Αφηρημένο

Synaptonemal σύμπλοκο πρωτεΐνης 3 (SCP3), ένα μέλος της οικογένειας COR1, είναι up-ρυθμίζονται σε διάφορα καρκινικά κύτταρα? Ωστόσο, ογκογόνο δυναμικό και η κλινική σημασία του δεν έχει ακόμη χαρακτηριστεί. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την ογκογόνο ρόλο της SCP3 και η σχέση της με την φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ (ρΑΚΤ) στην αυχενική νεοπλασιών. Ο λειτουργικός ρόλος της έκφρασης SCP3 ερευνήθηκε από υπερέκφραση ή knockdown του SCP3 στην κυτταρική σειρά ποντικού ΝΙΗ3Τ3 και ανθρώπινου κολπικού καρκινικές κυτταρικές σειρές CUMC6, SiHa, CaSki και HeLa αμφότερα

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, εξετάσαμε την έκφραση SCP3 σε δείγματα όγκων από 181 καρκίνο του τραχήλου και 400 τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (CIN) ασθενείς με ανοσοϊστοχημεία και ανέλυσε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης SCP3 και κλινικοπαθολογική παράγοντες ή την επιβίωση. Η υπερέκφραση του SCP3 προωθείται μεσολαβεί η ΑΚΤ ογκογένεση τόσο

in vitro

και

in vivo

. Λειτουργικές μελέτες χρησιμοποιώντας κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 απέδειξε ότι η C-τερματική περιοχή της ανθρώπινης SCP3 είναι σημαντική για την ενεργοποίηση ΑΚΤ και ογκογόνο δυναμικό του. Υψηλή έκφραση SCP3 συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο του όγκου (

P

= 0,002) και του βαθμού του όγκου (

P

& lt? 0.001), ενώ η έκφραση SCP3 συσχετιζόταν θετικά με το επίπεδο της πρωτεΐνης ρΑΚΤ στην αυχενική νεοπλασίες . Οι χρόνοι επιβίωσης για τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας που υπερεκφράζουν τόσο SCP3 και ρΑΚΤ (διάμεσος, 134,0 μήνα,

n

= 68) ήταν σημαντικά μικρότερη από ό, τι για τους ασθενείς με χαμηλή έκφραση του είτε SCP3 ή ρΑΚΤ (161,5 μηνών, n = 108) όπως καθορίζεται από πολυπαραγοντική ανάλυση (

P

= 0,020). Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι SCP3 παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας μέσω της οδού σηματοδότησης ΑΚΤ, υποστηρίζοντας την πιθανότητα ότι SCP3 μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη νέα στόχος του καρκίνου για τη θεραπεία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Cho Η, Noh KH, Chung JY, Takikita Μ, Chung EJ, Kim BW, et al. (2014) Synaptonemal Συγκρότημα Πρωτεΐνη 3 είναι ένας προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. PLoS ONE 9 (6): e98712. doi: 10.1371 /journal.pone.0098712

Συντάκτης: Eric Asselin, Πανεπιστήμιο του Κεμπέκ στο Trois-Rivieres, Καναδάς

Ελήφθη: 28, Σεπτεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 6 Μάη 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Ιουνίου, 2014

Copyright: © 2014 Cho et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (2012R1A2A2A01007527, 2012R1A6A3A01010537, 2011-0005230, 2.011 έως 0.010.286, και 2011 με 0.007.146), την Κορέα Υγειονομική περίθαλψη τεχνολογίας Ε & amp? D Έργου (A121387, A110057 και A062260), και ερευνητικού προσωπικού επιχορηγήσεις από Yonsei University College of Medicine (3-2010-0072, 6-2011-0073 και 6-2013-0106). Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε, εν μέρει, από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Κέντρο για την έρευνα του καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν μια ποικιλία αντιγόνων, συμπεριλαμβανομένων ανώμαλη έκφραση του καρκίνου αντιγόνων /όρχεων που σχετίζονται με (CTA). CTAs περιορίζονται σε φυσιολογικούς ιστούς σε γεννητικά κύτταρα των όρχεων, με περιστασιακές έκφραση σε γυναικεία αναπαραγωγικά όργανα, και εκφράζονται σε ιστολογικά διαφορετικών τύπων κακοηθών όγκων στον άνθρωπο [1] – [4]. Η περιορισμένη όγκος πρότυπο έκφρασης του CTAs τα καθιστά μια ενδιαφέρουσα στόχο για ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις [3], [5]. Ο ρόλος της έκφρασης CTA στα καρκινικά κύτταρα παραμένει ασαφής, και ως εκ τούτου είναι ένας τομέας της ενεργού έρευνας. Ομοίως, τα αποτελέσματα μας για την έκφραση της CTAs και μοριακός μηχανισμός τους σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να παρέχει καλύτερη εικόνα ογκογένεση.

COR1 μέλη της οικογένειας, όπως η φυλοσύνδετη λεμφοκυττάρων ρυθμίζεται πρωτεΐνη (XLR), XLR σχετίζονται μειωτικής διαδικασίας ρυθμίζονται πρωτεΐνη (XMR), και synaptonemal σύμπλοκο πρωτεΐνης 3 (SCP3) είναι τυπικά CTAs [1]. Εμπλέκονται σε πρωτεΐνες που δεσμεύονται με DNA και ένα δομικό συστατικό του συμπλόκου synaptonemal, η οποία μεσολαβεί συνάψεων, το ζευγάρωμα των ομόλογων χρωμοσωμάτων κατά τη διάρκεια της μειωτικής των γεννητικά κύτταρα [6]. Αξιοσημείωτα, τα ποντίκια με έλλειψη αρσενικών για SCP3 είναι στείρα ως αποτέλεσμα της μαζικής αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου στους όρχεις κατά την διάρκεια μειωτικής πρόφασης [6], [7]. Αν και SCP3 εκφράζεται αυστηρά στους όρχεις και ωοθήκης σε φυσιολογικούς ιστούς, η έκφραση του SCP3 παρατηρείται συχνά σε διάφορους ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα όπως οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [8], [9]. Έχουμε προηγουμένως πραγματοποιήθηκε μια μικρή πιλοτική μελέτη, και διαπίστωσε ότι SCP3 εκφράζεται σε διάφορες τραχηλικού καρκινικές κυτταρικές γραμμές και ένα μικρό αριθμό του τραχήλου της μήτρας ιστών του καρκίνου [10]. Ωστόσο, καμία από αυτές τις μελέτες έχουν παράσχει πειστικές αποδείξεις για την ογκογόνο δυναμικό του SCP3.

Για να διαλευκανθεί ο ρόλος των SCP3 στην ογκογένεση, εξετάσαμε το ρόλο αυτών των μελών της ως πιθανούς ογκοπρωτεΐνες διεξάγοντας μια σειρά από

in vitro

και

in vivo

πειράματα χρησιμοποιώντας τόσο μία κυτταρική σειρά ποντικού (ΝΙΗ3Τ3) και ανθρώπινου κολπικού καρκινικές κυτταρικές σειρές (CUMC6, SiHa, CaSki, και HeLa). Εδώ, αναφέρουμε ότι η υπερέκφραση της SCP3 προκαλεί φαινοτυπική αλλάζει χαρακτηριστικό του μετασχηματισμού τόσο

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, αναλύσαμε πρότυπα SCP3 και έκφραση ρΑΚΤ με ανοσοϊστοχημεία σε δείγματα τραχηλικού ιστού από ασθενείς με τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (CIN) ή τραχηλικού καρκινώματος επεμβατική. Οι σχέσεις μεταξύ της έκφρασης πρωτεΐνης και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων /επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας αναλύθηκαν επίσης, και έδειξαν ότι η έκφραση SCP3 είναι ένας προγνωστικός παράγοντας για ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Υλικά και Μέθοδοι

Ποντίκια και κυτταρικές σειρές

έξι έως οκτώ εβδομάδων θηλυκά Balb /c Nude ποντίκια αγοράστηκαν από την Daehan Biolink (Chungbuk, Κορέα). Όλες οι διαδικασίες ζώων πραγματοποιήθηκαν υπό ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Πανεπιστήμιο της Κορέας Θεσμικό Ζώων (KUIACUC-2009-126). Το μυϊκό κυτταρική γραμμή ινοβλάστης ΝΙΗ3Τ3 και ανθρώπινου κολπικού καρκινικές κυτταρικές σειρές CUMC6, SiHa, CaSki και HeLa αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM) με την παρουσία 10 % εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 ισορροπημένη αέρα στους 37 ° C. Οι ταυτότητες των κυτταρικές σειρές επιβεβαιώθηκε με μικρή διαδοχική επανάληψη (STR) profiling με IDEXX Laboratories Inc. και χρησιμοποιήθηκαν εντός 6 μηνών για τη δοκιμή.

Ασθενείς και δείγματα όγκων

Πρωτογενής δείγματα όγκου λήφθηκαν μεταξύ 1996 και 2010, από 181 περιπτώσεις καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, 301 περιπτώσεις υψηλού βαθμού τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας (CIN), και 99 περιπτώσεις χαμηλής ποιότητας CIN που υποβάλλονται σε πρωτογενή χειρουργική επέμβαση στο Gangnam αποχώρησης Νοσοκομείο, Yonsei University College of Medicine. Όλοι οι ασθενείς έδωσαν προφορικές και γραπτές ενημερωμένη συγκατάθεση. μπλοκ παραφίνης για μερικούς από τους ασθενείς που παρέχονται από την Κορέα Γυναικολογικής Καρκίνου Τράπεζα μέσω της Bio & amp? Ιατρικό Πρόγραμμα Τεχνολογικής Ανάπτυξης του Υπουργείου Παιδείας, Επιστήμης και Τεχνολογίας, την Κορέα (https://www.kgcb.or.kr). Όλοι οι ιστοί του όγκου ιστολογικά επανεξετάζονται και μόνο δείγματα με επαρκή αφθονία των κυττάρων όγκου περιλήφθηκαν στην κατασκευή μικροσυστοιχιών ιστό. Στάσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη Διεθνή Ομοσπονδία Γυναικολογίας και Μαιευτικής (FIGO) σύστημα σταδιοποίησης. Πρωτοβάθμια επεξεργασία για διηθητικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας αποτελούνταν από ένα τύπο 3 ριζική υστερεκτομή με πυελική λεμφαδένων. Ταυτόχρονη chemoradiation με βάση την πλατίνα δόθηκε σε περιπτώσεις με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής, όπως θετικά περιθώρια εκτομή, θετικούς λεμφαδένες, ή parametrial εισβολή. Ιατρικά αρχεία αναθεωρήθηκαν προκειμένου να αποκτήσει δεδομένα όπως η ηλικία, η χειρουργική διαδικασία, ο χρόνος επιβίωσης, και την κατάσταση επιβίωσης. Ανταπόκριση στη θεραπεία αξιολογήθηκε σύμφωνα με τα Κριτήρια Αξιολόγησης απόκρισης σε συμπαγείς όγκους (RECIST? Έκδοση 1.0), είτε με αξονική τομογραφία ή μαγνητική τομογραφία [11]. Τα στοιχεία σχετικά με το μέγεθος του όγκου, τον τύπο των κυττάρων, το βαθμό του όγκου και της μετάστασης λεμφαδένα ελήφθησαν επανεξετάζοντας εκθέσεις παθολογία. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Institutional Review Boards (IRBs) του Gangnam αποχώρησης Νοσοκομείο και το Γραφείο για τα Ανθρώπινα Θέματα έρευνας στο Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH).

Κατασκευάστε της SCP3 και οι φορείς της έκφρασης διαγραφή μεταλλαγμένο

hSCP3 πλήρη και μεταλλάξεις διαγραφής δημιουργήθηκαν με μια βασιζόμενη σε PCR στρατηγική από βιβλιοθήκη ανθρώπινους όρχεις cDNA (Clontech, Moutain View, CA) με τους ακόλουθους εκκινητές: hSCP3 1 προς τα εμπρός 5′-GCTCGAGATGGTGTCCTCCGGAAAAAAG-3 ‘? hSCP3 81 προς τα εμπρός 5’-CCCTCGAGACCATGATTAACAAGGCTCTTCTT-3 ‘? hSCP3 131 προς τα εμπρός 5’-GGCTCGAGATGGATATGCAGAAAGCTGAG-3 ‘? hSCP3 80 αντίστροφη 5’-CGAATTCTCAGTCAACTCCAACTCCTTCCA-3 ‘? hSCP3 130 αντίστροφη 5’-CGAATTCTCAGAAACTGCTGAGAATAT-3 ‘? hSCP3 236 αντίστροφη 5’-CGAATTCAGTCTTATTGTACCTAACTTCTCTG-3 ‘. hSCP3 1-236 (πλήρης), 1-80, 1-130, 81-236, και 131-236 θραύσματα υποκλωνοποιήθηκαν εντός του φορέα pMSCV-puro (Clontech) στο

Xho

Ι και

EcoR

θέσεις περιορισμού. Ανασυνδυασμένη pMSCVs κωδικοποιεί SCP3 ή μεταλλάξεις διαγραφής του επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση της αλληλουχίας του DNA.

Κατασκευάστε της shSCP3 φορέων

Για να δημιουργήσετε το Scp3 μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) exoression ανθρώπινο κατασκεύασμα Scp3-shRNA ανόπτηση εμπρός 5 «GATCCGGAGAAGAATCATGATAATTCAAGAGAT TATCATGATTCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ‘(

Bam HI-

συμβατή) και αντίστροφα 5′-AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGAATCATGATAATCTCTTGAATTATCATGATTCTTCTCCG-3′ (

Hind III

-συμβατή) ολιγονουκλεοτίδια συνδέθηκαν στο

Bam

HI /

Hind

ΙΙΙ-πέψη pSilencer 3.1-H1 Puro. Ο έλεγχος shRNA που χρησιμοποιείται για αυτές τις μελέτες ήταν ένα κωδικοποιημένο DNA αλληλουχία που δεν στοχεύει κάποια προσδιορισμένη ανθρώπινη αλληλουχία κωδικοποίησης (Ambion, Austin, ΤΧ).

Western ανάλυση κηλίδος

Για κάθε πείραμα, ένα σύνολο 5 × 10

5 κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS και προστέθηκαν 0,2 mL από το Protein Extraction Λύση RIPA (Ελπίς Biotech, Daejeon, Κορέα) [50 mM Tris CI, ρΗ 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF), 0.1% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS), 1% Nonidet Ρ-40 (ΝΡ-40), 0,5 mM EDTA], επωάστηκε για 30 λεπτά σε πάγο, και στη συνέχεια αποξέστηκαν και φυγοκεντρήθηκε. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με την δοκιμασία Coomassie συν πρωτεΐνης (Pierce, Rockford, USA). 50 μα πρωτεΐνης διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό Laemmli (62,5 mM Tris /HCL ρΗ 6,8, 10% γλυκερόλη, 2% SDS, 5% μερκαπτοαιθανόλη και 0,00625% κυανό βρωμοφαινόλης), έβρασαν για 5 λεπτά, και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου SDS. Ο διαχωρισμένος πήκτωμα μεταφέρθηκε σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης σε 90 V επί 1 ώρα επί πάγου. Πρωτογενή αντισώματα έναντι φωσφο ΑΚΤ (Ser473), ΑΚΤ, και φωσφο ΕΚΚ (T202 /Y204) αγοράστηκαν από Cell Signaling (Beverly, ΜΑ) και χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. Ομοίως, τα πρωτογενή αντισώματα εναντίον διπλής ΜΑΡΚ φωσφο ρ38 (Stressgen, Βικτώρια, Καναδάς) και SCP3 (BD ​​Biosciences, San Jose, CA) χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:1000, ενώ τα αντισώματα κατά των β-ακτίνης και Flag (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:10,000 σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS) -Τ που περιέχει 5% BSA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) στους 4 ° C όλη τη νύκτα, ακολουθούμενο από 3 πλύσεις σε TBST, 5 λεπτά ανά πλύση. αντι-ποντικού IgG-HRP, αντι-κουνελιού IgG-HRP δεύτερα αντισώματα αίγας (1:5000) (Stressgen) επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές με ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL, Ελπίς Biotech). Πυκνομετρία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή εικόνας Fujifilm ΣΕΝ-4000 (Fuji, Τόκιο, Ιαπωνία) και λογισμικού πολλαπλών Gauge V3.1 απεικόνισης (Fujifilm Ιατρική συστήματα USA, Inc., Edison, NJ). Για να ποσοτικοποιηθεί η ένταση προφίλ των εικόνων ζώνη πρωτεΐνης, χρησιμοποιήσαμε Image J λογισμικό πυκνομετρία (Version 1.6, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Οι εικόνες μπάντα σαρώθηκαν σε αποχρώσεις του γκρι σε ανάλυση τουλάχιστον 600dpi και εξέφρασε ένα ποσοστό του συνολικού μεγέθους του συνόλου των μετρούμενων κορυφών. Για να υπολογίσει μια σχετική τιμή, η ένταση του κάθε δείγματος διαιρούνται με εκείνη του ελέγχου. Αριθμοί παρακάτω κηλίδες Western αναφέρονται στις σχετικές τιμές της έντασης ομαλοποιηθεί σε κάθε έλεγχο.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών δοκιμασίες

Για προσδιορισμούς κυτταρικού πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα (η = 3) αναπτύχθηκαν σε έξι φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο για 3 ημέρες. Τα ποσοστά των ζωντανών κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα Αιματοκυτταρόμετρο μετά 0,4% trypan blue χρώση. Οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν για κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Για τη δοκιμασία μαλακού άγαρ σχηματισμού αποικίας, 1 × 10

4 ΝΙΗ3Τ3 κύτταρα, κύτταρα CaSki και τα κύτταρα HeLa απλώθηκαν σε πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων ως εναιώρημα σε 2 κ.εκ. ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS και 0,4% άγαρ στο επάνω του βασικού στρώματος του 0,7% άγαρ που περιέχει 2 ml του ίδιου μέσου. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 εβδομάδες μέχρι σχηματίστηκαν αποικίες. Δύο εβδομάδες αργότερα, & gt? 2 mm αποικίες μετρήθηκαν με ένα οφθαλμικό μικρόμετρο σε ένα μικροσκόπιο. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές.

siRNA θεραπεία

Συνθετικό μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) ειδικό για πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και ΑΚΤ ποντικού αγοράστηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Οι ακόλουθες αλληλουχίες χρησιμοποιήθηκαν: GFP (μη-ειδική ελέγχου στόχων) 5′-GCAUCAAGGUGAACUUCAA-3 ‘(νοηματικό), 5′-UUGAAGUUCACCUUGAUGC-3′ (antisense)? ΑΚΤ, 5’-GACAACCGCCAUCCAGACU-3 ‘(νοηματικό), 5′-AGUCUGGAUGGCGGUUGUC-3’ (antisense). Για

in vitro

παράδοση, τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 σε ένα δοχείο 6-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με 300 pmol των συντιθέμενων siRNAs χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα siRNA επεξεργασμένα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση για ανάλυση western blot, δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων, και δοκιμασία σχηματισμού αποικιών.

σχηματισμός όγκων

Τα επιμολυσμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 (1 × 10

5 κύτταρα /ποντικό), κύτταρα CaSki (1 × 10

6 κύτταρα /ποντικό), ή κύτταρα HeLa (1 × 10

6 κύτταρα /ποντικό) εγχύθηκαν υποδορίως σε Balb /c γυμνών ποντικών. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα για 24 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου. Κάθε επιμέρους μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: όγκος του όγκου (mm

3) = [πλάτος χ μήκος

2] /2 [12]

επισήμανση ανοσοφθορισμού τομών ιστού όγκου

όγκου δείγματα ιστού σταθεροποιήθηκαν και ενσωματωμένα σε Tissue-Tek Οκτώβριο ένωση (Sakura Finetechnical, Τόκιο, Ιαπωνία) σε καλούπια. Για τις αναλύσεις ανοσοφθορισμού, 10-μm κρυοτομές τοποθετήθηκαν σε πλακίδια με πολυ-L-λυσίνη, μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, και μπλοκαρίστηκαν σε PBS με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας (NGS) (NGS /PBS). Οι τομές ιστού επωάσθηκαν με αντίσωμα ρΑΚΤ (1:100? κυτταρική σηματοδότηση) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Μετά την πλύση, οι τομές επωάστηκαν με το δευτερεύον Alexa555-συζευγμένο IgG αίγας αντι-κουνελιού (1:1000 σε NGS /PBS? Molecular Probes, Eugene, OR) και στη συνέχεια τοποθετούνται σε Fluorescent μέσο στερέωσης (Dako, Glostrup, Denmark) σε γυαλί μικροσκοπίου διαφάνειες. Όλες οι εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM 5 Pascal ομοεστιακό μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Jena, Germany). Για να ποσοτικοποιηθεί το προφίλ ένταση ρΑΚΤ φθορισμού εικόνα σε τμήματα ιστών όγκου, χρησιμοποιήσαμε το λογισμικό πυκνότητας ImageJ. Οι ιστοί του όγκου σε διαφάνειες σαρώθηκαν σε αποχρώσεις του γκρι σε ανάλυση τουλάχιστον 600dpi. περιοχές του όγκου στις σαρωμένες εικόνες επιλέχθηκαν πάνω από 10 φορές από κάθε ομάδα με το εργαλείο ελεύθερου και μετρήθηκε η μέση τιμή γκρι. Για να υπολογίσει μια σχετική τιμή, η ένταση του κάθε δείγματος διαιρέθηκε δια του ότι κενό διαφάνειες (χωρίς πρωτογενές αντίσωμα).

Tissue μικροσυστοιχιών κατασκευή

τομές ολόκληρου του προσώπου όλων των μπλοκ δότη υπέστησαν χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (η & amp? Ε) και επανεξετάζονται από έναν παθολόγο που σημειώνονται αντιπροσωπευτικές περιοχές του όγκου. Η μικροσυστοιχία ιστού (TMA) κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας ένα εγχειρίδιο Tissue arrayer ΜΤΑ-1 (Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD). Τέσσερις πυρήνες διαμέτρου 1,0 mm ιστός που αποτελείται από συμφωνημένα δείγματα όγκων και φυσιολογικά επιθηλιακά δείγματα εκχυλίζονται από επιλεγμένες περιοχές του κάθε μπλοκ δότη. Η παρουσία των ιστών όγκου στην TMA επαληθεύθηκε με Η &? Χρώση Ε. Πολλαπλές 5 μm πάχους τομές κόπηκαν με μικροτόμο και H & amp? Ε χρώση της TMA διαφάνειες εξετάστηκαν κάθε 50

ου τμήματος για την παρουσία καρκινικών κυττάρων

Η ανοσοϊστοχημεία και βαθμολόγησης

TMA. τομές αποπαραφινώθηκαν και ενυδατωμένο σε ξυλόλη και φθίνουσα κλίση λύσεις αλκοόλ. Η ενδογενής υπεροξειδάση παρεμποδίστηκε με επώαση σε 3% Η

2O

2 για 10 λεπτά. Το αντιγόνο ανάκτηση πραγματοποιήθηκε σε μια χύτρα ταχύτητας ατμού (Pascal, Dako, Carpinteria, CA) με ρυθμιστικό προθερμανθέν ανάκτηση αντιγόνου ρΗ 9 (Dako) στους 95 ° C για 10 λεπτά. Για να ελαχιστοποιηθεί η μη ειδική χρώση, οι τομές επωάστηκαν με μπλοκ πρωτεΐνη (Dako) για 20 λεπτά. Οι τομές επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-SCP3 (κλώνος 25 /SCP3, BD Biosciences, αραίωση 1:500) όλη τη νύκτα στους 4 ° C ή ένα αντίσωμα αντι-ρΑΚΤ (Cell Signaling? Αραίωση 1:200) για 120 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου . EnVision FLEX EnVision + διττό σύστημα σύνδεσης (Dako) + και χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των SCP3 και ρΑΚΤ, αντίστοιχα. Η χρώση έγινε ορατή χρησιμοποιώντας 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) και οι τομές με αιματοξυλίνη. Τέλος, τα πλακίδια καλύφθηκαν και παρατηρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός (Axioplot, Carl Zeiss, Jena, Germany). Σε αυτή τη μελέτη, πέντε συμβατικά διαφάνειες ολόκληρο τμήμα επιλέχθηκαν προσεκτικά για να επικυρώσετε την ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε για SCP3 και ρΑΚΤ. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, τα πρότυπα χρώσης ήταν καλά σε σύγκριση, και μερικά από τα σχέδια ταιριάζουν εκείνες των συμβατικών διαφάνειες από την ίδια υπόθεση. Επιπλέον, κατά τον σχεδιασμό αυτής της μελέτης, τα στρωματικά κύτταρα από τις ολόκληρα τμήματα του καρκίνου cercival επελέγησαν ως εσωτερικός θετικός έλεγχος, ενώ το πρωτογενές αντίσωμα παραλείφθηκε από τον αρνητικό έλεγχο.

SCP3 και ρΑΚΤ αποτελέσματα χρώσης βαθμολογήθηκαν με βάση (α ) ένταση [κατηγοριοποιούνται ως 0 (απούσα), 1 (ασθενής), 2 (μέτρια), ή 3 (ισχυρή)] και (β) το ποσοστό των θετικών χρωματισμένο επιθηλιακών κυττάρων [βαθμολογήθηκαν ως 0 (0% θετική), 1 (1 -25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%), ή 4 (& gt? 75%)] (Σχήμα S1). Μια συνολική βαθμολογία έκφραση της πρωτεΐνης υπολογίστηκε πολλαπλασιάζοντας τις βαθμολογίες έντασης και θετικότητα (συνολικό εύρος βαθμολογίας 0-12). Η βαθμολογία IHC στη συνέχεια διαχωρίστηκαν μεταξύ τους σε υψηλής έκφρασης (βαθμολογία SCP3 IHC της & gt? 7 και το σκορ ρΑΚΤ της & gt? 7, αντίστοιχα), καθώς και χαμηλή έκφραση (βαθμολογία IHC της ≤7 τόσο SCP3 και ρΑΚΤ). Λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη ανάλυση (ROC) χρησιμοποιήθηκε κατά τον καθορισμό των τιμών αποκοπής του SCP3 και ρΑΚΤ. Η ευαισθησία και ειδικότητα για διακρίσεις θάνατο ή ζωντανός απεικονίστηκε γραφικά σε κάθε αποτέλεσμα IHC και ιδρύθηκε τιμή cut-off για να είναι το σημείο της καμπύλης ROC, όπου το άθροισμα των ευαισθησία και η ειδικότητα ήταν μεγιστοποίηση [13]. Δύο ανεξάρτητες παθολόγων με εμπειρία στην ανάλυση μικροσυστοιχιών ιστό εξέτασε τις διαφάνειες χωρίς καμία γνώση των αντίστοιχων κλινικών δεδομένων.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 2 ανεξάρτητα πειράματα. Μη παραμετρική 1 δρόμου ή 2-way ANOVA διεξήχθη με SPSS έκδοση 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Συγκρίσεις μεταξύ των μεμονωμένων σημείων δεδομένων αξιολογήθηκαν με έλεγχος τ. Οι στατιστικές αναλύσεις των SCP3 και ρΑΚΤ έκφρασης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Mann-Whitney test και τη δοκιμή Kruskal-Wallis. Η δοκιμή μη παραμετρικό συσχέτιση Spearman χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της σχέσης μεταξύ SCP3 και ρΑΚΤ. Οι καμπύλες επιβίωσης εκτιμήθηκαν με ανάλυση Kaplan-Meier. Η δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των διαφορών της κατανομής επιβίωσης μεταξύ των ομάδων. Η πολυπαραγοντική ανάλυση με μοντέλο Cox αναλογικών κινδύνων διεξήχθη για να προσδιορίσει ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες της επιβίωσης ελεύθερης νόσου σε ρύθμιση με τις σχετικές κλινικές συμπαράγοντες όπως η ηλικία, το στάδιο της νόσου, ιστολογικός τύπος, βαθμός του όγκου, το μέγεθος του όγκου, και την κατάσταση των λεμφαδένων. Το τελικό μοντέλο επιλέχθηκε με βάση το αποτέλεσμα του μονοπαραγοντική ανάλυση καθώς και την εξέταση της κλινικής ή βιολογικής σημασίας των μεταβλητών. Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων, και

P

τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

έκτοπη έκφραση hSCP3 αυξάνει τον πολλαπλασιασμό και την ογκογονικότητα των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3

Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι η ανθρώπινη SCP3 (hSCP3) εκφράζεται σε διάφορα καρκινικά κύτταρα και ότι η έκφραση του σε ανθρώπινα δείγματα συνδέεται με ογκογένεση [8], [10]. Ωστόσο, η ογκογονική πιθανότητα των SCP3 δεν έχει επαρκώς χαρακτηριζόμενη είτε στο μοριακό ή κυτταρικό επίπεδο. Να εξετάσει κατά πόσον hSCP3 μπορεί να έχει κυψελοειδή ογκογόνο δυναμικό, έχουμε χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά ένα μη-ογκογόνο ποντικού κυτταρική σειρά ινοβλαστών ΝΙΗ3Τ3 και καθόρισε τις κυτταρικές σειρές που εκφράζουν hSCP3 χρησιμοποιώντας ένα ρετροϊικό σύστημα μεταγωγής (ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3). χωρίς κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 /ένθετο (κενός φορέας) καθορίστηκε επίσης ως έλεγχος. Η έκφραση του SCP3 πρωτεΐνης σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3 επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western (Σχήμα 1Α). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετασχηματισμένων κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 μετρήθηκε με καταμέτρηση του αριθμού των ζωντανών κυττάρων μετά από χρώση trypan blue. Σε δοκιμασίες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 1Β), κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3 παρουσίασαν ένα σημαντικά αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με ΝΙΗ3Τ3 /όχι ένθετο κυττάρων (

P

& lt? 0.005). Τα αποτελέσματα μιας προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ με τους ίδιους κυτταρικές γραμμές ήταν σύμφωνα με αυτά της δοκιμασίας πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 1C). κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3 εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερες δυνατότητες σχηματισμού αποικίας σε μαλακό άγαρ, σε σύγκριση με το ΝΙΗ3Τ3 /χωρίς ένθετο κύτταρα (

P

& lt? 0.005). Εμείς επόμενη υποδορίως hSCP3- ή καθόλου ένθετο κυττάρου που εκφράζει ΝΙΗ3Τ3 στο αριστερό πλευρό αθυμικών Balb /c γυμνά ποντίκια (Σχήμα 1 D) του. Συνεπής με μας

in vitro

δεδομένων, η ικανότητα του όγκου σχηματισμού των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 δραστικά αυξήθηκε κατά εκτοπικά εκφράζουν hSCP3 (δεν υπάρχει ένθετο

vs

. HSCP3,

P

& lt ? 0.001). Εμείς επόμενη διερευνηθεί κατά πόσον άλλα γονίδια από το μυϊκό οικογένεια COR1 όπως mXLR, mXMR και mSCP3, οι οποίες μοιράζονται πάνω από 60% ομολογία με hSCP3, θα μπορούσε να έχει παρόμοια ογκογόνο δυναμικό στο μοντέλο ΝΙΗ3Τ3 [10]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S2, έκτοπη έκφραση των μελών της οικογένειας COR1 προωθείται ουσιαστικά

in vitro

κυτταρικού πολλαπλασιασμού και μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας όπως επίσης και

in vivo

σχηματισμό όγκων σε ΝΙΗ3Τ3 μοντέλο κυτταρική γραμμή, η οποία ήταν συνεπής με εκείνη του hSCP3. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν σαφώς την ογκογόνο δυναμικό του SCP3 και άλλα μέλη COR1 σε μοντέλο ΝΙΗ3Τ3.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης του hSCP3 σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 ρετροϊικώς μεταγωγή με ένα φορέα που κωδικοποιεί pMSCV hSCP3 (ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3). ΝΙΗ3Τ3 /Δεν ένθετο κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Οι αριθμοί κάτω από τη δυτική κηλίδες αναφέρονται στις σχετικές τιμές της έντασης ομαλοποιηθεί σε κανέναν έλεγχο ένθετο. (Β)

In vitro

καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3. Τα κύτταρα μετρήθηκαν μετά τη χρώση trypan blue για τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων. (Γ) ικανότητα σχηματισμού αποικίας των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 /hSPC3 σε μαλακό άγαρ? (Αριστερά) Εκπρόσωπος εικόνες του μέσου μεγέθους των αποικιών σε κάθε ομάδα? (Δεξιά) γραφική παράσταση ράβδων που παριστάνει τον αριθμό των αποικιών με διαμέτρους μεγαλύτερες από 2 mm σε μαλακό άγαρ (γραμμή κλίμακας: 1 mm). (D) Ογκογονικότητα κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3. Balb /c γυμνά ποντίκια (η = 5) εμβολιάσθηκαν υποδορίως με 1 χ 10

5 κύτταρα /ποντικό από ΝΙΗ3Τ3 /χωρίς ένθετο ή κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την μέση ± SD.

Η

hSCP3 προωθεί την ογκογένεση μέσω ΑΚΤ οδού σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3

αναφερθεί στο παρελθόν ότι το επίπεδο ρΑΚΤ αυξάνεται σε hSCP3 εκφράζουν τραχηλικού κυτταρικές γραμμές [10] . Για την αξιολόγηση αλλαγών σε διάφορα μόρια σηματοδότησης που μπορεί να παίζει ρόλο στην παγκόσμια έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, εκτελέσαμε ανάλυση κηλίδος Western για να μετρηθούν τα επίπεδα του Ser 473 φωσφορυλιωμένου ΑΚΤ, Thr 202 /Tyr 204 φωσφορυλιωμένο ERK, και Thr 180 /Tyr 182 φωσφορυλιωμένη ρ38 ΜΑΡ κινάσης σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν hSCP3 ή καθόλου ένθετο (κενός φορέας). Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση του ρΑΚΤ ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα που έχουν υποστεί μεταγωγή με hSCP3 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 2Α). Στη συνέχεια, για να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ hSCP3 μεσολάβηση ογκογόνο δυναμικό και τη σηματοδότηση ΑΚΤ, συγκρίναμε τόσο κυτταρικού πολλαπλασιασμού και μαλακό αποικίας άγαρ σχηματισμού ικανότητα των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3 παρουσία του ελέγχου (DMSO), 10 μΜ API2 (έναν αναστολέα της ΑΚΤ ), 50 μΜ PD98059 (αναστολέας της ΜΕΚ /ΕΚΚ) ή 10 μΜ SB203580 (ένας αναστολέας του p38-ΜΑΡΚ) (Σχήμα 2Β και 2C). Η θεραπεία με PD 98059 και SB203580 δεν επηρέασε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό και την ικανότητα σχηματισμού αποικίας των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3 σε σύγκριση με εκείνη του DMSO. Αντίθετα, αντιμετωπίζεται API2 κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3 παρουσίασαν σημαντικά μειωμένη ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σχέση με τον έλεγχο DMSO-αγωγή (

P

& lt? 0.001). Σταθερά, API2 κατεργασμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3 σχηματίζονται επίσης μικρότερες αποικίες, ο αριθμός των οποίων ήταν σχεδόν 5-φορές μικρότερη από αποικίες που σχηματίζονται από DMSO-κατεργασμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3. Έτσι, είναι προφανές ότι και οι δύο τον πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό αποικιών σε αυτά τα κύτταρα εξαρτώνται από την σηματοδότηση ΑΚΤ. Για να εξαιρέσετε δυναμικό off-στόχο επιπτώσεις της API2, πραγματοποιήσαμε

in vitro

κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μαλακό πειράματα σχηματισμό αποικιών άγαρ χρησιμοποιώντας siRNA που στοχεύει ΑΚΤ (siAKT) για να μπλοκάρουν την οδό ΑΚΤ. siRNA που στοχεύει σε άσχετα GFP (GFP siRNA) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Σε συμφωνία με τα δεδομένα API2, siAKT κατεργασμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3 παρουσίασαν μειωμένο ρυθμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχήμα 2D και 2Ε) και τον αριθμό των αποικιών σε σύγκριση με τον έλεγχο siGFP κατεργασμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3 (Σχήμα 2F). Παρόμοια εξάρτηση ΑΚΤ παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν mXLR, η οποία εμφανίζεται το πιο ισχυρό ογκογόνο δυναμικό μεταξύ των μελών της οικογένειας ποντικού COR1 (Σχήμα S3). Έτσι, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι SCP3 και τα άλλα μέλη COR1 θα μπορούσε να προσδώσει ογκογόνο δυναμικό κατά ΝΙΗ3Τ3 κυττάρων μέσω μονοπατιού AKT.

(Α) ανάλυση Western blot των επιπέδων της ρΑΚΤ, pERK, και ρρ38 σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 εκτοπικά εκφράζουν hSCP3 ή καθόλου ένθετο. Οι αριθμοί κάτω από τη δυτική κηλίδες αναφέρονται στις σχετικές τιμές της έντασης ομαλοποιηθεί σε κανέναν έλεγχο ένθετο. (Β)

In vitro

καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3 αγωγή με DMSO ή API2 (αναστολέας Akt), PD98059 (αναστολέας Erk), ή SB203580 (αναστολέας της p38). (C) μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας ικανότητα των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 /hSPC3 παρουσία API2, PD98059, ή SB203580? (C, Δεξιά) Εκπρόσωπος εικόνες του μέσου μεγέθους των αποικιών σε κάθε ομάδα? (C, αριστερά) μπάρα γράφημα που δείχνει τον αριθμό των αποικιών με διαμέτρους μεγαλύτερες από 2 mm σε μαλακό άγαρ (γραμμή κλίμακας: 1 mm). (D) ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων της ρΑΚΤ σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3 επιμολυνθεί με ένα siRNA που στοχεύει GFP ή ΑΚΤ (siGFP ή siAKT) για να επιβεβαιωθεί η μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης ΑΚΤ. Οι αριθμοί κάτω από τη δυτική κηλίδες αναφέρονται στις σχετικές τιμές της έντασης ομαλοποιηθεί σε κανέναν έλεγχο ένθετο. (Ε)

In vitro

καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 /hSCP3 επιμολυσμένα με siGFP ή siAKT. (F) μαλακό άγαρ ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 /hSPC3 κατεργάζεται με siGFP ή siAKT? (Αριστερά) Εκπρόσωπος εικόνες του μέσου μεγέθους των αποικιών σε κάθε ομάδα? (Δεξιά) γραφική παράσταση ράβδων που παριστάνει τον αριθμό των αποικιών με διαμέτρους μεγαλύτερες από 2 mm σε μαλακό άγαρ (γραμμή κλίμακας: 1 mm). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την μέση ± SD.

Η

Η Ο-τερματική περιοχή του hSCP3 είναι επαρκής για να αυξήσει ρΑΚΤ επίπεδα και την ενίσχυση της ογκογένεσης

Όπως απεικονίζεται στο Σχέδιο 3Α, hSCP3 περιέχει ένα πυρηνικό εντοπισμό σήμα (NLS, υπολείμματα 88-91), Gln πλούσια (κατάλοιπα 106-139) και δύο σπειραμάτων (κατάλοιπα 131 έως 236) μοτίβα. Για τον προσδιορισμό των βασικών μοτίβων που εμπλέκονται στην hSCP3 διαμεσολαβούμενη ογκογένεση, κατασκευάσαμε τέσσερις μεταλλάξεις διαγραφής του hSCP3 περιέχουν διαφορετικά μοτίβα (Σχήμα 3Α). Η Ν-άκρα της πλήρους hSCP3 και τα μεταλλάγματα διαγραφής κολλήθηκαν με ένα επιτόπιο Flag για οπτικοποίηση με κηλίδα Western. Στη συνέχεια χαρακτηρίζεται από την έκφραση και τη λειτουργία του hSCP3 και μεταλλακτών του σε ρετροϊό-μεταδιηγερμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3. Αξιοσημείωτα, μεταλλάγματα που στερούνται την μοτίβο συσπειρωμένης σπείρας (hSCP3

1-80 και hSCP3

1-130) απέτυχε να αυξήσει φωσφορυλίωση της ΑΚΤ (Σχήμα 3Β). Αντιστρόφως, hSCP3

81-236 και hSCP3

131-236 μεταλλάγματα που περιέχουν το μοτίβο συσπειρωμένης σπείρας αυξημένα επίπεδα επιτυχώς ρΑΚΤ (Σχήμα 3Β). Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, τα κύτταρα που εκφράζουν NIH3T hSCP3

81-236 ή hSCP3

131 – 236 εμφάνισαν ένα αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων και του αριθμού των αποικιών σε σύγκριση με εκείνα που εκφράζουν hSCP3

1-80 και hSCP3

1-130 όπως επίσης και όχι ένθετο (Εικόνα 3C και 3D). Το πιο σημαντικό, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Ε-3G, παρόμοια φαινόμενα παρατηρήθηκαν επίσης

in vivo

με πειράματα ξενομοσχεύματος όγκου. Η ικανότητα του όγκου σχηματισμού των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 είχε αυξηθεί δραστικά μετά την έκτοπη έκφραση της hSCP3

81 έως 236 και hSCP3

131-236 [καμία ένθετο

vs

. hSCP3

81 – 236 (

P

& lt? 0,01) ή hSCP3

131-236 (

P

& lt? 0.003)]. Ομοίως, χρώση ανοσοφθορισμού για ρΑΚΤ αυξήθηκε σημαντικά σε ιστολογικές τομές των όγκων εκτοπικά εκφράζουν hSCP3

81-236 ή hSCP3

131 – 236 [δεν ένθετο

vs

. hSCP3

81 – 236 (

P

& lt? 0,05) ή hSCP3

131-236 (

P

& lt? 0,003)] (Σχήμα 3G). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το μοτίβο συσπειρωμένης σπείρας που περιέχει την C-τερματική περιοχή είναι η κύρια συμβολή στο ΑΚΤ εξαρτώμενη ογκογόνο δυναμικό των hSCP3.

(Α) Σχηματική από τους τομείς στους hSCP3. Κουτιά αντιπροσωπεύουν τις NLS, Gln-πλούσια, και μοτίβα τυλιγμένης σπείρας, αντίστοιχα. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων hSCP3 και μεταλλαγμάτων διαγραφής του, το Ν-άκρα των οποίων κολλήθηκαν με ένα επιτόπιο Flag για οπτικοποίηση. Οι αριθμοί κάτω από τη δυτική κηλίδες αναφέρονται στις σχετικές τιμές της έντασης ομαλοποιηθεί σε κανέναν έλεγχο ένθετο. (C) μαλακό άγαρ ικανότητα σχηματισμού αποικιών των ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν άγριου τύπου ή μεταλλάγματα εξάλειψης του hSCP3. (D)

In vitro

καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν άγριου τύπου ή μεταλλάγματα εξάλειψης του hSCP3. Τα κύτταρα μετρήθηκαν μετά τη χρώση trypan blue για τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων. (Ε)

In vivo

ογκογονικότητα των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3. Balb /c γυμνά ποντίκια (η = 5) εμβολιάσθηκαν υποδορίως με 1 χ 10

5 κύτταρα /ποντικό των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν πλήρους μήκους ή μεταλλαγμένο hSPC3. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την μέση ± SD. (F) Εκπρόσωπος εικόνες των όγκων του δέρματος (γραμμή κλίμακας: 60 χιλ). (G) Μπαρ γράφημα που παριστά την ένταση του φθορισμού ρΑΚΤ εικόνας σε τομές ιστών όγκου, ImageJ λογισμικό πυκνομετρία χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό της έντασης της εικόνας, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.