Αφηρημένο

Τεράστια αυξανόμενη παγκόσμια συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου απαιτεί αποτελεσματικές στρατηγικές θεραπείας και πρόληψης. Εδώ, αναφέρουμε απρόσμενη αντικαρκινική επιπτώσεις της Αιθανολικά

Iberis amara

εκχύλισμα (ΙΑΕ), η οποία είναι γνωστή ως ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο phytomedical προϊόν για τη θεραπεία γαστρεντερικών παραπόνων. ΙΑΕ ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκινώματος ΗΤ-29 και Τ84 κόλου με μία ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) 6 και 9 μg /ml, αντίστοιχα, και περαιτέρω δημιουργούνται ανασταλτικά αποτελέσματα σε PC-3 προστάτη και MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού . Η αναστολή του πολλαπλασιασμού σε ΗΤ-29 κυττάρων συνδέθηκε με μια G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου φάση συμπεριλαμβανομένων μειωμένη έκφραση των διαφόρων ρυθμιστικών πρωτεϊνών δείκτη. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε κύτταρα ΗΤ-29 ΙΑΕ επάγεται περαιτέρω απόπτωση με ενδοκυτταρική σχηματισμό δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS). Συνεπής με τις προβλέψεις που προέρχονται από μας

in vitro

πειράματα, BiDaily στοματικό καθετήρα 50 mg /kg της ΙΑΕ πάνω από 4 εβδομάδες οδήγησε σε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε ένα ΗΤ-29 μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου ποντικού. Στο σύνολό τους,

Iberis amara

αποσπάσματα θα μπορούσαν να γίνουν χρήσιμες εναλλακτικές λύσεις για την πρόληψη και τη θεραπεία της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Weidner C, Rousseau M, Plauth Α, Wowro SJ, Fischer C, Αμπντέλ -Aziz H, et al. (2016)

Iberis amara

Απόσπασμα Προκαλεί Η ενδοκυτταρική Σχηματισμός των δραστικών μορφών οξυγόνου και αναστέλλει τον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 11 (4): e0152398. doi: 10.1371 /journal.pone.0152398

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 23 Απριλίου του 2015? Αποδεκτές: 14 Μαρτίου 2016? Δημοσιεύθηκε: 6 Απριλίου 2016

Copyright: © 2016 Weidner et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το γερμανικό Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας (BMBF, χορηγούν αριθμούς 0315082, 01EA1303). Συγγραφέας ΣΣΕ υποστηρίχθηκε από Steigerwald Arzneimittelwerk GmbH, με τη μορφή του μισθού. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Heba Abdel-Aziz απασχολείται από Steigerwald Arzneimittelwerk GmbH, μια εταιρεία που πουλάει τα προϊόντα phytomedical . Heba Abdel-Aziz και οι άλλοι συντάκτες έχουν δηλώσει καμία πιθανή σύγκρουση συμφερόντων. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε παγκόσμιο επίπεδο και η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου -σχετικών θάνατο [1]. CRC λογαριασμούς για 1-2 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις και πάνω από 600.000 θανάτους ετησίως [1]. Η παγκόσμια συχνότητα εμφάνισης CRC αυξάνεται σταθερά και φαίνεται να συνδέεται με ένα δυτικό τρόπο ζωής [1].

Η αποτελεσματική θεραπεία της CRC παρεμποδίζεται από τη μειωμένη συμμόρφωση με τις συστάσεις διαλογής, το προχωρημένο στάδιο η διάγνωση της νέας CRC περιπτώσεις, σοβαρή θεραπεία τοξικότητα, αντοχή φαρμάκου, και της υποτροπής του καρκίνου [2, 3]. Για να ξεπεραστούν αυτοί οι περιορισμοί είναι νέες προσεγγίσεις για την αποτελεσματική πρόληψη και τη θεραπεία της CRC χρειάζεται, συμπεριλαμβανομένων συμπλήρωση των ισχυρών κυτταροτοξικό ή στοχευμένες θεραπείες φαρμάκου, για παράδειγμα χρησιμοποιώντας την ασφαλή φυτοθεραπευτικών εναλλακτικές λύσεις [4].

Σε γενικές γραμμές, δεξαμενές φυσικών ουσιών όπως ως φλαβονοειδή, φαινολικά οξέα, πολυφαινόλες και τερπενοειδή μπορούν να διαμορφώσουν πολλαπλών μοριακών οδών που εμπλέκονται στην παθολογία των πολύπλοκων ασθενειών. Αξιοσημείωτα, μίγματα ένωσης με βάση φυτά γενικά προκαλούν χαμηλή τοξικές παρενέργειες [5]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ήπια φυτικά εκχυλίσματα μειώσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, με την επαγωγή της απόπτωσης και την παραγωγή συνεργιστικές επιδράσεις σε CRC. Για παράδειγμα, εκχυλίσματα από πράσινο τσάι, τα σταφύλια, το τζίντζερ, κουρκούμη, η σόγια και το σκόρδο [4], το χαμομήλι [6] ή μελισσόχορτο officinalis [7, 8] έχουν αναφερθεί να ασκήσει την υγεία ευεργετικά αποτελέσματα.

Iberis amara

(ονομάζεται επίσης πικρή candytuft) ανήκει στην οικογένεια των

Brassicaceae

, και είναι κοινή στην Κεντρική και Νότια Ευρώπη [9]. Εδώ, αναλύσαμε ένα καλά επικυρωμένη και εγκεκριμένη Αιθανολικά εκχύλισμα

Iberis amara

(ΙΑΕ), η οποία συνήθως εφαρμόζεται για γαστρεντερική χρήση.

ΙΑΕ ασκείται εκπληκτικά ισχυρή αντιπολλαπλασιαστική και αποπτωτική δραστηριότητα, για παράδειγμα, σε κύτταρα καρκινώματος κόλου. Αυτά τα αντικαρκινικά αποτελέσματα προκλήθηκαν από ενδοκυτταρικά σχηματισμό δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), ενώ απόσβεση των ROS από αντιοξειδωτικά προστατεύονται τα καρκινικά κύτταρα από την απόπτωση. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η εφαρμογή της ΙΑΕ σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού είχε σαν αποτέλεσμα αποτελεσματική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

,

Υλικά παρέχοντας απόδειξη ότι ΙΑΕ θα μπορούσε να εφαρμοστεί επωφελώς για την πρόληψη και συμπληρωματική θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. και Μέθοδοι

Υλικά |

Χημικά αγοράστηκαν από τις ακόλουθες πηγές: σταυροσπορίνη (STN) και ιρινοτεκάνη (IRI) από LKT Laboratories (Biomol), οξαλιπλατίνη (ΟΧ) από την Cayman Chemical (Biomol, Αμβούργο , Γερμανία). Η πακλιταξέλη (ΡΤΧ), 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), μεναδιόνη (MD), τριτ-βουτυλο υδροϋπεροξείδιο (ΤΒΗΡ), Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC), γλουταθειόνη (GSH), 3Η-1, 2-διθειόλη-3- θειόνη (D3T), α-τοκοφερόλη (α-TOC) και ασκορβικό οξύ (ΑΑ) αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (Taufkirchen, Γερμανία). Αιθανολικά

Iberis amara

εκχύλισμα (ΙΑΕ) είναι ένα βιομηχανικό, επικυρωμένη Αιθανολικά (31% v /v) απόσπασμα που παρέχονται από Steigerwald Arzneimittelwerk (Darmstadt, Γερμανία). Το εκχύλισμα που παράγεται σύμφωνα με μία τυποποιημένη διαδικασία. Ποιότητα ελέγχεται μέσω HPLC δακτυλικών αποτυπωμάτων, καθώς και το περιεχόμενο του εκχυλίσματος προσδιορίστηκε ακριβώς όπως περιγράφεται παραπάνω σε πλήρη λεπτομέρεια [10].

καλλιέργειας κυττάρων

Ανθρώπινο ΗΤ-29 (ACC-299 , DSMZ, Braunschweig, Germany) και τα καρκινικά κύτταρα του παχέος Τ84 (CCL-248, ΑΤΟΟ, LGC Promochem, Wesel, Γερμανία) καλλιεργήθηκαν σε Modified Eagle Medium /Θρεπτικό Μίγμα του Dulbecco F-12 (DMEM /F-12, # 11330-057 , Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany) συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Biochrom, Βερολίνο, Γερμανία) και 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Biochrom). ΗΤ-29 κύτταρα καθορίστηκαν από τον πρωτογενή όγκο ενός 44-year-old Καυκάσιος γυναίκα με αδενοκαρκίνωμα κόλου? Τ84 κύτταρα απομονώθηκαν από πνευμονική μετάσταση καρκινώματος του παχέος εντέρου σε ένα 72-year-old αρσενικό. PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα (CRL-1435, ATCC) καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Biochrom) συμπληρωμένο με 10% FBS και 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού (ΗΤΒ-22, ATCC) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ GlutaMAX (Gibco, Life Technologies) συμπληρωμένο με 10% FBS, 10 μg /ml ανθρώπινη ινσουλίνη (Sigma Aldrich) και 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη . CCD 841 Con πρωτογενή κύτταρα του παχέος εντέρου (CRL-1790, ATCC) αναπτύχθηκαν σε DMEM GlutaMAX (ϋίβ Technologies) που περιείχε 10% FBS. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε

2 ατμόσφαιρα υγροποιημένη 5% CO. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση Αιθανολικά ΙΑΕ, που υποδεικνύεται ενώσεις διαλύονται σε DMSO, ή αντίστοιχους ελέγχους οχήματος.

Θεραπείες των κυττάρων με ΙΑΕ ήταν ιδιαίτερα βελτιστοποιημένη όσον αφορά τη συγκέντρωση και τη θεραπεία φορές, η οποία ποικίλει ανάλογα με την βιολογική απόκριση και δεικτών που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση.

δοκιμασία πολλαπλασιασμού

ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την CyQUANT NF κιτ προσδιορισμού κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Life Technologies). Για το σκοπό αυτό, ΗΤ-29, Τ8, PC-3 και τα καρκινικά κύτταρα MCF7, και φυσιολογικά CCD 841 κύτταρα con, σπάρθηκαν σε μαύρο 384-φρεατίων (# 3712, Corning, Fisher Scientific, Schwerte, Γερμανία) με πυκνότητα 750 κύτταρα /φρεάτιο (ΗΤ-29), 900 κύτταρα /φρεάτιο (Τ84), 250 κύτταρα /φρεάτιο (PC-3), 900 κύτταρα /φρεάτιο (MCF7) και 900 κύτταρα /φρεάτιο CCD 841 CON πρωτογενή κύτταρα του παχέος εντέρου, αντίστοιχα, σε ένα τελικό όγκο 50 μΙ /φρεάτιο. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις των ενώσεων με την προσθήκη 10 μΙ ενός 6-πλάσια συγκέντρωση υλικού. Μετά από 72 ώρες (ΗΤ-29, PC-3) και 96 ώρες (Τ84, MCF7, CCD 841 con) θεραπεία, αντίστοιχα, ο σχετικός αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση του περιεχομένου κυτταρικού DNA με τη χρήση της φθορίζουσας χρωστικής CyQUANT σύμφωνα με τον κατασκευαστή του οδηγίες. Για συν-θεραπεία με αντιοξειδωτικά, ο χρόνος θεραπείας μειώθηκε σε 48 ώρες. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την Polarstar Omega (BMG Labtech, Ortenberg, Γερμανία) και μετασχηματίστηκε σε σχετικό αριθμό των κυττάρων. Για σειρά συγκεντρώσεων, τα δεδομένα προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5.0 σύμφωνα με την εξίσωση: Y = Top + (Bottom-Top) /(1 + 10 ^ ((λογική

50-Χ) * Hillslope)) με μεταβλητή κλίση Hill. Απόδοση είναι η μέγιστη παρατηρούμενη επαγωγή του κυτταρικού θανάτου (100% -Bottom) σε σχέση με το μη επεξεργασμένο κύτταρα (σετ με 0%).

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου

Η διαμόρφωση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε σε ΗΤ -29 κύτταρα κατεργασμένα με 30 μg /ml ΙΑΕ για 24 ώρες. Μετά θρυψινοποίηση κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη και επωάστηκαν σε πάγο για 15 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια επισημάνθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) /διάλυμα χρώσης RNase (# 4087, Cell Signaling Technology, New England Biolabs, Frankfurt, Germany) και περαιτέρω επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Σταθερή κύτταρα καταψύχθηκαν στους -20 ° C πριν από την ανάλυση. Τέλος, τα κύτταρα αναλύθηκαν με τη χρήση της ροής FACS Aria II κυτταρόμετρο (BD Biosciences, Heidelberg, Germany). Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση FlowJo 7.6 (Δέντρο Star), και τα κράτη του κυτταρικού κύκλου έχουν ανατεθεί από τη χρήση του σε εφαρμογή το μοντέλο Dean-Jett-Fox. Ιστογράμματα έγιναν ορατές με GraphPad Prism 5.0. Σημειώστε ότι στα χέρια μας αυτή η ανάλυση ήταν δυστυχώς αναποτελεσματική όταν χρησιμοποιούν εναλλακτικές παχέος εντέρου προέρχονται από κύτταρα Τ84 λόγω των δυσκολιών να αποκτήσει σημαντικό αριθμό μεμονωμένων κυττάρων. Το πρόβλημα αυτό μάλιστα αυξήθηκαν κατά τη διάρκεια του σεξ, με αποτέλεσμα τη συσσώρευση των κυττάρων Τ84 (π.χ. ζεύγη), η οποία έκανε την ανάλυση των δεδομένων των διαφόρων κυτταρικού κύκλου δηλώνει στην πράξη αδύνατη.

Ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα λύθηκαν σε 50 mM Tris-HCl (ρΗ 8.0), 10 mM EDTA, 1% SDS με αναστολείς πρωτεάσης (Roche Diagnostics) και αναστολείς φωσφατάσης (Sigma Aldrich), και κατεργασία με υπερήχους (χρησιμοποιώντας μια συσκευή από Bandelin ηλεκτρονικό, Βερολίνο, Γερμανία). Μετά από φυγοκέντρηση στα 10.000 g για 10 λεπτά, τα υπερκείμενα αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Τα δείγματα μετουσιώθηκαν και διαχωρίστηκαν με χρήση NuPAGE Novex 4-12% γέλες Protein Bis-Tris (Life Technologies) και στυπώθηκαν σε Hybond ECL μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (GE Healthcare, Freiburg, Γερμανία). Οι μεμβράνες δεσμεύτηκαν με 5% σκόνη γάλακτος σε 0.1% Triton Χ-100 /TBS (TBS-Τ, ρΗ 7,6) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και στη συνέχεια εκπλύθηκαν σε TBS-T (0.1%). Πρωτογενή αντισώματα έναντι κυκλίνης Α2 (# 4656), κυκλίνη D3 (# 2936), CDK 2 (# 2546), CDK 4 (# 2906), CDK 6 (# 3136), κασπάσης 3 (# 9665), διασπασμένη κασπάση 3 (# 9664), κασπάσης 9 (# 9502), διασπασμένη κασπάση 9 (# 9501), PARP (# 9542), διασπασμένη PARP (# 5625), Ρ18 (# 2596), ρ21 (# 2947, όλα από την Cell Signaling Technology), και GAPDH (# sc-48 167, Santa Cruz) αραιώθηκαν σε TBS-Τ (0,1%) με γάλα σε σκόνη και BSA, αντίστοιχα, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Οι μεμβράνες ανακινούνται στους 4 ° C όλη τη νύκτα, στη συνέχεια πλένεται με ΤΒδ-Τ (0,1%) και επωάστηκαν με αντι-κουνελιού IgG-HRP (# sc-2004), αντι-ποντικού IgG-HRP (# sc-2005) και αντι- κατσίκα IgG-HRP (# sc-2020, όλα Santa Cruz), αντίστοιχα, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το διάλυμα Western Lightning ECL (Perkin Elmer, Rodgau, Γερμανία). Οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν με Restore Plus Western Blot απογύμνωσης Buffer (Thermo Scientific) για 7 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Πυκνομετρικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του FUSION-SL Advance 4.2 MP Σύστημα (Peqlab, Erlangen, Γερμανία).

Η ενεργοποίηση της κασπάσης

Η ενεργοποίηση των κασπασών 2, 3/7, 6, 8 και 9 ήταν διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας την λουμινομετρικές κασπάση-Glo δοκιμασίες (Promega, Mannheim, Germany). Εν συντομία, μία ημέρα πριν τη θεραπεία ΗΤ-29 κύτταρα σπάρθηκαν σε μαύρες πλάκες 384-φρεατίων (# 3712, Corning) με πυκνότητα 2000 κύτταρα /φρεάτιο σε τελικό όγκο 20 μΐ /φρεάτιο. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με 60 μg /ml ΙΑΕ, 10 μΜ σταυροσπορίνη ή όχημα μόνο. Η φωταύγεια μετρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας το Polarstar Omega (BMG Labtech).

DNA

δοκιμασία κατάτμηση

BrdU-επισημασμένα θραύσματα DNA στο κυτταρόπλασμα των επεξεργασμένων κυττάρων ΗΤ-29 προσδιορίστηκαν ποσοτικά με τη χρήση του Cellular κιτ DNA Ο κατακερματισμός ELISA (Roche Diagnostics). Εν συντομία, κύτταρα ΗΤ-29 εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (ΤΡΡ) με πυκνότητα 13.000 κύτταρα /φρεάτιο σε παρουσία 10 μΜ 5-βρωμο-2′-δεοξυουριδίνη (BrdU) και επωάζονται για 2 ημέρες στους 37 ° C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 6 ώρες με ΙΑΕ, STS ή όχημα, όπως αναφέρεται στο αντίστοιχο ποσοστό αποτελέσματα. Τα κυτοσολικά κλάσματα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν σε 96 φρεατίων μισής περιοχής σαφής υψηλής δέσμευσης μικροπλάκας (# 3690, Corning). Δείγματα χωρίς κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος υπόβαθρο για αφαίρεση, και τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν σε κύτταρα υπό αγωγή με όχημα.

φωσφατιδυλοσερίνη εξωτερίκευσης (αννεξίνη V) δοκιμασία

Εξωτερίκευση φωσφατιδυλοσερίνης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας την annexin- κιτ χρώσης V-FLUOS (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ΗΤ-29 και Τ84 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται στην εικόνα αντίστοιχα αποτελέσματα και στη συνέχεια επισημαίνονται με Annexin-V-FLUOS και ιωδιούχο προπίδιο. κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Accuri C6 (BD Biosciences, Heidelberg, Germany). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FlowJo 7.6 (Tree Star). Για την παρουσίαση οικόπεδο μπαρ, απόπτωση αποτελείται νωρίς (αννεξίνη θετική, PI αρνητικό) και όψιμο στάδιο αποπτωτικών εκδηλώσεις (αννεξίνη θετική, PI θετική).

Ανίχνευση αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)

Σχηματισμός ROS ανιχνεύθηκε με τη χρήση της ROS-ευαίσθητο ανιχνευτή CellROX Orange (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αυτό το κύτταρο-διαπεράσεως χρωστική είναι μη φθορίζουσα σε ανηγμένη κατάσταση και επιδεικνύει έντονο πορτοκαλί φθορισμό κατά την οξείδωση. CellROX Orange επελέγη για τη μέτρηση εξωκυτταρικό καθώς και ενδοκυτταρική ROS επειδή αυτό βαφή είναι συμβατό με συνθήκες πλήρους μέσου και δεν απαιτεί καμία κυτταρική ενεργοποίηση. Για την ανίχνευση των εξωκυτταρικών ROS, CellROX Orange αραιώθηκε σε μια τελική συγκέντρωση 10 μΜ σε πλήρες μέσο κυτταρικής καλλιέργειας, και ΙΑΕ και υπό εξέταση ενώσεις προστέθηκαν όπως αναφέρεται στο αντίστοιχο ποσοστό αποτελέσματα. Η μέτρηση πραγματοποιήθηκε σε μαύρες πλάκες 96-φρεατίων (# 655090, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Γερμανία) σε έναν τελικό όγκο 150 μΙ /φρεάτιο. Για να αυξηθεί η ευαισθησία του προσδιορισμού, το χρώμα ήταν προστατευμένο από την ατμοσφαιρική οξυγόνο με την προσθήκη ενός στρώματος σφραγίσεως 100 μΙ ορυκτελαίου (Luxcel Biosciences, Cork, Ireland) σε κάθε φρεάτιο. Η ένταση φθορισμού (529/590 nm) καταγράφηκε για 24 ώρες στους 37 ° C με τη χρήση του Polarstar Omega (BMG Labtech). τιμές φθορισμού σε χρόνο μηδέν αφαιρέθηκαν για δεδομένα αναλύσεις χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5.0. Για την ανίχνευση της ενδοκυτταρικής ROS, ΗΤ-29 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων (ΤΡΡ, Biochrom) με πυκνότητα 250.000 κύτταρα /φρεάτιο μία ημέρα πριν από τη θεραπεία. Μετά τη θεραπεία με ΙΑΕ, MD ή οχήματος, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και στη συνέχεια πλένονται με PBS. Τα ιζηματοποιημένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1 ml από 5 μΜ CellROX Orange σε PBS και επωάστηκε για 20 λεπτά στους 37 ° C. Για να αφαιρέσετε μη ενσωματωμένο χρωστικής τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν εκ νέου σε PBS πριν κυτταρομετρία ροής ανίχνευση (με τη χρήση μιας συσκευής Accuri C6). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FlowJo 7.6 (Tree Star) και GraphPad Prism 5.0.

Ανίχνευση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων

Σχηματισμός κυτταρικών υπεροξειδίων λιπιδίων διερευνήθηκε με τη χρήση του Click-iT Λιπιδίου Η υπεροξείδωση δοκιμασία (Life Technologies ). Αυτή η δοκιμασία κάνει χρήση της linoleamide αλκυνίου (LAA, αλκύνιο-τροποποιημένο λινελαϊκό οξύ) που συγκεντρώνουν με κυτταρικές μεμβράνες. LAA μπορεί να οξειδωθεί με αποτέλεσμα αλκύνιο-τροποποιημένες πρωτεΐνες που μπορούν να σημανθούν χρησιμοποιώντας ένα αζίδιο-τροποποιημένο Alexa Fluor 488 βαφή μέσω της χημείας κλικ χαλκού-καταλύτη. Έτσι, οι αυξανόμενες εντάσεις φθορισμού ανιχνεύεται λόγω ενισχυμένη υπεροξείδωση λιπιδίων κατά την κατεργασία. Μία ημέρα πριν από τη θεραπεία ΗΤ-29 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων με πυκνότητα 250.000 κύτταρα /φρεάτιο. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με την ΙΑΕ ή μεναδιόνη σε παρουσία 50 μΜ LAA. Μετά θρυψινοποίηση, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε 3.7% φορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και πάλι, διαπερατά χρησιμοποιώντας 0.5% Triton Χ-100 σε PBS για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και ακολούθως δεσμεύεται με προσθήκη 1% BSA για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Παραμένοντας BSA απομακρύνθηκε με αυστηρά πλύση των κυττάρων με PBS. Ιζηματοποιημένα κύτταρα επωάστηκαν με 500 μΐ Click-iT κοκτέιλ αντίδρασης για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το Click αντίδραση σταμάτησε με προσθήκη 1% BSA /PBS. Τα κύτταρα και πάλι πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν με PBS. Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της συσκευής Accuri C6. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FlowJo 7.6 (Tree Star) και GraphPad Prism 5.0.

φθορισμού μικροσκοπία

Για την οπτικοποίηση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΗΤ-29 κύτταρα Click-iT υπεροξείδωσης λιπιδίων σπάρθηκαν στις 13 mm καλύπτουν ολισθήσεις τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων με πυκνότητα 125.000 κύτταρα /φρεάτιο μία ημέρα πριν από τη θεραπεία. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με την ΙΑΕ ή μεναδιόνη σε παρουσία 50 μΜ linoleamide αλκύνιο (LAA). Στη συνέχεια, προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε 3.7% φορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS, κατέστησαν διαπερατά χρησιμοποιώντας 0.5% Triton Χ-100 σε PBS (ΡΒδ-Τ) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και μπλοκάρεται με την προσθήκη 1% BSA για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση με PBS, 250 μΙ Click-iT κοκτέιλ αντίδρασης προστέθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι αντιδράσεις σταμάτησαν με έκπλυση με 1% BSA σε PBS, και τα κύτταρα πλύθηκαν και πάλι με BSA-PBS ελεύθερο. μπόλια Cover τελικά αντίθετα με διάλυμα παρατείνει Gold αντιξεθωριάσματος έγκλεισης (που περιέχει DAPI) και επωάστηκαν για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. μικροσκοπία φθορισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα όργανο LSM700 (Zeiss, Jena, Germany).

Για την ανίχνευση της διασπασμένης ΡΑΚΡ, ΗΤ-29 κύτταρα σπάρθηκαν στις 13 ολισθήσεις mm κάλυμμα (Sarstedt, Nürnbrecht, Germany) και τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (Nunc, Wiesbaden, Γερμανία) με πυκνότητα 125.000 κύτταρα /φρεάτιο μία ημέρα πριν από τη θεραπεία. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με την ΙΑΕ ή ενώσεις δοκιμής, πλύθηκαν με PBS, και τελικά σταθεροποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη /PBS για 15 λεπτά. Τα κύτταρα διαπερατά σε 0.3% Triton Χ-100 /PBS (PBS-T) για επιπλέον 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια αποκλείστηκε σε 5% ορό κατσίκας (Sigma Aldrich) σε PBS-T (0.3%) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου . Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτογενές αντίσωμα έναντι διασπασμένης ΡΑΚΡ (# 5625, Cell Signaling Technology), το οποίο αραιώθηκε (1: 200) σε 1% BSA /PBS-T (0.3%). Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS-T (0.3%) και επισημαίνονται με αντι-κουνελιού IgG (H + L), F (ab ‘) 2 θραύσμα Alexa Fluor 488 Συζεύγματος (# 4409, Cell Signaling Technology) αραιωμένο (1: 1000) σε 1% BSA /PBS-T (0.3%) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου.

F-ακτίνης βάφτηκε με Texas Red-X φαλλοειδίνη (Life Technologies) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, καλυπτρίδες βάφτηκαν αντίθετα χρησιμοποιώντας διάλυμα παρατείνει Gold αντιξεθωριάσματος έγκλεισης (που περιέχει DAPI) και επωάστηκαν για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. μικροσκοπία φθορισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας μία συσκευή LSM700 (Zeiss, Jena, Germany).

κυτταροτοξικότητας δοκιμασία

Για να εξεταστεί το αποτέλεσμα της ΙΑΕ σε κυτταρικές βιωσιμότητας σε καρκίνο του παχέος εντέρου και πρωτογενή κύτταρα, εφαρμόσαμε ο CytoTox-Glo κυτταροτοξικότητας δοκιμασία (Promega, Mannheim, Germany), όπως περιγράφεται πρόσφατα [11]. Ως εκ τούτου, ΗΤ-29, και CCD 841 κύτταρα Con σπάρθηκαν σε μαύρες πλάκες 384-φρεατίων (# 3712, Corning, Wiesbaden, Γερμανία) με πυκνότητα 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε τελικό όγκο 25 μΙ /φρεάτιο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με διάφορες συγκεντρώσεις ΙΑΕ με την προσθήκη 10 μΙ ενός 3.5-πλάσια συγκέντρωση υλικού. Μετά φωταύγεια θεραπεία μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη συσκευή Polarstar Omega (BMG Labtech). Η βιωσιμότητα υπολογίστηκε με αφαίρεση των νεκρών κυττάρων από φωταύγειας συνολικές τιμές φωταύγειας. Τα δεδομένα προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5.0 σύμφωνα με την εξίσωση:. Υ = Κάτω + (Top-Bottom) /(1 + 10 ^ ((X-LogIC50))

όγκων ξενομοσχεύματος μελέτη

Για να μελετήσει το

in vivo

αποτελεσματικότητα της ΙΑΕ για τη θεραπεία της ανθρώπινης CRC, μια μελέτη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου έγινε με το μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού ΗΤ-29 όγκου. η μελέτη εγκρίθηκε στις 13 Αυγούστου

ου 2014 από τον Charles River Discovery Έρευνα Υπηρεσίες NC φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήσης και διεξάγεται από τον Charles River Discovery Research Services (Morrisville, NC, USA). η ευημερία των ζώων του Charles River Discovery Έρευνα Υπηρεσίες εγκρίθηκε από το Γραφείο του Εργαστηρίου Μέριμνας ζώων των ΗΠΑ στις 14 Δεκεμβρίου

ου 2011 για το χρονικό διάστημα μεταξύ του 14, Δεκεμβρίου του 2011 έως τις 31 Οκτωβρίου

ου 2015 (αριθμός αναγνώρισης A4358-01). Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις πολιτικές και τις κατευθυντήριες γραμμές Charles River Discovery Έρευνα Υπηρεσίες NC και Υπηρεσία των ΗΠΑ Δημόσιας Υγείας (μελέτη σε ζώα αριθμό πρωτοκόλλου:. # 980702) εν συντομία, 36 θηλυκών αθυμικών γυμνών (NCr ηυ /ηυ) ποντικούς εμφυτεύθηκαν με 5 εκατομμύρια κύτταρα ΗΤ-29 υποδορίως στο πλευρό. Κατά την ημέρα του εμβολιασμού, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες (η = 18), και από το στόμα μία BiDaily για 4 εβδομάδες με 50 mg /kg ΙΑΕ σε απιονισμένο νερό ή με μόνο όχημα. όγκοι των όγκων και το σωματικό βάρος παρακολουθήθηκαν κατά τη διάρκεια ολόκληρου του πειράματος από τον Charles River Discovery Υπηρεσίες Έρευνα και τεκμηρίωση των δεδομένων που στάλθηκε με τους συγγραφείς του άρθρου αυτού για την ανάλυση των δεδομένων. Στο τέλος της θεραπείας, οι όγκοι συλλέχθηκαν, ζυγίστηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C πριν από την ανάλυση περαιτέρω. Αίμα συλλέχθηκε με καρδιακή παρακέντηση τερματικό υπό αναισθησία με ισοφλουράνιο, και ο ορός αναλύθηκε με κλινικές δοκιμές χημεία στο Charles River.

Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) εάν δεν δηλώνεται διαφορετικά. Στατιστική δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 5.0. Για τη σύγκριση των δύο ομάδων στατιστικής σημαντικότητας εξετάστηκε με t-test unpaired δύο κατεύθυνσης Student εάν δεν δηλώνεται διαφορετικά. Για πολλαπλές συγκρίσεις δεδομένα αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA με δοκιμή των υστέρων επακόλουθη Dunnett. Ένα

σ

τιμή ≤ 0,05 ορίστηκε ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

ΙΑΕ ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και επαγόμενη G2 /M του κυτταρικού κύκλου σύλληψη

για να διερευνηθούν οι επιδράσεις του ΙΑΕ επί του πολλαπλασιασμού του ορθοκολικού καρκίνου, ΗΤ-29 και Τ84 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις ΙΑΕ για 72 και 96 ώρες (ανάλογα με το διαφορετικό χρόνο που απαιτείται για την κυτταρική πολλαπλασιασμού του ΗΤ-29 και κύτταρα Τ84), αντίστοιχα. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση του περιεχομένου κυτταρικού DNA. ΙΑΕ ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων ΗΤ-29 και Τ84 κόλου σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, με IC

50 τιμές (μέση ± SD) από 6 ± 1 μg /ml (Σχήμα 1Α) και 9 ± 1 μg /ml ( Σχήμα 1Β), αντίστοιχα.

Αναστολή πολλαπλασιασμού του ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου (Α), ο καρκίνος του παχέος εντέρου Τ84 κυττάρων (Β), PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα (C), MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού (D ) και φυσιολογική CCD 841 Con (κόλον) κύτταρα (Ε) μετά την επεξεργασία με ΙΑΕ και ένα μικρό πάνελ των αντικαρκινικών φαρμάκων (δηλαδή ιρινοτεκάνη, 5-FU και oxiliplatin). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις ΙΑΕ και ενώσεων για 3 ημέρες (Α και C) και 4 ημέρες (Β και D, E), αντίστοιχα. Ο σχετικός αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση του περιεχομένου κυτταρικού DNA μέσω δέσμευσης φθορίζουσα χρωστική. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (η = 4).

Η

Στην αρχική φάση της μελέτης, μπορούμε επιπλέον να δοκιμαστεί δύο άσχετα μοντέλα των καρκινικών κυττάρων, δηλαδή PC-3 (προστάτης) και MCF7 (μαστού ), να αποκλείσει περίπου συγκεκριμένες συνέπειες των κυττάρων του ΙΑΕ. Ομοίως για τα δύο μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου, ΙΑΕ επαγόμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού (IC

50 τιμές από 44 ± 4 μg /ml (Εικ 1C) σε PC-3 και 11 ± 1 μg /ml (Σχ 1D) σε καρκινικά κύτταρα MCF7 , αντίστοιχα). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι οι επιπτώσεις της ΙΑΕ δεν περιορίζεται σε κύτταρα καρκινώματος του κόλον.

Καθώς τα κυτταροτοξικά αντικαρκινικά φάρμακα ιρινοτεκάνη, 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και οξαλιπλατίνη, ΙΑΕ έδειξε αποτελεσματικότητες της θεραπείας μεταξύ 70 και 80%, υποδεικνύοντας ένα κλάσμα 20-30% του ακόμη πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία (Σχήμα 1, Πίνακας 1). Σε γενικές γραμμές, το IC

50 αξία της ΙΑΕ ήταν περίπου μία τάξη μεγέθους μεγαλύτερη σε σύγκριση με τις εφαρμοζόμενες ενώσεις. Αξίζει να σημειωθεί ότι, υπό κανονικές CCD 841 Con κύτταρα (πρωτογενή κύτταρα του παχέος εντέρου που προέρχονται από ένα βρέφος), ο πολλαπλασιασμός αναστέλλεται από ΙΑΕ-και επίσης από την 5-FU και οξαλιπλατίνη σε IC

50 αξίες που ήταν περίπου μία τάξη μεγέθους μικρότερη από για τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου (Σχήμα 1 Ε και Πίνακας 1). Από την άλλη πλευρά, σε σύγκριση με τα καρκινικά κύτταρα σε πρωτογενή κύτταρα του παχέος εντέρου αναστολή της αποτελεσματικότητας ήταν σαφώς χαμηλότερη, υποδεικνύοντας μία αύξηση του αριθμού των ακόμη πολλαπλασιαζόμενα φυσιολογικά κύτταρα του παχέος εντέρου σε σύγκριση με τις δοκιμαζόμενες καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Η

Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός είναι γενικά που συνδέονται με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [12]. έτσι ρωτήσαμε αν οι παρατηρούμενες αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις της ΙΑΕ είναι αποτέλεσμα των αλλαγών στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Εμείς αγωγή ΗΤ-29 κύτταρα καρκινώματος κόλου με 30 μg /ml ΙΑΕ για 24 ώρες και αναλύθηκαν τα κύτταρα μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο με κυτταρομετρία ροής. θεραπεία ΙΑΕ οδήγησε σε σημαντική συσσώρευση στο G2 /M φάση (40 έναντι 24%) με ταυτόχρονη μείωση της G0 /G1 (35 έναντι 58%) και τη φάση S (9 έναντι 14%, Σχήμα 2Α). ΙΑΕ αυξηθεί περαιτέρω ο αριθμός των κυττάρων στη φάση SubG1 (17 έναντι 3%), υποδεικνύοντας επαγωγή απόπτωσης σε αυτά τα κύτταρα.

Α, κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής ιωδιούχου προπιδίου βαμμένων κυττάρων. Ιστογράμματα (κορυφή) δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα για κάθε συνθήκη θεραπείας. οικόπεδα Bar (κάτω) δείχνουν τοις εκατό του κυτταρικού πληθυσμού σε αποπτωτικά SubG1, G0 /G1, S και G2 /M είναι φάσεις του κυτταρικού κύκλου και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM (n = 3). * P ≤ 0,05, *** p≤0.001 έναντι του ελέγχου. Β, προϊόντα λύσης ολόκληρου κυττάρου αναλύθηκαν για την έκφραση της κυκλίνης Α2, κυκλίνη D3, CDK2, CDK4, CDK6 και πρωτεΐνες GAPDH με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα.

Η

Επίσης, αναλύσαμε την έκφραση των ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου πρωτεΐνες με ανοσοστύπωμα. Σε συμφωνία με την κυτταρομετρία ροής δεδομένων, η θεραπεία ΙΑΕ μείωσε την έκφραση των κυκλινών Α2 και D3, και των εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών (CDK) 2, 4, 6 (Σχήμα 2Β). Συνολικά, οι παρατηρούμενες αλλαγές στην έκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου, καθώς και η παρατηρούμενη G2 /M σύλληψη πιθανώς αντιπροσωπεύουν τα ανασταλτικά αποτελέσματα της κυτταρικής ανάπτυξης του ΙΑΕ σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα.

θεραπεία ΙΑΕ ενεργοποιηθεί κασπασών, που προκαλείται DNA κατακερματισμός και οδήγησε σε φωσφατιδυλοσερίνη εξωτερίκευση στα κύτταρα καρκινώματος του παχέος εντέρου

η ενεργοποίηση του δικτύου σηματοδοσίας κασπάσης είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης, που συνδέει εξωγενή και ενδογενή ερεθίσματα με κατάντη αποπτωτικά γεγονότα. Για να ρίξει περισσότερο φως σχετικά με τις επιπτώσεις της ΙΑΕ στο δίκτυο κυτταρική σηματοδότηση κασπάσης, μετρήσαμε ενζυμική ενεργοποίηση ενός πάνελ των κασπασών χρησιμοποιώντας λουμινομετρικές προσδιορισμούς. Θεραπεία της ΗΤ-29 κυττάρων με 60 μg /ml ΙΑΕ για 24 ώρες δεν έδειξαν επίδραση στις κασπάσες 2 και 6. Ωστόσο, σε ΗΤ-29 ανάπτυξη κυττάρων ΙΑΕ οδήγησε σε σημαντική 3πλάσια αύξηση της δραστικότητας των κασπασών τελεστών 3 /7, παρόμοια με την εφαρμογή των 10 μΜ σταυροσπορίνη (STN, 4-πλάσια αύξηση). Παρόμοια αποτελέσματα θα μπορούσε να παρατηρηθεί χρησιμοποιώντας μια εναλλακτική (μεταστατικό) μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου (κύτταρα Τ84), που πιστοποιεί τα αποτελέσματα που προέρχονται από το μοντέλο ΗΤ-29 κυττάρων (Σχήμα 3Α).

Α, ΗΤ-29 και Τ84 κύτταρα ήταν θεραπεία για 24 ώρες. Η ενζυματική ενεργοποίηση κασπασών 2, 3/7, 6, 8 και 9 προσδιορίστηκε με χρήση προσδιορισμών φωταύγειας που βασίζονται. Τα δεδομένα είναι κανονικοποιημένα για τον έλεγχο της θεραπείας και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM (n = 4). Β, κυτταρολύματα Σύνολο από κύτταρα ΗΤ-29 θεραπεία για 24 ώρες αναλύθηκαν για την έκφραση του συνόλου και διασπάται πρωτεΐνες της κασπάσης 3, κασπάσης 9 και PARP με ανοσοστύπωση. Οι αριθμοί δείχνουν πυκνομετρικές αναλογίες του διασπασμένου σε ολικές πρωτεΐνες κανονικοποιούνται για τον έλεγχο των θεραπειών. C, Μικροσκοπία φθορισμού των κυττάρων ΗΤ-29 θεραπεία για 24 ώρες. Διασπασμένη κασπάση 3 ονομάστηκε πράσινο, F-ακτίνης κόκκινο και το μπλε πυρήνα. Κλίμακα μπαρ, 25 μm. D, ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν για 6 ώρες. κατάτμηση DNA ανιχνεύθηκε μέσω της συσσώρευσης των κυτταροπλασματικών BrdU-σημασμένο DNA με ELISA. Τα δεδομένα είναι κανονικοποιημένα για τον έλεγχο της θεραπείας και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM (n = 5). N.S. δεν είναι σημαντική, * p ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001 έναντι του ελέγχου.

Η

Αξίζει να σημειωθεί ότι, η θεραπεία ΙΑΕ αύξησε τη δραστηριότητα των δύο, κασπάσης 8 και κασπάσης 9, περίπου 4 φορές (Σχήμα 3Α), υποδεικνύοντας επαγωγή της εξωγενούς (υποδοχέας θάνατο που επιτελείται), καθώς και την εγγενή (μεσολάβηση μιτοχονδριακό) μονοπάτι απόπτωσης σε ΗΤ-29 κύτταρα. Όπως ανιχνεύεται από ανοσοαποτύπωση, έχουμε επιπλέον παρατηρείται επαγόμενη διάσπαση του τελεστή κασπάσης 3, επιβεβαιώνοντας έτσι πάνω-ανιχνευθεί ενεργοποίηση. θεραπεία ΙΑΕ οδήγησε περαιτέρω σε περίπου 9-πλάσια αυξημένη διάσπαση της χρωματίνης που σχετίζεται με πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) (σχήμα 3Β). διάσπαση PARP επίσης επικυρωθεί με μικροσκοπία φθορισμού (Σχήμα 3C). Από PARP είναι γνωστό ότι ενεργοποιείται με βλάβες στο DNA, ερευνήσαμε περαιτέρω τις επιπτώσεις της ΙΑΕ στην ακεραιότητα του DNA. Σύμφωνα με διάσπαση PARP, τα πειράματα σήμανσης BrdU έδειξε αυξημένα επίπεδα κυτοσολικού DNA σε κύτταρα ΗΤ-29 επεξεργασία με 60 μg /ml ΙΑΕ για 6 ώρες, υποδεικνύοντας αποπτωτική κατακερματισμού του DNA κατά την κατεργασία ΙΑΕ (Σχήμα 3D).

σε υγιή κύτταρα φωσφατιδυλοσερίνη (PS) γενικά περιορίζεται στο εσωτερικό φύλλο της κυτταρικής μεμβράνης, και την έκθεση της φωσφατιδυλσερίνης στην εξωτερική φυλλάδιο θεωρείται ως ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης [13]. Έχουμε έτσι επεξεργασμένα κύτταρα καρκινώματος του κόλου με 60 μg /ml ΙΑΕ για 48 ώρες και προσδιορίστηκε PS εξωτερίκευση με κυτταρομετρία ροής αννεξίνης V-FLUOS /προπίδιο κύτταρα ιωδιούχο σημασμένο. ΙΑΕ αύξησε σημαντικά τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων από 6% σε 22% σε ΗΤ-29 (Σχήμα 4Α) και από 43% σε 53% σε κύτταρα Τ84 (Σχήμα 4Β). Παρόμοιες παρατηρήσεις έγιναν με χαμηλές δόσεις του paclitaxel αντικαρκινικού φαρμάκου (5-50 ηΜ) (Σχήμα 4). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι ΙΑΕ επάγεται αποδοτικά απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

αννεξίνης V δοκιμασίες ΗΤ-29 (Α) και Τ84 (Β) κύτταρα καρκινώματος του κόλου μετά την αγωγή με ΙΑΕ για 48 ώρες. Η απόπτωση προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής αννεξίνης V-FLUOS και ιωδιούχο προπίδιο χρωματισμένα κύτταρα. διαγράμματα διασποράς δείχνουν ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα για κάθε συνθήκη θεραπείας. οικόπεδα Bar δείχνουν το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων, η οποία περιλαμβάνει νωρίς (αννεξίνη θετική, PI αρνητική) και το προχωρημένο στάδιο (αννεξίνη θετική, PI θετικά) γεγονότα. Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM (n = 3). * P ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001 έναντι του ελέγχου.

Η

Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα καρκινικά κύτταρα διαθέτουν μια ανισορροπία των αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS). Δεδομένου ότι αυξημένες συγκεντρώσεις του ROS μπορεί να διεγείρει απόπτωση, αυξάνοντας το οξειδωτικό στρες σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για θεραπεία [14].