Αφηρημένο

Εμείς ερεύνησε τις επιπτώσεις της KML001 (NaAsO

2, metaarsenite νατρίου, Kominox), ένας από του στόματος βιοδιαθέσιμο ένωση του αρσενικού, για την ανάπτυξη και το θάνατο των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του προστάτη και του μηχανισμού δράσης του . Η αναστολή της ανάπτυξης εκτιμήθηκε με δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας παρουσία ή απουσία του αναστολέα της απόπτωσης, αναστολέα αυτοφαγία ή αντιοξειδωτικό

N

Ακετυλ

Ε-κυστεΐνη να μηχανισμός κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από KML001 σε PC3 μελετήσει, κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη DU145 και LNCaP. Ηλεκτρονική μικροσκοπία, κυτταρομετρία ροής και κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη αποπτωτικών και αυτοφαγικά μηχανισμούς. Το μοντέλο ξενομοσχεύματος DU145 χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα των KML001 in vivo. KML001 μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων και αύξησε το ποσοστό των κυττάρων αννεξίνης ν-θετικής δοσοεξαρτώμενο σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, και τα κύτταρα LNCaP ήταν πιο ευαίσθητα σε KML001 από PC3 ή DU145 κυττάρων. Ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκάλυψε τυπικά αποπτωτικά χαρακτήρες και αυτοφαγικά κενοτόπια σε κύτταρα κατεργασμένα με KML001. Η έκθεση σε KML001 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη που προκαλείται από απόπτωση και αυτοφαγία με χρονο και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. KML001 επαγόμενη δοσοεξαρτώμενη συσσώρευση δραστικών ειδών οξυγόνου, και δεσμεύει τις αντιδραστικά είδη οξυγόνου με

N

Ακετυλ

L-κυστεΐνη μειωμένη LC3 και διασπασμένο πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράση. KML001 ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου στο μοντέλο ξενομοσχεύματος DU145. Επιπλέον, σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού και σημαντικές αυξήσεις απόπτωσης και αυτοφαγία παρατηρήθηκαν σε όγκους KML001 αγωγή από ό, τι σε όγκους υποστεί αγωγή με έκδοχο. Η έκθεση ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη να KML001 επάγεται τόσο απόπτωση και αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο μέσω της οδού οξειδωτικού στρες. Και KML001 είχε μια αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση στα κύτταρα DU145 σε ξενομόσχευμα ποντικούς

Παράθεση:. Μπορείτε D, Kim Y, Jang MJ, Lee C, Jeong IG, Cho ΥΜ, et al. (2015) KML001 επάγει την απόπτωση και αυτοφαγικά θάνατο των κυττάρων σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη μέσω Οξειδωτικό στρες οδό. PLoS ONE 10 (9): e0137589. doi: 10.1371 /journal.pone.0137589

Επιμέλεια: Spencer B. Gibson, Πανεπιστήμιο της Μανιτόμπα, Καναδάς

Ελήφθη: 6 του Μάρτη, 2015? Αποδεκτές: 18, Αυγούστου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 9η Σεπτεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 Μπορείτε et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις της Κορέας Υγεία Τεχνολογία R & amp? D Έργου και του Υπουργείου Υγείας & amp? Πρόνοιας (A062254 και A102059)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αν και ενώσεις του αρσενικού είναι ευρέως γνωστές ως καρκινογόνες που προκαλούν καρκίνους σε πολλούς ανθρώπινους ιστούς, τριοξείδιο του αρσενικού (As

2O

3, ΑΤΟ) έχει αποδειχθεί κλινικά ότι είναι ένας αποτελεσματικός θεραπευτικός παράγοντας για τη θεραπεία της οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας [1,2]. Αν και αντικαρκινική ο μηχανισμός δράσης της δεν είναι καλά κατανοητή, ΑΤΟ ευρέθη ότι ρυθμίζουν διάφορες βιολογικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, τη διαφοροποίηση, και την αγγειογένεση σε διάφορες κυτταρικές γραμμές [3]. Επειδή ATO ήταν επιτυχής στην αντιμετώπιση οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία [1,2,4], είναι αρσενικού βιώνει μια αναβίωση στη σύγχρονη ιατρική καρκίνο [5].

Αρσενικό υπάρχει σε τρι-και πεντα-δύναμο καταστάσεις οξείδωσης, όπως χημικά ασταθείς σουλφίδιο και οξείδιο, και τα άλατα νατρίου, καλίου, ή ασβεστίου. αρσενικού τρισθενούς, συμπεριλαμβανομένων KML001 (NaAsO

2, metaarsenite νατρίου, Kominox) και ATO, αναστέλλουν πολλά ένζυμα αντιδρώντας με βιολογικούς συνδέτες που έχουν ελεύθερες ομάδες θείου [3,6]. Τρεις σημαντικές μοριακούς μηχανισμούς ΑΤΟ απόπτωση αξιολογήθηκε, με τη συμμετοχή ενεργοποιείται από μιτογόνο κινασών πρωτεΐνης, κασπάσες, και αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) [3]. Αν και ο μηχανισμός δράσης της ΑΤΟ είναι γνωστή [7-12], εκείνη των KML001 είναι ακόμα υπό διερεύνηση [13,14].

Λόγω του στόματος βιοδιαθεσιμότητα, διαλυτότητα στο νερό και χαμηλότερη διάμεση θανατηφόρο δόση ( LD

50) σε αρουραίους, KML001 είναι πιο κατάλληλο για κλινικές εφαρμογές από ΑΤΟ [13]. Συνεπώς ερευνήσαμε την ικανότητα των KML001 να αναστέλλει την ανάπτυξη και να επάγει τον κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυτταρικών γραμμών ανθρώπινου προστάτη. Αναλύσαμε επίσης αν αυτοφαγία είναι με την απόπτωση που εμπλέκονται στην KML001 κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη. Τέλος, προσδιορίσαμε την αντικαρκινική δράση του KML001 σε μοντέλο ξενομοσχεύματος DU145.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

Ο καρκίνος ανθρώπινες κυτταρικές σειρές του προστάτη, PC3, DU145, και LNCaP αγοράσθηκαν από την ATCC (Manassas, VA, USA) και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) με 10% θερμικά αδρανοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνης και 100 μg /ml στρεπτομυκίνης σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C. KML001 λήφθηκε από Komipharm International (Gyeonggi-do, Κορέα). Z-VAD-FMK αγοράστηκε από την R &? Συστήματα D (Minneapolis, ΜΝ, USA). 3-

μεθύλιο

-αδενίνη (3-ΜΑ) και

N

Ακετυλ

L-κυστεΐνη (NAC) αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). Το πρωτόκολλο θεραπείας φαρμάκου περιγράφηκε προηγουμένως [15].

Μέτρηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της βιωσιμότητας

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Alamar Blue (Serotec Abd, Kidlington, Oxford, UK) σύμφωνα με τον κατασκευαστή του οδηγίες και πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Δοκιμασία ΟθΙΙϋίθΓ Glo Luminescent την Κυτταρική Βιωσιμότητα (Promega, Madison, WI, USA) και πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. IC

50 υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism version 5.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

κύτταρα καρκίνου του προστάτη Ανθρώπινα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με IC

50 συγκεντρώσεις KML001 για 24 και 48 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15], και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο μετάδοσης ηλεκτρονίου (JEOL μοντέλο 1200ΕΧ, Tokyo, Japan).

Αναλύσεις για

ανίχνευσης απόπτωσης

κύτταρα καρκίνου του προστάτη Ανθρώπινα εκτέθηκαν σε KML001 και απόπτωση εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το αννεξίνη V-FITC apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15].

κηλίδας Western ανάλυση

Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου προστάτη καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 με 5% θερμοαπενεργοποιημένο FBS υποβλήθηκαν σε αγωγή με KML001 σε διάφορες συγκεντρώσεις για διαφορετικές χρονικές περιόδους, ακολουθούμενο από επώαση για 6 ώρες με ή χωρίς Ζ-VAD-FMK (20 μΜ ) ή 3-ΜΑ (2 mM). Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Αντισώματα προς LC3 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), procaspase-3, και πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA), και β-ακτίνης (Santa Cruz Biotechnology, Σάντα Cruz, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western.

ROS

ανίχνευση

η ενδοκυτταρική ROS παράγονται από KML001 ή υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2) ως θετικός μάρτυρας μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία με βάση την ενδοκυτταρική υπεροξείδιο εξαρτώμενη οξείδωση της 2 ‘, 7′-dichlorodihydrofluorescein διοξεικό (DCFH-DA? Molecular Probes, Eugene, OR, USA) προς την φθορίζουσα ένωση 2′, 7’-διχλωροφθορεσκεϊνης (DCF), και αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

DU145 ξενομοσχεύματος ζωικό μοντέλο

Όλες οι πτυχές της φροντίδας των ζώων και επεξεργασίας διεξήχθησαν σύμφωνα με την όγδοη έκδοση του Οδηγού για τη φροντίδα και Χρήση ζώων Εργαστηρίου που δημοσιεύθηκε το 2011. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από Θεσμικών φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής των Ασάν Ιατρικό Κέντρο, Σεούλ, Κορέα (2012-02-067). Τεσσάρων εβδομάδων αρσενικούς BALB /C γυμνά ποντίκια (OrientBio, Σεούλ, Κορέα) υποδορίως εμβολιάζονται με 5 × 10

6 DU145 κύτταρα. Όταν οι όγκοι έφθασαν ένα μέσο όγκο περίπου 100 mm

3, οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες ελέγχου και επεξεργασίας (6 ζώα ανά ομάδα). Για τους DU145 που φέρουν τα ποντίκια, οι ομάδες θεραπείας χορηγήθηκαν KML001 (2,5 ή 10 mg /kg /d) και καθημερινά με στοματική gavages για 4 εβδομάδες. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν για τοξικότητα με μετρήσεις βάρους σώματος, και οι όγκοι μετρήθηκαν τρεις φορές την εβδομάδα και ο όγκος υπολογίστηκε με την τροποποιημένη ελλειψοειδούς τύπου: 0,52 × μήκος Χ (πλάτος)

2 [17]. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με διοξείδιο του άνθρακα μετά τη συγκομιδή τους όγκους.

δοκιμασία TUNEL και Ki-67 ανοσοϊστοχημική χρώση

Τερματικό δεσοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης (TdT) μεσολάβηση τέλος επισήμανση dUTP nick (TUNEL) για την ανίχνευση αποπτωτικών κύτταρα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του

in situ

κιτ ανίχνευσης θανάτου κυττάρου (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Για την ανάλυση της εικόνας, τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία από κάθε ποντικοί φωτογραφήθηκαν σε 200 × μεγέθυνση χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού (Carl Zeiss, Jena, Germany).

Για Ki-67 ανοσοχρώση χρησιμοποιώντας δείκτες πολλαπλασιασμού, ιστός ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές ήταν αποπαραφινοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ξυλόλιο και βαθμολογούνται αιθανόλη που ακολουθείται από ανάκτηση αντιγόνου χρησιμοποιώντας IHC-Tek σύνολο ανάκτησης επιτόπου ατμόπλοιο (IHC World, LLC. Woodstock, MD, USA). χρώση διαφάνειες διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Για τις εικόνες και την ένταση βαθμολόγησης, τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία από κάθε ποντίκια φωτογραφήθηκαν σε 200 × μεγέθυνση χρησιμοποιώντας ένα Olympus U-LH100L-3 κάμερα και τον Όλυμπο Ix 71 λογισμικό.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εμφανίζονται ως το μέσο ± τυπικές αποκλίσεις (SD). Η στατιστική σημαντικότητα θεωρήθηκε σε

σ

& lt? 0,05 και προσδιορίζεται με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA).

Αποτελέσματα

Επίδραση της KML001 επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

Η επώαση του ανεξάρτητου από ανδρογόνο PC3 και DU145 και εξαρτώμενων από ανδρογόνα LNCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη με 0.0001-200 μΜ KML001 για 72 ώρες μειώνεται η βιωσιμότητα των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. LNCaP κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα από PC3 ή DU145 κυττάρων (σχήμα 1? Πίνακας 1)

Κύτταρα κατεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις KML001 επωάστηκαν για 72 h.. Το μπλε δοκιμασία Alamar έγινε εις τριπλούν. Οι μέσες τιμές δίδονται, την αξία του ελέγχου είναι 100%. PC3 (●,

παχιά στερεά γραμμή

), DU145 (▲,

λεπτή συνεχής γραμμή

), και LNCaP (▼,

λεπτή συνεχή γραμμή

).

Διέγερση αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου

Για να προσδιοριστεί αν η θεραπεία με KML001 (10 μΜ) προκαλεί απόπτωση, η υπερδομή του KML001 επεξεργασμένου PC3 κύτταρα αναλύθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία. PC3 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με KML001 έδειξε χαρακτηριστική αποπτωτικών χαρακτήρες, συμπεριλαμβανομένου ενός μικρότερου πυρήνα, πιο συμπυκνωμένο κυτταρόπλασμα, τσαλακωμένο πυρηνική μεμβράνη, και τα χρωμοσώματα συμπυκνωθεί σε μια μηνοειδούς σχήματος με συνημμένα τα πυρηνικά και των κυτταρικών μεμβρανών. Επιπλέον, αποπτωτικών σωμάτων παρατηρήθηκαν όταν η χρωματίνη συμπυκνώνεται και ρήξη με την πυρηνική περιθώριο. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα DU145 και LNCaP κατεργάζεται με IC

50 συγκεντρώσεις KML001 (5 μΜ και 1 μΜ, αντίστοιχα) (Εικόνα 2).

Η

Για να διερευνηθεί ο μηχανισμός της επαγόμενης KML001 κυτταρικού θανάτου, εκτελέσαμε ροής αννεξίνη V κυτταρομετρία δοκιμασίες. Η κατεργασία αυτών των κυττάρων με KML001 απέδωσε κύτταρα θετικά για χρώση αννεξίνης V μόνο και κύτταρα θετικά για αννεξίνη V και χρώση ΡΙ. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι KML001 κυτταρικό θάνατο που επάγεται μέσω τόσο απόπτωση και νέκρωση (σχήμα 3Α).

(Α) FACS ανάλυση της χρώσης αννεξίνης V /ΡΙ. Τα αποτελέσματα δείχνουν πρώιμη απόπτωση, ορίζονται ως αννεξίνη V-θετικά και ΡΙ-αρνητικά κύτταρα, και αργά απόπτωση, ορίζονται ως αννεξίνη V-θετικά και ΡΙ-θετικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (Β) ανάλυση κηλίδας Western της χρόνου και δοσο-εξαρτώμενη διάσπαση της PARP και ενεργοποίηση procaspase-3.

Η

Βρήκαμε επίσης ότι η έκθεση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη να KML001 οδήγησε σε χρόνο- και δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην διάσπαση της PARP, όπως επίσης και η ενεργοποίηση του procaspases-3, η οποία μεσολαβεί εγγενή απόπτωση (Σχήμα 3Β). Για να επιβεβαιωθεί ο ρόλος της απόπτωσης στην KML001 που προκαλείται θάνατος των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, υποβάλλαμε σε αγωγή των κυττάρων με τον αναστολέα κασπάσης Ζ-VAD-FMK. Βρήκαμε ότι η προσθήκη 20 μΜ Ζ-VAD-FMK μείωσε την ενεργοποίηση του procaspases-3 σε όλες καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποστηρίζοντας την υπόθεση ότι η απόπτωση που επάγεται από KML001 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Επαγωγή της αυτοφαγικά κυτταρικού θανάτου

Για να προσδιοριστεί εάν η θεραπεία με KML001 (10 μΜ) προκαλεί αυτοφαγία, η υπερδομή των κυττάρων αντιμετωπίζεται PC3 εξετάσθηκε με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Παρατηρήσαμε αυτοφαγικά κενοτόπια, συμπεριλαμβανομένων αυτοφαγοσώματα ή autolysosomes, σε KML001 επεξεργασμένα PC3 κύτταρα, όπως επίσης και σε κύτταρα DU145 και LNCaP αντιμετωπίζονται με τις αντίστοιχες IC

50 συγκεντρώσεις KML001 (Σχήμα 2).

Ο καρκίνος του προστάτη τους κύτταρα που εκτίθενται σε KML001 εξετάστηκαν με κηλίδωση Western, χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-LC3 που αναγνωρίζει και τις δύο μορφές του LC3. Βρήκαμε ότι η έκφραση της LC3 ή /και μετατροπή σε LC3-ΙΙ αυξήθηκε με τον χρόνο και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ 4Α). Για να επιβεβαιωθεί ο ρόλος της αυτοφαγία στην KML001 που προκαλείται θάνατος των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, υποβάλλαμε σε αγωγή τα κύτταρα με το αυτοφαγία αναστολέα 3-ΜΑ. Βρήκαμε ότι η προσθήκη 2 mM 3-MA μείωσε την έκφραση της LC3-ΙΙ σε όλους τους καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, η προσθήκη 1 mM 3-MA εξασθενημένος επίσης KML κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε όλες καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 4C). Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι KML001 επάγεται autophagy μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Ανάλυση

(Α) Western στύπωμα της χρόνου και δοσο-εξαρτώμενη μετατροπή του LC3-Ι-ΙΙ. (Β) Αναστολή με 3-MA του KML001 επαγόμενης μετατροπή LC3 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. (C) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 10 μΜ (PC3), 5 μΜ (DU145), ή 2 μΜ (LNCaP) KML001 παρουσία ή απουσία 1 mM 3-ΜΑ για 72 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. *

σ

& lt? 0.05 με μονόδρομη ANOVA.

Η

Η αντιοξειδωτική NAC προστατεύει τα κύτταρα από KML001-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο

KML001 επάγεται δοσοεξαρτώμενη ROS συσσώρευση σε όλες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη 3 (Σχήμα 5Α ). Εξετάσαμε επίσης τα αποτελέσματα της αντιοξειδωτικής NAC για KML001 απόπτωση και αυτοφαγία. Βρήκαμε ότι η θεραπεία όλων των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη 3 με 1 mM NAC μείωσε την έκφραση της LC3-ΙΙ και την πρωτεόλυση της PARP (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, η προσθήκη 1 mM NAC εξασθενημένα επίσης KML κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε όλες καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 5C). Αυτά τα ευρήματα παρέχουν περαιτέρω αποδείξεις ότι η έκθεση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη να KML001 ενεργοποιούνται τόσο απόπτωση και autophagy μέσω οξειδωτικού στρες.

Όλα τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη 3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του KML001 απουσία ή παρουσία 5 mM NAC για 24 ώρες. (Α) KML001 προκαλεί δοσοεξαρτώμενη ROS (μπλε) συσσώρευση. Τα κύτταρα βάφτηκαν με DCFH-DA και πλένονται με PBS. Περισσότερα από τρία πεδία σε κάθε κύτταρο παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού (200 ×), και οι αντιπροσωπευτικές εικόνες. (Β) NAC αναστολή της επαγόμενης KML001 μετατροπή του LC και κασπάσης ενεργοποίηση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. (C) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 10 μΜ (PC3), 5 μΜ (DU145), ή 2 μΜ (LNCaP) KML001 παρουσία ή απουσία 1 mM NAC για 72 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. *

σ

& lt? 0.05 από μονόδρομη ANOVA.

Η

Επίδραση στην ξενομοσχευμάτων DU145

υποδόρια ένεση γυμνά ποντίκια με 5 × 10

6 DU145 κύτταρα για να εξεταστούν τα αποτελέσματα της KML001 σε ανδρογόνα ανεξάρτητων κυττάρων καρκίνου του προστάτη in vivo. Αφού το μέγεθος του όγκου έφθασε 100 mm

3, χορηγήσαμε KML001 (2,5 ή 10 mg /kg /d) σε αυτούς για 4 εβδομάδες. Στο μοντέλο ξενομοσχεύματος DU145, ανάπτυξη όγκου ανεστάλη με KML001 σε σύγκριση με όχημα (Εικόνα 6Α). Ωστόσο, η θεραπεία KML001 δεν είχε καμία επίδραση επί του σωματικού βάρους των ποντικών (Σχήμα 6Β)

οχήματος και τα ποντίκια της ομάδας KML001 στόματος έλαβαν φυσιολογικό ορό και KML001 (2,5 ή 10 mg /kg /d) για 4 εβδομάδες, αντίστοιχα. *

σ

& lt? 0,05 έναντι οχήματος.

Η

Στο επόμενο πείραμα, προσδιορίσαμε την επίδραση της KML001 στον πολλαπλασιασμό, απόπτωση, και αυτοφαγία σε ιστούς όγκων που συλλέγονται από ζώα διαφορετικών ομάδων θεραπείας. Σε ανοσοϊστοχημική χρώση του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki-67, σημαντικές μειώσεις στις Ki-67 ανοσοχρώση παρατηρήθηκαν σε KML001 αγωγή όγκων σε σχέση με τους όγκους υπό αγωγή με όχημα (Εικόνα 7Α). Στην δοκιμασία TUNEL, σημαντική μεγαλύτερη αποπτωτικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε όγκους KML001 αγωγή από ό, τι σε όγκους υπό αγωγή με όχημα (Εικόνα 7Β). Σε ανάλυση στυπώματος Western, βρήκαμε ότι η έκφραση του LC3 ή /και μετατροπή σε LC3-ΙΙ αυξήθηκε με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, σε σχέση με τους όγκους υπό αγωγή με όχημα (Εικόνα 7C).

Τρεις πεδίων σε κάθε ποντίκια ήταν παρατηρήθηκαν με φθορισμό (200 Χ) και φωτεινά μικροσκόπια πεδίου (200 Χ), αντίστοιχα. Αντιπροσωπευτικές εικόνες κάθε ομάδα θεραπείας που φαίνεται. Όχημα και ομάδα KML001 ποντικοί έλαβαν στοματικά φυσιολογικό ορό και KML001 (2,5 ή 10 mg /kg /d) για 4 εβδομάδες, αντίστοιχα. *

σ

& lt? 0,05 έναντι του οχήματος.

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου μεταξύ των ανδρών στις Ηνωμένες Πολιτείες [19]. Αν και επιθετικές προσπάθειες προς την πρόωρη θνησιμότητα ανίχνευση και μείωση της θεραπείας για τον καρκίνο του προστάτη, ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη συνηθέστερη αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες ακόμα. Αν και πρώιμου σταδίου καρκίνου του προστάτη απαιτεί ανδρογόνων για την ανάπτυξη και συνεπώς ανταποκρίνεται σε θεραπεία στέρησης ανδρογόνων, η νόσος μπορεί να εξελιχθεί σε ανδρογόνα ανεξαρτησία και μπορεί να είναι αδιάφορη για ανδρογόνων εκτομή [20]. χημειοθεραπείες docetaxel-based έχουν δείξει ανακουφιστική και την επιβίωση οφέλη για τους ασθενείς με ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη, αλλά τα αποτελέσματα της θεραπείας είναι γενικά ικανοποιητική, με μέσο χρόνο επιβίωσης των μόλις 16 με 18 μήνες [21,22]. Έτσι δεν είναι μόνο σημαντική για την ανάπτυξη αποτελεσματικών τρόπους πρόληψης ή επιβράδυνση του σχηματισμού ευνουχισμό ανθεκτικών καρκίνο του προστάτη, αλλά επίσης για την ανάπτυξη νέων χημειοθεραπευτικών παραγόντων για τη θεραπεία του ευνουχισμού ανθεκτικών καρκίνο του προστάτη.

Από ΑΤΟ δείχθηκε να έχει δραματικές συνέπειες σε ασθενείς με οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία [1,2], αυτός ο παράγοντας έχει επίσης δοκιμαστεί σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [23]. Τόσο ΑΤΟ και KML001 είναι τρισθενές αρσενικού και ταυτόσημες ουσίες σε διάλυμα, με παρόμοια κυτταροτοξικότητα έναντι ανεξάρτητο από ανδρογόνο καρκινικών κυττάρων του προστάτη [13]. Ωστόσο, η από του στόματος βιοδιαθεσιμότητα και διαλυτότητα στο νερό της KML001 προτείνουν την κλινική εφαρμογή της, σε σύγκριση με το ATO. Επιπλέον, KML001 δείχθηκε να έχουν υψηλότερες LD

50 (41,6 mg /kg) σε αρουραίους, σε σύγκριση με ΑΤΟ (14,6 mg /kg) [13]. Έτσι ελέγξαμε την ικανότητα του KML001 να αναστέλλει την ανάπτυξη και να επάγει τον κυτταρικό θάνατο των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη του ανθρώπου. Βρήκαμε ότι η θεραπεία KML001 μείωσε τον πολλαπλασιασμό όλων των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη 3, είναι πιο τοξικές για τα κύτταρα LNCaP εξαρτώμενων από ανδρογόνα παρά να ανεξάρτητου από ανδρογόνο κύτταρα. Το πιο σημαντικό, KML001 είχε αντιπολλαπλασιαστική επίδραση επί ανεξάρτητου από ανδρογόνο DU145 κυττάρων in vitro και in vivo.

ΑΤΟ δρα επί κακοήθων κυττάρων μέσω μιας ποικιλίας μηχανισμών, που στοχεύουν πολλαπλές οδούς μεταγωγής σήματος και οδηγούν σε διέγερση απόπτωσης, αντιπολλαπλασιαστικά δραστηριότητα, και αντιαγγειογένεση [3]. Αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η ATO και KML001 μπορεί να στοχεύει σε μια σύνθετη τελομερών /τελομεράσης [8-10,13]. KML001 συνδέεται με τελομερικές ακολουθίες και διαβρώνει των τελομερών, με αποτέλεσμα την πρόκληση βλαβών στο DNA των τελομερών που σχετίζονται και των τελομερών τριβή. Επιπλέον, ΑΤΟ βρέθηκε να επάγει τύπου II προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, αυτοφαγία, σε κακοήθη κύτταρα γλοιώματος [11,24]. Έχουμε δείξει εδώ ότι η θεραπεία KML001 οδήγησε στο σχηματισμό του αυτοφαγικά κενοτόπια, όπως τεκμηριώνεται με ηλεκτρονική μικροσκοπία. Επιπλέον, KML001 προκάλεσε χρόνου και δοσο-εξαρτώμενη αύξηση στην LC3-ΙΙ. Χρησιμοποιώντας τον αναστολέα αυτοφαγία 3-ΜΑ, εμείς ενισχύεται ότι ο μηχανισμός του KML001 κυτταρικό θάνατο που επάγεται περιλαμβάνει αυτοφαγία. Αυτοφαγία δεν είναι μόνο υπεύθυνη για τη θανάτωση των κυττάρων από μόνη της, αλλά επίσης συμμετέχει σε ένα θανατηφόρο συμβάν σηματοδότηση που επάγει απόπτωση ή νέκρωση [25,26].

Επιπλέον, βρήκαμε ότι η ενεργοποίηση αυτοφαγία και την απόπτωση από KML001 επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση από το οξειδωτικό στρες. ROS παίζουν κεντρικό ρόλο στη διαμεσολάβηση της κυτταροτοξικότητας που προκαλείται από KML001. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι ROS παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση τόσο φυσιολογικές κυτταρικές διεργασίες και την εξέλιξη της νόσου [27-29]. Επιπλέον, έχουν συσσωρευτεί ROS γίνει γνωστό ως το βασικό ενδιάμεσο για την κυτταροτοξικότητα που επάγεται από τους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της ΑΤΟ [3].

Μία ανησυχία σχετικά με τη χρήση του αρσενικού για κλινικές εφαρμογές είναι η τοξικότητά του σε ανθρώπους. Κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η ΑΤΟ σε συγκεντρώσεις μικρότερες από 2 μΜ δεν επάγει σοβαρές παρενέργειες [30,31]. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, KML001 ήταν λιγότερο τοξική σε αρουραίους στην ίδια συγκέντρωση του ΑΤΟ [13]. Στη μελέτη μας, KML001 δεν είχε καμία αρνητική επίδραση στο σωματικό βάρος των ποντικών ξενομοσχεύματος DU145. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι KML001 μπορεί να είναι κλινικά χρήσιμη σε ασθενείς με ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη.

ότι τα περισσότερα χημειοθεραπευτικά μέσα που αποσκοπούν στην αναστολή της ανάπτυξης του ευνουχισμού ανθεκτικών καρκίνο του προστάτη, ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα έχουν αναφερθεί ότι είναι εξίσου ευαίσθητα σε ΑΤΟ επαγόμενη απόπτωση [23]. Επιπλέον, η αναστολή από ΑΤΟ ήταν εντονότερη στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη που εκφράζουν υποδοχέα ανδρογόνων σε σχέση με τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη απεμπλουτισμένο του υποδοχέα ανδρογόνων, και η αναστολή της δράσης του υποδοχέα ανδρογόνων με ΑΤΟ και από τον ανταγωνιστή του υποδοχέα ανδρογόνου, βικαλουταμίδη, ήταν προσθέτου [24]. Αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να δικαιολογήσουν την μελλοντική αξιολόγηση των επιπτώσεων KML001, μόνη της ή σε συνδυασμό με θεραπεία στέρησης ανδρογόνων, στην εξέλιξη της εξαρτώμενων από ανδρογόνα LNCaP να ανδρογόνο ανεξαρτησία σε ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικούς.

Συμπεράσματα

Έχουμε δείξει εδώ ότι η έκθεση του εξαρτώμενων από ανδρογόνα και ανεξάρτητη καρκινικά κύτταρα του προστάτη να KML001 ενεργοποιούνται τόσο απόπτωση και αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο μέσω οξειδωτικού στρες. Επιπλέον, KML001 είχε μια αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση στα κύτταρα DU145 ανδρογόνα-ανεξάρτητους in vivo.

Ευχαριστίες

KML001 παρασχέθηκαν από Komipharm International Co., Ltd., Gyeonggi-do, Κορέα.

η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις της Κορέας Υγεία Τεχνολογία R & amp? D Έργου και του Υπουργείου Υγείας & amp? Πρόνοιας (A062254 και A102059).