Abstract

Η φολλιστατίνη (FST), μια ωοθυλακιογένεσης ρυθμίζει πρωτεΐνη, βρίσκεται σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις σε θηλυκούς ιστούς των ωοθηκών. FST δρα ως ανταγωνιστής σε ακτιβίνη, η οποία συχνά αυξημένα σε ανθρώπινο καρκίνωμα των ωοθηκών, και έτσι μπορεί να χρησιμεύσει ως ένας πιθανός στόχος για θεραπευτική παρέμβαση κατά του καρκίνου των ωοθηκών. Το γονίδιο ευαισθησίας στον καρκίνο του μαστού 1

(BRCA1

) είναι ένα γνωστό ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε ανθρώπινο καρκίνο του μαστού? ωστόσο το ρόλο της στον καρκίνο των ωοθηκών δεν είναι καλά κατανοητός. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση μικροσυστοιχιών στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκινώματος των ωοθηκών SKOV3 που υπερεκφράζουν σταθερά άγριου τύπου BRCA1 και σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κενά κλώνους φορέα-επιμολυσμένα. Βρήκαμε ότι η σταθερή έκφραση των γονιδίων BRCA1 δεν διεγείρει μόνο την έκκριση FST αλλά και αναστέλλει ταυτόχρονα την έκφραση της Ακτιβίνης. Για να προσδιοριστεί η φυσιολογική σημασία του φαινομένου αυτού, έχουμε περαιτέρω διερευνήθηκε η επίδραση των κυτταρικών BRCA1 επί της έκκρισης FST σε αθανατοποιημένα επιφάνεια των ωοθηκών επιθηλιακά κύτταρα (IOSE) που προέρχεται είτε από κανονικό ανθρώπινο ωοθήκες ή ωοθήκες ενός ασθενή με καρκίνο των ωοθηκών που φέρουν μετάλλαξη στο

BRCA1

γονίδιο. Knock-down του

BRCA1

σε φυσιολογικά κύτταρα IOSE καταδεικνύει τα κάτω ρύθμιση της έκκρισης FST μαζί με την ταυτόχρονη ανοδική ρύθμιση της έκφρασης Ακτιβίνης. Επιπλέον, knock-down του

FST

σε κυτταρικές γραμμές IOSE καθώς και κυτταρική γραμμή SKOV3 έδειξαν σημαντικά μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μειωμένη μετανάστευση κυττάρων, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου. Έτσι, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν μια νέα λειτουργία για το BRCA1 ως ρυθμιστής της έκφρασης FST και λειτουργία των ωοθηκών ανθρώπινα κύτταρα

Παράθεση:. Karve TM, Preet Α, Sneed R, Σαλαμάνκα C, Λι Χ, Xu J, et al. (2012) BRCA1 Ρυθμίζει φολλιστατίνη Λειτουργία στον καρκίνο των ωοθηκών και Ανθρωπίνων Ωοθηκών Surface επιθηλιακά κύτταρα. PLoS ONE 7 (6): e37697. doi: 10.1371 /journal.pone.0037697

Επιμέλεια: Swati Palit Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Ιούλη του 2011? Αποδεκτές: 26 του Απρίλη 2012? Δημοσιεύθηκε: 1 Ιουνίου 2012

Copyright: © 2012 Karve et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Τάπας Saha είναι ευγνώμων για την αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία (IRG # 97-152-16-2), Fisher Κέντρο για οικογενειακές Cancer Center, Lombardi Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Georgetown για χρηματοδοτική στήριξη. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Επιχορηγήσεις 1U56CA101429-01 (με τον Δρ Peter Shield, Deepak Kumar και ο Δρ Carolyn εξάδελφος). Έλιοτ Μ Rosen έχει υποστηριχθεί, εν μέρει, από ερευνητικές επιχορηγήσεις από το USPHS (R01-CA150646), Susan G. Komen για τη θεραπεία (KG110580), Ζώντας σε ροζ, και το πρόγραμμα World Class Πανεπιστήμιο χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας , Επιστήμη και Τεχνολογία, μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (R31-10069). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια από τις κορυφαίες γυναικολογικών καρκίνων στις Ηνωμένες Πολιτείες με 22.280 εκτιμάται νέες περιπτώσεις και 15.500 θάνατοι το 2012 (https://www.cancer.gov/cancertopics/types/ovarian? αξιολογείται Φεβρουαρίου 2012). Τα υψηλά ποσοστά θνησιμότητας για τον καρκίνο των ωοθηκών οφείλεται κυρίως στην προχωρημένο στάδιο διάγνωση της νόσου? σχεδόν το 60-65% των περιπτώσεων καρκίνου των ωοθηκών διαγιγνώσκονται όταν ο καρκίνος έχει ήδη κάνει μετάσταση πέρα ​​από τα όρια του ωοθηκικού ιστού. Η έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών φαίνεται να αυξήσει σημαντικά το προσδόκιμο ζωής των ασθενών για να φθάσει το 85% [1]. Έτσι, υπάρχει ανάγκη να αναπτυχθούν βιοδείκτες που μπορεί να είναι χρήσιμη στην ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών σε πρώιμα στάδια της νόσου. καρκίνοι των ωοθηκών περισσότεροι εμφανίζονται μέσα στο επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών (ΟΣΕ) και ως εκ τούτου έρευνες χρησιμοποιώντας κύτταρα OSE που προέρχονται τόσο από φυσιολογικούς ασθενείς μεμονωμένα και καρκίνο των ωοθηκών είναι κρίσιμες για τη διαλεύκανση της αιτιολογία του καρκίνου του ανθρώπου ωοθηκών. Είναι ενδιαφέρον, μόνο το 5-10% των γυναικών με καρκίνο των ωοθηκών έχουν κληρονομήσει γενετικές μεταλλάξεις στα γονίδια καταστολής όγκων όπως

BRCA1

και

BRCA2

που τους προδιαθέτει σε καρκίνο μαστού και ωοθηκών [2], [ ,,,0],3], [4]. Επιπλέον, μια μελέτη γενετικής σύνδεσης κοόρτης που αποτελείται από 214 καρκίνου του μαστού και του μαστού-ωοθήκης καρκίνο οικογένειες συνδυάζονται, αποκάλυψε ότι το 90% των ασθενών που φιλοξενούνται μεταλλάξεις στο

BRCA1

[5] γονίδιο τους. Επιπλέον,

BRCA1

μετάλλαξη (ες) θηλυκά φορέα έχουν περίπου 15 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο για ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών σε σύγκριση με τους ομολόγους τους των γυναικών μη-φορέα [6], [7].

Η φολλιστατίνη ( FST), ένας αυτοκρινής γλυκοπρωτεΐνη απλής αλύσου, εκφράζεται σε όλους σχεδόν τους ανθρώπινους ιστούς, όπως νεφρά, τον εγκέφαλο, τη μήτρα, και του μαστού με την υψηλότερη συγκέντρωση που βρέθηκαν σε ωοθηκικό ιστό του ανθρώπου [8]. Ώριμη, εκκρινόμενη μορφή FST πρωτεΐνη υπάρχει σε τρεις ισομορφές? πλήρους μήκους, ενδιάμεσων και συντομότερη που αποτελείται από 315, 303 και 288 αμινοξέων, αντίστοιχα [9]. FST, αρχικά απομονώθηκε από θυλακικό υγρό βρέθηκε να αλληλεπιδρά με ακτιβίνη, ένα μέλος του αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης-β (ΤΟΡ-β) υπεροικογένειας. Η ακτιβίνη έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την αγγειογένεση, όπως επίσης και την απόπτωση, και έτσι μπορεί να είναι ενδεχομένως εμπλέκεται στη ρύθμιση της ανάπτυξης των ωοθηκών όγκου [10]. Αυξημένα επίπεδα Ακτιβίνης ανιχνεύονται όχι μόνο στις περισσότερες από τις όγκους των ωοθηκών επιθηλιακής προέλευσης αλλά και στα δείγματα ορού που συλλέγονται από τους ασθενείς επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. Τα υψηλά επίπεδα της Ακτιβίνης πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την προώθηση και την εξέλιξη της νόσου είναι προγνωστικά χειρότερη πρόγνωση της νόσου για τους ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών [10]. FST δεσμεύεται με Ακτιβίνη με ανταγωνιστικό τρόπο και αυξημένη έκφραση των κυτταρικών FST μπορεί οδηγεί σε κυτταροπροστασία ρόλο σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι παροδική επιμόλυνση με άγριου τύπου (wt)

FST

αποδείχθηκε ότι αναστέλλει μετάσταση στον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές μικρών κυττάρων [11]. Σε αντίθεση, σημαντικά υψηλότερη (Ρ & lt? 0,05) έχουν συγκεντρώσεις FST έχουν αναφερθεί σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, σε σύγκριση με ίδιας ηλικίας υγιείς εθελοντές

μέλη της ΤΟΡ-β έχουν υπεροικογένειας δειχθεί ότι ρυθμίζει την ανάπτυξη του. φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών

in vitro

[12], [13]. Έτσι, οι μεταλλάξεις στο ΤΟΡ-β υποδοχείς ή ενδοκυτταρική σηματοδότηση μορίων τους όπως πρωτεΐνες SMAD έχουν ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη αρκετών καρκίνων [14], [15], [16], [17], [18], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου ωοθηκών ανθρώπου [19], [20], [21]. Ένα άλλο μέλος της ΤΟΡ-β υπεροικογένειας, ινχιμπίνη, είναι ένα λειτουργικό ανταγωνιστής της ακτιβίνης και έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν την ανάπτυξη των φυσιολογικά επιθηλιακά ανθρώπινης ωοθήκης [22], [23]. Ινχιβίνες, που παράγεται από την ανθρώπινη γονάδες, παίζουν κρίσιμο ρόλο στην εξασθένηση ακτιβίνη ρυθμιζόμενες σηματοδότησης σε ανθρώπινο σύστημα gonodal [22]. Inhibin ενεργοποιείται από την παρουσία ενός συν-παράγοντα, βήτα-γλυκάνη, η οποία με τη σειρά της συναγωνίζεται με ακτιβίνη να δεσμεύονται με τους υποδοχείς ακτιβίνης (Atria και ActRIIB), ανταγωνιζόμενες έτσι ακτιβίνη ρυθμιζόμενες καταρράκτη σηματοδότησης [24]. Επιπλέον, οι συνολικές αναστολίνη έχει προταθεί ως πιθανός δείκτης ορού για επιθηλιακής προέλευσης ανθρώπινου καρκίνου των ωοθηκών. Επιπλέον, σχετίζεται φολλιστατίνη πρωτεΐνη γονιδίου (FLRG), το οποίο δείχνει μια ισχυρή ομολογία με FST, και έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρούν και να μπλοκάρει τη λειτουργία της υπερ-οικογένειας συνδετών ΤΟΡ-β, συμπεριλαμβανομένων ακτιβίνη, μορφογενετική πρωτεΐνη οστού (ΒΜΡ) -2, ΒΜΡ-6 , ΒΜΡ-7, και GDF-8. FLRG εκφράζεται κυρίως στην καρδιά, τους πνεύμονες, τα νεφρά, και πλακούντα και μπορούν να διεγερθούν από τον TGF-β, ακτιβίνη και πρωτεΐνες Smad [25]. FLRG έκφραση φέρεται να είναι εξαιρετικά μεταβλητή σε διάφορες γραμμές και καρκινικούς ιστούς. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι τα κάτω ρύθμιση FLRG αναστέλλει την ανάπτυξη όγκου ανθρώπινου μαστού [26].

Αρκετές μελέτες έχουν προτείνει ότι η στοχευμένη θεραπευτικές στρατηγικές, ειδικά μοριακά μεσολαβητών που ρυθμίζουν προς τα κάτω τα ενδογενή επίπεδα Ακτιβίνη έκφρασης μπορούν να επιβραδύνουν ή εμποδίζουν τον καρκίνο εξέλιξη [27]. Έτσι, ένα πιθανό ρόλο του FST ως ανταγωνιστής ακτιβίνης στην παθογένεση του καρκίνου των ωοθηκών απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε απαθανάτισε επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών (IOSE) κύτταρα από τη φυσιολογική ανθρώπινη ωοθήκη (IOSE 7576 και IOSE 397) και από έναν ασθενή με καρκίνο των ωοθηκών με

BRCA1

μετάλλαξη, IOSE 592στ, να διερευνήσει το ρόλο των γονιδίων BRCA1 στην μεσολάβηση έκκριση FST σε αυτά τα κύτταρα. Κατασκευάσαμε επίσης αρκετά σταθεροί κλώνοι BRCA1 σε SKOV3 κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος των ωοθηκών που εκφράζουν εκτοπικά πρωτεΐνης BRCA1 (

δηλ.

BRCA1-SKOV3). Αρχικά πραγματοποιήθηκε ανάλυση μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας BRCA1-SKOV3 κλώνο και τον έλεγχο νεο κλώνος για τον εντοπισμό πρώιμων βιοδεικτών σε καρκίνους των ωοθηκών. Στη συνέχεια, θα επικυρώνονται τα αποτελέσματά μας χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο ανάλυση-PCR και διαπίστωσε ότι

FST

και

SMAD6

ήταν επάνω-ρυθμίζονται σε BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19, καθώς και σε όλες του κυττάρου IOSE γραμμές. Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η απώλεια ή μειωμένα επίπεδα της FST έκκρισης στα κύτταρα των ωοθηκών μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης για την ανθρώπινη καρκινογένεση των ωοθηκών.

Μέθοδοι

Οι φορείς έκφρασης και αντιδραστήρια

Ο άγριου τύπου (wt) πλασμίδιο έκφρασης BRCA1 δημιουργήθηκε με κλωνοποίηση BRCA1 cDNA εντός του φορέα pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) χρησιμοποιώντας τεχνητά γενετικά 5 ‘

Hind III

και 3′

Δεν

sites I [28]. Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), β-μερκαπτοαιθανόλη, και όλα τα άλλα χημικά ελήφθησαν από την Sigma (St Louis, ΜΟ) εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

κυτταρική γραμμή SKOV3 ελήφθη από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS), μη ουσιώδη αμινοξέα (100 mM), L-γλουταμίνη (5 mM), στρεπτομυκίνη (100 mg /ml) και πενικιλλίνη (100 U /ml) (όλα από την Lonza, Inc., Walkersville, MD). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2 και υπο-καλλιεργήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα, χρησιμοποιώντας θρυψίνη (Lonza) [29]. Σταθεροί κλώνοι BRCA1-SKOV3, καθώς και empty-φορέα επιμολυσμένα (neo) σταθεροί κλώνοι δημιουργήθηκαν μέσω διαμόλυνσης με τις σχετικές φορείς που ακολουθείται από επιλογή με γενετικίνη (Invitrogen). Κύτταρα

Απαθανάτισε ωοθηκών επιφανειακό επιθήλιο (IOSE)

Οι αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές (IOSE 7576, IOSE 397 και IOSE 592στ) ήταν ευγενικό δώρο από Dr.Nelly Auersperg της καναδικής ωοθηκικού ιστού Τράπεζα (Πανεπιστήμιο της βρετανικής Κολομβίας, Βανκούβερ, Καναδάς). Εν συντομία, επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών επιφάνεια ξύστηκαν από ανθρώπινο ιστό ωοθήκης επιφάνεια και καλλιεργήθηκαν σε 1:01 μίγμα του μέσου 199 (Invitrogen) και MCDB 105 (Sigma) συμπληρωμένο με 10% FBS, NaHCO3 (2.2 g /L), L-γλουταμίνη ( 5 mM), πενικιλλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) (όλα από την Invitrogen). Οι καλλιέργειες χαμηλής διόδου των απομονωμένων ανθρώπινων κυττάρων επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών στη συνέχεια αθανατοποιούνται με επιμόλυνση με ιικά σωματίδια αντιγόνου SV40 μεγάλου Τ-[30]. Τα μορφολογικά χαρακτηριστικά και το πρότυπο ανάπτυξης των κυτταρικών γραμμών IOSE παρατηρήθηκαν να μιμούνται επιφάνεια επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών στις εξωκυτταρικές μήτρες. Περαιτέρω, τα κύτταρα IOSE εμφανίζουν ισχυρή μορφολογική ομοιότητα με τις πρώτες νεοπλασματικά κύτταρα των ωοθηκών σε ανθρώπους και, επομένως, να χρησιμεύσει ως ένα εξαιρετικό μοντέλο για τις

in vitro

μελέτες επικεντρώθηκαν στην καρκινογένεση του ανθρώπου ωοθηκών [30], [31].

Affymetrix ολιγονουκλεοτιδίων μικροσυστοιχίες

Affymetrix μικροσυστοιχιών αναλύσεις έγιναν σε βασικές εγκαταστάσεις Lombardi Κέντρο Καρκίνου Γονιδιωματική και Epigenomics Shared Πόρων του Πανεπιστημίου Georgetown. απομόνωση RNA, σύνθεση cDNA, υβριδοποιήσεις γονίδιο τσιπ, και ανάλυση δεδομένων έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Το κενό φορέα και το σταθερός κλώνος BRCA1 σε κύτταρα SKOV3 που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή δεδομένων μικροσυστοιχίας περιγράφονται λεπτομερώς στην προηγούμενη χειρόγραφο μας [32]. Το γονίδιο τσιπ που χρησιμοποιούνται για αυτά τα πειράματα ήταν Human Genome U133 Plus 2.0 Array. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών ήταν MIAME (Ελάχιστες πληροφορίες Περίπου ένα πείραμα μικροσυστοιχιών) συμμορφώνεται και η ανεπεξέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί στη γονιδιακή έκφραση βάσης δεδομένων Omnibus (GEO) όπως περιγράφεται στην προηγούμενη χειρόγραφο μας [32]. Ο αριθμός ένταξης για την υποβολή αυτή είναι GSE30296. Ιεραρχική συσταδοποίηση των επιλεγμένων γονιδίων πραγματοποιήθηκε όπως πριν [32].

Παροδικές επιμολύνσεις

κύτταρα πολλαπλασιαζόμενα SKOV3 επιμολύνθηκαν όλη τη νύκτα με τις υποδεικνυόμενες φορείς έκφρασης (4-6 μg πλασμιδίου DNA ανά φρεάτιο μια πλάκα 6 φρεατίων ή 20-25 μg ανά τρυβλίο των 100 mm) με χρήση Lipofectamine 2000 (Invitrogen) όπως περιγράφεται προηγουμένως [29], [33]. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα πλύθηκαν με 1Χ PBS που ακολουθείται από επώαση με φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας για μέχρι και 24-48 ώρες για την έκφραση του γονιδίου.

μικρό παρεμβαλλόμενο (SI) RNA θεραπείες

ασύγχρονα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα ήσαν προ-αγωγή με ειδική γονιδιακή siRNA (100 ηΜ για 72 ώρες) χρησιμοποιώντας siPORT αμίνη (Ambion, Foster City, CA). Η αποτελεσματικότητα του knock-down επιβεβαιώθηκε μέσω ανοσοστύπωμα για την πρωτεΐνη (ες) στόχο. Μετά siRNAs χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη: έλεγχος siRNA [ON-TARGET

συν

μη στόχευση siRNA (Cat # D-001810-01, Dharmacon, Chicago, IL)]? FST συγκεκριμένες siRNA λήφθηκε από την Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA? BRCA1-ειδικό siRNA [συνένωση δύο έθιμο συντίθεται siRNA από Dharmacon (αλληλουχίες 5 ‘→ 3’ CAGCTACCCTTCCATCATA και CTAGAAATCTGTTGCTATG)]. Τόσο FST και BRCA1 siRNA στοχεύθηκαν έναντι του ORF των αντίστοιχων γονιδίων

ημι-ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης -. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) ανάλυση

ημι-ποσοτικές αναλύσεις RT-PCR ήταν πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως αναφέρεται παραπάνω και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας την RNase Easy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Δείγματα ολικού RNA (50 ng) μεταγράφηκαν ανάστροφα χρησιμοποιώντας 50 μονάδες Superscript αντίστροφης μεταγραφάσης III (Invitrogen) σε όγκο αντίδρασης 20 μΙ. Ημι-ποσοτική PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας δείγμα 1 μΙ από κάθε δείγμα του μεταγράφεται cDNA, με τη χρήση θερμής εκκίνησης Taq πολυμεράσης (Denville, South Plainfield, NJ). Το DNA πρώτα μετουσιώθηκε για 5 λεπτά στους 95 ° C, και στη συνέχεια ενισχύεται χρησιμοποιώντας κύκλους των 30 sec στους 95 ° C, 30 sec στη συγκεκριμένη θερμοκρασία ανόπτησης, και 1 λεπτό στους 72 ° C, με τελική επώαση 10 λεπτών στους 72 ° C . Ο αριθμός κύκλος ρυθμίστηκε έτσι ώστε όλες οι αντιδράσεις εντός της γραμμικής περιοχής του πολλαπλασιασμού των προϊόντων PCR. Η προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές που χρησιμοποιούνται, οι θερμοκρασίες ανόπτησης, και αναμενόμενα μεγέθη των προϊόντων PCR φαίνονται στον Πίνακα 1. Οι ποσοτικοί σημαίνει ανάλυση από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα αντιπροσωπεύεται μαζί με τυπικό σφάλμα των μετρήσεων (± SEM).

Ποσοτική πραγματικού χρόνου-PCR (Q-PCR) ανάλυση

Η Q-PCR διεξήχθη από την ABI PRISM 7900HT Σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας SYBR Green ΡΟΚ Μάστερ Αναμείξτε αντιδραστήριο (Applied Biosystems) σε έναν όγκο αντίδρασης 25 μΙ. 10 ng των δειγμάτων cDNA με κατάλληλο γονίδιο-ειδικών εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ανάλυση PCR. τιμές κατωφλίου του κύκλου ήταν προσαρμόζεται αυτόματα, και προσδιορίστηκαν οι φορές αλλαγές για κάθε ζεύγος γονιδίου-ειδικών εκκινητών. Οι Q-PCR εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα 1 και λήφθηκαν από Real Time αστάρια, LLC., Elkin Parks, ΡΑ.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται και λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Εν συντομία, τα κύτταρα μετά την αγωγή πλύθηκαν με 1Χ PBS και λύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό (Roche, Indianapolis, ΙΝ) συμπληρωμένο με πλήρη Mini, άνευ ΕϋΤΑ δισκίο κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche) σε πάγο για 10 λεπτά. Τα λυμένα κύτταρα ανακινήθηκαν στους 4 ° C για 20 λεπτά, ακολουθούμενο από φυγοκέντρηση στα 12.000 χ g για 20 λεπτά. Δείγματα πρωτεΐνης (50 μg) σε 4Χ LDS (λίθιο δωδεκυλοθειικό) ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος (Invitrogen) αναλύθηκαν για τις πρόχυτα Bis-Tris (BT) πηκτώματα 4-12% (Invitrogen). Τα κλασματωμένα πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν κατόπιν σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Billerica, ΜΑ) και αποκλείστηκαν για μία ώρα σε γάλα 5% άπαχο σε 1Χ PBS-Tween 20. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα που υποδεικνύονται, και εν συνεχεία με συγκεκριμένα είδη υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) δευτερογενές αντίσωμα (Santa Cruz). Οι κηλιδωμένες πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Santa Cruz). Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: BRCA1 (C-20, Santa Cruz, 1:200)? FST (Κ-19, Santa Cruz, 1:100)? Ακτίνη (C-11, Santa Cruz, 1:400), και ακτιβίνης (ab89307, Abcam, Cambridge MA, 1:1000).

Η φολλιστατίνη Δοκιμασία

Ποσοτική ανίχνευση των κυτταρικών επιπέδων FST ήταν πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ Quantikine Human FST Immunoassay (R &? D Systems Inc., Minneapolis, ΜΝ) που χρησιμοποιεί τη μέθοδο ποσοτικού ενζυμικό ανοσοπροσδιορισμό τύπου σάντουιτς (ELISA). Εν συντομία, μια πρότυπη καμπύλη έγινε για να ποσοτικοποιηθεί η ποσότητα του FST στο μέσο καλλιέργειας και τα κυτταρολύματα χρησιμοποιώντας γνωστά πρότυπα FST παρέχονται στο κιτ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται, και το μέσο από τα επεξεργασμένα κύτταρα αραιώθηκε 10 φορές για τον προσδιορισμό. Αμφότερα τα πρότυπα και τα αραιωμένα δείγματα μεταφέρθηκαν με πιπέττα σε φρεάτια προ-επικαλυμμένα με μονοκλωνικό αντίσωμα FST. Το ακινητοποιημένο αντίσωμα αφήνεται να συνδεθεί με FST υπάρχουν στα δείγματα, που ακολουθείται από την επώαση του ενζύμου-συνδεδεμένο μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για FST σε κάθε φρεάτιο. Ένα διάλυμα υποστρώματος προστέθηκε στα φρεάτια μετά από επώαση που οδηγεί σε ανάπτυξη χρώματος σε αναλογία με την ποσότητα του FST δεσμεύονται κατά το αρχικό στάδιο της αντίδρασης. Η ένταση του χρώματος μετράται σε διπλού μήκους κύματος (450-540 nm). Το ποσό των FST σε κάθε υποδεικνύεται δείγματα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SEM τους.

Η μετανάστευση των κυττάρων Δοκιμασία

Η μετανάστευση των κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας CytoSelect 96 φρεατίων Kit κυττάρων Μετανάστευσης, 8 μΜ, φθορομετρικής (Cell Biolabs, Inc. San Diego, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, η οποία βασίζεται στην μέθοδο Boyden τμήμα. Εν συντομία, θεραπεία /χωρίς θεραπεία κύτταρα αιωρήθηκαν σε ένα μέσο απαλλαγμένο από ορό καλλιέργεια και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε θάλαμο άνω μεμβράνη της πλάκας κυτταρικής μετανάστευσης. Ο θάλαμος μεμβράνης που περιέχουν κύτταρα στη συνέχεια τοποθετήθηκαν στην κορυφή του δίσκου του τροφοδότη για να διευκολύνει την κυτταρική μετανάστευση κατά μήκος της μεμβράνης. Η χημειο-προσελκυστικό χρησιμοποιείται στο δίσκο του τροφοδότη ήταν πλήρες μέσο κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχει 10% FCS. Το πλήρες σύνολο επωάσθηκε στους 37 ° C επωαστήρα κυτταρικής καλλιέργειας για 24 ώρες. Τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν από κάθε δείγμα συλλέχθηκε από το δίσκο τροφοδοσίας? λύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που αποτελείται από φθορίζουσα χρωστική CyQuannt GR, και το συνολικό φθορισμό των κυττάρων μετανάστευσαν ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας Victor 1420 αναγνώστη μικροπλακών φθορισμού (Perkin-Elmer Wallac, Inc., Waltham, ΜΑ) σε διπλού μήκους κύματος (480-520 nm ). Οι παρατηρούμενες μονάδες φθορισμού (FU) είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των κυττάρων που μετανάστευσαν? υψηλότερη η παρατηρούμενη φθορισμού υψηλότερη είναι η μετανάστευση των κυττάρων. Μία πρότυπη καμπύλη κατασκευάστηκε για κάθε κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας ένα στοιχειώδες πυκνότητα κυττάρων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και τα δεδομένα που λαμβάνονται από την πρότυπη καμπύλη από κάθε κυτταρική γραμμή (θεραπεία /χωρίς θεραπεία) που αντιπροσωπεύεται ως μέσο ± SEMs.

Κυττάρων πολλαπλασιασμός Δοκιμασία

κιτ ροή FITC BrdU από την BD Pharmingen (San Jose, CA) χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση των δοκιμασιών του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με τις κυτταρικές γραμμές IOSE σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 10 μΜ BrdU προστέθηκαν σε ασύγχρονα αναπτυσσόμενα κύτταρα σε λογαριθμική φάση για μια ώρα σε παλμική τα κύτταρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά χρησιμοποιώντας BD Cytofix /Cytoperm ρυθμιστικού (που παρέχεται στο κιτ), και στη συνέχεια κατεργάζεται με DNase ώστε να εκτεθεί BrdU. FITC αντίσωμα στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση BrdU, και στη συνέχεια τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ένα κυτταρόμετρο ροής FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA) και οι παράμετροι ορίστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. FACS ανάλυση έγινε στο κυτταρομετρίας ροής και διαλογή κυττάρων Shared Resources στο Lombardi Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Georgetown. Τα δεδομένα που λαμβάνονται εκπροσωπήθηκαν ως μέσοι όροι ± SEM, των εκατό BrdU επισημασμένα κύτταρα.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά με «Ένας τρόπος για την ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) μέσω Tukey Test», η οποία είναι κατά ζεύγη σύγκριση των μέσων απαντήσεων στις διάφορες ομάδες θεραπείας με τη χρήση SigmaStat στατιστικού λογισμικού (Ver 3 για τα παράθυρα). Μια τιμή της P & lt? 0,05 ή λιγότερο θεωρήθηκε σημαντική για όλα τα πειράματα

Αποτελέσματα

Σταθερή έκφραση των γονιδίων BRCA1 στην κυτταρική σειρά SKOV3

Σε αντίθεση με τον καρκίνο του μαστού, δεν υπάρχουν καλά. -Ιδρύθηκε κατευθυντήριων γραμμών που συνδέουν

BRCA1

μεταλλάξεις και προδιάθεση του ατόμου για την ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών (SKOV3) ως γονέας καρκινική κυτταρική σειρά ωοθηκών και δημιουργούνται διάφορες σταθεροί κλώνοι που εκτοπικά εκφραζόμενη wtBRCA1 (BRCA1-SKOV3) και κενού φορέα του φόντου, pcDNA3 (Neo). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, # 4, # 18 και # 19 κλώνοι του BRCA1-SKOV3 έδειξαν σημαντική αύξηση στην έκφραση του BRCA1 (Ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με γονικά κύτταρα SKOV3, καθώς και οι αντίστοιχοι κλώνοι Neo. Η πυκνομετρική ανάλυση από τρία ανεξάρτητα Western blots φαίνεται στο Σχήμα 1Β ως μέσο ± τυπικό σφάλμα των μετρήσεων (SEM). Έτσι, η παραγωγή των υπο-κυτταρικών σειρών SKOV3 με σταθερή έκφραση γονιδίων BRCA1 θα βοηθήσουν περαιτέρω στην κατανόηση της επίδρασης των γονιδίων BRCA1 σε ανθρώπινο καρκίνωμα των ωοθηκών.

(Α) Αρκετές σταθερές γραμμές δημιουργήθηκαν με υπερέκφραση των γονιδίων BRCA1 και διάνυσμα φόντο του, pcDNA3 σε κύτταρα καρκινώματος ωοθήκης SKOV3. Τα επίπεδα έκφρασης του BRCA1 φαίνονται σε όλους τους κυτταρικούς κλώνους. Γονική δείχνει μόνο μη επιμολυσμένα κύτταρα SKOV3. Η πυκνομετρική ανάλυση από τρία ανεξάρτητα ανοσοστυπώματα δίδεται στο (Β). Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι SEMs. * Αντιπροσωπεύει Ρ & lt? 0,05 (σε σύγκριση με τη γονική)

Η

διαφορική γονιδιακή έκφραση λόγω BRCA1 υπερέκφραση σε κύτταρα SKOV3

Με βάση την έκφραση BRCA1 του # 19 κλώνου του BRCA1-SKOV3 (. στο εξής θα αναφέρεται ως επιλέχθηκε BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19) και σε συνδυασμό με το # 3 Νέο κλώνος (εφεξής ως Neo κλώνος 3 για την ανάλυση μικροσυστοιχιών Affymetrix #). RNA από τρεις ξεχωριστές διόδους καλλιέργεια του BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19 κύτταρα και Neo κλώνος # 3 κύτταρα απομονώθηκε και υποβλήθηκε σε ανάλυση μικροσυστοιχιών (βλέπε μεθόδους για λεπτομέρειες). Στη συνέχεια, κατασκευάσαμε μια ιεραρχική συσταδοποίηση της γονιδιακής έκφρασης που ήταν σημαντικά (Ρ & lt? 0,05) μεταβάλλεται στις BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19 κύτταρα και σε σύγκριση με το Neo κλώνος # 3 κύτταρα. Παρατηρήσαμε πάνω από 10 φορές πάνω ρύθμιση σε 274 γονίδια και περισσότερο από 4 φορές κάτω ρύθμιση σε 279 γονίδια BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19 κύτταρα σε σύγκριση με το Νέο κλώνο # 3 (βλέπε πίνακα S1, καθώς και αντίστοιχο χάρτη θερμότητας στο σχήμα S1 ). Χρησιμοποιώντας αυτά τα δεδομένα μικροσυστοιχιών, ανάλυση Ingenuity Διαδρομή αποκάλυψε ότι BRCA1 υπερέκφραση σε κύτταρα SKOV3 (BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19) ρυθμίζει αρκετές εξαιρετικά σημαντικό σηματοδότησης και μεταβολικές οδούς (βλέπε πίνακα S2 για τις up-ρυθμιζόμενων γονιδίων και στον Πίνακα S3 για τα γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω σε BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19). Ο κατάλογος των γονιδίων περαιτέρω περιόρισε σε 40 επιλεγμένες γονιδίων βασίζεται σε περίπου 3-φορές μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με τον έλεγχο, και με σημαντικές τιμές ρ (Ρ & lt? 0,05). Οι επιλεγμένες ομάδες γονιδίων βρέθηκαν να είναι κυρίως υπεύθυνοι για την κυτταρική ανάπτυξη, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και οξειδωτική αντίδραση στο στρες, τα οποία ήταν του πρωτεύοντος ενδιαφέροντος για την παρούσα μελέτη. Ιεραρχική συσταδοποίηση ήταν redone χρησιμοποιώντας αυτά τα επιλεγμένα σύνολο δεδομένων 40 γονίδια για πάνω ρυθμισμένα (κόκκινο) ή κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια (πράσινο) λόγω wtBRCA1 υπερέκφραση σε BRCA1-SKOV3 κυττάρων κλώνος # 19 (Σχήμα 2). Οι προκύπτουσες δύο συστάδες γονιδίων μαζί με την πολλαπλή μεταβολή τους και σ αξίας που παρέχονται στη δεξιά πλευρά του σχήματος 2.

Ένας χάρτης θερμότητας εμφανίζει σημαντικές αλλαγές σε μια ομάδα επιλεγμένων γονιδίων λόγω υπερέκφραση του wtBRCA1 σε SKOV3 κύτταρα των ωοθηκών καρκίνωμα. Τρεις ανεξάρτητες αναλύσεις μικροσυστοιχιών πραγματοποιήθηκαν. Δύο συμπλέγματα ανιχνεύθηκαν, μία λόγω κάτω ρύθμιση των γονιδίων (πράσινο) και το άλλο λόγω της πάνω ρύθμιση των γονιδίων (κόκκινο). Φορές οι αλλαγές και σ τιμές των γονιδίων στις συστάδες δίνεται στη δεξιά

Η

FST, ένας ανταγωνιστής της Ακτιβίνης, είναι υπεύθυνη για την πρόωρη ανάπτυξη των ωοθηκών.? Ωστόσο, δεν γνωρίζουμε πολλά για την κυτταρική ρύθμιση του FST σε ωοθηκικό ιστό του ανθρώπου. Αυξημένα επίπεδα FST σε κύτταρα των ωοθηκών του ανθρώπου προτείνεται να είναι κυτταροπροστατευτικών έναντι των ωοθηκών καρκινογένεση. Έχουμε παρατηρήσει 51,6 φορές υψηλότερη έκφραση του FST σε BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19 σε σύγκριση με το Neo κλώνος # 3 κύτταρα. Η αναστολίνη επίσης βρέθηκε να είναι σημαντικά (Ρ & lt? 0,05) κύτταρα BRCA1-SKOV3 πάνω ρυθμισμένα (11,6 φορές) σε. Αρκετές μελέτες έχουν προτείνει τον δυνητικό ρόλο της ινχιμπίνης ως βιοδείκτη για καρκίνο επιθηλιακής προέλευσης [35] των ωοθηκών. Μερικές μελέτες προτείνουν ινχιμπίνη ως δείκτη ορού σε ωοθηκική καρκινογένεση αποκάλυψε ότι τα επίπεδα ινχιμπίνης αυξημένα σε περίπου 70-80% των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών βλεννώδες τύπου, και με 15-35% των μη βλεννωδών τύπου επιθηλιακά περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών [36] , [37]. Μελέτες έχουν δείξει περαιτέρω ότι στις γυναίκες μετά την εμμηνόπαυση, η συνολική αναστολίνη μπορεί να συνδυαστεί με CA-125 για την αποτελεσματική διάγνωση του επιθηλιακού καρκινογένεσης των ωοθηκών [35].

Επιπλέον, βρήκαμε ότι διάφορα άλλα μέλη της ΤΟΡ οικογένεια β όπως ΤΟΡ-β2, ΤΟΡ-ßR1, ΤΟΡ-ßR3 και μια ανασταλτική SMAD, SMAD6, επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω σε BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19 (Σχήμα 2). Έτσι, η προσέγγιση ιεραρχικής ομαδοποίησης δεν ήταν μόνο σε θέση να επιβεβαιώσει τον αριθμό των ήδη γνωστών πιθανών δεικτών στον καρκίνο των ωοθηκών, αλλά και να αποκαλύψει πολλά άλλα πιθανά μοριακούς στόχους που μπορεί να παρουσιάζουν ενδιαφέρον για το σχεδιασμό στοχευμένη θεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών ανθρώπινη.

Επικύρωση της Affymetrix αποτελέσματα μικροσυστοιχιών από ημι-ποσοτική RT-PCR

Έχουμε χρησιμοποιήσει RT-PCR για την επικύρωση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από την ανάλυση μικροσυστοιχιών. Τρεις σταθεροί κλώνοι άτομο για κάθε κυτταρικές σειρές BRCA1-SKOV3 Neo και χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση ημι-ποσοτική RT-PCR. Βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση (Ρ & lt? 0,05) μεταξύ της μικροσυστοιχίας και τα αποτελέσματα RT-PCR. Το Σχήμα 3Α δείχνει αντιπροσωπευτικά εκφράσεις mRNA των υποδεικνυόμενων γονιδίων σε όλες τις ομάδες των κυττάρων. Το Σχήμα 3Β καταδεικνύει ποσοτική εκτίμηση των εκφράσεων mRNA όλων των γονιδίων υπό έρευνα βασίζεται σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Σε όλες τις περιπτώσεις, η έκφραση του mRNA της FST ήταν σημαντικά (Ρ & lt? 0,05) υψηλότερη στην BRCA1-SKOV3 κλώνων σε σύγκριση με Neo κλώνους, την επικύρωση των αποτελεσμάτων που παρατηρήθηκαν σε ανάλυση μικροσυστοιχιών, αν και είναι απαραίτητο να σημειωθεί ότι ο βαθμός της πολλαπλής μεταβολής είναι μεταβλητό ? πιθανόν λόγω της διαφοράς στην ευαισθησία αυτών των δύο τεχνικών. BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19 έδειξαν ότι οι μέγιστες πάνω ρύθμιση του BRCA1 μεταξύ των σταθερές κυτταρικές σειρές? ως εκ τούτου, όλα τα μελλοντικά πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση αυτού του κλώνου, όπως δείχνεται παραπάνω, και συγκρίθηκε με Neo κλώνος # 3. Επιπλέον, RT-PCR επιβεβαίωσε επίσης την ρύθμιση προς τα πάνω του SMAD6 στο BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19 (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση της παροδικής έκφρασης του BRCA1 στα γονικά κύτταρα SKOV3. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 3C είναι συνεπείς με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν στο Σχήμα 3Α και 3Β. έκφραση FST mRNA βρέθηκε να είναι σημαντικά (Ρ & lt? 0,05) είναι αυξημένα σε BRCA1 υπερεκφράζεται κύτταρα SKOV3 σε σύγκριση με τον φορέα φόντο επιμολυσμένα (pcDNA3), καθώς και τα γονικά κύτταρα SKOV3. Επιπλέον, το mRNA εκφράσεις SMAD6 επίσης αυξημένα στα κύτταρα που υπερεκφράζουν wtBRCA1 (Σχήμα 3C). Πυκνομετρία την έκφραση των γονιδίων ενδιαφέροντος από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα δίνονται στο Σχήμα 3D.

(Α) Τα πολλαπλασιαζόμενα σταθερών κλώνων τόσο Neo (pcDNA3-SKOV3) και wtBRCA1 (BRCA1-SKOV3) συλλέχθηκαν για ημι-ποσοτική δοκιμασία RT-PCR όπως περιγράφεται υπό τον τίτλο «Μέθοδοι». Οι ζώνες που αντιστοιχούν στα αντίστοιχα γονίδια υποδεικνύονται στα δεξιά. (Β) Οι PCR ζώνες από τρία ανεξάρτητα πειράματα κάθε υποδεικνύεται γονιδίων ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία και τα επίπεδα mRNA ομαλοποιήθηκαν προς ακτίνη. κύτταρα (C) Πολλαπλασιαζόμενα SKOV3 διαμολύνθηκαν παροδικά είτε με wtBRCA1 ή διάνυσμα φόντο pcDNA3 και το απομονωμένο RNAs προσδιορίστηκε με ημι-ποσοτική RT-PCR. Τα αποτελέσματα προσδιορίστηκαν ποσοτικά όπως παραπάνω και αντιπροσωπεύεται από διάγραμμα bar (D). Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι SEMs. * Ρ & lt?. 0.05 (σε σχέση με το καθένα ελέγχους)

Η

BRCA1 ρυθμίζει FST έκκριση σε κύτταρα καρκινώματος ωοθήκης SKOV3

FST εκκρίνεται από θυλακοειδές υγρό των ωοθηκών στην εξωκυτταρική περιοχή, και είναι απαραίτητη για την έγκαιρη ανάπτυξη των ωοθηκών [38].

In vitro

πείραμα με καλλιεργημένα κύτταρα των ωοθηκών παρουσιάζουν απόκλιση επίπεδα έκκρισης FST στο μέσο καλλιέργειας, ανάλογα με τις θεραπείες των κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας. Έτσι, ένα αραιωμένο μέσο εξυπηρετεί μια καλή πηγή για τη μέτρηση της έκκρισης και έκφραση FST σε ένα συγκεκριμένο τύπο κυττάρου. Το Σχήμα 4Α δείχνει μια πρότυπη καμπύλη που λαμβάνεται με την καθαρισμένη πρωτεΐνη FST, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της ποσότητας της εκκρινόμενης FST στα δείγματα υπό έρευνα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση BRCA1 σε κύτταρα SKOV3 δείχνει περίπου 2 φορές υψηλότερη εκκρινόμενη FST όταν συγκρίνεται με pCDNA3-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, θα πραγματοποιηθεί παρόμοια ποσοτική δοκιμασία FST χρησιμοποιώντας κύτταρα SKOV3 όπου στο BRCA1 χτυπήθηκε κάτω από BRCA1 ειδικό siRNA. Σχήμα 4C έδειξαν τουλάχιστον 50% μείωση στην έκφραση FST σε BRCA1 κύτταρα knock-down σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με έλεγχο siRNA. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η ίδια δοκιμασία FST με τις σταθερούς κλώνους BRCA1 κυττάρων σε κύτταρα SKOV3 όπως περιγράφηκε προηγουμένως. BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19 κύτταρα έδειξαν αυξημένη έκκριση FST από νεο κλώνο # 3, όπως αναμενόταν (Σχήμα 4D). Επιπλέον, ερευνήσαμε επίσης τα εκκρινόμενα επίπεδα των FST στις σταθερές γραμμές παρακάτω ρύθμιση προς τα κάτω του BRCA1 στην ίδια. Κάτω ρύθμιση του BRCA1 είτε Neo κλώνος # 3 (σχήμα 4Ε) ή BRCA1-SKOV3 κλώνος # 19 (Σχήμα 4F) σημαντικά (Ρ & lt? 0,05) ανέστειλαν την έκκριση του FST σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας σε σύγκριση με τις αντίστοιχες τους ελέγχους τους. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης του BRCA1 σε όλα τα παραπάνω δείγματα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 4G. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από αυτή την ποσοτική δοκιμασία FST υποδηλώνει ότι η επαγωγή σε κυτταρικά επίπεδα BRCA1 με τη σειρά της διεγείρει την έκκριση εξωκυττάριας FST σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

(Α) Πρότυπη καμπύλη παρήχθη με καθαρισμένο ανθρώπινο FST όπως αναφέρεται στις «Μεθόδους» , το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση άγνωστες συγκεντρώσεις FST στα υποδεικνυόμενα δείγματα. κύτταρα SKOV3 επιμολύνθηκαν όπως και πριν, είτε για BRCA1 υπερέκφραση (Β) ή για BRCA1 υποέκφραση (C), και προσδιορισμούς FST (βλέπε μεθόδους) διεξήχθησαν με το αραιωμένο μέσο καλλιέργειας. Η ίδια δοκιμασία FST πραγματοποιήθηκε με τα σταθερούς κλώνους όπως υποδεικνύεται (D), καθώς και με τα σταθερά κύτταρα όπου η έκφραση του BRCA1 χτυπήθηκε κάτω από BRCA1-siRNA (Ε-Ρ). Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι SEMs. * P & lt? 0,05 (σε σχέση με κάθε έλεγχο).