Αφηρημένο

Μοριακοί βιοδείκτες για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα των στοχευμένων θεραπειών στη θεραπεία του καρκίνου έχουν υιοθετηθεί ευρέως σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC), αλλά εκείνοι για την πρόβλεψη της ευαισθησίας σε χημειοθεραπεία παραμένουν ακαθόριστα. Ελέγξαμε την υπόθεση μας ότι KRAS μετάλλαξη μπορεί να είναι ένας προγνωστικός δείκτης της ευαισθησίας οξαλιπλατίνη σε CRC. KRAS ήταν νοκ-κάτω στο KRAS-μεταλλαγμένα κύτταρα CRC (DLD-1

G13D και SW480

G12V) από μικρές RNAs παρεμβολής (siRNA) και υπερεκφράζεται σε KRAS-άγριου τύπου CRC κύτταρα (ΟοΙο320ϋΜ) με KRAS μεταλλαγμένο φορείς για να δημιουργήσει ζεύγη κύτταρα CRC. Αυτά τα ζεύγη τα κύτταρα CRC ελέγχθηκαν με οξαλιπλατίνη, ιρινοτεκάνη και 5FU για να προσδιοριστεί η μεταβολή στην ευαισθησία φαρμάκου με δοκιμασία ΜΤΤ και κυτταρομετρία ροής. Λόγοι για την ευαισθησία αλλοίωση περαιτέρω προσδιορίζεται με κηλίδα western και σε πραγματικό χρόνο ποσοτική αντίστροφη αλυσίδα μεταγραφάσης αντίδραση πολυμεράσης (qRT -PCR). Σε CRC κύτταρα τύπου KRAS-άγρια ​​(ΟοΙο320ϋΜ), KRAS υπερέκφραση από μεταλλαγμένα φορείς που προκαλείται επισκευή εκτομής ομάδα cross-συμπλήρωση 1 (ERCC1) ρύθμιση προς τα κάτω σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA και αυξημένη ευαισθησία οξαλιπλατίνη. Αντίθετα, σε KRAS-μεταλλαγμένα κύτταρα CRC (DLD-1

G13D και SW480

G12V), KRAS νοκ-κάτω από KRAS-siRNA οδήγησε σε ERCC1 ρύθμιση προς τα πάνω και αυξημένη αντίσταση οξαλιπλατίνη. Η ευαισθησία της ιρινοτεκάνης και 5FU δεν είχε αλλάξει στα ζεύγη κύτταρα CRC. Για την επικύρωση ERCC1 ως προγνωστικός δείκτης της ευαισθησίας για την οξαλιπλατίνη, ERCC1 χτυπήθηκε κάτω από siRNA στα κύτταρα CRC KRAS-άγριου τύπου, που αποκατέστησε την ευαισθησία οξαλιπλατίνη. Σε αντίθεση, ERCC1 ήταν υπερεκφράζεται από φορείς ERCC1 εκφράζουν το γονίδιο KRAS-μεταλλαγμένα κύτταρα CRC, και προκάλεσε αντίσταση οξαλιπλατίνη. Συνολικά, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι KRAS μετάλλαξη είναι ένας προάγγελος της οξαλιπλατίνη ευαισθησία στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα από το μηχανισμό του ERCC1 αρνητική ρύθμιση

Παράθεση:. Lin YL, Liau JY, Yu SC, Ou DL, Lin LI, Tseng LH , et al. (2012) KRAS μετάλλαξη είναι μια Predictor της οξαλιπλατίνη ευαισθησία στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 7 (11): e50701. doi: 10.1371 /journal.pone.0050701

Επιμέλεια: Ajay Goel, Πανεπιστήμιο Baylor Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8, Μαΐου 2012? Αποδεκτές: 25η Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 28 του Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Υπουργείο Υγείας, Εκτελεστικό Yuan (DOH100-TD-C-111-001), Ταϊπέι, Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή έχουν

οι βιοδείκτες για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα της θεραπείας έχει ερευνηθεί στην παραδοσιακή εποχή χημειοθεραπεία, αλλά μόνο ένας περιορισμένος αριθμός των βιοδεικτών έχει βρεθεί μέχρι σήμερα. Παραδείγματα είναι επισκευή εκτομή ομάδα εγκάρσια συμπληρώσεως 1 (ERCC1) έκφραση για να προβλεφθεί η αντοχή της οξαλιπλατίνης [1], και θυμιδυλική συνθάση (TS) έκφραση για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας 5FU [2]. Η έννοια αυτή έχει εξελιχθεί και έχει γίνει πιο σχετικό ενώ η θεραπεία έχει προχωρήσει σε μοριακή στόχευση εποχής. Οι περισσότεροι παράγοντες μοριακής στόχευσης έχουν προκαθορισμένους στόχους, οι οποίες διευκολύνουν την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της θεραπείας ή την πρόγνωση ασθενειών. Καλά παραδείγματα είναι υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μετάλλαξης για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας των αναστολέων κινάσης τυροσίνης EGFR (ΤΚΙδ) σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [3], καθώς και KRAS μετάλλαξη για την πρόβλεψη της κατάστασης μη απόκρισης του μονοκλωνικού αντισώματος EGFR σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC) [ ,,,0],4]. Παρά το γεγονός ότι έχουν εκτεταμένες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί για τον εντοπισμό νέων προγνωστικών από γνωστά μονοπάτια σηματοδότησης ή μελέτες βάσει μικροδιάταξης [5], [6], βιοδείκτες για την πρόβλεψη της ευαισθησίας σε χημειοθεραπεία παραμένουν ακαθόριστα.

(Α) KRAS-νοκ-κάτω DLD-1

κύτταρα G13D ήταν πιο ανθεκτικά στην οξαλιπλατίνη, αλλά έχουν την ίδια ευαισθησία στις ιρινοτεκάνη, 5ΡΙΙ και δοξορουβικίνη από τη γονική DLD-1

κύτταρα G13D, όπως αποδεικνύεται από ανάλυση ΜΤΤ. (Β) Το επίπεδο πρωτεΐνης ERCC1, όχι όμως και εκείνες των TOPO1 ή TS, ρυθμίζεται αυξητικά μετά DLD-1

κύτταρα G13D χτυπήθηκαν κάτω από KRAS siRNA. (Γ) Το επίπεδο του mRNA του ERCC1, όχι όμως και εκείνες των TOPO1 ή TS, ρυθμίζεται αυξητικά μετά DLD-1

κύτταρα G13D χτυπήθηκαν κάτω από KRAS siRNA. ***:

σ

& lt? 0.001

Η

Πολλά post hoc αναλύσεις των πρόσφατων τυχαιοποιημένες μελέτες για CRC πρότεινε ότι η κατάσταση μετάλλαξης του γονιδίου KRAS θα μπορούσε να προβλέψει την αποτελεσματικότητα των κυτταροτοξική χημειοθεραπεία, ιδιαίτερα. για οξαλιπλατίνα. OPUS [7] και τον Πρωθυπουργό [8] μελέτες, οι οποίες ήταν και οι δύο έχουν σχεδιαστεί για τους ασθενείς να λαμβάνουν πρώτης γραμμής οξαλιπλατίνη /5FU /λευκοβορίνης με /χωρίς EGFR μονοκλωνικά αντισώματα, είναι καλά παραδείγματα. Κατά κύριο λόγο με επίκεντρο την χημειοθεραπεία μόνη ομάδα σε αυτές τις 2 μελέτες δείχνουν ότι πρώτης γραμμής επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (PFS) στην ομάδα μεταλλαγμένου KRAS διήρκεσε περισσότερο από ότι στην ομάδα του άγριου τύπου, με 8,6 έναντι 7,2 μηνών στη μελέτη OPUS, και 8,8 έναντι 8,0 μηνών στο PRIME μελέτη. Αντίθετα, στη μελέτη CRYSTAL [9], το οποίο σχεδιάστηκε για ασθενείς που λαμβάνουν πρώτης γραμμής ιρινοτεκάνη /5FU /λευκοβορίνης με /χωρίς μονοκλωνικό αντίσωμα EGFR, δεν παρατηρήθηκε ένα παρόμοιο φαινόμενο. Η διάμεση πρώτης γραμμής PFS σε KRAS-μεταλλάξεως και αγρίου-τύπου ασθενών ήταν 7,7 και 8,4 μήνες, αντιστοίχως.

Σύμφωνα με αυτές τις παρατηρήσεις, υποθέσαμε ότι KRAS μετάλλαξη μπορεί να είναι μια προγνωστικός δείκτης της ευαισθησίας οξαλιπλατίνης σε CRC. Κατ ‘αρχάς, KRAS χτυπήθηκε κάτω στο KRAS-μεταλλαγμένα κύτταρα CRC και υπερεκφράζεται σε κύτταρα CRC KRAS-άγριου τύπου. Αυτά τα ζεύγη τα κύτταρα CRC ελέγχθηκαν με οξαλιπλατίνη, ιρινοτεκάνη και 5FU για να αξιολογηθεί η μεταβολή στην ευαισθησία φαρμάκου. Λόγοι για την ευαισθησία αλλοίωση περαιτέρω προσδιορίζεται με κηλίδα western και σε πραγματικό χρόνο ποσοτική αντίστροφη αλυσίδα μεταγραφάσης αντίδραση πολυμεράσης (qRT -PCR). Τέλος, ο στόχος υπεύθυνος για την ευαισθησία τροποποίηση επικυρώθηκε με να χτυπήσει κάτω και υπερεκφράζουν τον στόχο.

(Α) KRAS-νοκ-κάτω SW480

κύτταρα G12V ήταν πιο ανθεκτικά στην οξαλιπλατίνη, αλλά έχουν την ίδια ευαισθησία να ιρινοτεκάνη, 5ΡΙΙ και δοξορουβικίνη από τη γονική SW480

κύτταρα G12V, όπως αποδεικνύεται από ανάλυση ΜΤΤ. (Β) Το επίπεδο πρωτεΐνης ERCC1, όχι όμως και εκείνες των TOPO1 ή TS, ρυθμίζεται αυξητικά μετά SW480

κύτταρα G12V χτυπήθηκαν κάτω από KRAS siRNA. (Γ) Το επίπεδο του mRNA του ERCC1, όχι όμως και εκείνες των TOPO1 ή TS, ρυθμίζεται αυξητικά μετά SW480

κύτταρα G12V χτυπήθηκαν κάτω από KRAS siRNA. ***:.

σ

& lt? 0.001

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και αντιδραστήρια

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου CRC ΟοΙο320ϋΜ (KRAS -wild τύπου), DLD-1

G13D (KRAS G13D μετάλλαξη), και SW480

G12V (KRAS G12V μετάλλαξη) ελήφθησαν όλα από την American Type Culture Collection. Τα κύτταρα όλες διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 που περιείχε 10% ορό εμβρύου μόσχου, 2 mmol /L Ε-γλουταμίνη (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), και PSA (10.000 μονάδες /ml πενικιλλίνης, 10 mg /ml στρεπτομυκίνης , και 25 μg /ml αμφοτερικίνη Β? Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) και καλλιεργήθηκε στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO2. Οξαλιπλατίνη (ένεση Eloxatin® 5 mg /ml) ελήφθη από την Sanofi-Aventis, Ltd (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Η ιρινοτεκάνη, 5ΡΙΙ και της δοξορουβικίνης ήταν όλα αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). αντισώματα κουνελιού για western blot κατά ERCC1 και KRAS αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA). αντισώματα ποντικού έναντι TS, τοποϊσομεράση Ι (ΤΟΡΟ Ι), και β-ακτίνης ελήφθησαν από την Millipore (Bedford, ΜΑ, USA), BD Biosciences (San Jose, CA, USA) και ΟβΙΙ Biolabs, Inc. (San Diego, CA, USA), αντίστοιχα.

(Α) KRAS

G13D-DDK-myc-ΟοΙο320ϋΜ κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα σε οξαλιπλατίνη, αλλά έχουν την ίδια ευαισθησία στις ιρινοτεκάνη, 5ΡΙΙ και δοξορουβικίνη από γονικά κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ, όπως αποδεικνύεται με δοκιμασία ΜΤΤ. (Β) Το επίπεδο πρωτεΐνης ERCC1, όχι όμως και εκείνες των TOPO1 ή TS, ήταν μειωτικά μετά κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ επιμολύνονται από το KRAS

G13D μεταλλαγμένο φορέα. (Γ) Το επίπεδο του mRNA του ERCC1, όχι όμως και εκείνες των TOPO1 ή TS, ήταν μειωτικά μετά κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ επιμολύνονται από το KRAS

G13D μεταλλαγμένο φορέα. **:.

σ

& lt? 0,01

Η

Χτύπημα κάτω του KRAS και ERCC1

Δύο τύποι τόσο KRAS και ERCC1 μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA) και κωδικοποιημένο μη ειδική (αρνητικός έλεγχος) siRNA αγοράστηκαν από την Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, USA). Για γονίδιο knockdown KRAS, DLD-1

G13D και SW480

κύτταρα G12V πρώτα επιμολυσμένα με KRAS- ή ομελέτα siRNAs για 1 ημέρα με τη χρήση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Τα επιμολυσμένα κύτταρα στη συνέχεια κατεργάζεται με οξαλιπλατίνη, ιρινοτεκάνη, 5ΡΙΙ και δοξορουβικίνη με διάφορες συγκεντρώσεις για τις ακόλουθες 72 ώρες. Το προϊόν λύσης πρωτεΐνης και mRNA των γονικών και KRAS νοκ ντάουν DLD-1

G13D και SW480

G12V κύτταρα συλλέχθηκαν σε 24, 48, 72 και 96 ώρες μετά την επιμόλυνση για την αξιολόγηση του KRAS νοκ ντάουν μεγέθους με κηλίδα western. Για γονίδιο ERCC1 knockdown, κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ επιμολυσμένα με δύο διαφορετικά ERCC1- ή ομελέτα siRNAs υποβλήθηκαν σε αγωγή με οξαλιπλατίνη για 72 ώρες. Το προϊόν λύσης πρωτεΐνης και mRNA των γονικών και ERCC-νοκ-κάτω τα κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ συλλέχθηκαν σε 24, 48, 72 και 96 ώρες μετά την επιμόλυνση για την αξιολόγηση της επίδρασης ERCC1 νοκ ντάουν με κηλίδα western και qRT-PCR.

( Α) KRAS

κύτταρα G12V-DDK-myc-ΟοΙο320ϋΜ ήταν πιο ευαίσθητα σε οξαλιπλατίνη, αλλά έχουν την ίδια ευαισθησία στις ιρινοτεκάνη, 5ΡΙΙ και δοξορουβικίνη από γονικά κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ, όπως αποδεικνύεται από ανάλυση ΜΤΤ. (Β) Το επίπεδο πρωτεΐνης ERCC1, όχι όμως και εκείνες των TOPO1 ή TS, ήταν μειωτικά μετά κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ επιμολύνονται από το KRAS

G12V μεταλλαγμένο φορέα. (Γ) Το επίπεδο του mRNA του ERCC1, όχι όμως και εκείνες των TOPO1 ή TS, ήταν μειωτικά μετά κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ επιμολύνονται από το KRAS

G12V μεταλλαγμένο φορέα. **:

σ

& lt? 0,01. (Δ) Αύξηση του ποσοστού της απόπτωσης, από 22,5% ± 0,2% έως 39,1% ± 0,2% της απόπτωσης (P & lt? 0.001), έχει αποδειχθεί όταν KRAS

WT-DDK-myc-ΟοΙο320ϋΜ κύτταρα, σε σύγκριση με το KRAS

κύτταρα G12V-DDK-myc-ΟοΙο320ϋΜ, στην οποία, τόσο υποβλήθηκαν σε αγωγή με την ίδια συγκέντρωση της οξαλιπλατίνης σε 5 μΜ. *:

σ

& lt? 0.001

Η

Η υπερέκφραση του KRAS και ERCC1

Η pCMV6-Myc-DDK-tagged-KRAS φορέα αγοράστηκε από ΟηΟεηε Technologies (. Rockville, MD, USA). DNA-αλληλουχία που κωδικοποιεί KRAS G12V και μετάλλαξης G13D δημιουργήθηκαν με κατευθυνόμενη σε θέση μεταλλαξιγένεση και κλωνοποιήθηκε στον φορέα pCMV6-Μγο-DDK-tagged-KRAS. Οι αλληλουχίες των KRAS G12V και μετάλλαξης G13D είχαν ως εξής: 5′-GTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAATGCC-3 ‘? αντίστροφη: 5’-GGCACTCTTGCCTACGCCAACAGCTCCAACTACCACAAG-3 ‘και προς τα εμπρός: 5′-GGTAGTTGGAGCTGGTGACGTAGGCAAGAGTGCC-3′? αντίστροφη: 5’-GGCACTCTTGCCTACGTCACCAGCTCCAACTACC-3 ‘, αντίστοιχα. Για KRAS υπερέκφραση, τα κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ επιμολύνθηκαν παροδικά με το pCMV6-Myc-DDK-tagged-KRAS, φορείς -KRAS

G12V, και -KRAS

G13D. Μετά από 24 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με οξαλιπλατίνη, ιρινοτεκάνη, 5ΡΙΙ και δοξορουβικίνη με διάφορες συγκεντρώσεις για τις ακόλουθες 72 ώρες. Το προϊόν λύσης πρωτεΐνης και mRNA των κυττάρων ΟοΙο320ϋΜ επιμολυνθεί από το pCMV6-Myc-DDK-tagged-KRAS, -KRAS

G12V, και -KRAS

διανύσματα G13D συλλέχθηκαν σε 24, 48, 72, και 96 ώρες για την αξιολόγηση του KRAS υπερέκφραση μεγέθους με κηλίδα western. Για ERCC1 υπερέκφραση, SW480

κύτταρα G12V επιμολύνθηκαν με τον φορέα pCMV6-ERCC1-GFP (ΟηΟεηε Technologies, Rockville, MD, USA) για 24 ώρες, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με οξαλιπλατίνη για 72 ώρες. Η πρωτεΐνη λύμα SW480

κύτταρα G12V επιμολυσμένα με τον φορέα ERCC1-GFP συλλέχθηκε σε 24, 48, 72, και 96 ώρες για την αξιολόγηση της ERCC1 υπερέκφραση μεγέθους με κηλίδα western.

(Α) ERCC1- νοκ-κάτω τα κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ ήταν πιο ευαίσθητα σε οξαλιπλατίνη από γονικά κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ, όπως αποδεικνύεται από ανάλυση ΜΤΤ. (Β) Η πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA του ERCC1 είχαν μειωτικά όταν τα κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ χτυπήθηκαν κάτω από ERCC1 siRNA. *:

σ

& lt? 0,05 (C) ERCC1-GFP-SW480

κύτταρα G12V ήταν πιο ανθεκτικά στην οξαλιπλατίνη από γονική SW480

κύτταρα G12V. (D) έκτοπη ERCC1 ρυθμίζεται αυξητικά μετά SW480

κύτταρα G12V επιμολύνθηκαν με τον φορέα έκφρασης ERCC1-GFP.

Η

Κυττάρων Η βιωσιμότητα και Αναλύσεις Τα αποπτωτικά

Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση η 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ? Tokyo Chemical Industry Inc., Tokyo, Japan) δοκιμασία σε 6 επαναλήψεις. Αρχικά, ΟοΙο320ϋΜ, SW480

G12V, και DLD-1

G13D κύτταρα σπάρθηκαν στα 3500, 4500, και 3000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 96 φρεατίων επίπεδου πυθμένα πλάκες, αντίστοιχα. Μετά από 24 ώρες επώασης, SW480

G12V και DLD-1

κύτταρα G13D επιμολύνονται από KRAS- και κωδικοποιημένα siRNAs, και τα κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ επιμολύνονται από το pCMV6-Myc-DDK-tagged KRAS, -KRAS

G12V, και -KRAS

διανύσματα G13D, όπως περιγράφεται. Μετά KRAS-siRNAs επιμολύνθηκαν να DLD-1

G13D /SW480

κύτταρα G12V και KRAS μεταλλαγμένο φορείς να ΟοΙο320ϋΜ κυττάρων για 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με οξαλιπλατίνη, ιρινοτεκάνη, 5ΡΙΙ, και δοξορουβικίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις σε 10 % FBS συμπληρωμένο RPMI-1640 για 72 ώρες. Τα κύτταρα ελέγχου αναμίχθηκαν με DMSO σε συγκέντρωση ίση με εκείνη σε κύτταρα υποστεί αγωγή με φάρμακο. Κυτταρική βιωσιμότητα αυτών των επεξεργασμένων κυττάρων μετρήθηκε με προσθήκη 200 μΙ 0.5 mg /ml ΜΤΤ διαλυτοποιούνται σε DMSO σε κάθε φρεάτιο, και τα κύτταρα επωάστηκαν στο CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C για 2 ώρες μετά την απομάκρυνση του μέσου. Η απορρόφηση προσδιορίστηκε στα 570 nm. Οι συγκεντρώσεις των ενώσεων που ανέστειλαν βιωσιμότητα κατά 50% (IC

50) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του μέσου αποτελέσματος με την χρησιμοποίηση του λογισμικού CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, ΜΟ, USA).

(Α) έκφραση πρωτεΐνης του ERCC1 στα κύτταρα DLD-1 (KRAS

μετάλλαξη G13D) ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά την 5′-azacitidine (παράγοντας de-μεθυλίωσης) θεραπεία για 96 ώρες, η οποία άφησε να εννοηθεί ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των ERCC1 σε KRAS-μεταλλαγμένα κύτταρα CRC μπορεί να είναι εν μέρει μέσω ERCC1 υπερμεθυλίωση. (Β) Ελάττωση του ERCC1 σε ΟοΙο320ϋΜ (KRAS άγριου τύπου) κύτταρα επιμολυσμένα με το γονίδιο KRAS

G13D-μεταλλαγμένο-φορέα για 24 και 96 ώρες δεν μπορεί να αποκατασταθεί μόνο με 5′-azacitidine σε 10 μΜ, αλλά και προκάλεσε απότομη ανωφέρεια ρύθμιση του DNMT3B.

Η

Το κλάσμα των αποπτωτικών κυττάρων, μετά KRAS υπερεκφράζεται σε κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ, και αντιμετωπίζονται από οξαλιπλατίνη, εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής με Annexin V-FITC. κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ σπάρθηκαν σε 2.5 × 10

5 κύτταρα /ανά φρεάτιο για κωδικοποιημένα και KRAS

G12V-μεταλλαγμένη-φορέα επιμόλυνσης σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά από 6 ώρες επιμόλυνσης, μέσο διαμολύνσεως αντικαταστάθηκε από το κανονικό μέσο. Η οξαλιπλατίνη με την συγκέντρωση 5 μΜ δόθηκε επιμολυσμένα κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ στην επόμενη ημέρα. Τα επιμολυσμένα κύτταρα στη συνέχεια ΟοΙο320ϋΜ σε επεξεργασία με θρυψίνη και συλλέχθηκαν για ανάλυση μετά από 48 ώρες θεραπείας οξαλιπλατίνη. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 300 g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και το κυτταρικό εναιώρημα βάφτηκε με Αννεξίνη V-FITC (κιτ δοκιμασίας V αννεξίνης, BD Biosciences Pharmingen) και ιωδιούχο προπίδιο σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 15 λεπτά στο σκοτάδι. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με FACScan κυτταρόμετρο ροής and Cell πρόγραμμα Quest. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ήταν το ποσοστό των κυττάρων που βάφονται με Annexin V-FITC.

Western Blot Ανάλυση

KRAS-υπερεκφράζεται ΟοΙο320ϋΜ και KRAS-νοκ-κάτω SW480

G12V και DLD- 1

G13D κύτταρα επεξεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις οξαλιπλατίνη, ιρινοτεκάνη, και 5ΡΙΙ για 72 ώρες σε 6-cm πιάτα (1 × 10

5 κύτταρα ανά δίσκο) συλλέχθηκαν και λύθηκαν με RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [50 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 8.0), 150 mmol /L NaCl, 1% ΝΡ40, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS] (Sigma Cat. Νο R0278). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης του προϊόντος λύσης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ προσδιορισμού πρωτεϊνών Pierce BCA (Thermal Scientific, Οδησσό, Texas, USA). Ισοδύναμες ποσότητες πρωτεΐνης από κάθε προϊόν λύσης υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης για ανοσοκηλίδωση. Οι απορροφήθηκε μεμβράνες πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS) που περιείχε 0,1% Tween 20 (TBST). Μετά από αποκλεισμό με TBST που περιείχε 5% άπαχο γάλα για 40 λεπτά, οι μεμβράνες επωάστηκαν με το κατάλληλο πρωτογενές αντίσωμα σε TBST που περιείχε 1% άπαχο γάλα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Όλα τα πρωτογενή αντισώματα αραιώθηκαν σε μια κατάλληλη συγκέντρωση 1% άπαχο TBST που περιέχει γάλα. Μετά την κατεργασία με το πρωτογενές αντίσωμα, οι μεμβράνες πλύθηκαν δύο φορές με TBST για 20 λεπτά, ακολουθούμενη από γίδινο αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού IgG-υπεροξειδάση αρμορακίας-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (αραιωμένο 1:3000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκε 3 φορές με TBST επί 1 ώρα. Οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν με χρήση ενός υποστρώματος ενισχυμένη χημειοφωταύγεια υπεροξειδάση (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

πραγματικού χρόνου ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-)

KRAS-υπερεκφράζεται ΟοΙο320ϋΜ, KRAS-νοκ-κάτω SW480

G12V και DLD-1

G13D κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις οξαλιπλατίνη, ιρινοτεκάνη, και 5FU για 24, 48, και 72 ώρες, αντίστοιχα, συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ένα αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C. Το RNA αυτών των κυττάρων εκχυλίζεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNAs συντέθηκαν από ολικό RNA (1 μg) χρησιμοποιώντας το Applied Biosystems υψηλής χωρητικότητας κιτ cDNA Archive σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το cDNA από 50 ng ολικού RNA ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την Taqman Universal ή SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σε ένα ΑΒΙ PRISM 7900 Sequence Detection System (Perkin-Elmer /Applied Biosystems). Οι αλληλουχίες εκκινητή του ERCC1 (ABI Taqman ID δοκιμασία: Hs01012158_ml), TOPO Ι (ABI Taqman ID δοκιμασία: Hs00243257_ml), TS (ΑΒΙ Taqman ID δοκιμασία: Hs00426586_ml), και το γονίδιο της β-ακτίνης (ABI Taqman ID δοκιμασία: Hs99999903_ml) ως ενδογενής έλεγχος ήταν όλα αγοράστηκαν από την Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). Προϋποθέσεις για την PCR ήταν 50 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 10 λεπτά, και 40 κύκλοι των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα (μετουσίωση) και 60 ° C για 1 λεπτό (ανόπτηση /επέκταση). Η σχετική ποσότητα mRNA του /ενδογενούς γονιδίου ελέγχου γονιδίου-στόχου (β-ακτίνη) υπολογίστηκε με τη μέθοδο της ΔΟΙ (κύκλος όριο), ως εξής: σχετική έκφραση = 2-ΔΟΙ, όπου ΔCt = Ct (γονίδιο-στόχος) – Ct (β β-ακτίνη).

Στατιστική Ανάλυση

για μελέτες κυτταρικής γραμμής, όλα τα δεδομένα επαναλήφθηκαν για τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Τα ποσοτικά δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Οι συγκρίσεις μεταξύ των στοιχείων εντός των ίδιων πειραμάτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student. Ένα

σ

-τιμή του & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Χτύπημα κάτω KRAS σε KRAS μεταλλαγμένο CRC κυττάρων αυξάνεται οξαλιπλατίνη Αντίστασης και Προκαλεί ERCC1 υπερέκφραση

Χτύπημα κάτω KRAS στο DLD-1

κύτταρα G13D οδήγησε σε κύτταρα πιο ανθεκτικά στην οξαλιπλατίνη, αλλά όχι με την ιρινοτεκάνη, και 5FU, πρότυπο χημειοθεραπευτικούς παράγοντες για CRC, και όχι στη δοξορουβικίνη, ευρεία χημειοθεραπευτικό φάσματος παράγοντας για την άλλων μεγάλων μορφών καρκίνου. Δύο διαφορετικές KRAS-siRNAs ήταν επιμολυσμένα με DLD-1

κύτταρα G13D. Το IC

50 από τα πρώτα ζεύγη γονική DLD-1

G13D (1) -DLD-1

κύτταρα G13D /KRAS-siRNA που έλαβαν θεραπεία με οξαλιπλατίνη για 72 ώρες ήταν 3,97 /33,07 μΜ. Το δεύτερο ζεύγη γονική DLD-1

G13D /KRAS-siRNA (2) -DLD-1

κύτταρα G13D ήταν 3,97 /13,49 μΜ. Το IC

50 ζευγών γονική DLD-1

/KRAS-siRNA-DLD-1

κύτταρα G13D G13D θεραπεία με ιρινοτεκάνη, 5FU και δοξορουβικίνη παρέμεινε αμετάβλητη (Εικόνα 1Α). ERCC1, ΤΟΡΟ Ι και TS, τα οποία πιστεύεται ότι είναι βιοδείκτες για την πρόβλεψη της ευαισθησίας της οξαλιπλατίνης [1], ιρινοτεκάνη [10] και 5FU [2], αντίστοιχα, περαιτέρω ελέγχθηκε με στύπωμα western και qRT-PCR (Σχήματα 1Β, and1C ) για να διερευνήσει τους μηχανισμούς πίσω από τα ευρήματά μας. Μόνο η έκφραση ERCC1 ρυθμίζεται αυξητικά μετά KRAS νοκ ντάουν? Σε αντίθεση, ΤΟΡΟ Ι και TS παρέμεινε σταθερή τόσο σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA. KRAS νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα αξιολογήθηκε από κηλίδα western, η οποία έδειξε μειωμένη έκφραση KRAS μετά από 72 ώρες να χτυπήσει κάτω το γονίδιο KRAS (Εικόνα 1Β).

Για να εδραιώσει περαιτέρω την παρατήρηση μας, χρησιμοποιήσαμε ένα άλλο κύτταρο CRC, SW480 , η οποία έτρεφε μια άλλη μετάλλαξη υποτύπου KRAS, G12V, να επαναλάβει τις ίδιες πειραματικές διαδικασίες. Εν ολίγοις, η γονική SW480

κύτταρα G12V ήταν, όπως αναμενόταν, πιο ευαίσθητα στην οξαλιπλατίνη από KRAS νοκ-κάτω SW480

κύτταρα G12V. Το IC

50 γονικής SW480

/KRAS-siRNA-SW480

κύτταρα G12V G12V αντιμετωπίζονται από οξαλιπλατίνη για 72 ώρες ήταν 2,08 /13,53 μΜ, αλλά η γονική SW480

G12V /KRAS-siRNA- SW480

G12V κύτταρα επεξεργασμένα με ιρινοτεκάνη, 5ΡΙΙ και δοξορουβικίνη παρέμεινε αμετάβλητος (Σχήμα 2Α). ERCC1, ΤΟΡΟ Ι, και TS ταυτοχρόνως ελέγχθηκε με στύπωμα western και qRT-PCR (Σχήματα 2Β και 2C), και πάλι μόνο ERCC1 ρυθμίζεται αυξητικά μετά KRAS knockdown, με τα επίπεδα ΤΟΡΟ Ι και TS παραμένουν αμετάβλητες σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA. Ομοίως, KRAS νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα μετρήθηκε με κηλίδα western, η οποία έδειξε μια μείωση στην έκφραση KRAS μετά από 72 ώρες να χτυπήσει κάτω το γονίδιο KRAS (Εικόνα 2Β).

υπερεκφράζουν το γονίδιο KRAS στο φυσιολογικό KRAS CRC κυττάρων οδηγεί με οξαλιπλατίνη Ευαισθησία και ERCC1 Ελάττωση

η υπερέκφραση του KRAS σε κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ με KRAS μεταλλαγμένο φορείς κατέληξαν σε κύτταρα πιο ευαίσθητα στην οξαλιπλατίνη. Το IC

50 γονικής ΟοΙο320ϋΜ /KRAS

G13D-DDK-myc-ΟοΙο320ϋΜ κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με οξαλιπλατίνη για 72 ώρες ήταν 2,86 /0,26 μΜ, αλλά η γονική ΟοΙο320ϋΜ /KRAS

G13D-DDK-myc- ΟοΙο320ϋΜ κύτταρα κατεργασμένα με ιρινοτεκάνη, 5ΡΙΙ και δοξορουβικίνη παρέμεινε αμετάβλητος (Σχήμα 3Α). ERCC1, TOPO εγώ, και TS ελέγχθηκαν με κηλίδα western και qRT-PCR (Εικόνες 3Β και 3C), η οποία έδειξε ότι μόνο ERCC1 ήταν μειωτικά χωρίς καμία αλλαγή στην πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA σε TOPO Ι και TS μετά KRAS υπερέκφραση. Η έκφραση της έκτοπης KRAS και ενδογενών KRAS μετρήθηκε με κηλίδα western, η οποία έδειξε μια ισχυρή έκφραση της έκτοπης KRAS, με σταθερή έκφραση των ενδογενών KRAS μετά από 24 ώρες η υπερέκφραση του γονιδίου KRAS (Εικόνα 3Β).

Τα ίδια αποτελέσματα βρέθηκαν επίσης σε κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ επιμολυσμένα με το KRAS

G12V-μεταλλαγμένο φορέα. Το IC

50 γονικής ΟοΙο320ϋΜ /KRAS

G12V-DDK-myc-ΟοΙο320ϋΜ κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με οξαλιπλατίνη για 72 ώρες ήταν 2,55 /0,25 μΜ, αλλά η γονική ΟοΙο320ϋΜ /KRAS

G12V-DDK-myc- ΟοΙο320ϋΜ κύτταρα κατεργασμένα με ιρινοτεκάνη, 5ΡΙΙ και δοξορουβικίνη παρέμεινε αμετάβλητος (Σχήμα 4Α). Και πάλι, μόνο ERCC1 ήταν μειωτικά χωρίς καμία αλλαγή του ΤΟΡΟ Ι και TS σε πρωτεΐνες (Σχήμα 4Β) και τα επίπεδα mRNA (Σχήμα 4C) μετά KRAS υπερέκφραση. Η έκφραση του έκτοπη KRAS και ενδογενών KRAS μετά από 24-ωρη υπερέκφραση του γονιδίου KRAS δείχνεται στο σχήμα 4Β. Για να ενισχυθεί περαιτέρω η διαπίστωση ότι KRAS

κύτταρα G12V-DDK-myc-ΟοΙο320ϋΜ ήταν πιο ευαίσθητα στην οξαλιπλατίνη από τα γονικά κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ, κυτταρομετρία ροής με αννεξίνη V-FITC εκτελέστηκε. Κατά συνέπεια, αυξημένο ποσοστό απόπτωσης, από 22,5% ± 0,2% έως 39,1% ± 0,2% της απόπτωσης (Ρ & lt? 0.001), έχει βρεθεί όταν τα γονικά κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ, επιμολυσμένα με KRAS

WT-DDK-myc-φορέα, ήταν σε σύγκριση με κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ, επιμολυσμένα με KRAS

G12V-DDK-myc-φορέα, στην οποία, τόσο υποβλήθηκαν σε αγωγή με την ίδια συγκέντρωση της οξαλιπλατίνης σε 5 μΜ (Εικόνα 4D).

Επικύρωση ERCC1 Έκφραση καθώς η προγνωστικός δείκτης της οξαλιπλατίνη ευαισθησία

Χτύπημα κάτω ERCC1 σε KRAS CRC κύτταρα άγριου τύπου αποκαθιστά την ευαισθησία οξαλιπλατίνη.

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τη σχέση ανάμεσα στην έκφραση ERCC1 και ευαισθησία οξαλιπλατίνη, εμείς νοκ-κάτω το γονίδιο ERCC1 με τη χρήση 2 διαφορετικών ERCC1-siRNAs στα κύτταρα KRAS-άγριου τύπου (ΟοΙο320ϋΜ). Βρήκαμε ότι το IC

50 της πρώτης αντιστοιχισμένη γονική ΟοΙο320ϋΜ /ERCC1-siRNA (1) -COLO320DM κύτταρα επεξεργασμένα με οξαλιπλατίνη για 72 ώρες ήταν 2,75 /0,91 μΜ (Σχήμα 5Α). Το δεύτερο ζεύγη γονική ΟοΙο320ϋΜ /ERCC1-siRNA (2) κύτταρα -COLO320DM ήταν 2,75 /0,83 μΜ (Σχήμα 5Α). Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης και του mRNA του ERCC1 είχαν μειωτικά μετά ERCC1 χτυπήθηκε κάτω από ERCC1-siRNA στα κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ (Εικόνα 5Β).

υπερεκφράζουν ERCC1 σε KRAS-μεταλλαγμένα κύτταρα CRC προκαλεί αντίσταση οξαλιπλατίνη.

η υπερέκφραση του ERCC1 σε SW480

G12V κύτταρα από το ERCC1 υπερεκφράζουν φορέα που προκαλείται SW480

κύτταρα G12V να γίνουν πιο ανθεκτικά με οξαλιπλατίνη. Το IC

50 γονικής SW480

G12V /ERCC1-GFP-SW480

κύτταρα G12V αγωγή με οξαλιπλατίνη για 72 ώρες ήταν 1,87 /11,03 μΜ (Σχήμα 5C). κηλίδα Western χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το επίπεδο υπερέκφραση ERCC1-GFP μετά την επιμόλυνση (Σχήμα 5D).

Συζήτηση

Η μελέτη μας δείχνει ότι KRAS μετάλλαξη είναι ένας προγνωστικός δείκτης της ευαισθησίας οξαλιπλατίνη σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου από ERCC1 αρνητική ρύθμιση. Αυτό μπορεί να παρέχει ένα σημαντικό βήμα για την εξατομικευμένη χημειοθεραπείας στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Στην προ-στοχευμένη εποχή θεραπεία, Tournigand et al [11] η οποία δημοσιεύθηκε τον κεντρικό άρθρο δείχνει ότι, χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής είτε με ιρινοτεκάνη /5FU /lecovorin (FOLFIRI) ή οξαλιπλατίνη /5FU /λευκοβορίνη (FOLFOX6) σε «μη-επιλεγμένο» CRC ασθενείς με μεταστατικό, που ακολουθείται διαδοχικά από την άλλη μετά την εξέλιξη, δεν επηρέασε τη συνολική επιβίωση (OS). άρθρο τους ανέφεραν επίσης ότι και τα δύο σχήματα μπορεί να συνιστάται ως θεραπεία πρώτης γραμμής για προχωρημένους CRC. Στη σύγχρονη εποχή της στοχευμένης θεραπείας, η τρέχουσα θεραπευτική αγωγή έχει προχωρήσει σε εξατομικευμένη θεραπεία μετά το γονίδιο KRAS άγριου τύπου αναγνωρίστηκε ως προγνωστικός δείκτης για το μονοκλωνικό αντίσωμα EGFR. κατάσταση KRAS έχει προταθεί να ελέγχεται τακτικά σε καθημερινή ογκολογική πρακτική. Για να εντοπίσει καλύτερα προγνωστικοί παράγοντες στην τρέχουσα χημειοθεραπεία ή νεότερη στόχοι της θεραπείας για CRC ασθενείς KRAS μεταλλαγμένο είναι δικαιολογημένη. Η μελέτη μας ξεκίνησε να βρούμε καλύτερους προγνωστικούς παράγοντες στην τρέχουσα χημειοθεραπεία, για την οποία η υπόθεση δημιουργήθηκε από αναλύσεις υποομάδων των τυχαιοποιημένων προοπτικών κλινικών δοκιμών, PRIME [8] και OPUS [7], έναντι CRYSTAL [9]. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, KRAS μεταλλαγμένο ασθενείς CRC ενδέχεται να ωφεληθούν περισσότερο από τη λήψη πρώτης γραμμής οξαλιπλατίνα από τους ασθενείς KRAS-άγριου τύπου. Αυτό το φαινόμενο χρήζει περαιτέρω επιβεβαίωσης από μεγάλες προοπτικές κλινικές δοκιμές.

Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι το γονίδιο KRAS μετάλλαξη στα κύτταρα CRC προκάλεσε ERCC1 αρνητική ρύθμιση. Αυτή σημαντικό εύρημα μπορεί να σημαίνει ότι κάποια άλλα άγνωστα druggable στόχων μπορεί να εξακολουθεί να είναι υπεύθυνη για KRAS μεταλλαγμένο θεραπεία CRC εκτός από την παραδοσιακή οδό /ΕΚΚ RAS /RAF /MEK. Για να διερευνήσει αυτές τις άγνωστες στόχους, οι μελέτες έχουν σχεδιαστεί από επιγενετικές ή /και γενετική απόψεων μπορεί να είναι χρήσιμη. Από επιγενετική άποψη, υπερμεθυλίωση προκαλεί γονιδιακή σίγηση είναι καλά γνωστό [12], [13]. Στη μελέτη μας, έχουμε διαπιστώσει ότι η πρωτεϊνική έκφραση των ERCC1 σε DLD-1 (KRAS

G13D μετάλλαξη) κυττάρων ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά την 5′-azacitidine (παράγοντας de-μεθυλίωσης) θεραπεία για 96 ώρες (Εικόνα 6Α), η οποία έδειξε ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των ERCC1 σε KRAS-μεταλλαγμένα κύτταρα CRC μπορεί να είναι εν μέρει μέσω ERCC1 υπερμεθυλίωση. Βρήκαμε επίσης ότι η καταστολή της πρωτεΐνης έκφρασης του ERCC1 σε ΟοΙο320ϋΜ (KRAS άγριου τύπου) κύτταρα επιμολυσμένα με KRAS μεταλλαγμένο-φορέα για 24 και 96 ώρες μπορούν να αποκατασταθούν με 5′-azacitidine (Εικόνα 6Β). Αυτό συνεπάγεται επίσης ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ERCC1 στα κύτταρα CRC δεν είναι μόνο εν μέρει μέσω της υπερμεθυλίωσης, αλλά και καθορίζεται από τις αλλαγές της έκφρασης KRAS σε κύτταρα CRC. Λόγω της προς τα κάτω ρύθμιση ERCC1 σε κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ, επιμολυσμένα με KRAS

G13D-μεταλλαγμένη-φορέα, μπορεί να προκληθεί από υπερμεθυλίωση ERCC1, ελέγξαμε περαιτέρω DNMT3B (DNA μεθυλοτρανσφεράση 3Β), των οποίων το μεγαλύτερο ρόλος είναι να προχωρήσει η διαδικασία της μεθυλίωσης. Βρήκαμε ότι DNMT3B ρυθμίζεται αυξητικά όταν ERCC1 ήταν dowenregulated σε κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ, επιμολυσμένα με KRAS

G13D-μεταλλαγμένη-φορέα (Σχήμα 6Β). DNMT3B μπορεί και πάλι να καταστείλει με 5′-azacitidine, που απεικονίζεται ότι DNMT3B είναι πιθανώς υπεύθυνο για τη διαδικασία της μεθυλίωσης. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι ERCC1 ρύθμιση προς τα κάτω στο KRAS-μεταλλαγμένα κύτταρα CRC μπορεί να είναι μέσω ERCC1 υπερμεθυλίωση. Προτείναμε ότι KRAS-μεταλλαγμένα κύτταρα CRC μπορεί να έχουν υψηλότερο ποσοστό μεθυλίωσης στην CpG νησίδες της περιοχής του υποκινητή ERCC1 από KRAS μεταλλαγμένο-κύτταρα επιμολυσμένα με το γονίδιο KRAS-siRNA. Αυτή η υπόθεση μπορεί να επικυρώνονται με σύγκριση των πιθανών διαφορών υπερμεθυλίωση στην περιοχή του υποκινητή ERCC1 μεταξύ KRAS-μεταλλαγμένων κυττάρων και KRAS-μεταλλαγμένα κύτταρα επιμολυσμένα με το γονίδιο KRAS-siRNA μέσω μεθυλίωσης ειδική PCR ή /και ανάλυση όξινο θειώδες νάτριο αλληλουχίας [14]. Η όλη ιδέα είναι ότι KRAS μετάλλαξη ενεργοποίηση μπορεί να προκαλέσει DNMT3B ρύθμιση προς τα πάνω. Στη συνέχεια, DNMT3B μπορεί να δεσμεύονται με την περιοχή υποκινητή του ERCC1 να οδηγήσει σε υπερμεθυλίωση του γονιδίου ERCC1. Τέλος, υπερμεθυλίωση γονιδίου ERCC1 αποτέλεσμα μειορύθμιση της έκφρασης ERCC1. Εναλλακτικά, από γενετική άποψη, καθώς KRAS μετάλλαξη είναι μια μετάλλαξη ενεργοποίησης, η οποία έχει γίνει ευρέως αποδεκτή [15], [16], προτείναμε ότι θα μπορούσε να υπάρχει ένας υπήρχε άγνωστος παράγοντας, ο οποίος μπορεί να ανασταλεί από την ενεργοποίηση του γονιδίου KRAS ή κατάντη του σήματα. Ο παράγοντας αυτός πρέπει επίσης να είναι ένας παράγοντας ενεργοποίησης για την ενεργοποίηση του γονιδίου ERCC1. Στη συνέχεια, αφού KRAS γονίδιο είναι μεταλλαγμένο (ενεργοποιημένο), αυτός ο παράγων μπορεί να ανασταλεί, και η ποσότητα αυτού του παράγοντα μπορεί να μειωθεί. Στη συνέχεια, η έκφραση των ERCC1 μπορούσε να κατασταλεί λόγω της έλλειψης του παράγοντα αυτού. Για τη διεξαγωγή τέτοιου είδους μελετών, κατασκευάσματα γονιδίου αναφοράς χρησιμοποιώντας υποστηρικτής ERCC1, λουσιφεράσης δοκιμασία δραστηριότητας και της χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση μπορεί έτσι να χρειάζεται [17].

Παρά το γεγονός ότι οι λεπτομερείς μηχανισμοί πίσω από τα ευρήματα αυτά παραμένουν ασαφείς, crosstalks ανάμεσα στο μεταλλαγμένο γονίδιο KRAS και μονοπάτια μηχανήματα επιδιόρθωσης του DNA, η οποία μπορεί επίσης να είναι υπεύθυνη για την επίδραση της αγωγής με οξαλιπλατίνη που βασίζονται, έχουν διερευνηθεί [18], [19]. Επιπλέον, διάφορες νέες γενεές τεχνολογιών μικροσυστοιχιών με βάση, συγκρίνοντας ίδια δεδομένη κύτταρα με /χωρίς μετάλλαξη KRAS με να χτυπήσει κάτω και που υπερεκφράζουν το γονίδιο KRAS αναλόγως, μπορεί να είναι άλλο χρήσιμο τρόπο στον καθορισμό νέων στόχων για KRAS μεταλλαγμένο επεξεργασία CRC [5], [6].

η υπερέκφραση του ERCC1 συνδέεται με την αντίσταση στην πλατίνα χημειοθεραπεία με βάση [1], [20], [21], [22], [23], [24], το οποίο έχει αποδείχθηκε σε διάφορα είδη καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του οισοφάγου [25], μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [26], και οι καρκίνοι της ουροδόχου κύστης [27]. Αυτά τα ευρήματα είναι επίσης συμβατό με την τρέχουσα μελέτη. Στη μελέτη μας, δείξαμε ότι KRAS άγριου τύπου κύτταρα (ΟοΙο320ϋΜ) CRC ήταν πιο ανθεκτικά στην οξαλιπλατίνη από τα ίδια δεδομένη κύτταρα (ΟοΙο320ϋΜ) επιμολυσμένα με το γονίδιο KRAS-μεταλλαγμένη-φορείς.