Αφηρημένο

Εισαγωγή

Αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαχθεί και Rad3 Σχετικές (ATR) πρωτεϊνική κινάση είναι ένα βασικό αισθητήριο του μονόκλωνου DNA που σχετίζονται με στασιμότητα πιρούνια αντιγραφή και ενδιάμεσα επισκευή που παράγονται κατά την επιδιόρθωση του DNA. ΧΚΧΧ1 είναι ένα κρίσιμο ένζυμο για αποκατάσταση σε ένα διάλειμμα σκέλος και επισκευή βάσης εκτομή. συγκρότημα ΧΚΧΧ1-LIG3 είναι επίσης μια σημαντική συμβολή στο βήμα απολίνωση της απάντησης νουκλεοτίδιο επιδιόρθωση εκτομής.

Μέθοδοι

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε συνθετικά θνησιμότητα σε ΧΚΧΧ1 ανεπάρκεια και ΧΚΧΧ1 καλά Chinese Hamster ωοθήκη (CHO) και ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών χρησιμοποιώντας αναστολείς ATR (NU6027). Επιπλέον, ερευνήσαμε επίσης την ικανότητα των αναστολέων ATR να ενισχύουν κυτταροτοξικότητα σε σισπλατίνη ΧΚΧΧ1 ανεπάρκεια και ΧΚΧΧ1 ικανό CHO και ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Κλωνογενείς δοκιμασίες, δοκιμασίες αλκαλικής COMET, γH2AX ανοσοκυτταροχημεία, FACS για κυτταρικού κύκλου, καθώς και ΡΙΤΟαννεξίνης ανάλυση κυτταρομετρίας ροής V πραγματοποιήθηκαν.

Αποτελέσματα

αναστολή ATR είναι συνθετικά θανατηφόρα σε ανεπαρκή κύτταρα ΧΚΧΧ1 ως αποδεικνύεται από την αυξημένη κυτταροτοξικότητα, συσσώρευση θραύσεων διπλής έλικος DNA, G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την αυξημένη απόπτωση. Σε σύγκριση με τη σισπλατίνη μόνη της, ο συνδυασμός σισπλατίνης και αναστολέα ATR αποτελέσματα σε ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα με ανεπάρκεια ΧΚΧΧ1 σε σύγκριση με καλά κύτταρα ΧΚΧΧ1.

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία μας παρέχει αποδείξεις ότι η αναστολή ATR είναι κατάλληλο για συνθετική θνησιμότητα εφαρμογή και σισπλατίνη chemopotentiation σε ΧΚΧΧ1 ανεπάρκεια καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

Παράθεση:. Sultana R, Αμπντέλ Φατάχ Τ, Perry C, Moseley P, Albarakti Ν, Mohan V, et al. (2013) Αταξία Τελαγγειεκτασία μεταλλαχθεί και Rad3 Σχετικές (ATR) πρωτεϊνικής κινάσης αναστολή συνθετικά Lethal σε κύτταρα ΧΚΧΧ1 Ελλιπή καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 8 (2): e57098. doi: 10.1371 /journal.pone.0057098

Συντάκτης: Todd W. Miller, Dartmouth, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 του Νοέμβρη 2012? Αποδεκτές: 17 Γενάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Φλεβάρη, 2013

Copyright: © 2013 Σουλτάνα et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στόχευση επιδιόρθωση του DNA για συνθετικό θνησιμότητας είναι ένα συναρπαστικό νέο. στρατηγική για την εξατομικευμένη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. επιδιόρθωση του DNA είναι απαραίτητη για την βλάβη του DNA επεξεργασία που προκαλείται από τη χημειοθεραπεία, όπως παράγοντες platinating (καρβοπλατίνη, σισπλατίνη) [1]. Intra-κλώνου σταυροδεσμών ενώσεις προσθήκης DNA που προκαλείται από platinating παράγοντες, αν της αποκατάστασης της, τελικά να οδηγήσουν σε κυτταρικό θάνατο [2], [3]. Τα DNA ενδο-κλώνου διασταυρωμένες συνδέσεις επισκευαστεί κατά κύριο λόγο από το νουκλεοτίδιο επιδιόρθωση εκτομής (NER) σε κύτταρα [4], [5]. Platinating παράγοντες μπορούν επίσης να δημιουργήσουν ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που προκαλούν ζημιές οξειδωτική βάση που υποβάλλονται σε επεξεργασία από την επισκευή βάσης DNA εκτομή (BER) οδού στα κύτταρα [6], [7].

Η ΧΚΧΧ1 (X-ray σταυρό επισκευής – συμπληρώνει το γονίδιο 1) πρωτεΐνη είναι ένας κρίσιμος παράγοντας στην ΚΑΚ και μόνο σκέλος της οδού επιδιόρθωσης διάλειμμα (SSBR). συγκρότημα ΧΚΧΧ1-LIG3 είναι επίσης μια σημαντική συμβολή στο βήμα απολίνωση της απόκρισης επισκευής νουκλεοτιδίων εκτομή (NER). ΧΚΧΧ1, μια πρωτεΐνη 70-kDa, δεν έχει γνωστή ενζυματική δραστικότητα (που επισκοπείται στο [8], [9], [10]). ΧΚΧΧ1 λειτουργεί ως μοριακός πρωτεΐνη ικρίωμα και συντονίζει την επιδιόρθωση του DNA μέσω αλληλεπίδρασης με διάφορα συστατικά του BER /SSBR όπως ΡΑΚΡ-1 [Πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμερασών 1], γλυκοζυλάσες DNA, ΑΡ ενδονουκλεάση (APE1) και άλλα (που επισκοπείται στο [ ,,,0],8], [9], [10]). ανεπάρκεια ΧΚΧΧ1 στα κύτταρα να οδηγήσουν σε συσσώρευση του DNA μόνο διαλείμματα σκέλος (SSB,), να προκαλέσουν μεταλλάξεις και να οδηγήσει σε αυξημένα επίπεδα των ανταλλαγών αδελφών χρωματίδων. ανεπάρκεια ΧΚΧΧ1 σε κυτταρικές σειρές οδηγούν σε υπερευαισθησία σε ιοντίζουσα ακτινοβολία και χημειοθεραπεία [9]. Σε μελέτες ανθρώπινη ένωση, βλαστική πολυμορφισμοί στο ΧΚΧΧ1 μπορεί να επηρεάσει τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου [11], [12] και την ανταπόκριση επιρροή στην πλατίνα χημειοθεραπεία με βάση [13], [14], [15], [16]. Σε ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών δείξαμε πρόσφατα ότι οι όγκοι συχνά υπερ-εκφράζουν ΧΚΧΧ1 (48%) και σημαντική συσχέτιση με υψηλότερο στάδιο (p = 0,006), ορώδες τύπος όγκους (ρ = 0.008), υπο-βέλτιστου de-διόγκωσης (p = 0,004 ), μια διπλάσια αύξηση του κινδύνου θανάτου (p = 0,007) και την εξέλιξη (ρ & lt? 0,0001) [17]. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, η έκφραση ΧΚΧΧ1 συσχετίστηκε ανεξάρτητα με την επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών [HR 2,3, p = 0,002]. αρνητικούς όγκους ΧΚΧΧ1 συσχετίστηκαν με ευαισθησία λευκόχρυσο (ρ & lt? 0,0001). Προ-κλινικά μας επιβεβαίωσε επίσης ότι οι αρνητικές κύτταρα ΧΚΧΧ1 είναι υπερευαίσθητοι στην σισπλατίνη σε σύγκριση με ΧΚΧΧ1 θετικά κύτταρα [17]. Υπερευαισθησία στη σισπλατίνη σε αρνητικά κύτταρα ΧΚΧΧ1 σχετίστηκε με συσσώρευση ρηγμάτων της έλικας DNA και G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου [17]. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι ΧΚΧΧ1 είναι μια πολλά υποσχόμενη βιοδείκτης για τον καρκίνο των ωοθηκών.

αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη και Rad3 Σχετικές (ATR) πρωτεϊνική κινάση είναι ένα βασικό αισθητήριο του μονόκλωνου DNA που σχετίζονται με αδιέξοδο πιρούνια αντιγραφής καθώς και παράγεται κατά τη διάρκεια ΚΑΚ και διπλή έλικα επισκευή διάλειμμα ως ενδιάμεσα επιδιόρθωση του DNA. Ενεργοποιημένος ATR με τη σειρά της φωσφορυλιώνει έναν αριθμό υποστρωμάτων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, την αντιγραφή του DNA, την επιδιόρθωση του DNA και την απόπτωση (που επισκοπείται στο [18], [19], [20], [21], [22]). Σε προκλινικές μελέτες, η αναστολή ATR μπορεί να οδηγήσει σε κυτταροτοξική θεραπεία ευαισθητοποίηση [22], [23], [24]. αναστολείς μικρού μορίου της ATR είναι επί του παρόντος υπό ανάπτυξη για θεραπευτική εφαρμογή στον καρκίνο [20], [21], [22].

Η ικανότητα των αναστολέων PARP να προκαλέσει συνθετικά θνησιμότητα σε BRCA ανεπάρκεια των ωοθηκών [25], [26], [27] δείχνει ότι επιπρόσθετοι παράγοντες εντός BER /SSBR μπορεί να είναι κατάλληλη για τέτοιες εξατομικευμένες προσεγγίσεις. ΧΚΧΧ1 είναι ένας κρίσιμος παράγοντας στην ΚΑΚ, SSBR και NER. ATR είναι ένα βασικό αισθητήριο της SSB,. Στην παρούσα μελέτη ερευνήσαμε και επιβεβαιώθηκε συνθετικά θνησιμότητα στην ανεπάρκεια των κυττάρων ΧΚΧΧ1 θεραπεία με αναστολείς ATR. Επιπλέον, σε σύγκριση με τη σισπλατίνη μόνη της, ο συνδυασμός σισπλατίνης και αναστολέα ATR αποτελέσματα της θεραπείας σε ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα με ανεπάρκεια ΧΚΧΧ1 σε σύγκριση με καλά κύτταρα ΧΚΧΧ1.

Υλικά και Μέθοδοι

Ενώσεις και Αντιδραστήρια

αναστολείς Μικρό μόριο ATR NU6027 και VE-821 αγοράστηκαν από Tocris Βιοεπιστημών, το Ηνωμένο Βασίλειο και Tinib-Εργαλεία, Τσεχική Δημοκρατία, αντίστοιχα. Οι ενώσεις διαλύθηκαν σε 100% DMSO και φυλάχθηκαν στους -20 ° C. Σισπλατίνη (1 mg /ml) ελήφθη από το Τμήμα Φαρμακευτικής, Nottingham University Νοσοκομεία, Ηνωμένο Βασίλειο

Γραμμές κυττάρων και Πολιτισμού

Προηγουμένως καλά χαρακτηρισμένα κύτταρα ωοθήκης κινέζικου χάμστερ (CHO).? CHO9 (αγρίου τύπου), ΕΜ-C11 (ΧΚΧΧ1-μεταλλαγμένο: C389Y υποκατάσταση οδηγεί σε αστάθεια XRCC1protein), ΕΜ-C12 (ΧΚΧΧ1-μεταλλαγμένο: υποκατάσταση E98K με αποτέλεσμα τη μειωμένη ακεραιότητα πρωτεΐνη ΧΚΧΧ1) [28] δόθηκαν από τον Καθηγητή Małgorzata Ζ Zdzienicka , Τμήμα Γενετικής κυττάρων Μοριακής, Πανεπιστήμιο Nicolaus-Copernicus στο Torun, Μπιντγκός 85-094, Πολωνία. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Ham F-10 μέσο (ΡΑΑ, UK) [συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (ΡΑΑ, UK) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη]. EM9-V (ΧΚΧΧ1 μεταλλαγμένο) και κύτταρα EM9 σταθερώς επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης της ανθρώπινης ΧΚΧΧ1 (κύτταρα EM9-XH) [29] δόθηκαν από τον καθηγητή Keith Caldicott, Genome Βλάβη και Κέντρο Σταθερότητας, Πανεπιστήμιο του Sussex, UK. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο (ΡΑΑ, UK) [συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (ΡΑΑ, UK) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη]. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα OVCAR-3 και OVCAR-4 αναπτύχθηκαν σε μέσα RPMI (ΡΑΑ, UK) [συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (ΡΑΑ, UK) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη].

ΧΚΧΧ1 knockdown Χρησιμοποιώντας siRNAs

Τρεις ΧΚΧΧ1 siRNA κατασκευάσματα (αλληλουχίες που παρατίθενται στον πίνακα 1) και ένα αρνητικό κωδικοποιημένα ελέγχου και siRNA για αφυδρογονάση 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) (θετικός έλεγχος) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις μελέτες. Τα κατασκευάσματα siRNA αγοράστηκαν από την Ambion τεχνολογίες της ζωής, του Ηνωμένου Βασιλείου. Το πρωτόκολλο διαμόλυνσης ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως από Fan et.al [30]. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων (2 ml μέσου /φρεάτιο χωρίς αντιβιοτικά). Στους 50% συρροή, επιμόλυνση επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας Lipofectamine ΤΜ 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, siRNA (100 pmol) και Lipofectamine (5 μΐ) αναμείχθηκαν έκαστο χωριστά με 250 μΐ αισιό- ΜΕΜ1 (GIBCO /Invitrogen) χωρίς FBS. Μετά από επώαση 5 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου, τα διαλύματα siRNA και Lipofectamine συνενώθηκαν και επωάστηκαν για άλλα 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτό το μίγμα στη συνέχεια προστέθηκε σε επιστρωμένα κύτταρα, καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C όλη τη νύκτα και το μέσο αντικαταστάθηκε αργότερα με φρέσκο ​​μέσο συν πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη (1%). Όταν τα κύτταρα φθάσει το 100% συρροή, αυτά θρυψινοποιήθηκαν και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε 75 cm

2 φιάλες για τη συνεχή ανάπτυξη και /ή θεραπεία. ΧΚΧΧ1 Knockdown αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western σε διάφορα χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση (ημέρες 3, 5 και 7).

Η

Ανάλυση Western Blot

Τα δείγματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν με λύση κυττάρων σε ρυθμιστικό RIPA (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Nonidet ρ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 1 ιπΜΕϋΤΑ, 0,1% SDS) που περιείχε αναστολέα πρωτεάσης (Sigma) και αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ 2 και 3 (Sigma) και στη συνέχεια λαμβάνονται για western blot αναλύσεις όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Πρωτογενή αντίσωμα ήταν ένα αντι -XRCC1 ποντικού (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) και κουνελιού αντι-ATR (Novus Biologicals, USA). συζυγούς HRP δευτερογενές αντίσωμα ήταν ένα κουνέλι αντι-ποντικού και αίγας αντι-κουνελιού αντίστοιχα (Dako, Glostrup, Δανία).

Δοκιμασία κλωνογονιδιακή επιβίωση

Διακόσια κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε έξι φρεατίων πλακών. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 4 ώρες. NU6027 ή VE-821 προστέθηκαν στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και οι πλάκες αφέθηκαν στον επωαστήρα για 10 ημέρες για τα κύτταρα CHO. Για siRNA επιμολυσμένα OVCAR-3 και OVCAR-4 κύτταρα, τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση, NU6027 ή VE-821 προστέθηκε στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και οι πλάκες αφέθηκαν στον επωαστήρα για 14 ημέρες. Για μελέτες σισπλατίνη και ο συνδυασμός αναστολέα ATR, τα κύτταρα αρχικά σε επεξεργασία με σισπλατίνη για 16 ώρες και στη συνέχεια πλένονται ήπια δύο φορές με 1Χ αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό και επωάστηκε σε φρέσκα μέσα με ή χωρίς NU6027 (4 μΜ για τα κύτταρα CHO και 6 μΜ για OVCAR-3 κύτταρα ) για 10 ημέρες (κύτταρα CH) ή 14 ημέρες (ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα). Μετά την επώαση, το μέσο απορρίφθηκε, σταθερό (με μεθανόλη και μίγμα οξικό οξύ) χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν. Κλάσμα επιβίωσης = [αρ των αποικιών που σχηματίζονται /(αριθ. των κυττάρων σπέρνονται x αποτελεσματικότητα επιμετάλλωση)]. Όλα κλωνογόνο δοκιμασίες έγιναν εις τριπλούν.

Αλκαλικές Δοκιμασία COMET

Αυτή η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [31]. Εν συντομία, υπο-συρρέοντα κύτταρα εκτέθηκαν σε NU6027 (4 μΜ). Στις 24 ώρες, τα κύτταρα εκχυλίζονται και αλκαλική κομήτη δοκιμασίες διεξήχθησαν. Αλκαλίων διάλυμα ηλεκτροφόρησης αποτελούνταν από 200 mM NaOH, 1 mM EDTA και ρΗ 13. Οι πλάκες στη συνέχεια βάφτηκαν με SYBR® πράσινο (1:10,000 αραίωση) (Molecular Probes) για 10 λεπτά και απεικονίσεις έγιναν ορατές κάτω από ένα φίλτρο ροδαμίνης με την Olympus BX40 μικροσκόπιο. Οι κομήτες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης εικόνας Comet Δοκιμασία III (οξυδερκής Instruments, Suffolk, Ηνωμένο Βασίλειο). Ένα σύνολο 200 κομήτη εικόνες αξιολογήθηκαν για ελιά ουρά στιγμή.

γH2AX ανοσοκυτταροχημεία

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με NU6027 (4 μΜ για τα κύτταρα CHO και 6 μΜ για OVCAR-3 κύτταρα) και η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [31]. Για μελέτες σισπλατίνη και NU6027 συνδυασμός, αρχικά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 16 ώρες με σισπλατίνη (1,5 μΜ για τα κύτταρα CHO και 1 μΜ για OVCAR-3 ή των κυττάρων OVCAR-4) και στη συνέχεια πλύθηκε απαλά δύο φορές με 1Χ αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό και επωάζονται σε φρέσκο μέσων με ή χωρίς NU6027 (4 μΜ για τα κύτταρα CHO και 6 μΜ για OVCAR-3 ή OVCAR-4 κύτταρα) και την δοκιμασία διεξήχθη όπως παραπάνω. Οι συχνότητες των κυττάρων που περιέχουν γH2AX εστίες προσδιορίστηκαν σε 100 κύτταρα ανά διαφάνεια σε τρία ξεχωριστά πειράματα. Πυρήνες που περιέχουν περισσότερο από έξι εστίες γH2AX θεωρήθηκαν θετικά.

Αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής (FACS) για τον Κύκλο Κυττάρου Πρόοδος

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες με NU6027 (4 μΜ για τα κύτταρα CHO και 6 μΜ για OVCAR-3 ή OVCAR-4 κύτταρα). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν αργότερα με θρυψινοποίηση και φυγοκέντρηση (1000 rpm για 5 λεπτά) και FACS αναλύσεις διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31].

Η απόπτωση Ανίχνευση με FITC-αννεξίνης V Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Cells υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ώρες με NU6027 (4 μΜ για τα κύτταρα CHO και 6 μΜ για OVCAR-3 ή OVCAR-4 κύτταρα). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν αργότερα με θρυψινοποίηση και φυγοκέντρηση (1000 rpm για 5 λεπτά) και πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και στη συνέχεια επανα-αιωρημένα κύτταρα σε ρυθμιστικό σύνδεσης 1Χ σε συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /ml. Στη συνέχεια, 100 μΙ του διαλύματος (1 χ 10

5 κύτταρα) μεταφέρθηκε σε έναν σωλήνα καλλιέργειας 5 ml και προστέθηκαν 5 μΐ FITC Annexin V και 5 μΐ ΡΙ. Τα κύτταρα στη συνέχεια ήπια δίνη και επωάζονται για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (25 ° C) στο σκοτάδι. Μετά την επώαση, 400 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης προστέθηκε σε κάθε σωλήνα και αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής μέσα σε 1 ώρα. Για μελέτες σισπλατίνη και NU6027 συνδυασμό, τα κύτταρα αρχικά σε αγωγή για 16 ώρες με σισπλατίνη (1,5 μΜ για τα κύτταρα CHO και 1 μΜ για OVCAR-3 ή των κυττάρων OVCAR-4) και στη συνέχεια πλύθηκε απαλά δύο φορές με 1Χ αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό και επωάζονται σε φρέσκο μέσων με ή χωρίς NU6027 (4 μΜ για τα κύτταρα CHO και 6 μΜ για OVCAR-3 ή OVCAR-4 κύτταρα) και την δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo7.6.1.

Η αξιολόγηση της αλληλεπίδρασης Φαρμάκων (Συνδυασμός Index)

Για να διερευνήσουν συνεργιστική και πρόσθετου δραστηριότητας, ο δείκτης συνδυασμού υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Οι καμπύλες δόσης-απόκρισης για τη σισπλατίνη ή NU6027 μόνος αρχικά δημιουργούνται. Η επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας στη συνέχεια αναλύθηκε για τον συνδυασμό του φαρμάκου Α (σισπλατίνη) και Β (NU6027), εφαρμόζοντας την ακόλουθη εξίσωση: AC /Ae + Bc /Be = D, όπου AC και BC αντιστοιχούν στις συγκεντρώσεις των φαρμάκων που χρησιμοποιείται στη θεραπεία συνδυασμού, και Ae και να αντιστοιχεί στις συγκεντρώσεις των φαρμάκων σε θέση, από μόνα τους, παράγουν το ίδιο μέγεθος της επίδρασης. Αν D (συνδυασμός δείκτης) είναι & lt? 1 το αποτέλεσμα του συνδυασμού είναι συνεργιστική, ενώ εάν D = 1 ή D είναι & gt? 1 το αποτέλεσμα είναι προσθετικό ή ανταγωνιστικό αντίστοιχα [32]

Αποτελέσματα

.

συνθετικό θνησιμότητα

Για την αξιολόγηση συνθετικών θνησιμότητα προ-κλινικά, ένα πάνελ ΧΚΧΧ1 ανεπάρκεια και ΧΚΧΧ1 ικανός ωοθήκης κινέζικου χάμστερ και ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών υπέστησαν αγωγή με αναστολείς μικρού μορίου του ATR (NU6027 και VE-821 ).

ωοθήκης κινέζικου χάμστερ (CHO).

CHO9 (άγριου τύπου), ΕΜ-C11 (ΧΚΧΧ1 ανεπάρκεια) και ΕΜ-C12 (ΧΚΧΧ1 ανεπάρκεια) διερευνήθηκαν σε δοκιμασίες κλωνογονική επιβίωση. Αξιολογήσαμε αρχικά ΧΚΧΧ1 και την κατάσταση της έκφρασης ATR στα κύτταρα CHO9, ΕΜ-C11 και EM-C12. Η ανάλυση στυπώματος Western στο Σχήμα 1Α δείχνει ότι ΕΜ-C11 και ΕΜ-C12 δεν έχουν μετρήσιμη έκφραση της πρωτεΐνης σε σύγκριση με ΧΚΧΧ1 CHO9. EM-C11, EM-C12 και CHO9 είναι καλά στην έκφραση ATR. Η Εικόνα 1Β δείχνει ότι ΕΜ-C11 και ΕΜ-C12 κύτταρα είναι ευαίσθητα σε θεραπεία NU6027 σύγκριση με τα κύτταρα CHO9. Παρομοίως, ΕΜ-C11 και ΕΜ-C12 κύτταρα είναι επίσης ευαίσθητα σε VE-821 σε σύγκριση με κύτταρα CHO9 (Σχήμα 1 C). Για να διερευνηθεί αν η ευαισθησία των ελαττωματικών κυττάρων ΧΚΧΧ1 στους αναστολείς ATR μπορεί να διορθωθεί με την έκφραση της πρωτεΐνης ΧΚΧΧ1 άγριου τύπου σε ΧΚΧΧ1 ελλειμματικά CHO κύτταρα, πραγματοποιήσαμε κλωνογενείς δοκιμασίες σε EM9-V (ΧΚΧΧ1 μεταλλαγμένο) και EM9-XH (κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με ένας φορέας ανθρώπινη ΧΚΧΧ1 έκφρασης). Το Σχήμα 1D δείχνει ότι EM9-V κύτταρα είναι ευαίσθητα σε σύγκριση με NU6027 EM9-XH.

Δοκιμασίες κλωνογονικότητας επιβίωσης για CH κύτταρα κατεργασμένα με NU6027 (Β) και VE-821 (C) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις (βλέπε μεθόδους για καθέκαστα). Δ Κλωνογόνος δοκιμασίες επιβίωσης για EM9-V και EM9-XH κύτταρα κατεργασμένα με NU6027. Ε αλκαλικές COMET δοκιμασία στο CH κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με NU6027. ΕΜ-C11 και ΕΜ-C12 έδειξε μια υψηλότερη μέση στιγμή ουρά σύγκριση με τα κύτταρα CHO9. ΣΤ EM-C11 και EM-C12 κύτταρα συσσωρεύονται σημαντικά υψηλότερο εστίες γH2AX σε σύγκριση με τα κύτταρα CHO9 κατά την αγωγή NU6027. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± SEM (n = 6). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Students t-test. * P & lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια, διεξάγεται λειτουργική ανάλυση σε κύτταρα. αναστολή ATR οδηγεί σε συσσώρευση του DNA μόνο διάλειμμα κλώνου (SSB). Ως εκ τούτου δοκιμασία αλκαλικές COMET εκτελέστηκε. Το Σχήμα 1Ε συνοψίζει τα αποτελέσματα για τα κύτταρα CHO9, ΕΜ-C11 και ΕΜ-C12 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 4 μΜ NU6027. Σε σύγκριση με τα δείγματα προ-επεξεργασία, μετά από 24 ώρες έκθεσης σε αναστολέα της ATR, ΕΜ-C11 και EM-C12 κύτταρα επιδεικνύουν μια σημαντικά υψηλότερη μέση ουρά στιγμή σε σύγκριση με CHO9 (p & lt? 0,01). Τα στοιχεία επιβεβαιώνουν SSB συσσώρευσης μετά από αναστολή ATR στην ανεπάρκεια των κυττάρων ΧΚΧΧ1.

DNA διπλής διαλείμματα σκέλος (DSBs) επάγει φωσφορυλίωση του Η2ΑΧ στη σερίνη 139 (γH2AX). Συσσώρευση γH2AX εστιών στον πυρήνα είναι ένας δείκτης του DSBs. Ως εκ τούτου, γH2AX ανοσοκυτταροχημεία πραγματοποιήθηκε σε ΕΜ-C11, EM-C12 και τα κύτταρα CHO9 αντιμετωπίζονται με 4 μΜ της NU6027. Πυρήνες που περιέχουν περισσότερο από έξι εστίες γH2AX θεωρήθηκαν θετικά. γH2AX ανοσοκυτταροχημεία επιβεβαίωσε ότι ΧΚΧΧ1 ανεπάρκεια EM-C11 και EM-C12 κύτταρα συσσωρεύσει πάνω γH2AX εστιών σε 48 ώρες (p = 0,02 και p = 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα CHO9 (Σχήματα 1D).

Η συσσώρευση των DSBs μπορεί να καθυστερήσει εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. FACS αναλύσεις, ως εκ τούτου πραγματοποιήθηκε σε ΕΜ-C11, C12-EM και κυττάρων CHO9 κατεργάζεται με NU6027 (4 μΜ). πρόοδο του κύκλου των κυττάρων εκτιμήθηκε και συγκρίθηκε με τα δείγματα ελέγχου. Στις 24 ώρες, ΕΜ-C11 και ΕΜ-C12 δείχθηκε να συλληφθεί στην G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου (p = 0.01 και ρ = 0.03) σε σύγκριση με κύτταρα CHO9 (Σχήμα 2Α και 2Β).

Β. Ποσοτικοποίηση των διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου δείχνεται για CH κύτταρο υποβάλλεται σε επεξεργασία με NU6027. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± SEM (n = 6). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Students t-test. * P & lt? 0,05. δοκιμασία V απόπτωση C. FITC-Annexin εμφανίζεται εδώ. Η αναλογία των κυττάρων σε απόπτωση πρώιμη φάση είναι υψηλότερη σε κύτταρα με ανεπαρκές ΧΚΧΧ1 κατεργάζεται με NU6027 σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου.

Η

Συσσώρευση DSBs, εάν επιδιορθώθηκε, επάγει απόπτωση σε κύτταρα. Ως εκ τούτου, FITC-αννεξίνης ανάλυση κυτταρομετρίας ροής V διεξήχθη για να προσδιοριστεί ποσοτικά απόπτωση σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 4 μΜ NU6027 και αποπτωτικών κυττάρων ποσοτικοποιούνται στις 48 ώρες. Σε κύτταρα ΕΜ-C11 το ποσοστό των κυττάρων σε πρώιμη απόπτωση αυξήθηκε σε 7,5% μετά από αγωγή 48 ώρες με NU6027 σε σύγκριση με 1,73% σε ακατέργαστα κύτταρα. Ομοίως σε κύτταρα EM-C12, το ποσοστό των πρόωρων αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε από 2,62% σε 9,88%. Από την άλλη πλευρά σε κύτταρα CHO9, δεν υπήρξε μεταβολή στο ποσοστό των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (3.22% σε μη επεξεργασμένα και 3,38% μετά από 48 ώρες επεξεργασίας NU6027 (Σχήμα 2C).

Τα δεδομένα που παρουσιάζονται σε Chinese Hamster κύτταρα υποδηλώνει ότι κύτταρα με ανεπαρκές ΧΚΧΧ1 είναι ευαίσθητα σε αναστολείς ATR. αναστολή ATR οδηγεί σε αυξημένη συσσώρευση DSB, G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Αυτό υποδηλώνει ένα συνθετικό σχέση θνησιμότητα μεταξύ ΧΚΧΧ1 και ATR. για να επιβεβαιωθεί αυτό δεδομένα περαιτέρω διερευνήσαμε σε ανθρώπινα ωοθήκης καρκινικές κυτταρικές σειρές.

ανθρώπινο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα.

δημιουργήσαμε ΧΚΧΧ1 knockdown ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών χρησιμοποιώντας τρία κατασκευάσματα siRNA (Πίνακας 1). Μετά την επιμόλυνση, λύματα κυττάρων ελήφθησαν δείγματα τις ημέρες 3, 5 και 7 για ΧΚΧΧ1 γκρεμίζω με ανάλυση κηλίδος western. Το Σχήμα 3Α επιβεβαιώνει ότι και οι τρεις κατασκευάσματα (siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3) επάγουν αποτελεσματική knockdown (πάνω από 80%) των ΧΚΧΧ1 σε OVCAR 3-κύτταρα την ημέρα 3 σε σύγκριση με κωδικοποιημένα αρνητικό έλεγχο και GAPDH θετικός μάρτυρας. Σε προσδιορισμούς κλωνογονική επιβίωση, θεραπεία NU6027 μειωμένη επιβίωση σε κύτταρα με ανεπαρκές ΧΚΧΧ1 σε σύγκριση με καλά κύτταρα (Σχήμα 3Β). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε OVCAR-4 κύτταρα (Σχήμα S1 Α). γH2AX ανοσοκυτταροχημεία επιβεβαίωσε ότι κύτταρα με ανεπαρκές ΧΚΧΧ1 συσσωρεύσει πάνω γH2AX εστιών στις 48 ώρες (ρ = 0,05, ρ = 0,01 και ρ = 0,007 αντίστοιχα) σε σύγκριση με κωδικοποιημένο αναφοράς (Σχήμα 3C). Επιπλέον, στις 24 ώρες, τα κύτταρα με έλλειψη ΧΚΧΧ1 δείχθηκαν να συλληφθεί στην G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου (ρ = 0,05, ρ = 0,04 και ρ = 0,05) σε σύγκριση με κύτταρα CHO9 (Σχήμα 3D). Σε κύτταρα με ανεπαρκές ΧΚΧΧ1 η αναλογία των κυττάρων στην απόπτωση αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τους ελέγχους κωδικοποιημένα κατά την αγωγή NU6027 (Σχήμα 3Ε).

Β. Δοκιμασίες κλωνογονικότητας επιβίωσης για siRNA επιμολυσμένα OVCAR-3 κύτταρα που κατεργάζονται με NU6027 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις παρουσιάζεται εδώ (βλέπε μεθόδους για λεπτομέρειες). ανεπάρκεια κύτταρα Γ ΧΚΧΧ1 συσσωρεύονται σημαντικά υψηλότερο εστίες γH2AX σε σύγκριση με ομελέτα κύτταρα ελέγχου κατά την αγωγή NU6027. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± SEM (n = 6). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Students t-test. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01. D. Η ποσοτικοποίηση των διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου φαίνεται για παρουσιάζεται εδώ siRNA επιμολυσμένα OVCAR-3 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με NU6027. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± SEM (n = 3). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Students t-test. * P & lt? 0,05. Ε-FITC Annexin V δοκιμασία απόπτωσης για siRNA επιμολυσμένα OVCAR-3 κύτταρα δείχνεται εδώ. Η αναλογία των κυττάρων σε απόπτωση όψιμη φάση είναι υψηλότερη σε κύτταρα με ανεπαρκές ΧΚΧΧ1 κατεργάζεται με NU6027 σύγκριση με κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου.

Η

Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα από κύτταρα CHO και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές παρέχουν πειστικές αποδείξεις ότι οι αναστολείς ATR επάγουν συνθετικό θνησιμότητα σε ανεπαρκή κύτταρα ΧΚΧΧ1.

η σισπλατίνη Chemopotentiation

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι το ελλιπές κύτταρα ΧΚΧΧ1 είναι ευαίσθητα στη σισπλατίνη [17]. Στην παρούσα μελέτη, επιβεβαίωσε για πρώτη φορά αυτή την παρατήρηση στην ΧΚΧΧ1 ανεπάρκεια EM-C11 και τα κύτταρα ΕΜ-C12 σε σύγκριση με CHO9 άγριου τύπου κύτταρα (Εικόνα 4Α). Στη συνέχεια αξιολογούνται οι στρατηγικές συνδυασμού. Η κυτταροτοξικότητα της σισπλατίνης ενισχύθηκε με NU6027 σε ΧΚΧΧ1 κύτταρα ελλειμματικά CH σε σύγκριση με καλά κύτταρα ΧΚΧΧ1. Προκειμένου να αξιολογηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ NU6027 και σισπλατίνη, ο δείκτης συνδυασμού υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με την παρουσία αυξανόμενων δόσεων cisplatin (εύρος 0,5-3 μΜ) σε συνδυασμό με μια συγκέντρωση NU6027 σε θέση να επάγουν μία αναστολή της ανάπτυξης κατά 50%. NU6027 ενίσχυσε την κυτταροτοξική δράση της σισπλατίνης επί ελλειμματικών κυττάρων ΧΚΧΧ1 (Πίνακας 2). Αν ο δείκτης συνδυασμού (D) είναι & lt? 1, η επίδραση του συνδυασμού είναι συνεργιστική, ενώ εάν D = 1 ή D είναι & gt? 1 το αποτέλεσμα είναι προσθετικό ή ανταγωνιστικό αντίστοιχα [32]. Στην παρούσα μελέτη, ο δείκτης συνδυασμού ήταν ένα στα κύτταρα ΕΜ-C11 και ΕΜ-C12. Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η ενίσχυση της σισπλατίνης κυτταροτοξικότητα με NU6027 σε κύτταρα CHO ήταν προσθετική και όχι συνεργική. Στη συνέχεια προχωρήσαμε να διεξάγει λειτουργικές αναλύσεις στα κύτταρα. Η σισπλατίνη μόνη θεραπεία αυξημένη συσσώρευση DSB σε κύτταρα με ανεπαρκές ΧΚΧΧ1 οποία αυξήθηκε περαιτέρω κατά NU6027 (ρ = 0,01 και ρ = 0,02) (Σχήμα 4Β). Η συσσώρευση DSB δει σε ελλειμματικά κύτταρα ΧΚΧΧ1 συσχετίστηκε επίσης με συσσώρευση αποπτωτικών κυττάρων όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Γ.

X-άξονας δηλοί αυξανόμενη συγκέντρωση του μόνο σισπλατίνη. NU6027 ορίστηκε σε 4 μΜ. B. ΧΚΧΧ1 ανεπάρκεια CH κύτταρα συσσωρεύονται σημαντικά υψηλότερα εστίες γH2AX σύγκριση με ΧΚΧΧ1 ικανός CH κύτταρα κατά την αγωγή cisplatin μόνο του ή σε συνδυασμό σισπλατίνης και NU6027. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± SEM (n = 6). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Students t-test. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01. δοκιμασία V απόπτωση C. FITC-Annexin εμφανίζεται εδώ. Η αναλογία των κυττάρων σε πρώιμη φάση, καθώς και η απόπτωση όψιμης φάσης είναι υψηλότερη σε κύτταρα με ανεπαρκές ΧΚΧΧ1 που έλαβαν μόνο σισπλατίνη ή ένα συνδυασμό σισπλατίνης και NU6027 σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου.

Η

τότε διεξάγονται παρόμοιες μελέτες σε siRNA επιμολυσμένα ανθρώπινα OVCAR-3 ή OVCAR-4 κύτταρα. Παρόμοια με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν σε CH κύτταρα, ΧΚΧΧ1 ανεπαρκή OVCAR-3 ή OVCAR-4 κύτταρα ήταν ευαίσθητα σε σισπλατίνη. NU6027 ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα της σισπλατίνης σε OVCAR-3 κύτταρα ΧΚΧΧ1 ανεπάρκεια σε σύγκριση με καλά κύτταρα ΧΚΧΧ1 (Σχήμα 5Α). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε OVCAR-4 κύτταρα (Σχήμα S1 Β). Μελέτες δείκτη συνδυασμού (Πίνακας 2) έδειξαν ότι στα περισσότερα κύτταρα ήταν μία, εκτός από OVCAR-3 κύτταρα που κατεργάζονται με Si RNA_3 (D = 0,93) και OVCAR-4 κύτταρα SiRNA_1 (D = 0,99). Στο σύνολό τους, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών η ενισχυτική δράση είναι πιθανό να είναι πρόσθετο. Η σισπλατίνη μόνη θεραπεία αυξήθηκε συσσώρευση DSB σε κύτταρα τα οποία αυξήθηκε περαιτέρω κατά NU6027 (ρ = 0.02, ρ = 0.007 και ρ = 004) (Σχήμα 5Β). Η συσσώρευση DSB δει σε ελλειμματικά κύτταρα ΧΚΧΧ1 σχετίστηκε με σημαντική συσσώρευση αποπτωτικών κυττάρων όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C.

Β. ελλειμματικά κύτταρα ΧΚΧΧ1 συσσωρεύονται σημαντικά υψηλότερα εστίες γH2AX σύγκριση με ΧΚΧΧ1 ικανός κύτταρα κατά την αγωγή cisplatin μόνο του ή σε συνδυασμό σισπλατίνης και NU6027. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± SEM (n = 6). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Students t-test. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01. δοκιμασία V απόπτωση C. FITC-Annexin εμφανίζεται εδώ. Η αναλογία των κυττάρων σε απόπτωση όψιμη φάση είναι υψηλότερη σε κύτταρα με ανεπαρκές ΧΚΧΧ1 που έλαβαν μόνο σισπλατίνη ή ένα συνδυασμό σισπλατίνης και NU6027 σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου.

Η

Τα στοιχεία που παρουσιάζονται εδώ δεν παρέχει μόνο περαιτέρω απόδειξη ότι ανεπαρκή κύτταρα ΧΚΧΧ1 είναι ευαίσθητα στη σισπλατίνη χημειοθεραπεία, αλλά επίσης δείχνει ότι η αναστολή ATR ενισχύει προσθετικά τοξικότητα σισπλατίνης σε ανεπαρκή κύτταρα ΧΚΧΧ1 σε σύγκριση με καλά κύτταρα ΧΚΧΧ1.

Συμπεράσματα

πρωτεΐνη ATR κινάση είναι ένας βασικός αισθητήρας του ενιαίου -stranded DNA που σχετίζονται με την στασιμότητα πιρούνια αντιγραφή και ενδιάμεσα επισκευής που δημιουργούνται κατά τη διάρκεια της ΚΑΚ και της DSB επισκευή. ενεργοποίηση ATR ρυθμίζει διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, την αντιγραφή του DNA, την επιδιόρθωση του DNA και απόπτωση. ΧΚΧΧ1 είναι απαραίτητη για την ΚΑΚ και SSBR και συμβάλλει στην βαθμίδα απολίνωση της απόκρισης NER. Υποθέσαμε ότι η αναστολή ATR θα μπορούσε να είναι συνθετικά θανατηφόρο σε ανεπαρκή κύτταρα ΧΚΧΧ1.

Στην παρούσα μελέτη έχουμε επιβεβαιώσει ότι οι αναστολείς ATR είναι συνθετικά θανατηφόρα σε ανεπαρκή κύτταρα ΧΚΧΧ1. Έχουμε συνάψει συνθετικά θνησιμότητα για τους ακόλουθους λόγους. Πρώτον, τα κύτταρα CHO καθώς επίσης ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα ανεπαρκή σε ΧΚΧΧ1 ήταν εξαιρετικά ευαίσθητο σε αναστολείς ATR. Δεύτερον, οι λειτουργικές αναλύσεις έδειξαν ότι ATR αναστολή σε κύτταρα με ανεπαρκές ΧΚΧΧ1 οδήγησε σε συσσώρευση του DNA DSBs, G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την αυξημένη απόπτωση. Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με μια μελέτη από Peasland et al [22], τα οποία απέδειξαν ότι NU6027 είναι συνθετικά θανατηφόρο στο κελί αγωγή με αναστολέα PARP που εμποδίζει ΚΑΚ. Επιπλέον, οι συγγραφείς έδειξαν επίσης ότι EM9 κύτταρα κινεζικού χάμστερ που στερούνται ΧΚΧΧ1 είναι επίσης ευαίσθητα σε NU6027 [22]. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα, συμπεριλαμβανομένων δική μας, παρέχει πειστικές αποδείξεις ότι η αναστολή ATR είναι συνθετικά θανατηφόρα σε ανεπαρκή κύτταρα BER. Σας παρουσιάζουμε ένα μοντέλο εργασίας για ATR αναστολή ως συνθετική στρατηγική θνησιμότητα σε ανεπαρκή κύτταρα ΧΚΧΧ1. Εν συντομία, η αναστολή ATR οδηγεί σε συσσώρευση SSB. Κύτταρα που παρουσιάζουν έλλειψη ΧΚΧΧ1 δεν είναι σε θέση να επεξεργάζονται SSB, οι οποίες τελικά μετατρέπονται σε τοξικά DSBs στα πιρούνια αναπαραγωγή. Συντριπτική DSBs μπορεί όχι μόνο να κορεστεί επισκευή DSB, αλλά η αναστολή ATR είναι επίσης γνωστό ότι διαμορφώνουν την επισκευή DSB άμεσα [33], [34] που συμβάλλουν στην συνθετική θνησιμότητα παρατηρήθηκε σε κύτταρα.

Βρήκαμε επίσης ότι κύτταρα με ανεπαρκές ΧΚΧΧ1 είναι ευαίσθητα να σισπλατίνη. Η ευαισθησία σισπλατίνης σε ελλειμματικά κύτταρα ΧΚΧΧ1 που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας είναι συνεπής με μια πρόσφατη μελέτη σε κύτταρα HepG2 όπου η ευαισθησία σισπλατίνη καταδείχθηκε μετά την εξάντληση ΧΚΧΧ1 [35]. Εμείς δεν τήρησε καμία ενίσχυση της σισπλατίνης κυτταροτοξικότητα με αναστολέα ATR στα κύτταρα άγριου τύπου ΧΚΧΧ1. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με προηγούμενες προκλινικές μελέτες όπου ATR αδρανοποίησης (γενετικά ή με αναστολείς) έχει επιδείξει αυξημένη ευαισθησία πλατίνα σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών [22]. Ωστόσο, ο περιορισμός της μελέτης μας είναι ότι η έρευνά μας περιορίστηκε μόνο σε μερικούς τύπους κυττάρων. Παρ ‘όλα αυτά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το γενετικό υπόβαθρο (όπως η κατάσταση ΧΚΧΧ1) μπορούν να επηρεάσουν την ευαισθησία της πλατίνας. Συμπερασματικά, έχουμε καταδείξει ένα συνθετικό αίτηση φονικότητα για αναστολείς ATR στην ανεπαρκή κύτταρα ΧΚΧΧ1. αναστολή ATR μπορούν επίσης να επηρεάσουν την ευαισθησία της πλατίνας σε ανεπαρκή κύτταρα ΧΚΧΧ1.