που διακρίνει μεταξύ των μεταστατικών και μη μεταστατικό σαφές καρκινώματα των νεφρικών κυττάρων. Μια ομάδα 12 miRNAs, συμπεριλαμβανομένης της οικογένειας let-7, miR-30c, και miR-26a, βρέθηκαν να μειωθεί σε εξαιρετικά επιθετική πρωτογενή μεταστατικούς όγκους.