Αφηρημένο

Σκοπός

Παρά την έλευση της FDA-εγκεκριμένων θεραπευτικών σε περιορισμένο αριθμό διαθέσιμων στόχων (κινάσες και mTOR), PFS του καρκίνου των νεφρών (RCC) έχει παραταθεί μόνο ένα με δύο χρόνια λόγω της ανάπτυξης της ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Εδώ, έχουμε αξιολογήσει ένα νέο θεραπευτικό για RCC που στοχεύει το (XPO1) αναστολέα exportin-1.

Υλικά και Μέθοδοι

κύτταρα RCC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με από του στόματος διαθέσιμος αναστολέας XPO1, KPT-330, και η κυτταρική βιωσιμότητα και αννεξίνης V (απόπτωση) δοκιμασίες, και του κυτταρικού κύκλου αναλύσεις διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα του KPT-330 σε δύο κυτταρικές γραμμές RCC. Ανοσοκηλίδωση και ανάλυση ανοσοφθορισμού διεξήχθησαν για την επικύρωση των μηχανισμών αναστολής XPO1. Η αποτελεσματικότητα και η on-στόχος επιδράσεις της KPT-330 αναλύθηκαν περαιτέρω in vivo σε ποντίκια ξενομόσχευμα RCC, και KPT-330-ανθεκτικά κύτταρα καθορίστηκαν για την αξιολόγηση πιθανών μηχανισμών του KPT-330 αντοχή.

Αποτελέσματα

KPT-330 εξασθενημένα RCC βιωσιμότητα μέσω της αναστολής της ανάπτυξης και επαγωγή απόπτωσης τόσο in vitro και in vivo, μια διαδικασία στην οποία αυξήθηκε πυρηνικό εντοπισμό του ρ21 με αναστολή XPO1 έπαιξε σημαντικό ρόλο. Επιπλέον, KPT-330 ανθεκτικά κύτταρα παρέμειναν ευαίσθητα με το σήμερα εγκεκριμένο για multi-κινάσης αναστολείς RCC (sunitinib, sorafenib) και αναστολείς mTOR (everolimus, temsirolimus), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές οι στοχευμένες θεραπευτικές ουσίες θα παραμείνει χρήσιμος ως δεύτερη θεραπευτική γραμμή μετά από KPT-330 θεραπείας.

Συμπέρασμα

Η από του στόματος διαθέσιμη αναστολέας XPO1, KPT-330, αντιπροσωπεύει ένα νέο στόχο για RCC των οποίων in vivo αποτελεσματικότητα προσεγγίζει εκείνη του sunitinib. Επιπλέον, τα κύτταρα ανθεκτικά στην KPT-330 διατηρούν την ικανότητά τους να ανταποκρίνονται στις διαθέσιμες θεραπευτικές ουσίες RCC προτείνοντας μια νέα προσέγγιση για τη θεραπεία σε KPT-330-αφελής καθώς και ανθεκτικών ασθενών RCC

Παράθεση:. Wettersten HI, Landesman Υ, Friedlander S, Shacham S, M Kauffman, Weiss RH (2014) ειδική αναστολή του πυρηνικού εξαγωγέας Exportin-1 εξασθενεί Νεφρού Καρκίνος Ανάπτυξης. PLoS ONE 9 (12): e113867. doi: 10.1371 /journal.pone.0113867

Επιμέλεια: Ντχιάνι Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Ιουνίου 2014? Αποδεκτές: 31 του Οκτώβρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 2 Δεκ, 2014

Copyright: © 2014 Wettersten et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί 5UO1CA86402, 1R01CA135401-01A1 και 1R01DK082690-01A1 και από Karyopharm Therapeutics. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ενώ ορισμένες από τις εργασίες χρηματοδοτήθηκε, και μερικοί από τους συντάκτες που απασχολούνται, με Karyopharm , αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Επιπλέον, κανένα από τα πειράματα ή τα συμπεράσματα του χαρτιού επηρεάζεται κατά κανένα τρόπο από Karyopharm

Εισαγωγή

Νεφρού του καρκίνου (νεφροκυτταρικό καρκίνωμα? RCC). Είναι το 13

ου πιο κοινή μορφή καρκίνου παγκοσμίως και είναι ένας από τους λίγους καρκίνους του οποίου η συχνότητα αυξάνεται, η διαπίστωση όχι μόνο λόγω των βελτιωμένων διαγνωστικών τεχνικών [1], [2]. Τα σημάδια και τα συμπτώματα του RCC είναι συχνά λεπτές ή ακόμη και απούσα, έτσι ώστε περισσότερο από το ήμισυ των ασθενών που διαγιγνώσκονται παρεμπιπτόντως, και συχνά στο μεταστατικό στάδιο, ενώ αξιολογείται για άλλες ασθένειες όπως οξεία νεφρική βλάβη [3]. Ενώ η πενταετής επιβίωση για αυτούς που παρουσιάζουν με εντοπισμένο RCC είναι περισσότερο από 70%, για εκείνους με μεταστατική νόσο, η πενταετής επιβίωση μειώνεται στο ένα μελαγχολική 16 έως 32%. Περίπου οι μισοί από τους ασθενείς RCC αναπτύξουν προχωρημένη νόσο και απαιτούν συστηματική θεραπεία. Παρά την έλευση αρκετών FDA-εγκριθεί στοχευμένη θεραπευτική κατά τα τελευταία αρκετά χρόνια, τα οποία περιορίζονται σε multi-κινάσης αναστολείς και οι αναστολείς mTOR, ελεύθερη εξέλιξης επιβίωση (PFS) επεκτείνεται μόνο ένα με δύο χρόνια με αυτές τις στοχευμένες θεραπευτικά οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στην ανάπτυξη αντοχής φαρμάκου [4]. Έτσι, είναι κρίσιμης σημασίας για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στόχων για άλλες από κινάσες και το μονοπάτι mTOR

ρ21 περιγράφηκε αρχικά ως αναστολέας κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση (ΟΚΙ) της κυκλίνης-CDK2, -CDK1, και. – CDK4 /6 συμπλέγματα των οποίων η έκφραση ρυθμίζεται από κλασικά p53 [5]. Ωστόσο, με την πάροδο των ετών έχει αποδειχθεί ότι έχει πλειοτροπικές, και μερικές φορές φαινομενικά αντιφατική, αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση, και γήρανση σε καρκίνο και σε αγγειακή νόσο ανεξάρτητα από ρ53 [5], [6]. Σε γενικές γραμμές, όταν ρ21 εντοπίζεται εντός του πυρήνα, αυτός συνδέεται με τα σύμπλοκα κυκλίνης-ΟϋΚ αναστέλλοντας έτσι την λειτουργία τους στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, με αποτέλεσμα διακοπή του κυτταρικού κύκλου [5]. Ωστόσο, όταν ρ21 εντοπίζεται εντός του κυτοσολίου διαμέρισμα, αναστέλλει την απόπτωση δια συμπλοκοποιήσεως με προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως προ-κασπάσης-3 ή ASK [7], [8]. Σύμφωνα με αυτές τις υποθετικές μηχανισμούς, προηγούμενη δουλειά στο εργαστήριο μας απέδειξε ότι η αυξημένη κυτοσολικό p21 είναι ένας δείκτης της κακής πρόγνωσης σε ασθενείς με RCC [9], ένα εύρημα που παρατηρήθηκε επίσης σε άλλους καρκίνους [10], [11].

Η πυρηνική εξαγωγέας, exportin11 (XPO1? CRM1), ελέγχει την πυρηνο-κυτταροπλασματική εντόπιση της περισσότερο από 200 πυρηνική εξαγωγή σήματος (NES) που περιέχει πρωτεΐνες, πολλές από τις οποίες είναι πρωτεΐνες καταστολής όγκου (κουταλιές), συμπεριλαμβανομένων των ρ21 [12]. Έχει δειχθεί προηγουμένως ότι οι αναστολείς XPO1 έχουν θεραπευτικό αποτέλεσμα σε RCC [13]. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάσαμε την αποτελεσματικότητα του KPT-330, από του στόματος διαθέσιμος αναστολέας XPO1 η οποία βρίσκεται σε φάση Ι /ΙΙ κλινικών δοκιμών, για να αξιολογηθεί πιθανή κλινική της, είτε μεμονωμένα είτε ως θεραπεία συνδυασμού, σε προχωρημένο RCC. Θα δείξουμε τώρα ότι, πιθανότατα μέσω ενός μηχανισμού που σχετίζονται με υποκυτταρικός εντοπισμός του p21, το στόμα-διαθέσιμος αναστολέας XPO1 αντιπροσωπεύει μια βιώσιμη νέα θεραπευτική ενεργεί σε αδοκίμαστες στόχο μέχρι τώρα στο RCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

Οι κυτταρικές γραμμές RCC ACHN και 786-Ο ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD) και αξιολογούνται τακτικά για την παρουσία Mycoplasma. Τα φυσιολογικά κύτταρα ανθρώπινου νεφρού εγγύς επιθηλιακά (NHK) ελήφθησαν από την Lonza (Allendale, NJ). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 μονάδες /mL στρεπτομυκίνη, και 100 mg /mL πενικιλίνη σε 5% CO

2 στους 37 ° C. Αυτές οι δύο κυτταρικές γραμμές επιλέχθηκαν για να εξετάσουμε την αποτελεσματικότητα του KPT-330 σε αμφότερες πρωτοπαθή όγκο που προέρχεται κύτταρα (786-Ο? Η οποία μπορεί να θεωρηθεί «νωρίς» όγκους). Καθώς και μεταστατικά κύτταρα (ACHN)

Υλικά

Lipofectamine RNAiMAX αντιδραστηρίου επιμόλυνσης, Stealth RNAi αρνητικού ελέγχου siRNA, και Stealth RNAi XPO1 siRNA ελήφθησαν από την Life Technologies (Grand Island, Νέα Υόρκη). KPT-330 συντέθηκε με Karyopharm Therapeutics (Natick, ΜΑ). Sunitinib και sorafenib ελεύθερη βάση λήφθηκαν από LC Laboratories (Worburn, ΜΑ). Το everolimus και temsirolimus ήταν δώρα από τον Dr. Prasit στο Inception Sciences (San Diego, CA). Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-β-ακτίνης ελήφθησαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ). αντίσωμα αντι-κουνελιού πολυκλωνικό XPO1 και αντι-ρ53 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Mouse μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-p21WAF1 /CIP ελήφθη από την Millipore (Billerica, ΜΑ). Κουνέλι μονοκλωνικό αντι-p21WAF1 /CIP αντίσωμα και IgG αντι-κουνελιού (Η + L), F (ab ‘) 2 θραύσμα (Alexa Fluor 488 Σύζευγμα) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, ΜΑ). Goat αντι-ποντικού και αιγοειδών HRP αντι-κουνελιού συζευγμένο IgG ελήφθησαν από την Bio-Rad (Hercules, CA). Vectashield HardSet Τοποθέτηση Μεσαίο με DAPI ελήφθη από Vector Laboratories (Burlingame, CA).

KPT-330, το sunitinib, sorafenib, το everolimus, και temsirolimus διαλύθηκαν σε DMSO για in vitro μελέτες. KPT-330 συνδυάστηκε με οχήματα Πολοξαμερές 188 (Pluronic F68? Λαμβάνεται από την Spectrum Laboratory Products, Inc.) και ΡνΡ Κ-29/32 (Plasdone Κ-29/32? Λαμβάνεται από την ISP Technologies, Inc.) σε διάλυμα και sunitnib ήταν διαλυμένα σε φυτικό έλαιο για την in vivo μελέτη.

ανοσοαποτύπωσης

ανοσοαποτύπωσης ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Εν συντομία, μετά από κατάλληλη αγωγές, τα κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, και κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% άπαχο ξηρό γάλα για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και ανιχνεύθηκαν με κατάλληλα αντισώματα. Οι μεμβράνες μετά ανιχνεύθηκαν με HRP ετικέτα αντι-ποντικού ή αντισώματα αντι-κουνελιού IgG. Σήμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) λύσεις. πυκνομετρική ανάλυση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ 1.440 (https://imagej.nih.gov/ij) και, μετά από κανονικοποίηση για τον έλεγχο φόρτωσης (β-ακτίνη) υποδεικνύεται πάνω από κάθε ανοσοστύπωμα.

ανοσοφθορισμού

Μετά την ενδεικνυόμενη θεραπεία σε οκτώ διαφάνειες θάλαμο καλά, ανοσοφθορισμός πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και τοποθετήθηκαν σε ρυθμιστικό αποκλεισμού. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με την υποδεικνυόμενη αντίσωμα, επωάστηκαν με IgG αντι-κουνελιού (Η + L), F (ab ‘)

2 Fragment (Alexa Fluor 488 συζυγές), και καλυπτρίδα με Vectashield με DAPI. Τα δείγματα εξετάστηκαν με συνεστιακή μικροσκόπηση.

ΜΤΤ δοκιμασία

κυτταρική ανάλυση βιωσιμότητας διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων, και μετά από κατάλληλη επεξεργασία, τα κύτταρα επωάστηκαν σε διάλυμα ΜΤΤ μίγμα /media. Στη συνέχεια, το διάλυμα ΜΤΤ απομακρύνθηκε και το μπλε κρυσταλλικό ίζημα σε κάθε φρεάτιο διαλύθηκε σε DMSO. Ορατό απορρόφηση εκάστου φρεατίου στα 540 nm ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέσθηκε χρησιμοποιώντας το MUSE Κυττάρων Analyzer (Millipore, Billerica, ΜΑ) ακολουθώντας τον κατασκευαστή εντολή. Εν συντομία, μετά τις υποδεικνυόμενες θεραπευτικές αγωγές, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Μετά τη χρώση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση κύκλου κυττάρου

Annexin V δοκιμασία

αννεξίνης V & amp.? Dead Δοκιμασία Κυττάρων διεξήχθη χρησιμοποιώντας τον αναλυτή κυττάρων MUSE ακόλουθες οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, μετά από κατάλληλη αγωγές, τα κύτταρα επωάστηκαν με Αννεξίνη V και Αντιδραστήριο νεκρού κυττάρου (7-AAD) και τα γεγονότα για τους νεκρούς, αργά αποπτωτικά, πρώιμων αποπτωτικών και ζωντανά κύτταρα μετρήθηκαν.

Ανοσοϊστοχημεία

Biogenex I6000 αυτοματοποιημένη ανοσοκηλιδωτή χρησιμοποιήθηκε για τη διεξαγωγή IHC σε φορμόλη σταθερά ενσωματωμένα σε παραφίνη ξενομοσχεύματα. Αντιγόνο ανακτήθηκε στον ατμό με κινητό αντιδραστήριο Marque Declere. Φόντο αποκλείστηκε με μπλοκ εξουσίας Biogenex. Πρωτογενής αντίσωμα εφαρμόστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ακολουθούμενη από ανίχνευση με την δύο σταδίων, Ανίχνευση Hi-Def Polymer kit από την Cell Marque, ακολουθούμενη από Κυττάρων Marque DAB χρωμογόνο. Δείγματα με αιματοξυλίνη, αφυδατωμένα, εκκαθαρίζονται και καλύφθηκαν. Χρησιμοποιήσαμε τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: p21 (Abcam) και Ki67 (Cell Marque). Το κιτ Millipore απόπτωση χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών.

siRNA διαμόλυνση

Lipofectamine RNAiMAX αντιδραστήριο επιμόλυνσης αναμίχθηκαν με Stealth RNAi siRNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με το μίγμα σε μέσο ανάπτυξης χωρίς πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη για κατάλληλο χρονικό διάστημα για διαμόλυνση siRNAs και knockdown επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα.

ACHN πείραμα ξενομοσχεύματος ποντικού

Ο UC Davis Θεσμική Φροντίδας Ζώων και Χρήση Επιτροπής (IACUC) επιτροπή ενέκρινε ειδικά αυτή τη μελέτη. Όλες οι διαδικασίες ζώων πραγματοποιήθηκαν σε συμμόρφωση με το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια IACUC. Αρσενικοί αθυμικοί ποντικοί Νυ /Νυ το καθένα σε ένεση με 5 χ 10

5 κυττάρων ACHN υποδορίως στην περιοχή του πλευρού. Η πρόοδος του όγκου παρακολουθήθηκε εβδομαδιαία με ένα παχύμετρο (όγκος όγκου = μήκος χ πλάτος χ πλάτος /2). Όταν τα μεγέθη του όγκου έφτασε περίπου 80-100 mm

3, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε πέντε ομάδες (όχημα, sunitinib, KPT-330 χαμηλή ή υψηλή δόση, ή KPT-330 χαμηλού και sunitinib) για φαρμακευτικές αγωγές. Για την ομάδα οχήματος, διαλύματα όχημα (Pluronic F-68 και PVP Κ-29/32 μείγμα και φυτικό έλαιο) δόθηκε από το στόμα (δύο φορές την εβδομάδα και πέντε φορές την εβδομάδα, αντιστοίχως, η = 8). Για την ομάδα sunitinib, το διάλυμα όχημα για KPT-330, Pluronic F-68 και PVP Κ-29 μίγμα /32, και sunitinib (40 mg /kg) χορηγήθηκαν από το στόμα (δύο φορές την εβδομάδα και πέντε φορές την εβδομάδα, αντιστοίχως, η = 8) [15]. Για την ομάδα χαμηλής KPT-330, χαμηλή δόση KPT-330 (7,5 mg /kg) και το φυτικό έλαιο χορηγήθηκε από το στόμα (δύο φορές την εβδομάδα και πέντε φορές την εβδομάδα, αντιστοίχως, η = 8). Για την υψηλή ομάδα KPT-330, υψηλή δόση KPT-330 (15 mg /kg) και το φυτικό έλαιο χορηγήθηκε από το στόμα (δύο φορές την εβδομάδα και πέντε φορές την εβδομάδα, αντιστοίχως, η = 8). Για το KPT-330 χαμηλού και sunitinib ομάδα, χαμηλή δόση KPT-330 (7,5 mg /kg) και sunitinib (40 mg /kg) χορηγήθηκαν από το στόμα (δύο φορές την εβδομάδα και πέντε φορές την εβδομάδα, αντιστοίχως, η = 8). Μετά από 25 ημέρες θεραπείας, τα ζώα θυσιάστηκαν και οι ιστοί όγκων συλλέχθηκαν σε 10% φορμαλίνη για ανάλυση ανοσοϊστοχημείας.

Στατιστικές μέθοδοι

Για in vitro μελέτες, οι συγκρίσεις των μέσων τιμών πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του ανεξάρτητα δείγματα t-test. Μια τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Για την in vivo μελέτη, ανάπτυξη όγκου συγκρίθηκε ζεύγη μεταξύ όλων των θεραπειών χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Tukey HSD.

Αποτελέσματα

Εξασθένιση του XPO1 από KPT-330 αναστέλλει RCC βιωσιμότητα μέσω διακοπή του κυτταρικού κύκλου και επαγωγή απόπτωση

Εμείς επιβεβαίωσε κατ ‘αρχάς ότι KPT-330 εξασθενημένα επίπεδα XPO1 σε δύο κυτταρικές σειρές RCC σε μια παρόμοιου μεγέθους (0,1 μΜ) με αυτή που παρατηρήθηκε με προηγουμένως αναπτύξει αναστολείς του πυρηνικού μεταφορέα (Εικ. 1Α) [13]. Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της αναστολής XPO1 από KPT-330 προς την επιβίωση των κυττάρων, διαπιστώσαμε ότι κυτταρικής βιωσιμότητας σε απόκριση αυτού του αναστολέα ήταν εμφανής σε συγκέντρωση 0,1 μΜ σε κυτταρικές γραμμές RCC αλλά κατά μία τάξη μεγέθους μεγαλύτερη δόση (10 μΜ) σε φυσιολογικό νεφρική σωληναριακή επιθηλιακά (ΝΗΚ) κύτταρα (Σχ. 1Β), ένα εύρημα πιθανόν λόγω των αυξημένων επιπέδων XPO1 σε ιστούς RCC, σε σύγκριση με φυσιολογικό νεφρό ιστοί που δείξαμε προηγουμένως [13]. Για να αρχίσει η διερεύνηση των μηχανισμών της KPT-330 που προκαλείται από μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε RCC, ανάλυση απόπτωση κυτταρικού κύκλου και διεξήχθησαν. Όταν επωάζονται με KPT-330, και οι δύο κυτταρικές σειρές RCC παρουσίασαν αύξηση των κυττάρων στο G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου κατά περισσότερο από 10% (Σχ. 1 C), καθώς και ένα αποπτωτικό κλάσμα κυττάρων περίπου 10% (Εικ . 1D και Εικ. S1), υποδηλώνοντας ότι η μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων RCC με KPT-330 λαμβάνει χώρα μέσω δύο διακοπή του κυτταρικού κύκλου και η επαγωγή της απόπτωσης.

Τα κύτταρα RCC 786-O και ACHN αναπτύχθηκαν προς -60% συρροή και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με KPT-330 στην υποδεικνυόμενη δόσεις για 24 ώρες και ανοσοκηλίδωση πραγματοποιήθηκε με ειδικά αντισώματα (Α). RCC και NHK κύτταρα αναπτύχθηκαν προς -30% συρροή, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με KPT-330 στην υποδεικνυόμενη δόσεις για 72 ώρες, και προσδιορισμοί ΜΤΤ Διεξήχθησαν (Β). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου (C) και δοκιμασία αννεξίνης V (D) διεξήχθησαν μετά από 24 ώρες επώαση με DMSO (Cont) ή KPT-330 (1 μΜ). * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση.

Η

XPO1 αναστολή περιορίζεται ρ21 στον πυρήνα σε κύτταρα RCC, αλλά όχι σε μια φυσιολογική νεφρική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή

Αυξημένη ρ21 κυτοσολικές, η οποία έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει απόπτωση [5] και ως εκ τούτου πιθανόν να ματαιώσει επιτήρηση του όγκου, είναι ένας δείκτης της κακής πρόγνωσης για RCC [9]. Για το λόγο αυτό, και υπό το φως της γνωστή ιδιότητα των πυρηνικών p21 στην εξασθένηση εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, αναρωτηθήκαμε εάν πυρηνικής ρ21 απαιτείται για KPT-330 για να προκαλέσει τις παρατηρούμενες επιδράσεις στα κύτταρα RCC. Όταν απεικονίστηκαν με ανοσοφθορισμό κυτταροχημεία, ρ21 δείχθηκε να περιορίζεται στον πυρήνα μετά από τη θεραπεία KPT-330 σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές RCC (Εικ. 2Α) σε μεγάλο βαθμό. Σε συμφωνία με τα δεδομένα κυτταρικού κύκλου, KPT-330 απέτυχε να μεταβάλλει εντοπισμό του ρ21 στα κύτταρα ΝΗΚ (Σχήμα 2Α).? Αυτό μπορεί να εξηγήσει την αποτυχία της KPT-330 για να μειώσετε την επιβίωση στα φυσιολογικά κύτταρα και είναι σημαντικός για τη μελλοντική κλινική μετάφραση αυτών των ευρημάτων (

βλέπε κατωτέρω

). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα ρ21 είχαν αυξηθεί με KPT-330 σε κύτταρα RCC (Εικ. 2Β), υποδεικνύοντας ότι ρ21 δεν ήταν μόνο περιορίζεται στον πυρήνα από KPT-330 αλλά έδειξε επίσης αυξημένα επίπεδα, πιθανόν μεσολαβούν την παρατηρούμενη G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου ( βλέπε Σχ. 1C και [16]).

Τα κύτταρα RCC 786-O και ACHN αναπτύχθηκαν προς -60% συρροή και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με KPT-330 στην υποδεικνυόμενη δόσεις για 24 ώρες. Ανοσοφθορισμού πραγματοποιήθηκε με ομοεστιακό μικροσκόπιο (20χ) και ο αριθμός των κυττάρων στα οποία p21 ήταν κυρίως στον πυρήνα μετρήθηκαν σε τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία και διαιρείται με τον συνολικό αριθμό κυττάρων (Α). Ανοσοκηλίδωση επιτεύχθηκε με ειδικά αντισώματα (Β). Μπλε, πυρήνα (DAPI)? Πράσινο, p21. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση.

Η

siRNA αναστολή των XPO1 αυξήθηκε πυρηνικών p21 στα κύτταρα RCC

Για να καταδειχθεί η ειδικότητα του KPT-330 σε επίπεδα και τον εντοπισμό του p21, και ότι αυτά τα αποτελέσματα είναι λόγω XPO1 αναστολή, RCC κύτταρα (ACHN 786-O και) επιμολύνθηκαν με είτε ένα ειδικό siRNA για XPO1 ή με ένα ανακατωμένο έλεγχο αλληλουχία siRNA. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές έδειξαν μειωμένα επίπεδα XPO1 συνοδεύεται από μια αύξηση των συνολικών ρ21 κατόπιν XPO1 knockdown (Εικ. 3Α), με χρώση ανοσοφθορισμού δείχνουν ότι η ρ21 ήταν σε μεγάλο βαθμό περιορίζεται στον πυρήνα κάτω από αυτές τις συνθήκες (Σχ. 3Β), παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε με KPT-330 (βλ. Σχήμα 2Β). Έτσι, η επίδραση της KPT-330 για p21 οφειλόταν ειδικά για XPO1 εξασθένηση.

Η RCC (786-O και ACHN) κύτταρα αναπτύχθηκαν σε περίπου 60% συρροή και επιμολύνονται με ομελέτα ελέγχου αλληλουχία ή XPO1- ειδικό siRNA για 48 ώρες. Ανοσοκηλίδωση επιτεύχθηκε με ειδικά αντισώματα (Α) και ανοσοφθορισμού πραγματοποιήθηκε με ομοεστιακό μικροσκόπιο (20χ) (Β). Ο αριθμός των κυττάρων στα οποία p21 ήταν κυρίως στον πυρήνα μετρήθηκαν σε τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία και διαιρείται με τον συνολικό αριθμό των κυττάρων. Μπλε, πυρήνα (DAPI)? Πράσινο, p21. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση.

Η

στόματος χορηγούμενη KPT-330 εξασθενημένη ανάπτυξη του όγκου, συνδέεται με αυξημένη πυρηνική p21

Για να αρχίσει να μεταφράσει αυτό το έργο στο κομοδίνο, την αποτελεσματικότητα των KPT- 330 σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού RCC αξιολογήθηκε. Άπαξ και οι όγκοι υποδόρια εμφύτευση έγινε προφανής, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε αγωγή με sunitinib (40 mg /kg), KPT-330 χαμηλή (7,5 mg /kg) και υψηλή (15 mg /kg) δόσεις, ένα συνδυασμό sunitinib και KPT-330 χαμηλή δόση, ή φορέα (η οποία ήταν η ίδια για KPT-330 και sunitinib). Sunitinib χρησιμοποιήθηκε τόσο ως ελέγχου των ναρκωτικών και ως δυνητικός εταίρος συνδυασμού θεραπείας από το sunitinib είναι η θεραπεία πρώτης γραμμής για RCC [17]. Τόσο KPT-330 υψηλής δόσης και ο συνδυασμός του sunitinib και KPT-330 χαμηλή δόση ανέστειλε την ανάπτυξη RCC σημαντικά σε σύγκριση με το όχημα (Σχ. 4), γεγονός που υποδηλώνει ότι KPT-330 μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ενιαία θεραπεία και είναι επίσης ευεργετική όταν συνδυάζεται με η τρέχουσα πρώτη γραμμή θεραπευτικής, sunitinib.

5 × 10

5 κύτταρα ACHN υποδόρια ένεση σε περιοχή πλευρό. Μόλις οι όγκοι ήταν ψηλαφητοί, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, sunitinib (40 mg /kg), KPT-330 χαμηλή (7,5 mg /kg), KPT-330 υψηλή (15 mg /kg) ή sunitinib και KPT-330 χαμηλή για 25 ημέρες, όπως συζητείται στο Υλικά και Μέθοδοι. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με παχύμετρο (όγκος όγκου = μήκος χ πλάτος χ πλάτος /2) και ο όγκος ρυθμού ανάπτυξης (όγκος όγκου την ημέρα Χ όγκο /όγκου την ημέρα 0) υπολογίστηκε. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα.

Η

Για να επικυρώσετε on-στόχο επιπτώσεις της KPT-330, οι ιστοί ξενομοσχεύματος υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μετά τη θυσία για ανάλυση ανοσοϊστοχημείας. Σε σύγκριση με τους ιστούς ξενομοσχεύματος ελέγχου, KPT-330 (υψηλή δόση) ζώα που υπέστησαν αγωγή παρουσίασαν αύξηση σε ρ21 πυρηνική χρώση, η αύξηση της χρώσης δείκτη απόπτωσης ApopTag, και μια μείωση στην χρώση από το δείκτη πολλαπλασιασμού Κί67 (Εικ. 5), όλα συνεπής με μας in vitro παρατηρήσεις. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι KPT-330 εξασθενίζει ανάπτυξη RCC μέσω αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης και επαγωγή απόπτωσης στο μοντέλο ξενομοσχεύματος RCC, και ότι η ρύθμιση του p21 εντοπισμού παίζει σημαντικό ρόλο στην αποτελεσματικότητα της KPT-330.

Μετά την το συμπέρασμα του πειράματος που περιγράφεται στο Σχ. 6, ξενομόσχευμα ιστοί συλλέχθηκαν και επεξεργάστηκαν για ανοσοϊστοχημεία με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Bar = 20 μm.

Η

KPT-330 ανθεκτικά κύτταρα ήταν ευαίσθητα στην εγκεκριμένη από την FDA θεραπευτικές ουσίες για RCC

Λόγω της συχνής εμφάνισης ανθεκτικότητας χημειοθεραπεία σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με RCC στοχευμένη θεραπευτικά, το είναι κρίσιμη για την παροχή εναλλακτικών θεραπευτικών επιλογών για εκείνους που μπορεί να αναπτύξουν αντίσταση στην αναστολή XPO1 με τη στρατηγική που προτείνεται σε αυτή τη μελέτη. Για να αξιολογηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο τα κύτταρα RCC γίνει ανθεκτικός σε KPT-330, εστιάσαμε στην 786-Ο κύτταρα VHL-mut, αφού η μετάλλαξη VHL παρατηρείται σε περίπου 90% των ασθενών RCC [18]. 786-Ο κύτταρα αρχικά επωάζονται με μια χαμηλή (50 ηΜ) συγκέντρωσης KPT-330, και σειριακά μεταφέρθηκαν σε μέσα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις KPT-330 για μία περίοδο έξι μηνών. Κύτταρα που άρχισε να αναπτύσσεται με 1 μΜ KPT-330 ορίστηκαν ως «KPT-330 ανθεκτική»? από τα πατρικά 786-Ο κύτταρα (Ρ), ένα σύνολο από δύο ξεχωριστές ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές καθιερώθηκαν (R1 και R2). Οπως ορίζεται, τα R1 και R2 κύτταρα ήταν λιγότερο ευαίσθητα σε KPT-330 από τα Ρ κύτταρα όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με διάφορες δόσεις KPT-330 (Σχ. 6Α) χωρίς εξασθένηση του XPO1 (Εικ. 6Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, ο εντοπισμός της ρ21 ήταν ανεπηρέαστη σε KPT-330 ανθεκτικών κυττάρων (Εικ. 6C), υποστηρίζοντας περαιτέρω την σημασία αυτής της πρωτεΐνης σε KPT-330 σηματοδότηση.

KPT-330 ανθεκτική 786-O (R1 και R2) κύτταρα καθορίστηκαν όπως περιγράφεται στο κείμενο, και αυτά, καθώς και τα γονικά κύτταρα (Ρ) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με KPT-330 στις ενδεικνυόμενες δόσεις επί 72 ώρες μετά τις οποίες πραγματοποιήθηκαν προσδιορισμοί ΜΤΤ (Α). R1, R2 και Ρ κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με KPT-330 για 24 ώρες και στη συνέχεια ανοσοαποτύπωση και ανοσοφθορισμού διεξήχθησαν. Ο αριθμός των κυττάρων στα οποία ρ21 ήταν κυρίως στον πυρήνα μετρήθηκαν σε τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία και διαιρείται με τον συνολικό αριθμό κυττάρων (μπλε, πυρήνα (ϋΑΡΙ)? Green, p21) (Β). * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση.

Η

Για να αξιολογηθεί η δυνατότητα για θεραπείες διάσωσης, η επιβίωση των κυττάρων ανθεκτικών αξιολογήθηκε με συμβατικούς παράγοντες στόχους. Όταν KPT-330 ανθεκτικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με καθένα από τα επί του παρόντος εγκριθεί για αναστολείς RCC κινάσης (sunitinib και sorafenib) και αναστολείς mTOR (everolimus και temsirolimus), τα R1 και R2 τα κύτταρα διατήρησαν την ευαισθησία παρομοίως σε κύτταρα Ρ (Εικ. 7), πράγμα που σημαίνει ότι τα συμβατικά στοχευμένες θεραπευτικά θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως θεραπεία δεύτερης γραμμής εάν οι ασθενείς αναπτύσσουν αντίσταση σε KPT-330.

KPT-330 ανθεκτική 786-O (R1 και R2) και γονικά κύτταρα (Ρ) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με KPT-330 στις ενδεικνυόμενες δόσεις επί 72 ώρες μετά τις οποίες πραγματοποιήθηκαν προσδιορισμοί ΜΤΤ. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση.

Η

Συζήτηση

Νέα θεραπευτικά μέσα για την προηγμένη RCC έχουν εγκριθεί από το FDA σχεδόν κάθε χρόνο από την έλευση του sorafenib, την πρώτη στοχευμένη θεραπευτική RCC. Ωστόσο, ακόμη και με αυτά τα φάρμακα, παρατείνεται PFS για εκείνους με μεταστατικό RCC είναι μόνο ένα έως δύο χρόνια λόγω της ανάπτυξης αντοχής φαρμάκου? η κατάσταση για τους ασθενείς με προχωρημένη νόσο γίνεται πιο μελαγχολική από το γεγονός ότι υπάρχουν, αλλά σε περιορισμένο ρεπερτόριο των διαθέσιμων θεραπευτικών στόχων (προς το παρόν μόνο κινάσες και mTOR) [4]. Έτσι, είναι κρίσιμης σημασίας για την ταυτοποίηση νέων στόχων για RCC που είναι διαφορετικές από εκείνες που χρησιμοποιούνται επί του παρόντος. Υπό το φως των προηγούμενων μελετών που δείχνουν ότι οι αναστολείς XPO1 έχουν μια θεραπευτική δράση σε RCC in vitro και in vivo [13], σε αυτή τη μελέτη αξιολόγησε την αποτελεσματικότητα και τον μηχανισμό του KPT-330, τον αναστολέα XPO1 η οποία είναι επί του παρόντος τη φάση 1 δοκιμές, για να προσδιοριστεί πιθανή κλινική χρήση KPT-330 για προχωρημένους RCC. Πράγματι, τα αποτελέσματα των πολλών εν εξελίξει Φάσης Ι /ΙΙ των κλινικών δοκιμών του KPT-330 (selinexor? Clinicaltrials.gov) δείχνουν ότι η από του στόματος KPT-330 έχει σαφή αντικαρκινική δράση με αποδεκτή ανοχή σε πολλά στερεά και αιματολογικές κακοήθειες, αλλά υπάρχει ελάχιστη δεδομένα σε αυτό το μέσο σε RCC και καμία μηχανιστική πληροφορίες.

κυτοσολίου p21 είναι ένας δείκτης της κακής πρόγνωσης σε RCC, και θα μπορούσε θεωρητικά να χρησιμοποιηθεί ως τέτοιο δείκτη σε άλλους καρκίνους, όπως ο καρκίνος του μαστού, που χαρακτηρίζονται επίσης από υπερέκφραση του κυτταροπλάσματος p21 [10]. Τόσο όταν επωάζονται

in vitro

σε αρκετές κυτταρικές γραμμές RCC και όταν χορηγείται από του στόματος

in vivo

σε έναν άνθρωπο RCC ξενομοσχεύματος ποντικού, KPT-330 αυξήθηκε πυρηνικών p21 μέσω ειδική αναστολή XPO1, με αποτέλεσμα ένα σημαντική μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας RCC μέσω διακοπή του κυτταρικού κύκλου (και αναστολή του πολλαπλασιασμού in vivo) και επαγωγή της απόπτωσης. Απροσδόκητα, υπήρχε ελάχιστη επίδραση του KPT-330 επί φυσιολογική νεφρική σωληναριακή επιθηλιακών τη βιωσιμότητα των κυττάρων ή ρ21 εντοπισμό σε αυτά τα κύτταρα, ένα εύρημα το οποίο υποστηρίζει την πιθανότητα ελάχιστες αρνητικές επιπτώσεις στην νεφρική (καθώς και άλλων οργάνων) λειτουργία σε ασθενείς που χορηγούνται αυτό φάρμακο. Όταν στον πυρήνα, συλλήψεις ρ21 στον κυτταρικό κύκλο με δεσμευτικός συμπλοκών κυκλίνης /CKD σε όλες τις φάσεις, ενώ όταν στο κυτταρόπλασμα, ρ21 αναστέλλει την απόπτωση αλληλεπιδρώντας με προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων προ-κασπάσης 3 και ASK [5]. Έτσι, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η πυρηνική p21 εμπλέκεται στο μηχανισμό με τον οποίο KPT-330 επηρεάζουν τα κύτταρα του RCC, μια υπόθεση που υποστηρίζεται από το γεγονός ότι τα κύτταρα NHK των οποίων ρ21 εντοπισμού δεν επηρεάστηκε από KPT-330 δεν ήταν τόσο ευαίσθητα σε KPT-330 ως RCC κύτταρα και ότι KPT-330 ανθεκτικά κύτταρα απέτυχαν να εντοπίσουν ρ21 στον πυρήνα.

σε πολλούς καρκίνους, πυρηνική εξαγωγή των πρωτεϊνών ενισχύεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου και μπορεί στην πραγματικότητα να συνεισφέρουν στη διαδικασία της ανθεκτικότητας στα φάρμακα [19]. Για παράδειγμα, τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης XPO1 συσχετίζονται θετικά με την πρόοδο βαθμού, καθώς και τα αυξημένα ποσοστά πολλαπλασιασμού σε γλοιώματος [20], του καρκίνου του παγκρέατος [21], και του καρκίνου του τραχήλου [22]. Με βάση τα δεδομένα μας, είναι πιθανό ότι η πυρηνική εξαγωγή του ρ21 με XPO1 είναι πιο έντονη σε RCC παρά σε κύτταρα ΝΗΚ ως κυτοσολικά ρ21 στους όγκους είναι αυξημένη, ιδιαίτερα στις περιπτώσεις εκείνες RCC με φτωχότερες προγνώσεις [9]. Η παρατήρηση αυτή (λιγότερο συνέπειες από την αναστολή XPO1 σε φυσιολογικά κύτταρα από τα καρκινικά κύτταρα τους) είναι συνεπής με άλλες δημοσιευμένες μελέτες με ΣΙΝΕ δείχνουν ότι ΣΙΝΕ στόχο άρρωστα κύτταρα ενώ διαφυλάσσει τα φυσιολογικά κύτταρα [12]. Επιπλέον, τα ευρήματά μας ότι KPT-330 ανθεκτικά κύτταρα διατήρησαν την ευαισθησία τους σε όλα τα τρέχοντα FDA ενέκρινε στοχευμένες θεραπευτικές μέθοδοι για προχωρημένο RCC (sunitinib, sorafenib, το everolimus, και temsirolimus) υποδηλώνει ότι οι ασθενείς που αποτυγχάνουν KPT-330 ή για τους οποίους αναπτύσσεται η αντίσταση, θα μπορούσε ακόμα ανταποκριθεί σε αυτές τις παλαιότερα φάρμακα [4].

Συμπεράσματα

Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν ότι XPO1 αναστολή από KPT-330 μειώνει τη βιωσιμότητα RCC μέσω σύλληψη του κυτταρικού κύκλου, καθώς και την επαγωγή της απόπτωσης, και ότι αυξημένη πυρηνική ρ21 με αναστολή XPO1 παίζει σημαντικό ρόλο στην αποτελεσματικότητα της KPT-330 σε RCC. Δείχνουμε ότι KPT-330 ενισχύει την αντικαρκινική δράση του sunitinib, με αποτέλεσμα την πλήρη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου in vivo RCC με αυτό το συνδυασμό. Επιπλέον, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την πιθανότητα ότι οι ασθενείς ανθεκτικοί σε KPT-330 θα ανταποκριθεί σε παλαιότερες στοχευμένες θεραπευτικά. Δεδομένου ότι προχωρημένο RCC έχει κακή πρόγνωση, ακόμη και με στοχευμένη θεραπευτικά, δουλειά μας εισάγει KPT-330 ως μια νέα θεραπευτική για RCC, η οποία μπορεί γρήγορα να μετακινηθεί στην κλινική σφαίρα να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα από την ίδια ή θεραπεία συνδυασμού με άλλα θεραπευτικά RCC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

KPT-330 απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα RCC. Τα κύτταρα RCC 786-O και ACHN αναπτύχθηκαν προς -60% συρροή. Μία δοκιμασία αννεξίνης V εκτελέστηκε μετά από 24 ώρες επώαση με DMSO ή KPT-330 (1 μΜ) όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Η περίφραξη φαίνεται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0113867.s001

(PPTX)