Αφηρημένο

Ιστορικό και Στόχοι

παράγοντα μεταγραφής 3 (

TCF3

) εμπλέκει Wnt οδό σηματοδότησης και ρυθμίζει την έκφραση Ε-καδερίνης, η οποία εμπλέκεται στην επιθετικότητα των όγκων. Η μελέτη αυτή έχει ως στόχο να διερευνήσει το ρόλο του

TCF3

στην πρόβλεψη πρόγνωση των ασθενών με τη φάση ΙΙ και ΙΙΙ καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC).

Μέθοδοι

Real-Time ποσοτική PCR ήταν πραγματοποιήθηκε σε 64 φρέσκα ιστούς CRC και 6 κυτταρικές σειρές για να εξετάσει

TCF3

έκφραση του mRNA. δυναμική έκφραση πρωτεΐνης TCF3 ανιχνεύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία του 118 δειγμάτων εγκλεισμένοι σε παραφίνη, και η κλινική σημασία του TCF3 εκτιμήθηκε με κλινική συσχέτιση και Kaplan-Meier αναλύσεις. Παρεκκλίνουσα υπομεθυλίωση του

TCF3

υποστηρικτής διερευνήθηκε επίσης με τη χρήση θειώδους αλληλουχίας και μεθυλίωσης ειδική PCR.

Αποτελέσματα

Η up-ρύθμιση του

TCF3

mRNA ήταν συχνά ανιχνεύεται τόσο σε CRC ιστούς με υποτροπή και μετάσταση κυτταρικές γραμμές που παράγονται. Το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης TCF3 συσχετίστηκε σημαντικά με ιστολογικό τύπο (

P

= 0,038) και ο χρόνος επιβίωσης ελεύθερης νόσου (

P

= 0,002). Υψηλότερη έκφραση TCF3 υποδεικνύεται κακή προγνωστική έκβαση (

P

& lt? 0,05, δοκιμασία log-rank). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε επίσης ισχυρή έκφραση της πρωτεΐνης TCF3 και περινευρικό εισβολή ήταν ανεξάρτητοι δυσμενείς prognosticators στο CRC (

P

= 0.010, 0.000). Επιπλέον, έγινε έδειξε ότι η υπομεθυλίωση υποστηρικτής του

TCF3

συνδέεται με up-έκφρασή της.

Συμπεράσματα

Αυτή η μελέτη υπογράμμισε την προγνωστική αξία του

TCF3

στο στάδιο ΙΙ και ΙΙΙ CRC. Το up-ρύθμιση του

TCF3

, η οποία προκαλείται κυρίως από υπομεθυλίωση υποκινητής, είναι ένας από τους μοριακούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την εξέλιξη της CRC

Παράθεση:. Li C, Cai S, Wang Χ, Jiang Z (2014) υπομεθυλίωση-Associated Up-κανονισμός του

TCF3

Έκφραση και την επανάληψη στο στάδιο ΙΙ και ΙΙΙ του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (11): e112005. doi: 10.1371 /journal.pone.0112005

Επιμέλεια: Αντώνης WI. Lo, Queen Mary Hospital, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 10 Απρ 2014? Αποδεκτές: 11 Οκτώβρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Νοεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι, για τις εγκεκριμένες λόγους, ορισμένοι περιορισμοί πρόσβασης ισχύει για τα στοιχεία στα οποία βασίστηκαν τα συμπεράσματα. Τα δεδομένα είναι διαθέσιμα από την Σαγκάη Cancer Center Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημίου Fudan για τους ερευνητές που πληρούν τα κριτήρια για την πρόσβαση σε εμπιστευτικά δεδομένα. Οι αιτήσεις για πρόσβαση στα δεδομένα μπορεί να αποσταλεί στον καθηγητή Sanjun Cai. (Email: [email protected])

Χρηματοδότηση: Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από Μεταδιδακτορικός Ίδρυμα Επιστημών της επαρχίας Heilongjiang (LRB87859), Ιατρικό Επιστημονικό Ίδρυμα Ερευνών της επαρχίας Heilongjiang (2011-144), το έργο Εγκαίνια Βασικά Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του Heilongjiang Ιδρυμάτων Ανώτατης Εκπαίδευσης και Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Heilongjiang (H201332). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μία από τις τρεις σημαντικότερες αιτίες θανάτου από καρκίνο σχετίζονται μεταξύ σε όλο τον κόσμο [1]. Σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ όγκων μαζί αντιπροσωπεύουν περίπου το 70% των ασθενών με CRC [2]. Περιφερειακή μετάσταση λεμφαδένα είναι ένα από τα πιο ισχυρά δείκτες της επιθετικότητας του ΚΕΣ και βοηθά στην πρόβλεψη της κλινικής έκβασης. Ωστόσο, το ένα τρίτο των ασθενών CRC χωρίς ιστολογική απόδειξη της συμμετοχής των λεμφαδένων πεθαίνουν μέσα σε πέντε χρόνια μετά την επέμβαση από μακρινή μετάσταση ή τοπικής υποτροπής, η οποία πρότεινε ότι το κομβικό κατάσταση δεν μπορεί να προβλέψει την κλινική πορεία της CRC επαρκώς [3]. Επομένως, είναι σημαντικό να προσδιοριστούν προγνωστικούς παράγοντες πρόβλεψης κακή έκβαση και την καθοδήγηση της θεραπείας στο στάδιο ΙΙ και ΙΙΙ CRC.

παράγοντα Μεταγραφή 3 γονίδιο (

TCF3

) βρισκόταν στο 19p13.3 χρωμοσωμική μπάντα.

TCF3

είναι ένα πανταχού εκφραζόμενη ρυθμιστής μεταγραφής και κωδικοποιεί δύο βασικές έλικας-βρόχου-έλικας (HLH) παράγοντες μεταγραφής, Ε12 και Ε47 [4]. Αυτές οι δύο πρωτεΐνες χαρακτηρίζονται από ευρύ σχήμα έκφρασης και την ικανότητα να δεσμεύει το DNA [5] – [8]. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει το αναδυόμενο ρόλο του

TCF3

σε πειραματικούς όγκους. Η υπερέκφραση του TCF3 έχει ανιχνευθεί σε καρκίνο του προστάτη [10], [11], γαστρικού καρκίνου [12] και νεφρικό καρκίνο [13] CRC [9],. Ως μεταγραφικός καταστολέας της Ε-καδερίνης,

TCF3

εμπλέκεται στην επιθηλιακή προς μεσεγχυματικά μετάβασης και μπορεί να συνδέεται με την επιθετικότητα του όγκου [14]. Η αύξηση της μεταγραφικής δραστηριότητας του

TCF /β-κατενίνης

πολύπλοκη είναι η έναρξη της εκδήλωσης στο πιο παχέος σποραδικές όγκους [15]. Παρά το γεγονός ότι σημαντικές μελέτες είχαν έδειξε

TCF3

ήταν προάγει την ανάπτυξη όγκων, ο ρόλος του στην εξέλιξη του καρκίνου παραμένει αμφιλεγόμενη [16], [17]. Patel

et al

. υπό τον όρο τρία σενάρια να αποδείξει τα πιθανά

TCF3

ρυθμιζόμενων μηχανισμών σε μοριακό επίπεδο [11].

Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι να αξιολογηθεί η κλινική σημασία του

TCF3

στην ανθρώπινο CRC, και να διερευνήσει τους μηχανισμούς που μεσολαβούν υπερέκφραση του

TCF3

, η οποία θα βοηθήσει στην πρώιμη αναγνώριση της επανάληψης υποσύνολο υψηλού κινδύνου των ασθενών με τη φάση ΙΙ και ΙΙΙ CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα ιστών

Από Απρίλιος 2000-Νοέμβριος 2004, 64 φρέσκα ιστούς CRC, 36 με υποτροπή και 28 χωρίς υποτροπή, συλλέχθηκαν αμέσως μετά τη λειτουργία στο Πανεπιστήμιο Fudan της Σαγκάης Κέντρο Καρκίνου (Σαγκάη, Κίνα ). Χαρακτηριστικά των δειγμάτων έδειξε στον πίνακα 1. Σύνολο 118 παραφίνη-ενσωματωμένες δείγματα, 78 με υποτροπή και 40 χωρίς υποτροπή, συλλέχθηκαν αναδρομικά από αρχειακό υλικό αποθηκεύεται στο τμήμα παθολογίας στο Πανεπιστήμιο Fudan της Σαγκάης Cancer Center (Σαγκάη, Κίνα) μεταξύ Φεβρουάριο 1993 και το Μάρτιο του 2004, αυτά τα δείγματα ήταν από διαφορετικούς ασθενείς από εκείνα που χρησιμοποιούνται για mRNA ανάλυση (Πίνακας 2).

Η

Όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν είχαν ληφθεί από ζωτικής σημασίας πυρήνες των ιστοπαθολογικά επιβεβαίωσε καρκίνων στην πρωτοβάθμια χειρουργική επέμβαση σε ασθενείς που δεν υφίστανται καμία τοπική ή συστηματική αγωγή πριν από τη λειτουργία. δείγματα όγκων εξετάστηκαν από τουλάχιστον 2 έμπειροι παθολόγους, και το στάδιο του όγκου ανατέθηκε βάσει του συστήματος της Διεθνούς Ένωσης Καρκίνου κατά. Δεν στάδιο ΙΙ, αλλά όλα σταδίου ΙΙΙ ασθενείς έλαβαν μετεγχειρητική χημειοθεραπεία, αλλά κανένας ασθενής δεν έλαβαν ακτινοθεραπεία.

ελεύθερη νόσου επιβίωση ορίστηκε ως ο χρόνος που έχει παρέλθει από την ημερομηνία της αρχικής διάγνωσης με την εμφάνιση των τοπικών υποτροπή ή μετάσταση μακρινό . Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς, καθώς και το πρωτόκολλο της έρευνας εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας στο Πανεπιστήμιο Fudan της Σαγκάης Κέντρο Καρκίνου.

Οι κυτταρικές σειρές

Έξι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC ελήφθησαν από την Αμερικανική Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Τρεις είναι οι κύριοι-που προέρχεται από όγκο γραμμές (SW480, Caco-2, HCT116), 2 είναι λεμφαδένες μεταστάσεις που προέρχονται από τις γραμμές (SW620, LoVo), και 1 είναι το κοιλιακό υδρωπικία-μεταστάσεων προερχόμενων γραμμής (ΟοΙο205). Οι κυτταρικές σειρές LoVo και ΟοΙο205 καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640, ενώ Caco-2 και HCT116 καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο Eagle και μεσαίου 5a του McCoy τροποποιημένα, αντίστοιχα. Τόσο SW480 και SW620 καλλιεργήθηκαν σε μέσον L-15 Leibovitz του. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου μόσχου (GIBCO, USA), πενικιλλίνη 100 IU /ml, και στρεπτομυκίνη 100 μg /ml στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2- υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Η μέθοδος καλλιέργειας κυττάρων που περιγράφηκε προηγουμένως [18].

ανάλυση mRNA με qPCR

Ολικό RNA απομονώθηκε με μία RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Dnase. Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, συντέθηκαν cDNA με ολιγο-dT εκκινητές (Promega, Madison, WI). Η

TCF3

-ειδικών εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5′-CTCGAGAAGAACAGGCCAAG-3 ‘(ForWord) και 5′-GGGGCAGGTACTGAACACAT-3’ (αντίστροφο). Αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (

GAPDH

) χρησίμευσε ως έλεγχος για ομαλοποίηση της γονιδιακής έκφρασης και ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ (αντίστροφο) . Η qPCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το προεπιλεγμένο κύκλο PCR σε ένα σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ΑΒΙ Prism 7900HT (Applied Biosystems), και ενισχυμένο cDNA ανιχνεύθηκε με SYBR Green Ι χρωστικής (Qiagen GmbH, Germany). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ΑΒΙ Prism 7900 SDS λογισμικό (Sequence Detection System 2.0? Applied Biosystems). Αναλογίες των εντάσεων του γονιδίου στόχου και

GAPDH

σήματα χρησιμοποιήθηκαν ως ένα σχετικό μέτρο του επιπέδου έκφρασης των γονιδίων στόχων. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Η ανοσοϊστοχημεία

Αρχειακές αιματοξυλίνη και διαφάνειες ηωσίνη-βάφονται εξετάστηκαν από 2 έμπειρους Παθολόγοι σε accordence με την ταξινόμηση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας το 2000. εφαρμόστηκε ένα 3-κλιμακωτή ιστολογική σύστημα ταξινόμησης. Το στάδιο TNM αξιολογήθηκε σύμφωνα με τη Διεθνή Ένωση το 2002 κατά την ταξινόμηση του καρκίνου.

αντιανθρώπινο Μια κουνελιού πολυκλωνικό

TCF3

αντίσωμα (αραίωση 1:400) λήφθηκε από Abcam (Cambridge, UK). Στη μελέτη, 4-μm τμήματα από αρχειακά μπλοκ παραφίνης αποπαραφινοποιήθηκαν και θερμάνθηκαν δύο φορές για 10 λεπτά το καθένα σε ένα φούρνο μικροκυμάτων (500 W) πριν από την έκθεση προς το πρώτο αντίσωμα. Βαφή ανοσοπεροξειδάσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας τη μέθοδο EnVision 2 βημάτων (ϋΑΚΟ, Glostrup, Denmark) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και οπτικοποιούνται με τετραχλωριούχο 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (Sigma, St Louis, ΜΟ).

κυτταρόπλασμα και πυρηνική χρώση μετρήθηκαν για αυτό το αντίσωμα. Θετικά κύτταρα μετρήθηκαν από 2 παθολόγους που ήταν τυφλοί στην κλινική έκβαση. Για κλινικοπαθολογοανατομικές συσχέτιση, χρησιμοποιήσαμε ένα 4-κλιμακωτό σύστημα βαθμολόγησης (αρνητική σε 3+), η οποία έλαβε υπόψη το ποσοστό των θετικών κυττάρων και την ένταση χρώσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Η λεπτομερής προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει μια βαθμολογία για κάθε πυρήνα ιστού ως εξής: καμία χρώση ή χρώση σε & lt? 10% των κυττάρων του όγκου (βαθμός 0), αμυδρή /μόλις αντιληπτή μερικός χρώση σε & gt? 10% των κυττάρων του όγκου (βαθμός 1 +), αδύναμη έως μέτρια χρώση στα & gt? 10% των καρκινικών κυττάρων (2+), και ισχυρή χρώση στα & gt? 10% των καρκινικών κυττάρων (βαθμολογία 3+). Εμείς χωριστά ερμηνεύεται TCF3 – και 1+ ως «χαμηλή έκφραση» και

TCF3

2+ και 3+ ως «ισχυρή έκφραση«

Bisulfite γονιδιωματικής αλληλουχίας (BGS)

. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από ιστούς χρησιμοποιώντας το DNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Germany) και αποθηκεύθηκε στους -20 ° C πριν από τη χρήση. DNA τροποποιήθηκε με EZ μεθυλίωσης του DNA-Χρυσό KitTM (ZYMO, Orange, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Γενικά, 1 μΙ τροποποιημένου DNA χρησιμοποιήθηκε σε επόμενες PCR. Οι εκκινητές για BGS είναι 5′-GTATAAGGTTGAAAATTTGGGT-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CTCCCTAAAATCCTAAAAATCTTA-3’ (αντίστροφο). συνθήκες της PCR θερμοκυκλικές ήταν 1 κύκλος στους 95 ° C για 15 λεπτά? 30 κύκλους στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 52 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα και τελική επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν με το κιτ εκχύλισης πηκτής (Qiagen), κλωνοποιήθηκε στο pMD20-T (Promega, Madison, WI, USA), και στη συνέχεια μετατρέπονται σε

Escherichia coli στέλεχος DH10B

. Επελέγησαν αποικίες 10-15 για να επιβεβαιωθεί η παρουσία και το μέγεθος του κλωνοποιημένου ενθέματος. επελέγησαν και ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητές καθολική του φορέα Ρ2, 5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3 ‘, Ρ4, 5′-AGAGGATAACAATTTCACACAGGA-3’ Πέντε θετικοί κλώνοι για κάθε δείγμα. Μετά τον καθαρισμό η αλληλουχία του PCR προϊόντος αναλύεται με χρήση ΑΒΙ 3730 DNA Sequencer (Applied Biosystems).

μεθυλίωσης ειδική PCR (MSP)

Οι εκκινητές για την μεθυλιωμένη ακολουθία του γονιδίου TCF3 ήταν 5′- AATTTTATAGGAAAAAGGCGC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-AACCTCGAACGCACATACTA-3′ (αντίστροφο). Για μη μεθυλιωμένη ακολουθία ήταν 5’-TGGAATTTTATAGGAAAAAGCTGT-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-AAAAACCTCAAACACACATACTA-3’ (αντίστροφο). Qiagen HotStarTaq DNA πολυμεράση χρησιμοποιήθηκε για PCR. θερμοκυκλικές συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 1 κύκλος στους 95 ° C για 15 λεπτά? 30 κύκλους στους 94 ° C για 30 s, 53 ° C (για Μ σετ εκκινητή) ή 51 ° C (για U σετ εκκινητή) για 30 s και 72 ° C για 30 s? και τελική επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά. Τα προϊόντα PCR φορτώθηκαν 2 πηκτές αγαρόζης% ακολουθούμενη από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο και έγινε ορατό άμεσα κάτω από φωτισμό UV. Ένα δείγμα ταξινομείται ως υπερμεθυλιωμένο όταν παρατηρήθηκε το προϊόν ενίσχυσης μεθυλίωση μόνο, μερικώς μεθυλιωμένα όταν παρατηρήθηκαν προϊόντα ενίσχυσης τόσο μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων όταν έδειξε προϊόντα μη μεθυλιωμένα ενίσχυσης μόνο, ή ούτε προϊόντα ενίσχυσης βρέθηκαν. Για τη στατιστική ανάλυση, τα υπερμεθυλιωμένων και μερικώς μεθυλιωμένα δείγματα θεωρήθηκαν ως μεθυλιωμένο ομάδα (Μ) και σε σύγκριση με την μη μεθυλιωμένη ομάδα (U) [19].

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις διεξάγεται με Stata (έκδοση SE /10? StataCorp, College Station, TX). Η ένωση μεταξύ κατηγορηματική δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ χ2. Οι καμπύλες επιβίωσης δημιουργηθούν με την μέθοδο Kaplan-Meier, και μονομεταβλητών κατανομής επιβιώσεως συγκρίθηκαν με τη χρήση του τεστ log-rank. Η πολυμεταβλητή Cox μοντέλο αναλογικών κινδύνων χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των ανεξάρτητων μάντης. Το 2-tailed

P

αξία για σημαντικότητας καθορίστηκε στο 0,05.

Αποτελέσματα

TCF3

έκφρασης ήταν ρυθμισμένο σε επαναλαμβανόμενες ιστούς CRC και CRC – μετάσταση που προέρχονται από κυτταρικές σειρές

στο 64 φρέσκα δείγματα,

TCF3

mRNA έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε επαναλαμβανόμενες ιστούς CRC σε σχέση με εκείνους χωρίς υποτροπή (

P

= 0,026? Εικόνα 1α). καμπύλη δέκτη-χειριστή (ROC) έδειξε ότι η καλύτερη τιμή αποκοπής για τη διάκριση μεταξύ περιοδικών και μη-επαναλαμβανόμενες ΚΕΣ 0,0041. Οι οι περιοχές κάτω από τις καμπύλες ROC ήταν 0,668 (95% CI 0,534 έως 0,803) (Εικόνα 1β). Σχετική ποσότητες

TCF3

mRNA σε κυτταρικές γραμμές CRC εκφράστηκαν ως Ν-πλάσια διαφορά σε σχέση με Caco-2 και ομαλοποιούνται στη

GAPDH

ως γονίδιο αναφοράς. Η

TCF3

έκφραση mRNA σε SW620, LoVo, και ΟοΙο205 αυξήθηκαν 3.4-, 1.8- και 6,9-φορές, αντίστοιχα, σε σύγκριση με εκείνη των Caco-2. Ενώ

TCF3

επίπεδα mRNA του SW480 και HCT116 μειώθηκαν 0,5- και 0,4-φορές, αντίστοιχα (Σχήμα 1γ). Για 118 ανοσοχρώσης δείγματα, η έκφραση της πρωτεΐνης TCF3 συσχετίστηκε με υποτροπή (Πίνακας 3).

(α) Σε επαναλαμβανόμενες CRC,

TCF3

επίπεδα mRNA ήταν σημαντικά αυξημένα comared στο CRC χωρίς υποτροπή ( Wilcoxon Signed Ranks Test,

P

& lt? 0,05). (Β) Καμπύλη ROC που δείχνει την απόδοση του

TCF3

στην πρόβλεψη υποτροπής της CRC. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) = 0.668 (95% CI 0,534 έως 0,803),

P

value = 0,012. (Γ)

TCF3

mRNA επίπεδα μετρήθηκαν με qPCR σε 6 κυτταρικές γραμμές CRC.

GAPDH

σήματα χρησιμοποιήθηκαν ως ένα σχετικό μέτρο του επιπέδου έκφρασης των γονιδίων στόχων. Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα, διενεργήθηκε εις τριπλούν, παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

Συσχέτιση

TCF3

έκφραση της πρωτεΐνης και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά

Θετική χρώση ήταν παρατηρούνται κυρίως σε κυτταρόπλασμα και της πυρηνικής των καρκινικών κυττάρων. Ανάλυση της έκφρασης TCF3 στα 118 ιστούς CRC αποκάλυψε ότι το 37% των δειγμάτων που αποδεικνύουν ισχυρή (2+ και 3+) εντάσεις και 63% σε χαμηλά επίπεδα (- και +) εντάσεις. Η ανοσοχρώση των TCF3 πρωτεΐνης απεικονίζεται στην Εικόνα 2.

Τα παραδείγματα της ανοσοχρώση TCF3 σε ισχυρή έκφραση (Α, Β) και χαμηλή έκφραση (c, d) επίπεδα (μεγέθυνση χ 400).

Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές όσον αφορά την ηλικία, το φύλο, το μέγεθος, lymphvascular και περινευρικό εισβολή. Ωστόσο, το ποσοστό επιβίωσης ελεύθερης νόσου ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ασθενείς με έκφραση της πρωτεΐνης υψηλής TCF3 ό, τι σε εκείνες με χαμηλή έκφραση (

P

= 0,002), και η έκφραση TCF3 συσχετίστηκε σημαντικά με ιστολογικού τύπου του καρκίνου (

P

= 0,038). Πίνακας 2 έδειξε τις σχέσεις μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και την έκφραση της πρωτεΐνης TCF3 in118 δείγματα.

πρωτεϊνικής έκφρασης και ελεύθερη νόσου TCF3

χρόνο επιβίωσης

Η μονοπαραγοντική ανάλυση Kaplan-Meier για αποκάλυψε ότι η ισχυρή έκφραση TCF3 ήταν σημαντικά σχετίζεται με δυσμενή αποτελέσματα ελεύθερη νόσου επιβίωση (

P

= 0,0001). Καμπύλες κατά Kaplan-Meier δεν έδειξε καμία διαφορά επιβίωσης σε CRC σύμφωνα με άλλες παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένου του φύλου, της ηλικίας, τη θέση του όγκου, και lymphvascular εισβολή (

P

& lt? 0,05). Ωστόσο, διανομές επιβίωσης ήταν σημαντικά διαφορετική σε CRC με και χωρίς περινευρικό εισβολή. Χαρακτηριστικές οικόπεδα έκφρασης TCF3 και περινευρικό εισβολή φαίνεται στο Σχήμα 3. Ισχυρή έκφραση TCF3 σχετίστηκε με υποτροπή (Πίνακας 3). Ανάλυση Η πολυπαραγοντική Cox έδειξε ότι περινευρικό εισβολή, η έκφραση πρωτεΐνης TCF3, και η χημειοθεραπεία ήταν ανεξάρτητες μεταβλητές (

P

= 0.00, 0.01, και 0.01) (Πίνακας 4).

(α) Οι ασθενείς με υψηλό έκφραση TCF3 (n = 44) έδειξε ένα σημαντικά φτωχότερη prognisis από εκείνους με χαμηλή έκφραση TCF3 (n = 74?

P

& lt? 0,05? δοκιμασία log-rank). (Β) Οι ασθενείς με περινευρικό εισβολή (n = 17) έδειξε σημαντικά φτωχότερη prognisis από εκείνους που δεν έχουν τέτοια εισβολή (n = 101?

P

& lt? 0,05? Δοκιμασία log-rank).

Η

Up-έκφραση

TCF3

συνδέεται με τον ανάδοχο CpG νησί υπομεθυλίωση του

Ένα νησί CpG που περιλαμβάνει περίπου 2.3 kb βρέθηκε στο ανθρώπινο

TCF3

γονίδιο περιοχή προαγωγέα (Σχήμα 4γ). Για να κατανοήσουμε τον μηχανισμό της

TCF3

κανονισμού CRC, η κατάσταση μεθυλίωσης στην περιοχή του υποκινητή του

TCF3

ελέγχθηκε. Εμείς ενισχύθηκε και προσδιορίστηκε η αλληλουχία της περιοχής του υποκινητή του

TCF3

χρησιμοποιώντας όξινο θειώδες νάτριο επεξεργασμένο γενωμικού DNA που παρασκευάστηκε από ιστούς CRC. Πιο πυκνά μεθυλιωμένες CpG θέσεις (90,7% έναντι 44,3%) ανιχνεύθηκαν σε μη επαναλαμβανόμενες ιστούς CRC σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 4d, 4e και 4f). Για την περαιτέρω επικύρωση των αποτελεσμάτων αλληλούχισης, η περιοχή υποκινητή χαρακτηρίστηκε από MSP χρησιμοποιώντας μεθυλίωση ή unmethylation-ειδικοί εκκινητές σε 47 δείγματα CRC. Η μεθυλίωση του

TCF3

ανιχνεύθηκε σε 23 (95,8%) 24 μη επαναλαμβανόμενα δείγματα CRC. Σε αντίθεση, η συχνότητα της μεθυλίωσης ήταν αισθητά χαμηλότερη σε επαναλαμβανόμενες δείγματα CRC (16/23, 69.6%?

P

= 0.023, Εικόνα 5Α, 5Β). Επιπλέον, φάνηκε ότι η

TCF3

έκφραση συνδέεται σημαντικά με την κατάσταση μεθυλίωσης, υποδεικνύοντας epigenetical αδρανοποίηση μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στο κανονιστικό του

TCF3

έκφρασης (

P

= 0,001, σχήμα 5γ).

Θέση του

TCF3

γονιδίων εντός ανθρώπινου χρωμοσώματος 19 (ch19p13.3). (Α) τη δομή εξόνιο του ανθρώπινου

TCF3

γονίδιο. (Β) δομή του 5 ‘άκρου του

TCF3

γονίδιο. Διάγραμμα της τοις εκατό γουανίνη (G) και κυτοσίνη (C) νουκλεοτίδια σε ολόκληρη αυτή την περιοχή, θέση των δινουκλεοτιδίων CpG εντός αυτής της περιοχής, και τα όρια του νησιού CpG (σκιασμένη περιοχή). (Γ) Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των χρωματογραφημάτων του CpG θέσεων που λαμβάνονται από όξινο θειώδες αλληλουχίας του

TCF3

θραύσμα σε CRC χωρίς υποτροπή (δ) και με υποτροπή (e, f).

Η

Μ, μετουσιωμένες αλληλόμορφο? U, μη μεθυλιωμένη αλληλόμορφο. (Γ) αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του

TCF3

επίπεδο έκφρασης κατάσταση μεθυλίωσης υποκινητή και το γονίδιο από qPCR ανάλυση των

TCF3

έκφραση στις 47 CRC ιστούς. Η γραμμή αντιπροσωπεύει την αναλογία του

TCF3

και

επίπεδα GAPDH

έκφρασης του mRNA.

TCF3

επίπεδα έκφρασης συσχετίζεται με την κατάσταση μεθυλίωσης του γονιδίου (

P

= 0,001, Mann-Whitney U test).

Η

Συζήτηση

η μελέτη μας ερευνά τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης TCF3 και των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά σε ασθενείς με σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ CRC. Η έκφραση TCF3 σε επαναλαμβανόμενες CRC ιστούς βρέθηκε σημαντικά υψηλότερη σε σχέση με εκείνους χωρίς υποτροπή. Η ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι η ισχυρή έκφραση της πρωτεΐνης TCF3 και περινευρικό εισβολή ήταν ανεξάρτητοι αρνητικά προγνωστικούς παράγοντες και τη χημειοθεραπεία ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας προστασίας. Για την εξάλειψη των προκαταλήψεων θεραπεία που προκαλείται από επικουρική χημειοθεραπεία, αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης TCF3 και του χρόνου επιβίωσης σε στάδιο ΙΙ και ΙΙΙ των ασθενών, αντίστοιχα. Η χημειοθεραπεία δεν επηρέασε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης TCF3 και πρόγνωση (Σχήμα S1).

υπομεθυλίωση του υποκινητή CpG νησίδων του ογκογονιδίου είναι ικανή να ενεργοποιεί αυτά τα γονίδια. Για να καθοριστεί αν η ρύθμιση προς τα πάνω της TCF3 συνδέθηκε με παρεκκλίνουσα μεθυλίωση, διερευνήθηκε η συχνότητα μεθυλίωσης σε 47 CRC ιστούς από MSP. Το μεθυλιωμένο αλλήλιο ανιχνεύθηκε σε 39 από 47 (83%) των όγκων που εξετάστηκαν. Η συχνότητα της μεθυλίωσης ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην υποτροπιάζουσα δείγματα CRC σε σύγκριση με τους όγκους χωρίς υποτροπή (

P

= 0,023). Η

TCF3

έκφρασης σε 39 όγκους με μεθυλίωση υποστηρικτής ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε 8 περιπτώσεις χωρίς μεθυλίωση προαγωγού (

P

= 0,001), υποδεικνύοντας ότι υπομεθυλίωση υποστηρικτής ήταν ο κύριος μηχανισμός της προς τα πάνω ρύθμιση

TCF3

. Αυξημένη

TCF /β-κατενίνης

σηματοδότησης είναι ένα από τα χαρακτηριστικά της CRC [20]. Εμείς, εδώ, να παρέχουν τα στοιχεία που δείχνουν μεθυλίωση του

TCF3

είναι μια κοινή εκδήλωση σε όγκους παχέος εντέρου. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το

TCF3

μεθυλίωση αδρανοποίηση είναι απαραίτητη για την ανασταλτική ογκογόνο δυναμικό του

TCF /β-κατενίνης

σηματοδότηση. Αντίθετα, παρεκκλίνουσα αυξήσεις υπομεθυλίωση

TCF3

έκφρασης, η οποία συνδέεται με την επανεμφάνιση του σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ CRC.

Τα μέλη του

TCF

οικογένεια δεσμεύονται να μη φωσφορυλιωμένη β- κατενίνης [21] – [24] και ρυθμίζουν τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων, όπως

TCF

εαυτό της και τα ογκογονίδια

κυκλίνη D1

και

c-myc

[25], [26]. Η απορρύθμιση αυτού του μονοπατιού σηματοδότησης είναι ένα σημαντικό γεγονός στην ανάπτυξη αρκετών κακοηθειών, όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου, του μελανώματος και του καρκίνου του προστάτη. Εκτός απορρύθμιση του

TCF /β-κατενίνης

μονοπάτι σε κύτταρα όγκου, έχει γίνει γνωστό ότι η δυσλειτουργία του Ε-καδερίνης επιτρέπει στα κύτταρα του όγκου να εισβάλλουν στους περιβάλλοντες ιστούς [27]. έκφραση Ε-καδερίνης έχει επίσης μειωθεί ή απουσιάζει σε πολλούς επιθηλιακούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων του στομάχου και του καρκίνου του μαστού [28] – [30]. Ως μεταγραφικό καταστολέα, τον ρόλο του

TCF3

είναι κάτω ρύθμιση Ε-καδερίνης κατά την διάρκεια της προόδου του όγκου [31], [32].

TCF3

δεσμεύει τα στοιχεία E-box στη θέση υποκινητή εγγύς του Ε-καδερίνης οδηγεί σε αδρανοποίηση μεταγραφής του Ε-καδερίνης, και η προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης παίζει σημαντικό ρόλο στη μείωση συστήματα προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και προάγει μετάσταση [33].

Εν όψει των πλήρων στοιχείων που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη, προτείνουμε ότι η υπερέκφραση της TCF3 σε ασθενείς III CRC σταδίου ΙΙ και ήταν σημαντικά σχετίζεται με κακή πρόγνωση και χαμηλό ποσοστό επιβίωσης ελεύθερης νόσου (Σχήμα 3), η οποία συμβάλλει στην εντοπισμό των ασθενών υψηλού κινδύνου CRC. Μερικά στάδιο ΙΙ και όλες οι περιπτώσεις CRC σταδίου ΙΙΙ θα μπορούσε να θεωρηθεί για την επικουρική θεραπεία [34]. Ωστόσο, ο ρόλος του επικουρική χημειοθεραπεία σε εκείνους τους ασθενείς με όγκους σταδίου II είναι ακόμα ασαφής [35], [36]. Για να επιλέξετε υψηλού κινδύνου σταδίου II της νόσου και να μεγιστοποιήσει τα οφέλη της επικουρικής θεραπείας, ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης μπορεί να είναι χρήσιμη για τον εντοπισμό επιθετικό φαινότυπο στο πλαίσιο της φάσης ΙΙ CRC. Έχουμε εντοπίσει GAS 1 ως παράγοντας για την επιλογή των ασθενών με υψηλό κίνδυνο υποτροπής σε προηγούμενες εργασίες μας [18], και μερικά ενδιαφέροντα υποψήφια γονίδια ως προγνωστικοί παράγοντες για αυτά τα δείγματα είναι επίσης επικύρωση στο εργαστήριο μας (αδημοσίευτα δεδομένα). Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η ισχυρή

TCF3

έκφρασης μπορεί να προσδιορίσει ένα υποσύνολο των ασθενών με υψηλό κίνδυνο υποτροπής και οι ασθενείς αυτοί μπορεί να επωφεληθεί από πιο επιθετική θεραπεία.

Εν κατακλείδι, τα δεδομένα μας υπογραμμίζει τον κεντρικό ρόλο του

TCF3

υπομεθυλίωση στην CRC επαναλαμβανόμενες ανάπτυξης. Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν το δυναμικό προγνωστική αξία του

TCF3

ως βιοδείκτη για την επιλογή επικουρική θεραπεία για ασθενείς που διατρέχουν υψηλό κίνδυνο κακής έκβασης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Kaplan-Meier εκτιμώμενα ποσοστά επιβίωσης, σύμφωνα με την έκφραση TCF3. Ασθενείς με υψηλή έκφραση TCF3 έδειξε σημαντικά φτωχότερη prognisis από εκείνους με χαμηλή έκφραση TCF3 στο στάδιο ΙΙ (α) και ΙΙΙ ασθενείς (β) (

P

& lt? 0,05, δοκιμασία log-rank)

doi.: 10.1371 /journal.pone.0112005.s001

(ΔΕΘ)