Αφηρημένο

Η ανώμαλη συσσώρευση ενδοκυτταρικής β-κατενίνης είναι ένα καλά αναγνωρισμένο χαρακτηριστικό αρκετών καρκίνων , συμπεριλαμβανομένων προστάτη, του παχέος εντέρου, και καρκίνους του ήπατος, και είναι ένας πιθανός στόχος για την ανάπτυξη αντικαρκινικών θεραπευτικών. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές προσυμπτωματικό έλεγχο μικρού μορίου για την αναγνώριση CGK062 ως αναστολέας της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης. CGK062 προωθείται πρωτεϊνική κινάση Οα (ΡΚΟα) μεσολάβηση φωσφορυλίωση της β-κατενίνης σε Ser33 /Ser37, σημειώνοντας ότι για την υποβάθμιση του πρωτεασώματος. Αυτή η μειωμένη ενδοκυτταρικά επίπεδα β-κατενίνης και συνεπώς ανταγωνίζεται β-κατενίνης μεταγραφή απόκριση (CRT). Φαρμακολογική αναστολή ή μείωση του ΡΚΟα κατήργησε φωσφορυλίωση και αποικοδόμηση της β-κατενίνης CGK062 μεσολάβηση. Επιπλέον, CGK062 καταπιεσμένη την έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν την κυκλίνη D1, c-myc, και αξίνη-2, γονίδια στόχους β-κατενίνης και έτσι ανέστειλε την ανάπτυξη των CRT-θετικών καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, η αγωγή των γυμνών ποντικών που φέρουν όγκους ξενομοσχεύματος PC3 με CGK062 σε δόσεις των 50 mg /kg και 100 mg /kg (ε.π.) κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι CGK062 εξασκεί αντικαρκινική δράση της μέσω της προώθησης ΡΚΟα μεσολάβηση β-κατενίνης φωσφορυλίωσης /αποικοδόμησης. Ως εκ τούτου, CGK062 έχει σημαντικές θεραπευτικές δυνατότητες για τη θεραπεία των καρκίνων CRT-θετική

Παράθεση:. Gwak J, Lee JH, Chung YH, Τραγούδι GY, Oh S (2012) μικρό μόριο-Based Προώθησης ΡΚΟα Μεσολαβεί β-κατενίνης Υποβάθμιση Καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRT-θετικό καρκίνο του. PLoS ONE 7 (10): e46697. doi: 10.1371 /journal.pone.0046697

Επιμέλεια: Manfred Jung, Albert-Ludwig του Πανεπιστημίου, Γερμανία

Ελήφθη: 30, Ιανουαρίου, 2012? Δεκτές: 7 Σεπτεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Οκτώβρη, 2012

Copyright: © Gwak et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη βασική επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος την Έρευνα της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (2012R1A2A2A01002941). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η /β-κατενίνης μονοπάτι Wnt, η οποία ενεργοποιείται από την αλληλεπίδραση των Wnt1, Wnt3A και Wnt8 με Frizzled (Fz) υποδοχείς και χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης υποδοχέα που σχετίζονται protein5 /6 (LRP5 /6) co υποδοχείς, παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση, και ογκογένεση [1]. Κεντρικό ρόλο σε αυτή οδός είναι το επίπεδο του κυτοσολίου β-κατενίνης, η οποία ρυθμίζει γονίδια στόχους της. Σε περίπτωση απουσίας ενός Wnt σήματος, β-κατενίνης φωσφορυλιώνεται τόσο καζεΐνης κινάση 1 (CK1) και την κινάση συνθάση γλυκογόνου-3β (GSK-3β), τα οποία σχηματίζουν ένα σύμπλοκο με αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) /Axin (σύμπλοκο καταστροφής) . Αυτό στη συνέχεια αναγνωρίζεται από F-box β-τρανσντουσίνης πρωτεΐνη που περιέχει επανάληψη (β-TrCP), ένα συστατικό του συμπλόκου ουβικιτίνης λιγάση, που έχει σαν αποτέλεσμα την αποικοδόμηση του β-κατενίνης [2] – [4]. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα από συνδέτες Wnt του ρυθμίζει αρνητικά την πολύπλοκη καταστροφή και οδηγεί σε κυτταροπλασματική σταθεροποίηση β-κατενίνης [5].

ανώμαλη ενεργοποίηση της Wnt /μονοπατιού β-κατενίνης και την επακόλουθη αυξητική ρύθμιση του β-κατενίνης μεταγραφή απόκριση (CRT) πιστεύεται ότι συμβάλλει στην ανάπτυξη και την εξέλιξη ορισμένων καρκίνων [6]. Ογκογονικής μεταλλάξεως σε β-κατενίνης ή άλλα συστατικά του συμπλόκου καταστροφής (APC ή Axin) παρατηρούνται στον καρκίνο του παχέος εντέρου, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, και του καρκίνου του προστάτη [6] – [8]. Αυτές οι μεταλλάξεις οδηγούν σε υπερβολική συσσώρευση του β-κατενίνης σε κυτταρόπλασμα και στη συνέχεια β-κατενίνης μετατοπίζεται στον πυρήνα, όπου συμπλέκεται με παράγοντες παράγοντα κύτταρο /παράγοντα ενισχυτή λεμφοκυττάρων (TCF /LEF) οικογένεια μεταγραφή Τ για την ενεργοποίηση της έκφρασης του Wnt /β-κατενίνης αποκρίνονται γονίδια, όπως

c-myc

,

κυκλίνη D1

και μεταλλοπρωτεϊνάση-7 (

ΜΜΡ-7

), που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και τη μετάσταση [9] – [11]. Η συσσώρευση β-κατενίνης παρατηρείται επίσης σε άλλους τύπους καρκίνου, όπως ο καρκίνος των ωοθηκών, μελάνωμα, καρκίνο του ενδομητρίου, μυελοβλάστωμα, και pilomatricoma [6] – [8]. Ετσι, ανώμαλη ενεργοποίηση του μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης είναι ένας δυνητικός θεραπευτικός στόχος για χημειοπρόληψη και τη θεραπεία διαφόρων καρκίνων.

Στην παρούσα μελέτη, εντοπίσαμε CGK062, η οποία αναστέλλει σημαντικά την οδό /β-κατενίνης Wnt και κυτταρικό πολλαπλασιασμό των CRT-θετικών καρκινικών κυττάρων. CGK062 προώθησε την αποικοδόμηση των ενδοκυτταρικών β-κατενίνης μέσω ΡΚΟα μεσολάβηση φωσφορυλίωσης β-κατενίνης.

Αποτελέσματα

Ταυτοποίηση CGK062 ως αναστολέας του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt

Για τον προσδιορισμό μικρού μορίου ανταγωνιστές του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα δημοσιογράφος ΗΕΚ293, που σταθερά έτρεφε TOPFlash δημοσιογράφος και τα ανθρώπινα Frizzled-1 (hFz-1) πλασμίδια. Μετά την επώαση αυτών των κυττάρων με ανταποκριτή Wnt3A-CM και κάθε ένωση, μετρήσαμε λουσιφεράση πυγολαμπίδας δραστηριότητα χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός και, στη συνέχεια, προσδιορίζονται ότι CGK062 (3- (3,4-διυδροξυ-φαινυλ) -ακρυλικό οξύ 2,2-διμεθυλ- 8-οξο-3,4-διϋδρο-2Η, 8Η-πυρανο [3,2-g] χρωμεν-3-υλ εστέρας) ως ένας αναστολέας της Wnt /β-κατενίνης οδού (Σχήμα 1Α, Β και S1). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1Γ, κατεργασία των κυττάρων ρεπόρτερ ΗΕΚ293 με διαφορετικές συγκεντρώσεις CGK062 οδήγησε σε εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στη μεταγραφή απόκριση β-κατενίνης (CRT) που είχε προκληθεί από Wnt3A-CM (IC

50 = 12,3 μΜ) . CGK062 δεν επηρέασε FOPFlash δραστηριότητα στα κύτταρα ελέγχου ΗΕΚ293 και τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα δημοσιογράφος ΗΕΚ293 (Σχήμα 1C και S2A). δραστηριότητες p53 δημοσιογράφος NF-κΒ και δεν επηρεάστηκαν από CGK062 (Σχήμα S2B και S2C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι CGK062 ισχυρά και ειδικά αναστέλλει την οδό Wnt /β-κατενίνης.

(Α) Διαλογή ενώσεων που αναστέλλουν την οδό /β-κατενίνης Wnt. Ενώσεις διαμόρφωσης TOPFlash δραστηριότητα δημοσιογράφος ελέγχθηκαν με τη χρήση των κυττάρων ρεπόρτερ ΗΕΚ293. Οι έλεγχοι δοκιμάστηκαν σε παρουσία ή απουσία Wnt3A-CM. (Β) Χημική δομή της CGK062. (Γ) Η δοσοεξαρτώμενη αναστολή της μεταγραφής απόκρισης β-κατενίνης. κύτταρα ανταποκριτού ΗΕΚ293 επωάστηκαν με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του CGK062 παρουσία Wnt3A-CM. Μετά από 15 ώρες, λουσιφεράση δραστηριότητες προσδιορίστηκαν και αναφέρθηκαν ως σχετική μονάδα φωτός (RLU) κανονικοποιημένη σε κύτταρο τίτλου. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών πειραμάτων, και οι ράβδοι υποδεικνύουν τυπικές αποκλίσεις. *,

P

& lt? 0,05, και **,

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με την Wnt3A-CM-αγωγή ομάδα ελέγχου. (D) κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών παρασκευάσθηκαν από κύτταρα ΗΕΚ293 ρεπόρτερ σε αγωγή είτε με φορέα (DMSO) ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του CGK062 παρουσία Wnt3A-CM για 15 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε κηλίδωση Western με αντίσωμα β-κατενίνης. (Ε) Ημι-ποσοτική RT-PCR για β-κατενίνης και GAPDH διεξήχθη με ολικό RNA παρασκευάζεται από κύτταρα ΗΕΚ293 ρεπόρτερ είτε όχημα (DMSO) ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του CGK062 παρουσία Wnt3A-CM για 15 ώρες. (F) κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών που παρασκευάζονται από κύτταρα ανταποκριτή ΗΕΚ293, τα οποία επωάστηκαν με όχημα (DMSO) ή CGK062 (25 μΜ) παρουσία ή απουσία Wnt3A-CM, εκτίθενται σε MG-132 (10 μΜ) επί 8 ώρες, υποβλήθηκαν να κηλίδωση Western με αντίσωμα αντι-β-κατενίνης. Στο (D) τροπ (F), για να επιβεβαιωθεί ίση φόρτωση, η κηλίδωση επανελέγχθηκε με αντίσωμα αντι-ακτίνης.

Η

Στο μονοπάτι /β-κατενίνης Wnt, CRT εξαρτάται από το επίπεδο του σε μεγάλο βαθμό ενδοκυτταρικής β-κατενίνης, η οποία ελέγχεται από ουβικιτίνη-εξαρτώμενη πρωτεόλυση [12]. Για να διερευνηθεί η επίδραση της CGK062 στην ενδοκυτταρική επίπεδο του β-κατενίνης, αναλύσαμε την ποσότητα της κυτταροπλασματικής β-κατενίνης με κηλίδωση Western με αντίσωμα αντι-β-κατενίνης σε CGK062 επεξεργασμένα ΗΕΚ293 κύτταρα ανταποκριτή. Το επίπεδο της κυτταροπλασματικής β-κατενίνης, η οποία είχε συσσωρευτεί από Wnt3A-CM, ήταν δραματικά μειωμένη με κατεργασία CGK062 (Σχήμα 1 D), η οποία είναι συνεπής με το αποτέλεσμα CRT. Για να εξεταστεί αν η μείωση του κυτταροπλασματική πρωτεΐνη β-κατενίνης με αυτή την ένωση ήταν οφείλεται στη μείωση του επιπέδου του mRNA β-κατενίνης σε κύτταρα ΗΕΚ293 ρεπόρτερ, εκτελέσαμε ημι-ποσοτική RT-PCR για να προσδιοριστεί η ποσότητα του β-κατενίνης mRNA. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1 Ε, το επίπεδο του mRNA β-κατενίνης δεν άλλαξαν σε απόκριση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις CGK062 σε κύτταρα ΗΕΚ293 ρεπόρτερ.

Στη συνέχεια, για να διερευνήσει κατά πόσον τα κάτω ρύθμιση β-κατενίνης με CGK062 διαμεσολαβείται από το πρωτεάσωμα, χρησιμοποιήσαμε το MG-132 να αναστέλλει πρωτεασώματος διαμεσολαβούμενη αποικοδόμηση πρωτεΐνης σε κύτταρα ΗΕΚ293 ρεπόρτερ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1F, CGK062 οδήγησαν σταθερά σε μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης β-κατενίνης? Ωστόσο, η προσθήκη του MG-132 κατήργησε την επίδραση της CGK062 όσον αφορά τη μείωση β-κατενίνης. χλωριούχο αμμώνιο, έναν αναστολέα λυσοσώματος, δεν επηρέασε CGK062 μεσολάβηση αποικοδόμηση β-κατενίνης (Σχήμα S3). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι CGK062 καταστέλλει την οδό /β-κατενίνης Wnt μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει την αποικοδόμηση των ενδοκυτταρικών β-κατενίνης.

CGK062 μεσολάβηση αποικοδόμηση β-κατενίνης απαιτεί β-TrCP αλλά όχι GSK-3βactivity

Δεδομένου ότι η φωσφορυλίωση της β-κατενίνης η GSK-3β και μετέπειτα σύνδεσή του με β-TrCP οδηγεί σε β-κατενίνης αποικοδόμηση [13], εξετάσαμε αν δραστηριότητα GSK-3β είναι αναγκαία για την αποικοδόμηση της β κατενίνης που προκαλείται από CGK062. Όταν τα κύτταρα ανταποκριτού ΗΕΚ293 επωάστηκαν με LiCl ή 6-bromoindirubin-3′-οξίμης (ΒΙΟ), αναστολείς της GSK-3β, CRT διεγέρθηκε (Σχήμα 2Α και 2Β), σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [14], [15]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α και 2Β, η θεραπεία με CGK062 είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή της CRT με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-β-κατενίνης με συνέπεια έδειξε ότι CGK062 οδήγησε σε ρύθμιση προς τα κάτω των ενδοκυτταρικών επιπέδων β-κατενίνης, η οποία συσσωρευμένη με LiCl (Σχήμα 2C), γεγονός που υποδηλώνει ότι CGK062 μεσολάβηση αποικοδόμηση β-κατενίνης είναι ανεξάρτητο της GSK-3β.

(Α) κύτταρα ανταποκριτή ΗΕΚ293 επωάστηκαν με CGK062 παρουσία 20 mM LiCl. (Β) κύτταρα ανταποκριτή ΗΕΚ293 επωάστηκαν με CGK062 παρουσία 0,75 μΜ ΒΙΟ. Στο (Α) και (Β), μετά από 15 ώρες, λουσιφεράση δραστηριότητες προσδιορίστηκαν και αναφέρθηκαν ως σχετική μονάδα φωτός (RLU) κανονικοποιημένη σε κύτταρο τίτλου. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών πειραμάτων, και οι ράβδοι υποδεικνύουν τυπικές αποκλίσεις. *,

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την LiCl- ή ομάδα ελέγχου ΒΙΟ-θεραπεία. (Γ) κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών παρασκευάσθηκαν από κύτταρα ΗΕΚ293 ρεπόρτερ σε αγωγή είτε με φορέα (DMSO) ή αυξανόμενες ποσότητες CGK062 παρουσία 20 mM LiCl για 15 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε κηλίδωση Western με αντίσωμα β-κατενίνης. (D) Κύτταρα ΗΕΚ293 διαμολύνθηκαν με το Δβ-TrCP πλασμίδιο έκφρασης και στη συνέχεια επωάστηκαν με είτε το όχημα (DMSO) ή CGK062 (25 μΜ) υπό την παρουσία Wnt3A CM για 15 ώρες. Κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western με β-κατενίνης και β-TrCP αντισώματα. Στο (C) και (D), οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με αντι-ακτίνης αντισώματος ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Στη συνέχεια προσδιορίζεται είτε β-TrCP είναι απαραίτητη για CGK062 επαγόμενη αποικοδόμηση ofβ-κατενίνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Δ, έκτοπη έκφραση της δεσπόζουσας-αρνητική μορφή του β-TrCP (Δβ-TrCP), το οποίο αλληλεπιδρά με φωσφορυλιωμένη β-κατενίνη, αλλά δεν είναι σε θέση να σχηματίσει ένα SCF

β-TrCP ουμπικουϊτίνης λιγάσης συγκρότημα [16] , κατήργησε την CGK062 προκαλούμενη αποικοδόμηση της β-κατενίνης. Επιπλέον, CGK062 δεν επηρέασε CRT που είχε ενεργοποιηθεί με υπερέκφραση των μεταλλακτών β-κατενίνης, S45A και S37A (Σχήμα S4). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι β-TrCP και Ν-τερματικά υπολείμματα του β-κατενίνης απαιτούνται για CGK062 μεσολάβηση αποικοδόμηση β-κατενίνης.

CGK062 επάγει ΡΚΟα μεσολάβηση φωσφορυλίωσης β-κατενίνης /αποικοδόμηση

Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι τα ενεργοποιημένα ΡΚΟα καταλύει τη φωσφορυλίωση της β-κατενίνης σε Ser33 /37 και μετέπειτα σύνδεσή του με β-TrCP οδηγεί σε β-κατενίνης αποικοδόμηση [17], [18]. Να αποκτήσουν περαιτέρω διορατικότητα στο μηχανισμό, εξετάσαμε πρώτα αν ΡΚΟα ενεργοποιείται με κατεργασία με CGK062. Δεδομένου ότι ενεργοποιείται ΡΚΟα κινείται από το κυτταρόπλασμα προς τη μεμβράνη του πλάσματος [19], απομονώσαμε κλάσματα μεμβράνης από CGK062 κατεργασμένα και -untreated κύτταρα, και μετριέται το ποσό της ΡΚΟα με ανάλυση κηλίδος Western. θεραπεία CGK062 οδήγησε στη συσσώρευση ΡΚΟα στην πλασματική μεμβράνη στα κύτταρα ΗΕΚ293 (Σχήμα 3Α). Παρατηρήσαμε επίσης CGK062 επαγόμενη μετατόπιση μεμβράνη ΡΚΟα σε ΗΕΚ293 κύτταρα με ανάλυση ανοσοφθορισμού (Σχήμα S5). Σταθερά, CGK062 ενίσχυσε την δραστικότητα κινάσης του ΡΚΟα

in vitro

, όταν χρησιμοποιήσαμε συνθετικό πεπτίδιο που περιέχει θέση φωσφορυλίωσης ΡΚΟα ως υπόστρωμα (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, BIM εγώ, ένας ειδικός αναστολέας της PKC κατάργησε την επίδραση της CGK062 (Εικόνα 3Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι CGK062 είναι ένα

καλόπιστους

ενεργοποιητή του ΡΚΟα.

(Α) κυτοσολίου και μεμβράνης κλάσματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα ΗΕΚ293 σε αγωγή με φορέα (DMSO) ή CGK062 (25 και 50 μΜ) παρουσία ή απουσία Wnt3A-CM για κηλίδωση Western με αντι-ΡΚΟα αντίσωμα. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με αντι-τουμπουλίνης ή αντι-MDR αντισώματα ως έλεγχοι κλάσμα. (Β) έδειξε πεπτίδιο επωάστηκε με καθαρισμένη ΡΚΟα και CGK062 (12,5 και 25 μΜ) ή ΒΙΜ (0,5 μΜ). Οι ποσότητες της ΑΤΡ στην αντίδραση ανιχνεύθηκαν με κιτ κινάσης Glo Δοκιμασία φθορισμού ™ (Promega). Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών πειραμάτων, και οι ράβδοι υποδεικνύουν τυπικές αποκλίσεις. *,

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου φορέα. (Γ) κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών παρασκευάσθηκαν από κύτταρα ΗΕΚ293 ρεπόρτερ σε επεξεργασία με CGK062 (25 μΜ) ή ΒΙΜ (10 μΜ) απουσία ή παρουσία Wnt3A-CM για κηλίδωση Western με αντίσωμα αντι-β-κατενίνης. (D) κύτταρα ανταποκριτή ΗΕΚ293 διαμολύνθηκαν με αρνητικό έλεγχο (NC) siRNA (40 ηΜ) ή ΡΚΟα siRNA (40 ηΜ), και στη συνέχεια επωάστηκαν με CGK062 (25 μΜ) επί 15 ώρες εν απουσία ή παρουσία Wnt3A-CM. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση στυπώματος Western με αντι-ΡΚΟα και αντισώματα αντι-β-κατενίνης. Στο (C) και (D), οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με αντίσωμα αντι-ακτίνης για να επιβεβαιωθεί ίση φόρτωση. (Ε) GST-β-κατενίνης (100 ng) επωάστηκε με καθαρισμένη ΡΚΟα και CGK062 (12,5 και 25 μΜ) ή ΒΙΜ (0,5 μΜ). Τα δείγματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με αντίσωμα αντι-φωσφο-ρ33 /37-β-κατενίνης. κύτταρα ανταποκριτή (F) ΗΕΚ293 επωάστηκαν με CGK062 (25 μΜ) και ΒΙΜ (10 μΜ) επί 15 ώρες εν απουσία ή παρουσία Wnt3A-CM. Κυτοσολικά κλάσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση στυπώματος Western με αντι-φωσφο-ρ33 /37-β-κατενίνης ή αντίσωμα αντι-β-κατενίνης. κύτταρα ανταποκριτή (G) ΗΕΚ293 διαμολύνθηκαν με αρνητικό έλεγχο (NC) siRNA (40 ηΜ) ή ΡΚΟα siRNA (40 ηΜ), και στη συνέχεια επωάστηκαν με CGK062 (25 μΜ) επί 15 ώρες εν απουσία ή παρουσία Wnt3A-CM. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση στυπώματος Western με αντισώματα αντι-β-κατενίνης και αντι-p33 /37-β-κατενίνης. Στο (F) και (G), το ίδιο ποσό της β-κατενίνης φορτώθηκε σε κάθε λωρίδα.

Η

Στη συνέχεια εξετάστηκε κατά πόσον δραστηριότητα ΡΚΟα είναι απαραίτητη για CGK062 μεσολάβηση της υποβάθμισης της β-κατενίνης. Η αναστολή της δραστικότητας ΡΚΟα χρησιμοποιώντας BIM Ι κατάργησε την κάτω ρύθμιση β-κατενίνης με CGK062 (Σχήμα 3C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η επιλεκτική εξάντληση του ενδογενούς ΡΚΟα χρήση μικρών παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) καταλυθεί επίσης την CGK062 επαγόμενη αποικοδόμηση ofβ-κατενίνης (Σχήμα 3D), υποδεικνύοντας ότι ΡΚΟα είναι υπεύθυνη για την αποδόμηση των β-κατενίνης με CGK062.

στη συνέχεια, για να ελεγχθεί αν CGK062 προάγει άμεσα ΡΚΟα μεσολάβηση φωσφορυλίωσης β-κατενίνης σε Ser33 /37, πραγματοποιήσαμε μια

in vitro δοκιμασία κινάσης

χρησιμοποιώντας βακτηριακά εκφραζόμενη β-κατενίνης και καθαρίζεται ΡΚΟα. ΡΚΟα φωσφορυλιώνεται άμεσα β-κατενίνης με την παρουσία CGK062 και ΒΙΜ Ι ανέστειλε αυτή τη φωσφορυλίωση (Σχήμα 3Ε). Εξετάσαμε επίσης το κατά πόσον CGK062 προωθεί ΡΚΟα μεσολάβηση φωσφορυλίωσης β-κατενίνης σε Ser33 /37 και Ser45 στα κύτταρα δημοσιογράφος ΗΕΚ293. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι Wnt3A-CM ανέστειλε την φωσφορυλίωση της β-κατενίνης σε Ser33 /37 και Ser45 (Σχήμα 3F, S6 και S7). Επιπλέον, CGK062 επαγόμενη τη φωσφορυλίωση της β-κατενίνης σε Ser33 /37 και Ser45 (Σχήμα 3F, S6 και S7), και Ser33 /37 φωσφορυλίωση καταργήθηκε με την προσθήκη BIM Ι (Σχήμα 3F). Σταθερά, θεραπεία CGK062 διασωθεί τη φωσφορυλίωση της β-κατενίνης σε Ser33 /37, η οποία αναστέλλεται από Wnt3A-CM, και η knockdown του ΡΚΟα κατέστειλε αισθητά CGK062 επαγόμενη Ser33 /37 φωσφορυλίωση σε κύτταρα ανταποκριτή ΗΕΚ293 (Σχήμα 3G).

CGK062 προωθεί επίσης αποικοδόμηση β-κατενίνης σε CRT-θετικά καρκινικά κύτταρα

στη συνέχεια εξετάσαμε εάν CGK062 ενεργοποιεί ΡΚΟα σε CRT-θετικά καρκινικά κύτταρα, όπως PC3 (καρκίνος του προστάτη), SNU475 (ηπάτωμα), και SW480 (καρκίνος του παχέος εντέρου). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα από τα κύτταρα ΗΕΚ293, CGK062 προώθησε την μετατόπιση του ΡΚΟα στην μεμβράνη πλάσματος σε αυτούς καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 4Α). Για να καθοριστεί εάν CGK062 αναστέλλει επίσης τη λειτουργία β-κατενίνης σε CRT-θετικά καρκινικά κύτταρα, TOPFlash πλασμίδιο επιμολύνθηκε σε CRT-θετικών καρκινικών κυττάρων που ακολουθείται από κατεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις CGK062. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, CGK062 καταστέλλεται με συνέπεια CRT σε PC3, SNU475, και τα κύτταρα SW480. Παράλληλα με αυτό το πείραμα, προσδιορίσαμε την επίδραση του CGK062 στο επίπεδο της κυτοσολικής β-κατενίνης σε αυτές τις CRT-θετικά καρκινικά κύτταρα με ανάλυση κηλίδος Western. Σταθερά, η θεραπεία της CGK062 είχε ως αποτέλεσμα την προς τα κάτω ρύθμιση της ενδοκυτταρικής επίπεδο β-κατενίνης σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο σε PC3, SNU475, και τα κύτταρα SW480 (σχήμα 4C). Βρήκαμε επίσης ότι CGK062 προώθησε τη φωσφορυλίωση της β-κατενίνης σε Ser33 /37, και αυτή η φωσφορυλίωση καταργήθηκε με BIM Ι σε κύτταρα SW480 (σχήμα S8). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CGK062 επάγει επίσης αποικοδόμηση β-κατενίνης σε CRT-θετικά καρκινικά κύτταρα.

(Α) κυτοσολίου και μεμβράνης κλάσματα παρασκευάστηκαν από PC3, SNU475, και τα κύτταρα SW480 σε αγωγή με φορέα (DMSO) ή CGK062 για κηλίδωση Western με αντι-ΡΚΟα αντίσωμα. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με αντι-τουμπουλίνης ή αντι-MDR αντισώματα ως έλεγχοι κλάσμα. (Β) PC3, SNU475, και τα κύτταρα SW480 συν-επιμολύνθηκαν με TOPFlash και pCMV-RL πλασμιδίων και επωάστηκε με CGK062 για 15 ώρες. Λουσιφεράσης μετρήθηκαν 39 ώρες μετά την επιμόλυνση και αναφέρονται ως σχετική μονάδα φωτός (RLU) κανονικοποιημένη σε

Renilla

λουσιφεράσης δραστηριότητες. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών πειραμάτων, και οι ράβδοι υποδεικνύουν τυπικές αποκλίσεις. *,

P

& lt? 0,05, και **,

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου φορέα. (Γ) κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών παρασκευάσθηκαν από PC3, SNU475, και τα κύτταρα SW480 σε επεξεργασία με το όχημα (DMSO) ή CGK062 για 15 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε κηλίδωση Western με αντίσωμα β-κατενίνης. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με αντι-ακτίνης αντισώματος για να επιβεβαιώσετε ίση φόρτωση.

Η

CGK062 καταστέλλει την έκφραση της β-κατενίνης που εξαρτώνται από τα γονίδια

Για να προσδιορίσετε αν CGK062 επηρεάζει την έκφραση της β- κατενίνης εξαρτώμενη γονιδίων, η δραστικότητα προαγωγέα του

κυκλίνη D1

, το οποίο είναι ένα γνωστό γονίδιο β-κατενίνης εξαρτώμενη, αξιολογήθηκε. Ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή που περιέχει την

κυκλίνη D1

υποκινητή, το οποίο περιέχει έναν απαντητικό περιοχή β-κατενίνης /TCF-4, επιμολύνθηκε σε PC3, SNU475, και τα κύτταρα SW480 ακολουθούμενη από επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CGK062. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α,

κυκλίνης D1

δραστικότητα προαγωγού καταστέλλεται από CGK062 σε αυτές τις CRT-θετικά καρκινικά κύτταρα. Αξιολογήσαμε επίσης το επίπεδο της πρωτεΐνης της κυκλίνης D1 σε CGK062 επεξεργασμένο CRT-θετικά καρκινικά κύτταρα. Συνεπής με αποτέλεσμα μας για το

κυκλίνη D1

υποκινητή, μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στην κυκλίνη D1 πρωτεϊνική έκφραση παρατηρήθηκε σε απάντηση CGK062 (Σχήμα 5Β) σε PC3, SNU475, και τα κύτταρα SW480. Επιπλέον, η έκφραση του

c-myc

και

αξίνης-2

, με έδρα κατάντη στόχοι της β-κατενίνης [9], ήταν επίσης σημαντικά μειωμένη σε αυτά τα CRT-θετικά καρκινικά κύτταρα μετά από επώαση με CGK062 (Σχήμα 5Β). Υπό αυτές τις συνθήκες, το επίπεδο ΡΚΟα δεν άλλαξε σε απόκριση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις CGK062 (Σχήμα S9).

(Α) PC3, SNU475, και τα κύτταρα SW480 συν-επιμολύνθηκαν με κυκλίνη D1-RL και pSV40- FL, και στη συνέχεια επωάστηκαν με δεικνυόμενες ποσότητες CGK062 για 15 ώρες. Λουσιφεράσης μετρήθηκαν 39 ώρες μετά την επιμόλυνση. δράση υποκινητή Κυκλίνη D1 αναφέρεται ως σχετική μονάδα φωτός (RLU) κανονικοποιημένη σε δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών πειραμάτων, και οι ράβδοι υποδεικνύουν τυπικές αποκλίσεις. *,

P

& lt? 0,05, και **,

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου φορέα. (Β) PC3, SNU475, και τα κύτταρα SW480 επωάστηκαν με το όχημα (DMSO) ή CGK062 για 15 ώρες και στη συνέχεια τα κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν για κηλίδωση Western με αντι-αξίνη, αντι-κυκλίνης D1 και αντι-myc αντισώματα. Για να επιβεβαιωθεί ίση φόρτωση, οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με αντίσωμα αντι-ακτίνης.

Η

CGK062 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των CRT-θετικών καρκινικών κυττάρων

in vitro

και

in vivo

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η διακοπή της λειτουργίας β-κατενίνης με αντινόημα, siRNA, ή εκκρίνεται στρατηγικές ανταγωνιστής Wnt έχει δειχθεί ότι αναστέλλουν ειδικά την ανάπτυξη των CRT-θετικών καρκινικών κυττάρων [20] – [22] . Δεδομένου ότι CGK062 προώθησε την αποικοδόμηση των ενδοκυτταρικών β-κατενίνης, υποθέσαμε ότι CGK062 επίσης καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των CRT-θετικών καρκινικών κυττάρων. Για να διερευνηθεί αυτή η υπόθεση, αξιολογήσαμε την επίδραση της CGK062 στην ανάπτυξη των διαφόρων CRT-θετικών καρκινικών κυττάρων. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1 και στο Σχήμα S10, CGK062 ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη των CRT-θετικού καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα (DLD-1, SW480, HCT15, SNU475, και τα κύτταρα PC3) με IC

50 τιμές από 1,62 μΜ έως 18,60 μΜ. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι CGK062 αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του CRT-θετικών καρκινικών κυττάρων.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η αντικαρκινική δράση του CGK062

in vivo

, αθυμικούς γυμνούς ποντικούς που φέρουν εγκατεστημένος sc PC3 όγκοι ξενομοσχεύματος υποβλήθηκαν σε αγωγή καθημερινά με ε.π. χορήγηση CGK062 για 5 εβδομάδες στους 50 και 100 mg /kg. Σε σύγκριση με το όχημα (έλεγχος), η θεραπεία των ποντικών με CGK062 ανάπτυξη του όγκου ανέστειλε σημαντικά PC3 (Εικόνα 6Α). Μια δόση των 100 mg /kg CGK062 επάγεται σχεδόν πλήρη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου. Ακόμη και στην δόση των 50 mg /kg, CGK062 ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου κατά ~ 70% σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Όλοι οι ποντικοί ανέχθηκαν την θεραπεία χωρίς σημαντική απώλεια σωματικού βάρους (Σχήμα 6Β).

(Α και Β) CGK062 αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη ξενομοσχεύματος όγκου

in vivo

. Υποδόρια ξενομοσχεύματα όγκων PC3 καθορίστηκαν και θεραπείες χορηγήθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. (Α), μέσα μεγέθη όγκου (n = 6) (Β), η μέση μέση μεταβολές βάρους σώματος κατά τη διάρκεια της θεραπείας. *,

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου του οχήματος

Η

Συζήτηση

Η ανώμαλη πάνω ρύθμιση της ενδοκυτταρικής β-κατενίνης εμπλέκεται στην ανάπτυξη. αρκετών καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, ορθοκολικό καρκίνο, και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [6] – [8]. Στην έκθεση αυτή, χρησιμοποιήσαμε ένα διαλογή με βάση κύτταρα για τον εντοπισμό CGK062 ως ένας ισχυρός αναστολέας του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt. CGK062 παρέχεται ένα σημαντικό θεραπευτικό όφελος σε σχέση με την κατά του όγκου δραστικότητα σε διάφορες μεταγραφή απόκριση β-κατενίνης (CRT) -θετικό καρκινικά κύτταρα, όπως τα καρκινικά κύτταρα κόλου (SW480, DLD-1, και HCT15), ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (SNU475), ορμόνη-πυρίμαχων καρκινικά κύτταρα προστάτη (PC3).

CGK062 ενεργοποιούμενη ΡΚΟα καταλύεται τη φωσφορυλίωση της β-κατενίνης σε Ser33 /Ser37, και με τον τρόπο αυτό μειώνεται το ενδοκυτταρικό επίπεδο β-κατενίνης με αποικοδόμηση β-TrCP εξαρτώμενη πρωτεασώματος. Επιπλέον, η φαρμακολογική αναστολή και ΡΚΟα siRNA ακύρωσε CGK062 επαγόμενη β-κατενίνης φωσφορυλίωσης /αποικοδόμησης, υποδεικνύοντας ότι ΡΚΟα είναι υπεύθυνη για CGK062 διαμεσολαβούμενη αναστολή της οδού /β-κατενίνης Wnt. Τα αποτελέσματα αρκετών μελετών, συμπεριλαμβανομένων ορισμένων διεξήχθη προηγουμένως στο εργαστήριο μας, προτείνουν ένα ρόλο κλειδί για ΡΚΟα στη ρύθμιση της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης. Wnt5a εμπλέκεται στην κινητοποίηση του ενδοκυτταρικού Ca

2+, την επακόλουθη ενεργοποίηση των ΡΚΟα, και η αναστολή της οδού Wnt /β-κατενίνης [23], [24]. Orford

et al.

[25] ανέφεραν ότι οι αναστολείς PKC προκαλεί συσσώρευση του β-κατενίνης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού. Πρόσφατα, το ρετινοϊκό οξύ που σχετίζονται ορφανός πυρηνικός υποδοχέας α (ROR α) δείχθηκε να εξασθενεί Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση σε καρκίνο του παχέος εντέρου με διέγερση ΡΚΟα-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση [26]. Προηγουμένως, δείξαμε ότι ΡΚΟα ρυθμίζει αρνητικά Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση σε κύτταρα ΗΕΚ293, τα οποία έχουν φυσιολογική λειτουργία Wnt /β-κατενίνης μονοπάτι [17] και ότι ΡΚΟα ρυθμίζει το ενδοκυτταρικό επίπεδο β-κατενίνης σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [18]. Η παρούσα μελέτη επεκτείνει αυτά τα προηγούμενα ευρήματα δείχνοντας ότι η ενεργοποίηση του ΡΚΟα με μια νέα αγωνιστή, CGK062, προωθεί αποικοδόμηση β-κατενίνης σε κυτταρικές σειρές τρία καρκίνος – PC3 (καρκίνος του προστάτη), SNU475 (ηπάτωμα), και SW480 (καρκίνος του παχέος εντέρου) – που εμφανίζουν παρεκκλίνουσα πάνω ρύθμιση της ενδοκυτταρικής επίπεδο β-κατενίνης.

έχουν μικρού μορίου αναστολείς που ανταγωνίζονται CRT ανακαλυφθεί με διαλογή υψηλής απόδοσης. Μικρά μόρια που μπλοκάρουν τη σύνδεση μεταξύ TCF4 και β-κατενίνης βλάπτουν β-κατενίνης που εξαρτώνται από δραστηριότητες, όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η επικάλυψη του άξονα εμβρυϊκών ραχιαίων σε

Xenopus laevis

[27]. Ένα άλλο μικρό μόριο, ICG-001, το οποίο παρεμποδίζει την αλληλεπίδραση μεταξύ β-κατενίνης και της πρωτεΐνης στοιχείο πρόσδεσης κυκλική απόκριση ΑΜΡ (CBP), ειδικώς διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [28]. Δύο άλλα μικρά μόρια, IWR-3 και XAV939, δείχνονται πρόσφατα να διεγείρουν την αποικοδόμηση β-κατενίνης με σταθεροποίηση αξίνης και έτσι παρεμποδίζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων DLD-1 κόλον, τα οποία μεταφέρουν μια μετάλλαξη στο [29], [30 APC ]. Σε αντίθεση με προηγουμένως μελετηθεί μικρά μόρια, CGK062 μειώνεται το ενδοκυτταρικό επίπεδο της β-κατενίνης μέσω ΡΚΟα μεσολάβηση φωσφορυλίωσης /αποικοδόμησης. Αξίζει να σημειωθεί, ότι ήταν σε θέση να προωθήσει αποικοδόμηση β-κατενίνης σε κύτταρα ηπατώματος SNU475, τα οποία φέρουν ένα μετάλλαξη αξίνη, καθώς επίσης και σε καρκίνο του παχέος εντέρου SW480 κυττάρων με μετάλλαξη APC, και κατέστειλε την ανάπτυξη του CRT-θετικών καρκινικών κυττάρων. CGK062 κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των όγκων PC3 του προστάτη σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μας

in vitro

αναλύσεις.

Εν κατακλείδι, εντοπίσαμε CGK062 που προωθεί ΡΚΟα μεσολάβηση β- φωσφορυλίωση κατενίνης και της υποβάθμισης του. CGK062 καταπιεσμένη την έκφραση των γονιδίων στόχων του, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που κωδικοποιεί κυκλίνη D1, c-myc και αξίνη-2, καταστέλλοντας έτσι την ανάπτυξη του όγκου

in vitro

και

in vivo

. Στο σύνολό τους, CGK062 αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη υποψήφια θεραπεία των καρκίνων CRT-θετική.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων, τα πλασμίδια, επιμόλυνση και λουσιφεράσης

δοκιμασία

ΗΕΚ293, PC- 3, SNU475, DLD-1, HCT15, SW480, και Wnt3A-κυττάρων που εκκρίνουν L ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 120 μg /ml πενικιλλίνη, και 200 ​​μg /ml στρεπτομυκίνη. Wnt3A-ρυθμισμένο μέσο (Wnt3A-CM) παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Ο δημοσιογράφος και κυτταρική γραμμή ΗΕΚ293 ιδρύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Τα πλασμίδια δημοσιογράφος pTOPFlash και pFOPFlash λήφθηκαν από Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). Το κυρίαρχο αρνητικό β-TrCP (Δβ-TrCP) πλασμίδιο έκφρασης ήταν ένα δώρο από τον M. Davis (Hebrew University-Hadassah Medical School, Ισραήλ). pCMV-RL και pSV-FL πλασμίδια αγοράστηκαν από Promega. PKC siRNA σχεδιάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δοκιμασία λουσιφεράσης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κιτ διπλής λουσιφεράσης Δοκιμασία (Promega, Madison, WI, USA).

Διαλογή για έναν αναστολέα μικρού μορίου του Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτήσεως

Ο ανταποκριτής ΗΕΚ293 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 15000 κύτταρα ανά φρεάτιο εις διπλούν και αναπτύχθηκαν για 24 ώρες. Wnt3A-CM προστέθηκε, και στη συνέχεια οι ενώσεις (800 ενώσεις) που περιλαμβάνουν κουμαρίνες, φλαβονοειδή, ναφθοκινόνες, και τερπενοειδή προστέθηκαν στα φρεάτια σε τελική συγκέντρωση 30 μΜ. Μετά από 15 ώρες, οι πλάκες αναλύθηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας και τη βιωσιμότητα των κυττάρων.

Παρασκευή του κλάσματος μεμβράνης

κύτταρα που αναπτύσσονται σε δίσκους καλλιέργειας των 100 mm πλύθηκαν με παγωμένο PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια εναιωρούνται σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης παγωμένου (20 mM Tris (ρΗ 7,5), 0,5 mM EDTA, και 0,5 mM EGTA)? ομογενοποιούνται χρησιμοποιώντας μία σύριγγα (26G)? και επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά. Το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε στα 13,400 χ

g

για 2 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε στα 100,000 χ

g

για 30 λεπτά στους 4 ° C σε ένα στροφέα 100Ti (Beckman, USA). Το σφαιρίδιο αιωρήθηκε σε ρυθμιστικό εκχύλισης που περιέχει 0.5% (β /ο) Triton Χ-100.

κηλίδωση Western

Το κυτοσολικό κλάσμα παρασκευάζεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε ένα πήκτωμα βαθμίδωσης 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα και ανιχνεύτηκαν με αντι-β-κατενίνης (BD Transduction Laboratories, Lexington, ΚΥ, ΗΠΑ), αντι-φωσφο-β-κατενίνης (Ser33 /Ser37 /Thr41) (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA), αντι-φωσφο-β-κατενίνης (Ser45) (Cell Signaling Technology), αντι-κυκλίνης D1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), αντι-myc (Santa Cruz Biotechnology), αντι-ΡΚΟα (BD Transduction Laboratories), αντι-αξίνη (BD Transduction Laboratories), αντι-β-TrCP (Santa Cruz Biotechnology), αντι-MDR1 (Santa Cruz Biotechnology) και αντι-ακτίνης αντισώματα (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA) . Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με ραφανιδική υπεροξειδάση-συζευγμένο IgG αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG (Santa Cruz Biotechnology) και κατέστη ορατή χρησιμοποιώντας το σύστημα ECL (Santa Cruz Biotechnology).

εκχύλιση RNA και ημι-ποσοτική RT -PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. σύνθεση cDNA, αντίστροφη μεταγραφή, και PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Το ενισχυμένο DNA διαχωρίστηκε σε πηκτές αγαρόζης 2% και βάφτηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο.

ανοσοφθορισμού ανάλυση

HEK293cells καλλιεργήθηκαν σε πλακίδια θαλάμου γυαλί και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή CGK062 για 15 ώρες. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά σε 0.3% Triton Χ-100, και αποκλείστηκε σε 4% αλβουμίνη βόειου ορού για 1 ώρα.