Αφηρημένο

κινάσης σερίνης /θρεονίνης 31 (STK31) είναι ένα από τα νέα αντιγόνα του καρκίνου του /των όρχεων για την οποία του βιολογικές λειτουργίες παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφής. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι STK31 υπερεκφράζεται σε πολλούς ανθρώπινους ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και ιστούς. STK31 συνεντοπίζεται με περικεντρίνη στην centrosomal περιοχή σε όλα τα στάδια του κυτταρικού κύκλου. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν τα κύτταρα υφίστανται μίτωση, STK31 εντοπίζεται επίσης στις κεντρομεριδίων, κεντρική άτρακτο, και μέσου σώματος. Αυτή η συμπεριφορά εντοπισμός είναι παρόμοια με εκείνη των πρωτεϊνών των επιβατών χρωμοσωμικών, τα οποία είναι γνωστό ότι είναι οι σημαντικές παίκτες του σημείου ελέγχου συγκροτήματος ατράκτου. Η έκφραση του STK31 είναι κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται μέσω της ρύθμισης ενός υποτιθέμενου D-box πλησίον Ο-τερματική περιοχή του. Εκτοπικά-εκφράζεται STK31-GFP αυξάνει την κυτταρική μετανάστευση και επεμβατική ικανότητα χωρίς να μεταβάλλει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, ενώ η knockdown έκφραση του ενδογενούς STK31 με προερχόμενων από φακοϊούς αποτελέσματα shRNA σε ελαττώματα συγκρότηση μικροσωληνίσκων που παρατείνει τη διάρκεια της μίτωσης και να οδηγήσει σε απόπτωση. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση του STK31 συμβάλλει στην ογκογονικότητα σε σωματικά κύτταρα καρκίνου. STK31 μπορεί συνεπώς να λειτουργήσει ως πιθανό θεραπευτικό στόχο στον ανθρώπινο σωματικό καρκίνους

Παράθεση:. Kuo PL, Huang YL, Hsieh CC-J, Lee JC, Lin BW, Hung LY (2014) STK31 είναι ένα κύτταρο-Cycle ρυθμίζεται πρωτεΐνη που συμβάλλει στην ογκογονικότητα κύτταρα επιθηλιακού καρκίνου. PLoS ONE 9 (3): e93303. doi: 10.1371 /journal.pone.0093303

Επιμέλεια: Cayetano Γκονζάλες, Ινστιτούτο για την Έρευνα στη Βιοϊατρική, Ισπανία

Ελήφθη: 30η Δεκεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 3 Μάρτη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 25 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Kuo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις NSC101-2325-B-006-001 και NSC102-2325-Β-006-001 από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, να χορηγούν IBMS-CRC100-P01 από την Academia Sinica, του έργου της προαγωγής της ακαδημαϊκής αριστείας και του αναπτυσσόμενου κόσμου Ερευνητικά Κέντρα Class , και το Κέντρο Λοιμωδών Νόσων και Σηματοδοσίας Μεταγωγή Ερευνών, Εθνικό Cheng Kung University. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η κυτταρική διαίρεση σε κύτταρα θηλαστικών ρυθμίζεται από έναν αριθμό πρωτεϊνικών κινασών που ελέγχουν πρόοδο μέσω διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι απορρύθμιση των κινασών κυτταρικού κύκλου μπορεί να οδηγήσει σε πολλαπλασιασμό και απεριόριστη παρεκκλίνουσα διαίρεση των κυττάρων που οδηγεί σε γενωμική αστάθεια, δύο από τα οποία είναι τα κύρια χαρακτηριστικά της καρκινογένεσης [1], [2]. Συσσωρευμένες στοιχεία δείχνουν ότι μιτωτικής κινάσες είναι υπεύθυνες για την προστασία των κυττάρων από τις χρωμοσωμικές εκτροπές και ανευπλοειδία. Οι μιτωτικές κινάσες, όπως Polo-όπως κινάσες (ΡΕΚ) και κινάσες Aurora εμπλέκεται στη ρύθμιση της κεντρόσωμα κύκλου και σχηματισμός μιτωτικής ατράκτου. Μόλις σχηματιστεί η διπολική άτρακτος, οι άξονα οδοφράγματος συναρμολόγηση των πρωτεϊνών (SAC), όπως Bub1 και BubR1 που απαιτούνται για να εξασφαλιστεί η ορθή διπολική προσανατολισμό αδελφές χρωματίδες και κατάλληλες συνδέσεις μεταξύ κινητοχώρους και μικροσωληνίσκων της ατράκτου [2]. Μεταβολές στα μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται σε αυτές τις μιτωτική κινάσες μπορεί να οδηγήσει σε έξοδο από την μίτωση με συνέπεια, παρεκκλίνουσα αριθμό χρωμοσωμάτων, που οδηγεί σε ανευπλοειδία και τελικά καρκίνο [3].

Το κεντρόσωμα έχει θεωρηθεί ως ένα σημαντικό συστατικό σε ζωικά κυτταρική διαίρεση. Αποτελείται από δύο κεντριόλια με μία ορθογώνια διάταξη που περιβάλλεται από πυκνά σε ηλεκτρόνια pericentriolar υλικό (PCM) [4], [5]. Πολλές centrosomal πρωτεΐνες που βρίσκονται στο PCM έχουν ανακαλυφθεί, και παίζουν σημαντικό ρόλο που έχουν υψηλή συσχέτιση με centrosomal λειτουργίες [6]. Αυτές centrosomal πρωτεΐνες μπορούν να χωριστούν σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα με τις λειτουργίες τους. Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει πρωτεΐνες που χρησιμεύουν ως ικριώματα για τη συναρμολόγηση των άλλων πρωτεϊνών, και έτσι απαιτούνται για τη διατήρηση της δομής του κεντροσώματος. Υπάρχει επίσης μια ομάδα πρωτεϊνών που λειτουργούν σε μικροσωληνίσκων πυρήνων. Τέλος, πολλά ρυθμιστικά μόρια, συμπεριλαμβανομένων των κινασών, φωσφατασών και μόρια σηματοδότησης, εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου [7]. Πολλές γραμμές αποδείξεως δεικνύουν ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση του centrosomal πρωτεϊνών ή κεντροσωμάτων δυσλειτουργία μπορεί να συνδεθεί με την ογκογένεση [8] – [10].

Στόχευση των μιτωτικών κινασών έχει θεωρηθεί μια άκρως επιτυχημένη στρατηγική για αντικαρκινική θεραπεία [11 ], [12]. μοριακό αναστολείς Μικρές στόχευσης CDKs, Aurora κινάσες, ή ΡΕΚ έχουν ερευνηθεί για την ικανότητά τους να διακόπτουν την ανάπτυξη του καρκίνου [13] – [16]. Αυτές οι ανασταλτικές ενώσεις επιδεικνύουν αποτελεσματικότητα

in vivo

επί ξενομοσχευμάτων ανθρωπίνου όγκου, και μερικά από αυτά διερευνώνται επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές [17]. Από την άλλη πλευρά, η θεραπεία καρκίνου που περιλαμβάνει ανοσοθεραπεία χρησιμοποιώντας Τ-κύτταρα, τα οποία αναγνωρίζουν τα αντιγόνα του καρκίνου, έχει γίνει μια προσέγγιση πολλά υποσχόμενη θεραπεία του καρκίνου [18], [19]. Έτσι, η ταυτοποίηση νέων αντιγόνων όγκου και επιτόπων Τ-κυττάρου όγκου-ειδική είναι χρήσιμο στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Μία ομάδα νεοπλασματικών αντιγόνων ονομάζεται καρκινικά αντιγόνα /όρχεων (CTA), η έκφραση του κανονικά να περιορίζεται σε όρχεις [20]. Ανοσογόνες αντικαρκινικά εμβόλια που στοχεύουν CTAs δεν δημιουργούν σημαντικό κίνδυνο εμφάνισης ανεπιθύμητων ενεργειών, επειδή η έκφρασή τους περιορίζεται σε αρσενικά γεννητικά κύτταρα, ανοσολογικά προνομιακή τοποθεσία του σώματος, και έτσι είναι ιδανικοί στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου.

προηγούμενη έκθεσή μας υποδεικνύονται ότι το

σερίνης /θρεονίνης κινάσης 31

(

STK31

) επίπεδο mRNA σε όρχεων ιστούς των ασθενών χωρίς ώριμα βλαστικά κύτταρα είναι σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των φυσιολογικών ανδρών [21]. Μια προηγούμενη έκθεση έδειξε ότι STK31 είναι ένα μυθιστόρημα CTA [22]. Εδώ, θα διερευνηθεί η συμμετοχή και φυσιολογικό ρόλο του STK31 στην ανάπτυξη καρκίνου. Βρήκαμε ότι STK31 εντοπίζεται στο κεντρόσωμα σε όλα τα στάδια του κυτταρικού κύκλου. Κατά τη διάρκεια της μίτωσης, μετοχές STK31 παρόμοια υποκυτταρικών εντοπίσεις με τις μιτωτικές κινάσες Aurora-Β και PLK1. Ο κύκλος εξαρτώμενη κυτταρική έκφραση του STK31 ελέγχεται από αποικοδόμηση ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος. Εξάντληση των STK31 επηρέασε τη διαδικασία συναρμολόγησης των μικροσωληνίσκων κατά τη μεσόφαση, υποδηλώνοντας δυνητικό ρόλο της στην μικροσωληνίσκων πυρήνων. Επιπλέον, η έλλειψη των καθυστερήσεων STK31 μιτωτικής εξέλιξη, οδηγεί σε αποτυχία για έξοδο από την μίτωση, και οδηγεί σε απόπτωση. Στο σύνολό τους, η μελέτη μας παρέχει μια πιθανή καρκίνο θεραπευτική στρατηγική που μπορεί να θεωρηθεί για τις μελλοντικές εφαρμογές.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενών Δείγματα

Ανθρώπινο παχέος καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Εθνικού Πανεπιστημίου Cheng Kung Νοσοκομείο. Η γραπτή συγκατάθεση από τον δότη ήταν αποθηκευμένα στη βάση δεδομένων του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Cheng Kung Νοσοκομείο και να χρησιμοποιηθούν για την έρευνα.

πλασμίδια, κυτταρικές γραμμές και διαμόλυνση

Ανθρώπινο STK31 πλήρους μήκους cDNA κλωνοποιήθηκε μέσα σε φορέα pEGFP -Ν1. ΑΖ521, ένα ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρική γραμμή, καλλιεργήθηκε σε μέσο DMEM (Sigma) συν 10% ΜΕΜ (GIBCO) και 1% ΝΕΑΑ (Bio-West). HCT116, ένα ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρική σειρά, διατηρήθηκε σε RPMI-1640 (GIBCO). Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% FBS (Bioscience), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (GIBCO). Για παροδική επιμόλυνση, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν μέχρι 80% συρροή και παροδικά επιμολυσμένα με STK31-GFP χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

λεντοϊών Short-φουρκέτας RNA (shRNA) Επιμόλυνση

Η pLKO.1 αποστολή σύντομο RNA (shRNA) φορείς ενάντια

STK31

(TRCN0000003274, TRCN0000003275, TRCN0000003276 και TRCN0000028838-Α4, TRCN0000028841-Β4, TRCN0000028758-F3, TRCN0000028817-G1, TRCN0000028819-H2) ήταν λαμβάνονται από τις εθνικές RNAi Πυρήνας διευκόλυνσης (Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας /Genomic Research Center, Academia Sinica, Ταϊβάν). Η αποτελεσματικότητα του

STK31

shRNA παρακολουθείται τόσο από ανοσοστυπώματος και ανάλυση Q-PCR (Εικόνες S2A και S2B). Για STK31 knockdown, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν μέχρι 80% συρροή και μολύνθηκαν με

STK31

Τα siRNAs με πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) τέσσερα συμπληρωμένο με 8 μg /ml polybrene (SIGMA). Μετά από 48 ώρες από τη μόλυνση, 1 μg /ml πουρομυκίνη (Sigma) προστέθηκε στο μέσο ανάπτυξης για την επιλογή. Μετά από επιπλέον 48 ώρες καλλιέργειας, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ολική κάθαρση RNA ή ολικό εκχύλιση κυτταρικής λύσης.

Ανάλυση Western Blot και Αντισώματα

Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM NaCl, 1% ΝΡ40, 0,5% δεοξυχολικό Να-, 1 mM EDTA, και 50 mM Tris-HCl? ρΗ 7,4) με την προσθήκη του κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης 1X (Roche Molecular Diagnostics) και 1Χ αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ (P0044, Sigma). Αντι-α-τουμπουλίνης (DM1A), αντι-γ-τουμπουλίνης (GTU88), αντι-ακτίνης, αντι-GAPDH, αντι-κυκλίνη Β, αντι-φωσφο-ιστόνης 3 /σερίνη 10, και αντι-Aurora-Β αντισώματα αγοράστηκαν από τη Sigma. αντίσωμα αντι-myc αποκτήθηκε από την Invitrogen. Anti-περικεντρίνη (Ab4448) αγοράστηκε από Abcam. Αντι-GFP αντίσωμα (JL-8) αγοράστηκε από την Clontech.

Real Time PCR και Αστάρια

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με την εικόνα του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με 1 μg του συνολικού RNA χρησιμοποιώντας IMPROM-ΙΙ της ανάστροφης μεταγραφάσης (Promega). Real-time PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το πλεονέκτημα SYBR qPCR προμίγματος (Bio-Rad) σε ένα CFX96 σύστημα πραγματικού χρόνου και C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad), και η αντίδραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες για 44 κύκλους: 95 ° C για 15 s, 60 ° C για 10 s, και 72 ° C για 5 s. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται έχουν ως εξής: εμπρόσθιος εναρκτήρας και αντίστροφο εκκινητή για ανθρώπινη

STK31

είναι 5′-CAGGACCAGAAACTGATTGAAG-3 ‘και 5′-TCCATTCAAAGAAGCTGGAGTAG-3’, αντίστοιχα. Παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο του φθορισμού και ανάλυση καμπύλης τήξης έγιναν με Bio-Rad σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Bio-Rad). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με Bio-Rad CFX λογισμικό Διαχειριστή έκδοση 1.5 για να καθοριστεί ο κύκλος κατωφλίου (

Cp

) πάνω από το υπόβαθρο για κάθε αντίδραση. Η σχετική ποσότητα του γονιδίου στόχου κανονικοποιήθηκε με εκείνο του

ακτίνης

του ίδιου cDNA.

ανοσοφθορισμού χρώσης

κύτταρα αναπτύσσονται σε καλυπτρίδες ξεπλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 3.7% φορμαλδεΰδη για 6 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, ή καθορίζεται από παγωμένη μεθανόλη /ακετόνη (w /w, 1:01) για 10 λεπτά στους -20 ° C. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με επώαση με 0,01% Tween-20 σε PBS για 3-5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Για την ανίχνευση κεντροσωμάτια ή μικροσωληνίσκους, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με μονοκλωνικό αντι-γ-τουμπουλίνης (GTU-88, 1:200 αραίωση) ή αντι-α-τουμπουλίνης (DM1A, 1:200 αραίωση), αντιστοίχως, που ακολουθείται από επώαση με Alexa Fluor 488 ή IgG αντι-ποντικού 568 κουνελιού (1:200 αραίωσης, Invitrogen). Για την ανίχνευση ενδογενών STK31, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντίσωμα STK31 μονοκλωνικό ποντικού, 1G10, ακολουθούμενα από επώαση με αντι-ποντικού IgG Alexa Fluor 488 ή 568 κουνέλι. Εικόνες παρατηρήθηκαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Personal DV Εφαρμοσμένης ακριβείας, Issaquah, WA) που έχει μια λειτουργία αποσυνέλιξη (

softWORX

).

κυτταρομετρίας ροής

Τα ΑΖ521 κύτταρα με διαφορετικές επεξεργασία του κυτταρικού κύκλου μονιμοποιήθηκαν με 80% αιθανόλη για 24 ώρες στους -20 ° C και στη συνέχεια χρωματίζονται με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. διανομή φάση κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με μέσο FACS Calibur (BD Biosciences).

TUNEL Δοκιμασία

Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 σε PBS που παρέχεται με 0.1% κιτρικό νάτριο. Η δοκιμασία TUNEL έγινε με ένα

In Situ

κυτταρικού θανάτου Detection Kit, TMR, (Roche) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

επούλωση της πληγής Δοκιμασία

κύτταρα ΑΖ521 και HCT116 κύτταρα σπάρθηκαν σε 3 πιάτα cm με συγκέντρωση 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από 24 h επιμόλυνσης με GFP και GFP-STK31, τα κύτταρα τραυματίστηκαν με ήπια tip-ξύσιμο. Το πλάτος της περιοχής της βλάβης κυμαινόταν από 500 μm έως 1 mm και φωτογραφήθηκε από μικροσκόπιο σε 0 h, 6 h, 12 h και 24 h. αποτελεσματικότητα της μετανάστευσης μετρήθηκε με μεσοδιάστημα των πληγών.

Transwell Δοκιμασία

Ένα transwell με μέγεθος πόρων 3,0 μm (Millipore, Bedford, ΜΑ) επικαλύφθηκε με 5 μg cm

2 κολλαγόνου /γέλη και ξηραίνεται στον αέρα όλη τη νύχτα ή 0,5 mg /ml matrigel (BD Biosciences) για 1 ώρα. GFP- ή GFP-STK31-επιμολυσμένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας χωρίς 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και σπάρθηκαν μέσα σε ένα transwell τοποθετήθηκαν σε τρυβλίο 24 φρεατίων που περιέχει μέσο ανάπτυξης με 10% FBS. Μετά από 24 ώρες επώαση, το transwell ξεπλύθηκε με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 3,7% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, τα φίλτρα απομακρύνθηκαν από τα φρεάτια και τοποθετούνται με αντιδραστήριο αντιξεθωριάσματος παρατείνει Χρυσό με DAPI, και τα κύτταρα στα φίλτρα μετρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού (Όλυμπος, BX51).

Αποτελέσματα

Έκφραση της STK31 σε διάφορες γραμμές ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών και κλινικής του παχέος ιστοί του Ανθρώπου

STK31

υπερέκφραση σε κλινικά δείγματα ορθοκολικού καρκίνου έχει ήδη αναφερθεί [23]. Για να αναλυθεί η έκφραση του

STK31

σε κυτταρικές σειρές καρκίνου, Q-PCR πραγματοποιήθηκε σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές ΑΖ521, Α549, HeLa, και Α375. Μεταξύ αυτών, η οποία προήλθε από διαφορετικούς ιστούς, ΑΖ521, ένα γαστρικό αδενοκαρκίνωμα, έδειξε την υψηλότερη

STK31

έκφραση mRNA (Σχήμα 1Α). Η έκφραση του

STK31

mRNA αξιολογήθηκε περαιτέρω σε πολλές καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα σε σύγκριση με ΑΖ521. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του

STK31

(Σχήμα 1Β). Το ίδιο αποτέλεσμα εμφανίστηκε σε ανθρώπινες κλινικές παχέος ιστούς, οι οποίοι εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του

STK31

σε καρκινικούς ιστούς σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς από το ίδιο άτομο (Σχήμα 1 C). Με βάση το υψηλό επίπεδο ενδογενούς

STK31

mRNA, ΑΖ521 χρησιμοποιήθηκε ως το πρότυπο κύτταρο σε αυτή τη μελέτη.

(Α) Ολικό RNA από τέσσερις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές διαφορετικών ιστών, ΑΖ521 ( ένα ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρική γραμμή), Α549 (μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα), HeLa (ανθρώπινο τραχηλικό καρκίνο κυτταρική γραμμή), Α375 (καρκίνος κυτταρική σειρά ανθρώπινου μελανώματος) και ένα φυσιολογικό ανθρώπινο μαστικό επιθηλιακό κύτταρο (Normal), που ήταν απομονωμένες για PCR πραγματικού χρόνου για να καθορίσει

STK31

επίπεδα mRNA.

STK31

ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται στο γαστρικού καρκίνου κυτταρική σειρά ανθρώπινου, ΑΖ521, σε σύγκριση με άλλες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. (Β) Ολικό RNA παρασκευάστηκε από έξι γαστρεντερικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση

STK31

επίπεδο έκφρασης του mRNA με πραγματικού χρόνου PCR όπως περιγράφεται στο Α (C) Paired ανθρώπινου ορθοκολικού καρκινικούς ιστούς (Ν, κανονικό ιστό? Τ, καρκινικό ιστό) συλλέχθηκαν για την απομόνωση ολικού RNA για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης του

STK31

με RT-PCR.

Η ακτίνη

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οκτώ εκπρόσωπος ζεύγη δειγμάτων έδειξαν.

Η

Η ενδογενής STK31 βρίσκεται στο κεντροσώματος, κινητοχώρου, κεντρική άτρακτο, και μέσου σώματος κατά τη διάρκεια της Μίτωση

Για την περαιτέρω διερεύνηση των φυσιολογικών ρόλων των STK31 σε σωματικών κυττάρων καρκίνου, ειδικές STK31 μονοκλωνικά (1G10, Σχήμα 2Α) και πολύκλωνα (19717) αντισώματα που δημιουργούνται έναντι διαφόρων ανθρωπίνων πεπτιδίων STK31 (Σχήμα 2Α, άνω). Η ειδικότητα αυτών των δύο αντισωμάτων αποδείχθηκε με ανάλυση στυπώματος Western των συνολικών προϊόντα λύσης από κύτταρα που ΑΖ521 εξωγενώς εκφράζουν EGFP-tagged ανθρώπινη πρωτεΐνη STK31 (STK31-GFP) ή πρωτεΐνη ποντικού Stk31 (Stk31-GFP) (Σχήμα 2Α). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενδογενής STK31 (Σχήμα 2Α, λωρίδα 7), εξωγενές STK31-GFP (Σχήμα 2Α, λωρίδα 8), και Stk31-GFP πρωτεΐνη σύντηξης (Σχήμα 2Α, λωρίδα 9) μπορεί να ανιχνευθεί από το μονοκλωνικό αντίσωμα, 1G10. Πολυκλωνικά αντισώματα STK31, 19717, μπορεί να ανιχνεύσει μόνο το εξωγενές STK31-GFP (Σχήμα 2Α, λωρίδα 5), αλλά όχι το ενδογενές STK31 και Stk31-GFP (Σχήμα 2Α, λωρίδες 4 και 6). Η ειδικότητα του μονοκλωνικού αντισώματος, 1G10, σε κύτταρα Α549 και κύτταρα ΑΖ521 Επιβεβαιώθηκε επίσης για την ανίχνευση της ενδογενούς STK31 (Σχήμα S1). Τα επίπεδα πρωτεΐνης απόκλιση των κυττάρων Α549 και κύτταρα ΑΖ521 είναι σύμφωνες με την έκφραση του mRNA όπως προσδιορίζεται με πραγματικού χρόνου PCR αντίστροφης μεταγραφής (Σχήμα 1Α).

(Α) Σχηματική αναπαράσταση του πολυπεπτιδίου STK31. Δύο επίτοποι, αμινοξέα 231 έως 350 και 982 έως 996, χρησιμοποιήθηκαν σαν αντιγόνα για τη δημιουργία του μονοκλωνικού αντισώματος, 1G10, και πολύκλωνα αντισώματα, 19717, αντίστοιχα. Μετά τον καθαρισμό, η εξειδίκευση του 19717 (λωρίδες 4-6) και 1G10 (διαδρομές 7-9) επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα ανάλυση (ΙΒ) χρησιμοποιώντας ΑΖ521 συνολικό προϊόν λύσης (λωρίδες 1, 4 και 7), STK31-GFP (περιέχει την ανθρώπινη μορφή STK31 διαδρομές 2, 5, και 8), ή Stk31-GFP (περιέχει τις λωρίδες μορφή ποντίκι Stk31 3, 6, και 9) επιμολυσμένα προϊόντα λύσης ΑΖ521 κυττάρου. Anti-GFP χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για ΙΒ για την ανίχνευση της έκφρασης του STK31-GFP και Stk31-GFP (διαδρομές 1-3). α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) κύτταρα ΑΖ521 είχαν διπλά χρωματίστηκαν με 1G10 (πράσινο) και περικεντρίνη (κόκκινο, ένας γνωστός centrosomal πρωτεΐνη). DNA οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ϋΑΡΙ (μπλε). Πρόφαση, ένα-d? μετάφαση, e-h? ανάφαση, i-l? και τελόφαση, m-p. συγχωνεύονται εικόνες που εμφανίζονται στα δεξιά (d, h, l, και ιστ). (C) κύτταρα ΑΖ521 συν-ανοσοχρώση με 1G10 (πράσινο, α-ε) και αντι-Aurora Β (κόκκινο, f-j) αντισώματα. Τα νέα εικόνες εμφανίζονται (k-o). (D) Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με διπλά STK31 (πράσινο), Aurora-Β (κόκκινο), και DNA (μπλε). Μόνο έδειξαν συγχωνευθείσας εικόνες. Βέλη έδειξε την συνεντόπισης της STK31 και Aurora-Β σε όλο τον κυτταρικό κύκλο.

Η

Για να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με την βιολογική λειτουργία της STK31 σε καρκινικά κύτταρα, ο υποκυτταρικός εντοπισμός της ενδογενούς STK31 προσδιορίστηκε. κύτταρα ΑΖ521 συν-ανοσοχρώση με αντισώματα έναντι STK31 (1G10) και περικεντρίνη (PCNT), ένα κεντροσωμάτων-πρωτεΐνη που συνδέεται με ανάλυση ανοσοφθορισμού. Κατά την πρόφαση και μετάφαση, STK31 συν-εντοπισμένη με PCNT, υποδηλώνοντας μια ένωση με πόλους της ατράκτου (Σχήμα 2Β, α-h). Επιπλέον, STK31 βρέθηκε να διαμένουν στον κεντρομερική περιοχή κατά τη διάρκεια της μετάφασης (Σχήμα 2Β, e-h), της ατράκτου κατά την διάρκεια midzone ανάφαση (Εικόνα 2Β, i-l), και τέλος συμπυκνώνονται στο μέσου σώματος κατά τη διάρκεια της telophase (Σχήμα 2Β, μ- p).

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τον εντοπισμό του STK31 κατά τη διάρκεια της μίτωσης, τα κύτταρα ΑΖ521 ήταν συν-ανοσοχρώση με αντισώματα έναντι STK31 και το συγκρότημα χρωμοσωμικές επιβατών (CPC) πρωτεΐνη, Aurora-Β (Σχήμα 2C). CPC αποτελείται από κινάσης Aurora-Β, INCENP, επιβιώνουν και borealin [24], και είναι γνωστό ότι μεταναστεύουν από το εσωτερικό κεντρομεριδίων στον άξονα midzone και ισημερινή φλοιό των κυττάρων κατά τη διάρκεια της μετάφασης-ανάφαση μετάβασης. χρώση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι Aurora-Β εμφανίζει την κυτταρική συμπεριφορά εκ νέου εντοπισμός που έχει υποδειχθεί σε προηγούμενες μελέτες (Σχήμα 2C, f-j). Αξιοσημείωτα, χρώση STK31 (Σχήμα 2C, Α-Ε) βρέθηκε να είναι συν-εντοπισμένα με Aurora-B στην περιοχή κεντρομεριδίου, ζώνη ατράκτου, και μέσου σώματος (Σχήμα 2C, k-o). Σημειώστε ότι εκτός από την συν-εντοπισμό με Aurora-Β, STK31 βρέθηκε επίσης να έχει ισχυρά σήματα στους πόλους της ατράκτου (Εικόνα 2D, βέλη). Αυτή η υποκυτταρική κατανομή του STK31 είναι παρόμοια με εκείνη του Πόλο-όπως κινάση 1 (PLK1) [25].

Η Εκδήλωση STK31 είναι κυτταρικό κύκλο που εξαρτώνται

Για να διερευνηθεί η μορφή έκφρασης του κυτταρικού κύκλου του STK31, κύτταρα ΑΖ521 συγχρονισμένη με νοκοδαζόλη (NZ) ή διπλή επεξεργασία θυμιδίνης επιβεβαιώθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Εικόνα 3Α), και η έκφραση της ενδογενούς πρωτεΐνης STK31 προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης STK31 μειώνεται κατά τη διάρκεια του σταδίου G2 και έφθασε στο χαμηλότερο επίπεδό της κατά τη φάση Μ (Σχήμα 3Β). Ανάλυση κηλίδας Western από το σύνολο των προϊόντων λύσης κυττάρου που απελευθερώνεται από νοκοδαζόλη θεραπεία έδειξε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης STK31 ήταν χαμηλότερα στην ΝΖ-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3C, διαδρομή 2), και μετά την απελευθέρωση, STK31 αυξάνεται σταδιακά κατά τη διάρκεια της μίτωσης (Σχήμα 3C, λωρίδες 3-10). Μετά την έξοδο από την μίτωση, ο κυτταρικός κύκλος εκ νέου εισέλθει στο στάδιο G1, το οποίο υποδεικνύεται από την υποβάθμιση από κυκλίνη Β1 σε 180 λεπτά μετά την απελευθέρωση, και το επίπεδο STK31 αυξήθηκε (Σχήμα 3C, διαδρομή 7). Εκτοπικά-εκφράζεται STK31-GFP παρουσιάζει το ίδιο πρότυπο έκφρασης με ενδογενή STK31 (Σχήμα 3D). Οι δύο κύριες στρατηγικές που εμπλέκονται σε πρωτεΐνες κύκλου ρυθμίζεται κυττάρων. Πρώτον, η πρωτεΐνη αφθονία μπορεί να ελέγχεται σε επίπεδο μεταγραφής. Δεύτερον, ο κύκλος εργασιών πρωτεΐνη με πρωτεολυτική αποικοδόμηση, η οποία είναι ο κύριος μηχανισμός που ρυθμίζει την έξοδο από την μίτωση, στοχεύεται από το σύμπλοκο APC /C-Cdh1 μέσω του κιβωτίου καταστροφή της (D-box). Ελέγξαμε πρώτα την έκφραση του ενδογενούς

STK31

mRNA από την Q-PCR, και διαπίστωσε ότι

STK31

mRNA μειώθηκε σε προμεταφασικά (Σχήμα 3Ε). Είναι ενδιαφέρον, ακόμη και η έκφραση της πρωτεΐνης του STK31 παρουσιάζεται σε χαμηλότερο επίπεδο στη φάση G2 (Σχήμα 3Β), και το επίπεδο του mRNA δεν έχει προφανή διαφορά με τις asynchronized κύτταρα (Σχήμα 3Ε). Επιπλέον, με την ανάλυση της αλληλουχίας αμινοξέων του STK31, διαπιστώσαμε ότι STK31 περιέχει το συντηρημένο μοτίβο D-box στο Arg

643 θέσης (R

643) (Σχήμα 4Α). Για να επιβεβαιώσετε ότι το μειωμένο επίπεδο STK31 στην έξοδο μίτωση οφείλεται σε APC /C-επαγόμενη ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος υποβάθμιση, η D-box μεταλλαγμένο της GFP-STK31 δημιουργήθηκε για να αναλύσει πρότυπο έκφρασης του κυτταρικού κύκλου (Εικόνα 4Α). Από το Σχήμα 4Β, η έκφραση του STK31-GFP D-box μεταλλαγμένο αυξήθηκε σημαντικά στη φάση G2 σε σχέση με τον άγριο τύπο STK31-GFP.

(Α) Asynchronized ή νοκοδαζόλη (NZ) κύτταρα κατεργασμένα ΑΖ521 ήταν συλλέγονται για την ανάλυση του πληθυσμού του κυτταρικού κύκλου τους με κυτταρομετρία ροής. Τα ποσοστά των G1, S, και G2 /M φαίνεται παρακάτω. Οι γύρο-up κυττάρων μετά κατεργασία ΝΖ ήταν κούνημα-off και ορίζονται ως κύτταρα φάσης Μ και τα συνδεδεμένα κύτταρα που απομένουν μετά κούνημα-off θεωρήθηκαν ότι είναι η φάση G2. (Β) τα προϊόντα λύσης Σύνολο ΑΖ521 από asynchronized (ASY), φάση Μ (Μ), και το στάδιο G2 κυττάρων συλλέχθηκαν για ανάλυση κηλίδας Western με αντι-STK31 πολυκλωνικά αντισώματα. Φωσφο-ιστόνης Η3 σερίνη 10 (Ρ-H3 /S10) είναι ένας δείκτης για μιτωτικά κύτταρα. (Γ) ΑΖ521 κύτταρα απελευθερώνονται από νοκοδαζόλη θεραπεία με διαφορετικά χρονικά σημεία (από 0 έως 360 λεπτά) συλλέχθηκαν για να αναλυθεί η μορφή έκφρασης του STK31 με ανάλυση ΙΒ. Αντι-κυκλίνης-Β και αντι-φωσφο-ιστόνης Η3 (ρ-H3 /S10) αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως μιτωτικοί δείκτες. κύτταρα (D) ΑΖ521 εκτοπικά εκφράζουν GFP ή STK31-GFP υποβλήθηκαν σε αγωγή με νοκοδαζόλη. κύτταρα γύρο-up Μ φάση συλλέχθηκαν από το κούνημα-off, και παραμένουν προσκολλημένα κύτταρα συλλέγονται ως τη φάση G2. Τα Asynchronized κύτταρα (ASYN) εμφανίζεται. α-τουμπουλίνης ή GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για ΙΒ. (Ε) Ολικό RNA από διαφορετικά στάδια του κυτταρικού κύκλου ΑΖ521 συλλέχθηκε για να αναλυθεί η έκφραση του

STK31

mRNA με πραγματικού χρόνου PCR. Τρία ανεξάρτητα πειράματα (Ν = 3), και μέσα με τα πρότυπα σφάλματα.

Η

(Α) Ένα υποθετικό D-box μοτίβο βρίσκεται εντός των αμινοξέων 643 έως 651 του STK31. Η συντηρημένη θέση, Arg643 (R643), στο πλαίσιο της D-box φάνηκε. (Β) Asynchronized (ΛΜ), Μ φάση, και G2 κύτταρα στάδιο ΑΖ521 με STK31-GFP ή STK31-GFP /D-box μεταλλαγμένο έκφρασης συλλέχθηκαν για να εκτελέσει την ανάλυση ΙΒ χρησιμοποιώντας αντι-GFP αντισώματος. Τα επίπεδα έκφρασης του STK31-GFP εμφανίζεται ως αναλογίες. Φωσφο-ιστόνης Η3 σερίνη 10 (Ρ-H3 /S10) είναι ένας δείκτης για μιτωτικά κύτταρα. GAPDH είναι ένα στοιχείο ελέγχου φόρτωσης.

Η

Η υπερέκφραση του STK31 Αυξάνει την κυτταρική μετανάστευση και ικανότητας εισβολής

Λόγω της υπερέκφραση STK31 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και του παχέος καρκινικούς ιστούς (Εικόνα 1), η φυσιολογικός ρόλος της STK31 στην ογκογένεση ήταν κάτω ερευνήθηκε από εκτοπικά-υπερεκφράζεται STK31-GFP. STK31-GFP δεν αυξάνει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε ΑΖ521 και HTC116 κύτταρα (Σχήμα 5Α) ή η κατανομή του κυτταρικού κύκλου (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, η υπερέκφραση του STK31-GFP έκανε ενισχύσει την ικανότητα κυτταρική μετανάστευση του ΑΖ521 και HTC116 (Σχήμα 5C). Βασισμένο σε επικοινωνούντα δοκιμασίες μετανάστευση και εισβολή, υπερεκφράζεται STK31-GFP ενεργοποιηθεί περισσότερο ΑΖ521 και HTC116 κύτταρα να περάσει μέσα από το matrigel ή πηγάδια collegen επικαλυμμένα (Σχήμα 5D). Με ανάλυση Q-PCR, το επίπεδο έκφρασης του

μήτρα μεταλλοπεπτιδάση 2

(

ΜΜΡ2

), ένας δείκτης μετανάστευσης, αυξήθηκε σε κύτταρα STK31-GFP-εκφράζεται αλλά σε μεγάλο βαθμό συμπιεσμένες σε sh

STK31

επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 5Ε).

(Α) ίσο ποσό ΑΖ521 ή HCT116 κυττάρων με GFP ή STK31-GFP έκφρασης ήταν seeded και την ανάπτυξη των κυττάρων στη συνέχεια ελέγχονται από τον υπολογισμό αριθμού των βιώσιμων κυττάρων σε το προκαθορισμένο χρόνο. Τρία ανεξάρτητα πειράματα και τα ποσοτικά αποτελέσματα τους παρουσιάζονται. Η έκφραση του GFP ή STK31-GFP την Ημέρα 1 και την Ημέρα 5 ανιχνεύθηκε με IB χρησιμοποιώντας αντι-ΟΡΡ αντίσωμα. α-τουμπουλίνης είναι ένας εσωτερικός έλεγχος. (Β) κύτταρα ΑΖ521 με GFP ή STK31-GFP έκφραση συλλέχθηκαν για την ανάλυση κατανομή του πληθυσμού των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. (Γ) ΑΖ521 ή HCT116 κυττάρων με GFP ή STK31-GFP έκφραση χρησιμοποιήθηκαν για να διεξαχθεί η δοκιμασία μετανάστευσης επούλωση της πληγής. Το διάστημα της κυτταρικής μετανάστευσης σε διαφορετικά χρονικά (0-24 h) μετρήθηκε και παρουσιάζεται. Τα ποσοτικά αποτελέσματα φαίνονται παρακάτω. (D) ΑΖ521 (άνω) ή HCT116 (κατώτερο) κυττάρων με GFP ή STK31-GFP έκφραση σπάρθηκαν σε κολλαγόνο τύπου II επιχρισμένα ή επικαλυμμένα με Matrigel trans-φρεάτια για να εκτελέσει προσδιορισμούς μετανάστευσης κυττάρων ή εισβολή. Μετά από χρώση με ϋΑΡΙ, ένα ειδικό DNA χρωστική, τα κύτταρα μετρήθηκαν και τα ποσοτικά αποτελέσματα φαίνονται. Τρία ανεξάρτητα πειράματα έγιναν. (Ε) Κύτταρα μετεμβολιασμένα με STK31-GFP ή μολυσμένα με λεντοϊού που βασίζεται

STK31

shRNA (sh

STK31

) συλλέχθηκαν για να ανιχνεύσει τις εκφράσεις του

ΜΜΡ-2 από

πραγματικού χρόνου PCR (δεξιά). Υπερεκφράζεται STK31-GFP ανιχνεύθηκε με ανάλυση IB (αριστερά). Η έκφραση του

STK31

στο sh

STK31

κυττάρων προσδιορίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR και κανονικοποιήθηκαν από τον

β-ακτίνης

(μεσαία).

Η

Η εξάντληση των STK31 προκαλεί γενετικές μικροσωληνίσκων Συνέλευση κατά τη μεσόφαση

STK31 Θεωρήθηκε για τη συμμετοχή οργάνωσης μικροσωληνίσκων με βάση centrosomal εντοπισμό του. Για να δοκιμάσετε αυτό, χρησιμοποιήσαμε ένα κρύο θεραπεία για την πρόκληση μικροσωληνίσκων αποπολυμερισμού και στη συνέχεια να προκαλέσει μικροσωληνίσκων re-ανάπτυξη. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθερά και ανοσοχρώση με αντι-α-τουμπουλίνης να παρατηρήσουμε την επανασυναρμολόγηση και την επιμήκυνση των μικροσωληνίσκων. Κύτταρα με

STK31

shRNA με ετικέτα EGFP (sh

STK31

-ΟΡΡ, το νοκ ντάουν απόδοση παρακαλούμε δείτε το σχήμα S2B) έδειξε ελαττώματα σε τρία επίπεδα: μικρό /δεν ελαττώματα (Σχήμα S3A), μέτρια ελαττώματα (Σχήμα S3b) και σοβαρή ελαττώματα (Σχήμα S3C). Συγκρίναμε τα κύτταρα επιμολυσμένα με sh

STK31

-ΟΡΡ και τα κύτταρα επιμολυσμένα με λουσιφεράση shRNA με ετικέτα EGFP (shLuc-

GFP

) ως έλεγχοι, και προσδιορίζεται ο αριθμός των κυττάρων για κάθε τύπο ( Εικόνα S3D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα εξαντλούνται σε STK31 απέτυχε να δείξει σωστή οργάνωση των μικροσωληνίσκων.

το νοκ ντάουν Έκφραση των STK31 από shRNA αποτελέσματα στην μιτωτική εξέλιξη Καθυστέρηση στην GC-1 κυττάρων

Για να αναλύσει τον τρόπο η εξάντληση των STK31 επηρεάζει μιτωτικής εξέλιξη, χρησιμοποιήσαμε ζώντων κυττάρων μικροσκοπία time-lapse για την παρακολούθηση της τύχης των GC-1 κύτταρα επιμολυσμένα με sh

STK31

-ΟΡΡ και συνέκριναν με κύτταρα επιμολυσμένα με sh

Luc

-ΟΡΡ (Εικόνα S4) μετά απελευθερώνεται από ένα διπλό μπλοκ θυμιδίνης. Εμείς χρονικά τη διάρκεια της μιτωτικής εξέλιξη από τη συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων (είσοδος μιτωτική) να κυτοκίνηση (έξοδος μιτωτική). Βρήκαμε ότι χρειάστηκαν 185 λεπτά για το sh

Luc

-ΟΡΡ κελί για να ολοκληρώσετε τη μίτωση (Εικόνες S4A-S4H), ενώ 357 λεπτά που απαιτούνται για την sh

STK31

-ΟΡΡ κύτταρο να φθάσουν τελόφασης (Εικόνες S4i-S4P). Η διάρκεια του διαστήματος των κυττάρων επιμολυσμένων με sh

STK31

-ΟΡΡ αυξήθηκαν δύο φορές σε σύγκριση με την επιμόλυνση με sh

Luc

-ΟΡΡ (Εικόνα S4, Ρ και Η, αντίστοιχα). Αυτό υποδηλώνει ότι η ανεπάρκεια STK31 προκαλεί καθυστέρηση στην μιτωτική πρόοδο στο κελί GC-1.

το νοκ ντάουν Έκφραση των STK31 από shRNA Προκαλεί Μιτωτικά καταστροφή και οδηγεί σε απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα

Στη συνέχεια, διερευνηθεί ο πιθανός ρόλος των STK31 χρησιμοποιώντας το νοκ ντάουν προσέγγιση. Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα μολυσμένα με ΑΖ521 λεντοϊού STK31 shRNA (sh

STK31

) που λαμβάνεται από Academia Sinica να δοκιμαστεί knockdown απόδοση (Σχήμα 6Α). Ελέγξαμε πρώτα την επίδραση λεντοικής sh

STK31

-μολυσμένα κύτταρα παρεμβαίνοντας με τον πληθυσμό των κυττάρων λόγω υποκυτταρικό εντοπισμό και τον κύκλο που εξαρτώνται πρότυπο έκφρασης των κυττάρων του STK31. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η αυξημένη subG1 και μειωμένη G2 /M παρατηρήθηκαν σε λεντοϊού sh

STK31

μολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 6Β). Για να επιβεβαιωθεί αν η ανεπάρκεια STK31 οδηγεί σε απόπτωση, τόσο δραστική κασπάση 3 και μία δοκιμασία TUNEL διενεργήθηκαν σε κύτταρα μολυσμένα με ΑΖ521 λεντοϊού sh

STK31

. Από τα στοιχεία 6C και 6D, STK31 knockdown κύτταρα παρουσίασαν προφανή πληθυσμού της απόπτωσης.

(Α) Μετά από τη μόλυνση 72 ώρες λεντοικής με βάση το

STK31

shRNA (sh

STK31

) ή τον έλεγχο shRNA (shCtrl), κύτταρα ΑΖ521 συλλέχθηκαν για να προσδιοριστεί η έκφραση STK31 από την IB. (Β-D) ελέγχου (shCtrl) ή sh

STK31

μολυνθέντα κύτταρα (sh

STK31

) συλλέχθηκαν για την ανάλυση του πληθυσμού κυτταρικό κύκλο με κυτταρομετρία ροής (Β), για την ανίχνευση της έκφρασης του δραστικού κασπάσης-3 από την IB (C), και να εκτελέσει την δοκιμασία TUNEL (D). Κύτταρα κατεργασμένα με ϋΝάση Ι χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι σε C και D. Τα κύτταρα χωρίς θεραπεία ήταν οι αρνητικοί μάρτυρες για τη δοκιμασία TUNEL. Το κόκκινο σήμα σε 6D αντιπροσωπεύει τα αποπτωτικά κύτταρα. ***

P

αξία & lt? 0.001. (Ε) Time-lapse εικόνες των κυττάρων επιμολυσμένων με

STK31

shRNA με ετικέτα EGFP (sh

STK31

-ΟΡΡ) (Α-Η). Τα κύτταρα συγχρονίστηκαν με νοκοδαζόλη (150 ng /ml) για 16 ώρες. Μετά την απελευθέρωση από νοκοδαζόλη, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία time-lapse. Γειτονικές μη επιμολυσμένα κύτταρα (που υποδεικνύεται από το λευκό βέλος) υποβλήθηκαν επιτυχώς μίτωση και πλήρη κυτοκίνηση, ενώ το νοκ ντάουν κυττάρων (που δείχνει το κίτρινο βέλος) παρέμεινε σε παρατεταμένη μιτωτική που μοιάζει με στάδιο. Εμείς χρονικά τη διάρκεια της μίτωσης από διάσπαση του πυρηνικού φακέλου (σε 0 λεπτά, α) και διαπίστωσε ότι σε 272 λεπτά το νοκ ντάουν κυττάρων κατέληξε με ένα αποπτωτικό-όπως το χαρακτηριστικό (h).

Η

Ζητήσαμε επιπλέον αν η εξάντληση των STK31 προκαλεί την ίδια επίδραση στην μιτωτική πρόοδο στα καρκινικά κύτταρα. Ομοίως, μικροσκοπία time-lapse χρησιμοποιήθηκε για να παρακολουθεί τα κύτταρα ΑΖ521 επιμολυσμένα με sh

STK31

-ΟΡΡ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με νοκοδαζόλη για 16 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε απεικόνιση ζωντανών κυττάρων. Η sh

STK31

κύτταρα-ΟΡΡ απέτυχε να βγείτε από τη μίτωση, ενώ τα κύτταρα ελέγχου ολοκλήρωσε με επιτυχία τη μίτωση και εισήλθε στην φάση G1 (Σχήμα 6Ε).