Αφηρημένο

Caffeic οξύ φαιναιθύλιο εστέρα (CAPE) πολλαπλασιασμό θεραπεία καταστέλλεται, σχηματισμό αποικιών, και εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε PC-3 ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα. CAPE μειωμένη πρωτεΐνη έκφραση της κυκλίνης D1, κυκλίνη Ε, SKP2, c-myc, Akt1, Akt2, Akt3, ολική Akt, mTOR, Bcl-2, Rb, καθώς και η φωσφορυλίωση της Rb, ERK1 /2, Akt, mTOR, GSK3α , ΟδΚ3β, ΡϋΚ1? αλλά αυξημένη πρωτεΐνη έκφραση KLF6 και p21

Cip1. ανάλυσης μικροσυστοιχιών έδειξαν ότι οδών που εμπλέκονται στην κυτταρική κίνηση, τον κυτταρικό θάνατο, πολλαπλασιασμό, και του κυτταρικού κύκλου επηρεάστηκαν από CAPE. Συν-θεραπεία CAPE με χημειοθεραπευτικά φάρμακα βινβλαστίνη, paclitaxol και εστραμουστίνη αναφέρεται συνεργιστική δράση καταστολής. διοίκηση CAPE μπορεί να χρησιμεύσει ως μια πιθανή συμπληρωματική θεραπεία για τον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Lin HP, Jiang SS, Chuu CP (2012) καφεϊκό οξύ φαιναιθυλο Ester Προκαλεί p21

Cip1 επαγωγής, Akt Σηματοδοσίας Μείωση και Ανάπτυξης Αναστολή σε PC-3 κύτταρα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (2): e31286. doi: 10.1371 /journal.pone.0031286

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26, Αυγούστου, 2011? Αποδεκτές: 5 του Γενάρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 Φεβ, 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το CS-100-PP-12 (Εθνική Έρευνα Υγείας Ινστιτούτα) και NSC 99-2320-B-400-015-my3 (Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, NSC) στην Ταϊβάν για CPC, καθώς και DOH100-TD-C- 111-014 (Υπουργείο Υγείας) για SSJ και CPC. Σας ευχαριστούμε υποστήριξη από Protein Chemistry Πυρήνας διευκόλυνση του πυρήνα Μέσου Center στο NHRI και την Ταϊβάν Ινστιτούτο Βιοπληροφορικής Πυρήνας διευκόλυνση του Εθνικού Προγράμματος πυρήνα Διευκόλυνσης για τη Βιοτεχνολογία με NSC (NSC100-2319-B-400-001). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια από τις πιο συχνές μη-δερματικό καρκίνωμα των ανδρών στις δυτικές χώρες. Περισσότερο από το 80% των ασθενών πέθαναν από καρκίνο του προστάτη που αναπτύχθηκε οστικών μεταστάσεων [1] – [3]. Το 1941, ο Charles Huggins ανακάλυψαν ότι η στέρηση των ανδρογόνων που προκαλείται υποχώρηση της ορμόνης που ανταποκρίνεται μεταστατικό καρκίνο του προστάτη [4]. Από τότε, θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων έχει γίνει η κύρια θεραπεία για μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο του προστάτη που λαμβάνουν θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων αναπτύξει τελικά υποτροπιάζουν, ευνουχισμός ανθεκτικά όγκους εντός 12-33 μήνες μετά τη θεραπεία. Η διάμεση συνολική χρόνος επιβίωσης είναι 1-2 χρόνια μετά από υποτροπή του όγκου [5], [6]. Η χημειοθεραπεία εφαρμόζεται συνήθως για τη θεραπεία του μεταστατικού ορμόνες πυρίμαχα καρκίνο του προστάτη [7].

Συνήθως χρησιμοποιούνται φάρμακα χημειοθεραπείας για τον μεταστατικό καρκίνο του προστάτη περιλαμβάνουν eoposide, paclitaxol, βινβλαστίνη, μιτοξαντρόνη, και εστραμουστίνη. Η ετοποσίδη και η μιτοξαντρόνη είναι αναστολέας τοποϊσομεράσης τύπου II [7], [8]. Εστραμουστίνη είναι ένα παράγωγο οιστρογόνου με ένα τμήμα εστέρα άζωτο μουστάρδας-καρβαμικό [7]. Βινβλαστίνη δεσμεύει τουμπουλίνης και αναστέλλει τη συναρμολόγηση των μικροσωληναρίων [7]. Η πακλιταξέλη διαταράσσει μιτωτική συναρμολόγηση ατράκτου, χρωμόσωμα διαχωρισμό, και την κυτταρική διαίρεση. Η πακλιταξέλη σταθεροποιεί επίσης το πολυμερές μικροσωληνίσκων και έτσι το προστατεύει από την αποσυναρμολόγηση [7]. Η θεραπεία με αυτά τα φάρμακα χημειοθεραπείας μειώθηκε ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA) και ακτινογραφικές απόκριση, καθώς και βελτιωμένη πόνος και συμπτώματα του ουροποιητικού σε ένα υπο-ομάδα ασθενών. Ωστόσο, έδειξαν μικρή επίδραση στην παράταση της επιβίωσης. Ανεπιθύμητες παρενέργειες αυτών των χημειοθεραπευτικών παραγόντων περιλαμβάνουν τοξικές θανάτους, εγκεφαλικά επεισόδια, θρόμβωση, ουδετεροπενία, οίδημα, δύσπνοια, κακουχία, κόπωση και [7]. Συν-θεραπεία με φάρμακα χημειοθεραπείας φυσικές ενώσεις με αντικαρκινική δράση μπορεί να μειώσει τη δόση των φαρμάκων χημειοθεραπείας απαιτείται.

Caffeic οξύ φαιναιθυλ εστέρας (CAPE), ένα βιοδραστικό συστατικό που εξάγεται από πρόπολη μελισσών κυψέλη, είναι ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό [9] , [10]. θεραπεία CAPE σε μαστού, του προστάτη, και λευχαιμικά κύτταρα καρκίνου προκαλεί αναστολή της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ [11], [12], η επαγωγή της Βαχ [11], [13], η ενεργοποίηση του c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) [ ,,,0],11] και p38 που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ p38) [11]. CAPE επάγει απόπτωση μέσω ενεργοποίησης της δραστικότητας κασπάσης [11], [13] και τα κάτω ρύθμιση του Bcl-2, CIAP-1, CIAP-2 και ΧΙΑΡ [12], [13] σε μαστού, του προστάτη, και λευχαιμικά κύτταρα καρκίνου . Επιπλέον, CAPE επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω της καταστολής της κυκλίνης D1 [14], [15], η κυκλίνη Ε [14], και την έκφραση c-Myc [15], καθώς επίσης και αυξάνει την έκφραση των αναστολέων κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη ρ21

Cip1 [14], p27

Kip1 [14], και p16

ΙΝΚ4 & [14] του παχέος εντέρου και του καρκίνου γλοιώματος κύτταρα. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι CAPE είναι ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για καρκίνους.

PC-3 είναι ένα από τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη που έχουν καταρτισθεί από οστικές μεταστάσεις προέλευσης. PC-3 κύτταρα δεν εκφράζουν υποδοχέα ανδρογόνου (AR) [16]. Μιτοξαντρόνη, εστραμουστίνη, βινβλαστίνη, ετοποσίδη, και πακλιταξέλη έχει αποδειχθεί ότι επάγει την αναστολή του πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, και διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα PC-3

in vitro

[17] – [21], καθώς και για την επιβράδυνση PC-3 ξενομοσχεύματα ανάπτυξη σε αθυμικά γυμνά ποντίκια [8], [21], [22]. Η θεραπεία με 88-176 μΜ CAPE επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα PC-3 μέσω αναστολής του ΝΡ-κΒ, CIAP-1, CIAP-2 και ΧΙΑΡ [12]. Ωστόσο, η επιτεύξιμη συγκέντρωση CAPE στον ανθρώπινο ορό είναι περίπου 5,0 μg /ml (17 μΜ) [23]. Είμαστε συνεπώς, να εξετασθεί αν η χαμηλή συγκέντρωση (0-20 μΜ) CAPE μπορεί να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό των PC-3 κύτταρα. Μπορούμε επίσης να καθοριστεί εάν συν-θεραπεία φαρμάκων χημειοθεραπείας με κάπα δείχνουν συνεργιστική δράση αναστολή στον πολλαπλασιασμό των PC-3 κύτταρα.

Αποτελέσματα

θεραπεία CAPE καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό και την αποικία σχηματισμό κύτταρα PC-3

μπλε χρώση

Trypan έδειξε ότι η CAPE δοσοεξαρτώμενο ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των PC-3 κυττάρων με μία ΕΚ

50 γύρω 20,4 μΜ (Εικ. 1Α). Hoescht δοκιμασία πολλαπλασιασμού των 96 φρεατίων τύπου dye έδειξε ότι η επίδραση αναστολής της ανάπτυξης του Πράσινου συνέβη μέσα σε 24 ώρες μετά τη θεραπεία CAPE σε συγκέντρωση τόσο χαμηλή όσο 2.5 μΜ (Εικ. 1Β). ΕΚ

50 για την αναστολή της ανάπτυξης των PC-3 κυττάρων ήταν 51,4 μΜ, 30,7 μΜ, και 23.1 μΜ για 24, 48, και 72 ώρες θεραπεία CAPE, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι η κατασταλτική επίδραση του Cape μπορεί να συσσωρευτεί. δοκιμασία σχηματισμού αποικίας αποκάλυψε ότι η θεραπεία 10 μΜ και 20 μΜ CAPE ανέστειλε αποτελεσματικά το σχηματισμό των PC-3 αποικίες σε μαλακό άγαρ (Εικ. 1 C).

Ο πολλαπλασιασμός των PC 3-κυττάρων σε επεξεργασία με αυξανόμενη συγκέντρωση CAPE είχε προσδιορίστηκε με την χρώση μπλε Τρυπάνης μετά από 72 ώρες θεραπείας (Α) ή τη μέτρηση της συνολικής περιεκτικότητας σε DNA ανά φρεάτιο χρησιμοποιώντας Hoechst 33258 φθορισμού με δοκιμασία πολλαπλασιασμού των 96 φρεατίων μετά από 24, 48, και 72 ώρες αγωγής (Β). Σχετική αριθμούς κυττάρων κανονικοποιήθηκαν προς το μέσο αριθμό των κυττάρων του μάρτυρα (χωρίς θεραπεία CAPE) της κάθε κυτταρικής σειράς σε κάθε πείραμα. Στήλες αντιπροσωπεύουν σημαίνει για 18 επαναλήψεις? μπάρες αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. Ο αστερίσκος (*) αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κυττάρων είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετικές (

ρ

& lt? 0,05) σε σύγκριση με τον έλεγχο. Στήλες αντιπροσωπεύουν σημαίνει για 5 βιολογική επαναλήψεις? μπάρες αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. (Γ) η επίδραση του Anticancer CAPE προσδιορίστηκε με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας των PC-3 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 0, 10, 20 μΜ για 14 ημέρες. Η εικόνα είναι ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα τριών βιολογικών επαναλήψεων.

Η

Από CAPE προηγουμένως αναφέρθηκε ως αναστολέας NF-κΒ [10], θα καθοριστεί αν τα χαμηλά dasage της CAPE μπορεί να αναστέλλουν τη δράση του NF-κΒ, χρησιμοποιώντας ένα πλασμίδιο με έδρα δοκιμασία λουσιφεράσης. Αν και η θεραπεία CAPE στους 40 μΜ ανέστειλε δραστικότητα ΝΡ-κΒ, η θεραπεία με κάπα σε συγκέντρωση χαμηλότερη από 40 μΜ δεν είχε επίδραση στην δραστικότητα του ΝΡ-κΒ (Εικ. 2Α). Αυτή η παρατήρηση προτείνει ότι άλλοι μηχανισμοί είναι υπεύθυνοι για την ανασταλτική δράση CAPE κατά χαμηλή δοσολογία.

(Α) PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με μια 4Χ ΝΡ-κΒ πλασμίδιο ανταποκριτή λουσιφεράσης για 24 ώρες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις CAPE για επιπλέον 24 ώρες. Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε για να συγκριθεί η επίδραση της CAPE επί μεταγραφική δραστικότητα ΝΡ-κΒ. (Β) κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με κάπα για 24, 48, ή 72 ώρες, συλλέχθηκαν, και χρωματίζονται με βαφή ιωδιούχου προπιδίου για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για τη διανομή του κυτταρικού κύκλου. (*) Αντιπροσωπεύει στατιστικά σημαντική διαφορά (

σ

& lt? 0,05). Μεταξύ των δύο ομάδα κυττάρων που συγκρίνεται

Η

θεραπεία CAPE διαταράσσει τον κυτταρικό κύκλο εξέλιξης

προπιδίου ιωδίδιο (ΡΙ) ροής χρώση κυτταρομετρίας ανάλυση αποκάλυψε ότι η θεραπεία με 10-20 μΜ CAPE μείωσε τον κυτταρικό πληθυσμό σε φάση G1 και αύξηση του πληθυσμού κυττάρων σε υπο-G1 φάση εντός 24 h σε PC-3 κύτταρα. Αυτή η επίδραση ήταν πιο δραματική σε 72 ώρες μετά από τη θεραπεία CAPE (Σχ. 2Β-2D). Ωστόσο, η χρώση αννεξίνης V ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι 10-20 μΜ CAPE δεν διεγείρει απόπτωση σε κύτταρα PC-3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η θεραπεία με 20 μΜ CAPE για 72 ώρες είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του κυτταρικού κύκλου ανασταλτικών πρωτεϊνών ρ21

Cip1 και μείωση της πρωτεϊνικής κινάσης που σχετίζεται με S-φάση 2 (SKP2), η φωσφορυλίωση της σερίνης 807/811 επί ρετινοβλάστωμα (Rb), cycin D1 , κυκλίνη Ε, c-Myc, και φωσφορυλίωση της θρεονίνης 202 /τυροσίνης 204 του εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη 1/2 (ERK1 /2) (Εικ. 3). Καμία αλλαγή στο p27 παρατηρήθηκε

Kip1, συνολικής ERK1 /2, ή β-τουμπουλίνης. Σε σύγκριση με 24 ώρες και 48 ώρες θεραπείας, 72 ώρες θεραπεία γενικά προκαλείται περισσότερο μεταβολή επιπέδου έκφρασης πρωτεΐνης εκτός από κυκλίνη D1. Αυτό μπορεί να εξηγήσει την μεγαλύτερη αναστολή ανάπτυξης που προκαλείται από CAPE σε 72 ώρες. Η κυκλίνη D1 αυξήθηκε μετά από 24 ώρες και 48 ώρες θεραπείας, αλλά μειώθηκε μετά από αγωγή 72 ώρες.

Protein έκφραση του c-myc, κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, SKP2, phosho-Rb (S807 /811), ρ27

Kip1, ρ21

Cip1, ERK1 /2, pERK1 /2 Thr202 /Tyr204, β-τουμπουλίνης, και β-ακτίνης σε κύτταρα PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 20 μΜ CAPE για 24, 48 και 5, 10, 20 μΜ CAPE για 72 ώρες αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

η

θεραπεία CAPE αναστέλλει την αφθονία και τη δραστηριότητα των πρωτεϊνών σε μονοπατιού AKT σηματοδότησης

Akt διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του προστάτη κύτταρα [24]. Έτσι προσδιορίζεται εάν η θεραπεία CAPE καταστέλλει Akt μονοπατιού σηματοδότησης. 72 ώρες μετά από 20 μΜ θεραπεία CAPE μείωσε την αφθονία του συνολικού Akt, Akt1, Akt2, και Akt3 (Σχήμα 4). θεραπεία CAPE για 24-72 ώρες μείωσε σημαντικά την φωσφορυλίωση της Akt σε σερίνη 473 και θρεονίνη 308 ,. CAPE δεν αλλάζουν τη συνολική αφθονία των εξαρτώμενων φωσφοϊνοσιτίδη κινάσης 1 (ΡϋΚ1) (Εικ. 4), ωστόσο, η φωσφορυλίωση της σερίνης 241 σε ΡϋΚ1 μειώθηκε κατά επεξεργασίας CAPE. επεξεργασία CAPE προκάλεσε επίσης μείωση του συνολικού στόχου της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) και ελαφρά μείωση της φωσφορυλίωσης στην σερίνη 2448 και 2481 του mTOR. επεξεργασία CAPE δεν αλλάζουν τη συνολική αφθονία των ΟδΚ3α και ΟδΚ3β (Εικ. 4). Ωστόσο, phosphosphorylation της ΟδΚ3α S21 και ΟδΚ3β S9 αυξήθηκε μετά από 24 ώρες και 48 ώρες 20 μΜ θεραπείας CAPE αλλά μειώθηκε σε 72 ώρες 20 μΜ θεραπείας CAPE (Εικ. 4). Bcl-2 είναι ένας παράγοντας αντι-απόπτωση κατάντη της Akt σηματοδότησης. Η υπερέκφραση του Bcl-2 έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι συνεισφέρουν αντοχή φαρμάκου καρκίνων του προστάτη [5]. CAPE μειώθηκε ελαφρά έκφραση των Bcl-2.

Πρωτεΐνη έκφραση του Akt, Akt1, Akt2, Akt3, ολική Akt, φωσφο-Akt S473, φωσφο-Akt T308, mTOR, φωσφο-mTOR Ser2448 και Ser2481, ΟδΚ3α, ΟδΚ3β, phopho-GSK3α S21, φωσφο-ΟδΚ3β S9, ΡϋΚ1, φωσφο-ΡϋΚ1 Ser241, Bcl-2, KLF6, β-τουμπουλίνης, και β-ακτίνης σε κύτταρα PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 20 μΜ CAPE για 24, 48 και 5 , 10, 20 μΜ CAPE για 72 ώρες αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

η

θεραπεία CAPE επηρεάζει τα γονίδια που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, και το θάνατο του PC-3 κύτταρα

μελετηθεί περαιτέρω η ολοκληρωμένη αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης σε κύτταρα PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 20 μΜ CAPE για 24 ώρες ή 72 ώρες με μικροσυστοιχίας. Γονίδια με την αλλαγή φορές έκφρασης & gt? 1,5 και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκαν ως γονίδια επηρεάζονται σημαντικά από τη θεραπεία CAPE. CAPE επηρεάζεται η έκφραση του 69 μοναδικά γονίδια μετά από 24 ώρες θεραπείας (Πίνακας S1). 53 γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω και 16 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω. Η θεραπεία με CAPE για 72 ώρες αλλοιωμένη έκφραση των 147 μοναδικά γονίδια (Πίνακας S2).