Αφηρημένο

λεμφαδένων μεταστάσεων υποδηλώνει κακή πρόγνωση στον καρκίνο του οισοφάγου. Για να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς που διέπουν, οι περισσότερες μελέτες μέχρι στιγμής επικεντρώνονται στη διερεύνηση εαυτό τους ή /και εισέβαλε λεμφαδένες οι όγκοι. Ωστόσο παραμέλησαν τις πιθανές εκδηλώσεις στο πλαίσιο του μεταστατικού θέση, η οποία προηγείται της εισβολής. Εδώ αναφέρουμε την πρώτη περιγραφή των εν λόγω κανονισμών σε ασθενείς στο επίπεδο της μεταγραφής. Έχουμε καθορίζεται transcriptomic προφίλ του ακόμα μετάσταση χωρίς τοπικούς λεμφαδένες για δύο ομάδες ασθενών: ασθενείς που ταξινομούνται ως ρΝ1 (n = 9, υπάρχουν μεταστατικό κόμβοι) ή PN0 (n = 5, δεν υπάρχουν μεταστατικό κόμβους). Όλα διερευνηθεί λεμφαδένες, και εκείνοι από ρΝ1 ασθενείς, ήταν ακόμα μετάστασης δωρεάν. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η περιφερειακή λεμφαδένες των ασθενών ρΝ1 διαφέρουν αποφασιστικά από εκείνα των ασθενών PN0 – ακόμη και πριν από τη μετάσταση έχει λάβει χώρα. Στην ομάδα PN0 παρατηρήθηκαν διαφορετικά πρότυπα ανοσολογική απόκριση. Αντίθετα, τους λεμφαδένες της ομάδας ρΝ1 εμφάνισε μια σαφή προφίλ μειωμένης ανοσολογικής απόκρισης και μειωμένη πολλαπλασιασμό, αλλά αυξημένη απόπτωση, ενισχυμένη υποπλασία και μορφολογικές διαδικασίες μετατροπής. DKK1 ήταν η πιο σημαντική γονίδιο που σχετίζεται με τους μοριακούς μηχανισμούς που λαμβάνουν χώρα σε λεμφαδένες των ασθενών που πάσχουν από μετάσταση (ρΝ1). Υποθέτουμε ότι οι δύο μοριακά προφίλ παρατηρείται συνιστούν διαφορετικά στάδια μιας προοδευτικής νόσου. Τέλος προτείνουμε DKK1 θα μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στο πλαίσιο των μηχανισμών που οδηγούν σε μετάσταση στους λεμφαδένες

Παράθεση:. Otto Β, Koenig AM, Tolstonog GV, Jeschke Α, Klaetschke Κ, Vashist YK, et al. (2014) Μοριακή Αλλαγές στην προ-μεταστατικούς λεμφαδένες του καρκίνου του οισοφάγου ασθενείς. PLoS ONE 9 (7): e102552. doi: 10.1371 /journal.pone.0102552

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 8 Απρ 2014? Αποδεκτές: 20 του Ιουνίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 21 του Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Otto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έχουν κατατεθεί στο δημόσιο αποθετήριο NCBI GEO και είναι προσβάσιμα με τον αριθμό πρόσβασης GSE51021

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Stiftung für Pathobiochemie und Molekulare Diagnostik, η Deutsche Gesellschaft für Vereinte Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σε καρκίνο του οισοφάγου (ESC), μετάσταση στους λεμφαδένες σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων μέσω των λεμφαγγείων και κατά τη διάρκεια παλιννόστησης τους στους λεμφαδένες, αυτά τα καρκινικά κύτταρα να μπει σε στενή επαφή με τα ενδοθηλιακά κύτταρα και λεμφαδένων κόλπων. επέκταση του όγκου αποτελεί σήμερα την κύρια βάση για την επιλογή της θεραπείας. Όμως, παρά την υψηλή προγνωστική σημασία των λυμφογενή μεταστάσεων, οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν αυτό το μεταστατικής οδού είναι ακόμη ως επί το πλείστον άγνωστη

Ένας αριθμός μελετών διερεύνησαν τις μοριακές προφίλ των όγκων [1] – [4]. Ή /και η . μεταστατικούς λεμφαδένες [5] Περαιτέρω μελέτες διερευνήθηκε λυμφογενή μετάσταση σε συσχέτιση με λεμφικό αγγειογένεση [6] – [9] και των χημειοκινών που συνδέονται [10] – [12] μετανάστευση. Θεωρήθηκε ότι κατευθυνόμενη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνωμα του οισοφάγου μπορεί να καθοδηγείται από τοπικά εξέφρασε χημειοκινών. [12] Και με βάση αυτά τα ευρήματα θα ήταν να φανταστεί κανείς ότι η διαδικασία της παλιννόστησης σε λεμφαδένες μπορεί να επικουρείται από λεκτίνη-γλυκάνης-αλληλεπιδράσεις μεταξύ του όγκου κύτταρα και λεμφαδένες ενδοθηλιακά κύτταρα. Hirakawa et al. [13] απέδειξε ότι στα ποντίκια, ακόμη και πριν από την μετάσταση, πρωτοπαθών όγκων (καρκίνος του δέρματος) μπορεί να τονώσει φρουρού λεμφαδένα λεμφαγγειογένεση. Πρότειναν ότι πρωτοπαθείς όγκους θα μπορούσε να είναι ικανοί να προετοιμάζονται για το μέλλον μεταστατικού τη θέση τους με την παραγωγή lymphangiogenic παράγοντες που θα μπορούσαν να μεσολαβούν αποτελεσματική μεταφορά τους στο λεμφαδένα φρουρού.

Ωστόσο, στην καλύτερη δυνατή γνώση των συγγραφέων δεν υπάρχει καμία δημοσιευμένη εργασία ειδικά εξετάζοντας τα πρώτα μοριακών μηχανισμών σε αυτόν τον μεταστατικό θέση σε ασθενείς -. μηχανισμούς εντός των μη επηρεάζονται λεμφαδένες, η οποία θα μπορούσε να μεταδοθεί ή να καταστείλει νωρίς μετάστασης σε ασθενείς που πάσχουν από ESC

Ο στόχος αυτής της μελέτης, επομένως, ήταν να διερευνήσει συγκεκριμένα αυτές οι πρώιμες αλλοιώσεις στους λεμφαδένες πριν από την ιστοπαθολογική ανιχνεύσιμη μετάσταση. Το έργο έχει οδηγηθεί από την υπόθεση ότι πριν από κύτταρα του όγκου μεταστάσεις στην περιφερειακή λεμφαδένες, σημαντικές αλλαγές πρέπει να έχουν ήδη λάβει χώρα πολλαπλασιαστικό ή καταστέλλοντας τη διαδικασία παλιννόστησης. Για να πάρετε διορατικότητα σε αυτή τη διαδικασία, συλλέξαμε όγκου των περιφερειακών και μακρινό λεμφαδένες από ασθενείς που πάσχουν από ESC ανέβηκε ως PN0 (δεν υπάρχουν μεταστατικό κόμβους) ή ρΝ1 (υπάρχουν μεταστατικό κόμβους). Όλες οι λεμφαδένες συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση ήταν μετάσταση χωρίς – ανεξαρτήτως της στάσης του ασθενούς. Πραγματοποιήσαμε μικροσυστοιχιών αναλύει και να διερευνηθούν οι μηχανισμοί που συνδέονται με τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των περιφερειακών και μακρινό λεμφαδένες του ίδιου του ασθενούς.

Κλειδί για την δουλειά μας εδώ είναι δύο χαρακτηριστικά. Κατ ‘αρχάς, όλα αναλύονται λεμφαδένες χωρίς εξαίρεση, ακόμη και εκείνων των ρΝ1 ασθενών, ήταν ακόμα χωρίς μετάσταση. Δεύτερον, χρησιμοποιήσαμε δείγματα των ασθενών οι οποίοι δεν υφίστανται καμία εισαγωγική ραδιο-χημειοθεραπεία και διαπιστώθηκε περαιτέρω διαδικασίες που εξασφαλίζεται πολύ υψηλή ποιότητα του δείγματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Γενική ροή εργασιών ανάλυσης

Οι συμπεριέλαβε ασθενείς έπασχαν από καρκίνο του οισοφάγου και υποβλήθηκε σε ριζική θωρακο-κοιλιακή en-bloc οισοφαγεκτομή συμπεριλαμβανομένων των λεμφαδένων του άνω και κάτω μεσοθωράκιο (R0 εκτομή) χωρίς εισαγωγική ραδιο-χημειοθεραπεία. Συμπεριλάβαμε λέμφος μόνο κόμβους από ασθενείς ανέβηκε ως PN0 (περιφερειακή λεμφαδένες χωρίς μετάσταση) ή ρΝ1 (περιφερειακών λεμφαδένων μεταστάσεων σήμερα) και επαληθεύεται από ιστοπαθολογική εξέταση που οι λεμφαδένες έχουν επιλεγεί για την ανάλυσή μας ήταν όλα καρκινικών κυττάρων δωρεάν. Εμείς επιβεβαιώνεται και από ανοσοϊστολογία ότι αυτές οι λεμφαδένες ήταν απαλλαγμένο από μικρο-μετάσταση. Εμείς που απομονώθηκαν από κάθε λεμφαδένα ολικού RNA για ανάλυση έκφρασης μικροσυστοιχίας. Μια paired t-test χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των περιφερειακών και μακρινά λεμφαδένες και ένας λειτουργική ανάλυση εμπλουτισμού και του δικτύου διεξήχθη. Στη συνέχεια σημαντικότερους υποψηφίους επικυρώθηκαν μέσω πραγματικού χρόνου PCR και DKK1 επικυρώθηκε εκτός μέσω ανοσοϊστολογικής χρώση.

Σχεδιασμός πειράματος

Ο σκοπός της εργασίας που παρουσιάζεται εδώ ήταν ο εντοπισμός πιθανών παραγόντων που διευκολύνουν και την οδήγηση μετάσταση σε λεμφαδένες ασθενών που πάσχουν από οισοφαγικό καρκίνωμα. Για να καταστεί δυνατή η κατανόηση του σχεδιασμού πειράματος (Σχ. 1) που ενσωματώνονται δύο μεταβλητές ενδιαφέροντος.

λεμφαδένες δύο διαφορετικές ομάδες ασθενών που πάσχουν (ρΝ1) ή δεν πάσχει (PN0) από μετάσταση λεμφαδένα ερευνήθηκαν. Από κάθε ασθενή περιφερειακή λεμφαδένες (δίπλα στον όγκο) συγκρίθηκαν με μακρινό λεμφαδένες (αναφορά ως βασική γραμμή). Κλειδί για το πείραμα είναι ότι

όλα

διερευνηθεί λεμφαδένες, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων των ασθενών ρΝ1, έγιναν σίγουρα θα είναι ακόμα ελεύθερη μετάστασης, καθώς και μικρο-μεταστάσεις.

Η

Κατ ‘αρχάς, δείγματα κατατάσσονται ανάλογα με την κύρια κατάσταση των ασθενών που εμφανίζουν (ομάδα ρΝ1) ή μη-εκθετήριο (ομάδα PN0) μετάσταση σε τοπικούς λεμφαδένες. Η σύγκριση του ΡΝ1 και PN0 ασθενείς θα πρέπει να τονίσει τις γενικές διαφορές στους κανονισμούς που ενδέχεται να επιφέρει ή αποτρέψει από μετάσταση.

Δεύτερον, δύο δείγματα λεμφαδένων συλλέχθηκαν από κάθε ασθενή, ένας κόμβος που βρίσκεται κοντά στον όγκο (περιφερειακές ) και το δεύτερο κόμβο μακρινό στον όγκο. Ενώ τα μακρινά κόμβους χρησίμευσε ως δείγμα αναφοράς για τα περιφερειακά κόμβοι ερευνήθηκαν για μεταγραφική κανονισμούς. Η κατά ζεύγη σύγκριση των όγκων μακρινό δείγματα με τα ασθενή ειδικών περιφερειακών κόμβων θα πρέπει να αποκαλύψει τα πρώτα κανονισμοί που ενδεχομένως προκύπτουν από την τοποθεσία κοντά στον όγκο. Στη δημοσίευση αυτή ο όρος «προς τα πάνω ρύθμιση» χρησιμοποιείται για αυτά τα γονίδια και τις λειτουργίες που εμφανίζουν μια υψηλότερη έκφραση στους τοπικούς λεμφαδένες σε σύγκριση με τα μακρινά λεμφαδένες. Αντίθετα, οι εν λόγω γονίδια και τις λειτουργίες που μειώνονται στις περιφερειακές λεμφαδένες ονομάζεται «κάτω-ρυθμίζονται».

Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι όλοι οι κόμβοι διερευνηθεί έγιναν βέβαιο ότι θα είναι ακόμα μετάσταση ελεύθερη, ανεξάρτητη από τους ασθενείς «ταξινόμηση ρΝ1 /PN0 και της θέσης σε σχέση με τον όγκο. Αυτό θα επιτρέψει τον εντοπισμό των πρώιμων αλλαγών που συμβαίνουν

πριν

με μετάσταση παλιννόστησης

Ηθική έγκριση της επιτροπής & amp.? ασθενείς συγκατάθεση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τους ισχύοντες κανονισμούς και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Αμβούργου, στη Γερμανία, υπό τον αριθμό ψηφοφορία PV3548. Οι ασθενείς γραπτή συγκατάθεση για να συμμετάσχουν στη μελέτη συλλέχθηκαν σύμφωνα με τους ισχύοντες κανονισμούς.

υλικό Δείγμα

αναλύθηκαν Συνολικά δείγματα από 22 ασθενείς με οισοφάγο καρκίνωμα εκ των οποίων 14 ζευγών δειγμάτων παρουσίασαν επαρκές δείγμα ποιότητα. Για κάθε ασθενή ζεύγη δείγμα της στενής όγκου και καρκινικών μακρινό λεμφαδένες συλλέχθηκαν για τη μείωση της ενδο-ατομικές διαφορές που μπορεί να προκύψουν λόγω των διαφορετικών γενετικό υπόβαθρο. Οι λεμφαδένες αμέσως αποκόπηκαν μετά την εκχύλιση σε ένα δωμάτιο λειτουργία. Τα τμήματα που αφιερώνεται για την ανάλυση της έκφρασης μικροσυστοιχιών μεταφέρθηκαν άμεσα σε υγρό άζωτο στο εργαστήριο για την εξαγωγή RNA. Το άλλο μέρος των λεμφαδένων ήταν ενσωματωμένο σε παραφίνη για την ταξινόμηση και τη διάγνωση.

Διαδικασία Λειτουργίας

Μετά την ιστολογική διάγνωση ενός οισοφαγικού καρκινώματος, οι ασθενείς με βλάβες πρώιμο στάδιο (pT1a) παραπέμφθηκαν σε χειρουργική επέμβαση είτε αν η ενδοσκοπική εκτομή ήταν ατελής ή ο όγκος ανέβηκε ως pT1b. Οι ασθενείς που αναφέρονται άμεσα σε χειρουργική επέμβαση, εάν η προεγχειρητική σταδιοποίηση ήταν ύποπτο είτε για μυϊκή συμμετοχή τοίχο (CT2) ή εμπλοκή λεμφαδένα (CN1). Κανένας ασθενής υποβλήθηκε σε εισαγωγική θεραπεία.

Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε μεσαίο σχήμα Τ laparatomy και δεξιά θωρακοτομή. Για τους ασθενείς με κολάρο αναστόμωση έγινε ένα επιπλέον αριστερής πλευράς cervicotomy για γιακά αναστόμωση. Κάθε ασθενής έλαβε μια ριζική en bloc οισοφαγεκτομή με εκτομή του οισοφάγου, θωρακικού πόρου, azygos φλέβα, σύστοιχο υπεζωκότα, και όλα periesophageal ιστού στον οπίσθιο μεσοθωράκιο. Ανακατασκευή έγινε με γαστρικό σωλήνα ή παρεμβολή του παχέος εντέρου συνήθως με υψηλό ενδοθωρακικών ή του τραχήλου της μήτρας αναστόμωση.

Επιπλέον, ένα τυποποιημένο λεμφαδενεκτομή δύο πεδίου διεξήχθη. Όλες οι λεμφαδένες συστηματικά δείγματα από οκτώ θέσεις: περιφερειακή μεσοθωρακίου, τόσο στην περιοχή του όγκου και μακριά από αυτό? infraclavicular? διαφραγματική (κάτω του μεσοθωρακίου)? perigastric λεμφαδένες (συμπεριλαμβανομένων αριστερά και δεξιά περικάρδιο)? κοινή ηπατική αρτηρία λεμφαδένες κόμβους? και των λεμφαδένων στο πορτ-μπαγκάζ κοιλιοκάκη. Όλοι οι κόμβοι χαρτογραφήθηκαν από τον χειρουργό, σύμφωνα με το σύστημα της Αμερικανικής Θωρακικής Εταιρείας, όπως τροποποιήθηκε από Casson et al. [14] Όλα τα εκτομή δείγματα αξιολογήθηκαν από έναν ανώτερο παθολόγο.

Μετεγχειρητική παρακολούθηση πραγματοποιήθηκε ως μέρος της συνήθους μετέπειτα παρακολούθηση. Οι ασθενείς παρατηρήθηκαν στην κλινική εξωτερικών ασθενών στο 3- έως διαστήματα 4 μήνες για τα πρώτα 2 έτη και σε διαστήματα 6 μηνών στη συνέχεια. αξιολόγηση Συνέχεια περιλαμβάνονται φυσική εξέταση, απλή ακτινογραφία θώρακα, κοιλιακή υπερηχογράφημα, ενδοσκόπηση, endosonography, CT του στήθους και της κοιλιάς, με PET-CT μετά τον Ιανουάριο του 2006 στο επιλεγμένες περιπτώσεις, CEA και CA μελέτες δείκτη 19-9 όγκου και σπινθηρογραφήματα οστών . Όποτε υποτροπή ήταν ύποπτος, επιπλέον ραδιολογική, ενδοσκοπική, ή ζητήθηκε η ιστολογική επιβεβαίωση.

Επανεμφάνιση διαγνώστηκε αν αποδειχθεί με βιοψία ή με αδιαμφισβήτητη απόδειξη μαζών όγκου (πρόσφατα εμφανίζονται μεταστάσεις ή τοπική υποτροπή) με μια τάση να αυξάνεται κατά τη διάρκεια της περαιτέρω παρακολούθηση και /ή την παρακολούθηση μέχρι το θάνατο. Υποτροπιάζουσα νόσος ορίστηκε ως είτε τοποπεριοχική (που συμβαίνουν στην άνω κοιλιακή χώρα ή mediastium) ή ως μακρινή μετάσταση.

χρώση μικρομεταστάσεων

χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση καρκινικών κυττάρων σε ένα πρώτο διαγνωστικό βήμα . Ιστολογικά «άνευ όγκου» λεμφαδένες μετά υποβλήθηκαν σε διαλογή ανοσοϊστοχημικά χρησιμοποιώντας αντι-κυτοκερατίνης αντίσωμα AE1 /ΑΕ3 (Dako, Glostrup, Δανία) αραιωμένο 1:50 (ν /ν) με την βιοτίνης-στρεπταβιδίνης μέθοδο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. ΑΕ1 /ΑΕ3 είναι ένα κοκτέιλ από δύο αντισωμάτων που αναγνωρίζει βασικές και όξινες CK σχετικά με την επιφάνεια και στο κυτταρόπλασμα όλων των επιθηλιακών κυττάρων (εκτός τοιχωματικά κύτταρα, ηπατοκύτταρα, και επιφανειακές στιβάδες του πλακώδες επιθήλιο). Τα αντισώματα δεν αντιδρούν με μεσεγχυματικού ιστού, συμπεριλαμβανομένων λεμφικό ιστό [16].

Τα σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και εμβαπτισμένες σε παραφίνη τομές των 5 έως πάχους 6 μm κόπηκαν σε τρία διαφορετικά επίπεδα σε κάθε κόμβο και αποπαραφινοποιήθηκαν σύμφωνα με πρότυπες ιστολογικές τεχνικές και μεταφέρθηκαν σε γυάλινα πλακίδια σε επεξεργασία με 3-triethoxysilylpropylamin (Merck, Darmstadt, Germany). Ένα τμήμα του δείγματος που λαμβάνεται σε κάθε επίπεδο χρωματίστηκε χρησιμοποιώντας αλκαλική φωσφατάση τεχνική-αντι-αλκαλικής φωσφατάσης σε συνδυασμό με το νέο fuchsine λεκέ (Sena, Heidelberg, Germany) για την αντίδραση οπτικοποίηση [17].

τομές φυσιολογικού βλεννογόνο του παχέος εντέρου χρησίμευσαν ως θετικοί έλεγχοι χρώση και ισότυπο, άσχετη μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού χρησίμευσε ως αρνητικοί έλεγχοι (πρωτεΐνη μυελώματος ποντικού καθαρίστηκε ανοσοσφαιρίνης για IgG1? Sigma, Deisenhofen, Germany).

Τα πλακίδια αξιολογήθηκαν κατά τυφλό διαδικασία από δύο ανεξάρτητους ερευνητές. Σε περίπτωση incongruent ευρήματα κλήθηκε να γνωμοδοτήσει το ένα τρίτο ερευνητή και μια συναινετική απόφαση ελήφθη. συμμετοχή Minimal κυττάρων όγκου σε έναν λεμφαδένα που θεωρήθηκε ότι είναι χωρίς-όγκο με συμβατική ιστολογική χρώση ορίστηκε ως η παρουσία ενός έως δέκα θετικά κύτταρα στο σώμα του κόμβου.

Η προετοιμασία των δειγμάτων και καθαρισμού

Απομόνωση ολικού RNA από άζωτο κατεψυγμένα δείγματα υγρού λεμφαδένα διεξήχθη με το ΤπζοΙ από Invitrogen σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών (Rev. ημερομηνία 12. Ιούνιος 2007) και καθαρίστηκε έπειτα με το Qiagen RNeasy Mini–Kit. Οι συγκεντρώσεις προσδιορίσθηκαν με ένα φωτόμετρο PeqLab NanoDrop και την ποιότητα του RNA με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας ένα Agilent Bioanalyzer 2100 System. Από τα ζεύγη δείγματος 22 9 ζεύγη των ασθενών με παρατηρείται πολύ μετάσταση και 5 ζεύγη δειγμάτων των ασθενών με κανένα μέτρο μετάσταση παρατηρήθηκε έδειξε την ποιότητα του RNA επαρκείς για την ανάλυση που ακολουθεί.

μικροσυστοιχιών ανάλυση

μικροσυστοιχιών τα πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Affymetrix ανθρώπινο πλήρες γονιδίωμα GeneChips U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών. Για την παρασκευή του RNA για την έκφραση συστοιχίες cDNA σύνθεσης με την προηγούμενη φωτομετρικό προσδιορισμό της συγκέντρωσης RNA πραγματοποιήθηκε. Τα παρακάτω βήματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 250 ng του συνολικού RNA για την σύνθεση του πρώτου κλώνου. Παρασκευή δείγματος ενσωματώνεται βήματα για τη σύνθεση του cDNA, ο καθαρισμός, η σύνθεση του βιοτίνη σημασμένο cRNA, in vitro μεταγραφή, τον κατακερματισμό, υβριδισμό καθώς επίσης και το πλύσιμο και χρώση. Το παρασκεύασμα διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του ένα κύκλο χρησιμοποιώντας το GeneChip 3 ‘IVT Express Kit από Affymetrix. Για υβριδισμός 12,5 μg χρησιμοποιήθηκαν κατακερματισμένη cRNA. Οι συστοιχίες επωάστηκαν για 16 ώρες στο Affymetrix Hybidization Φούρνος 640 στους 45 ° C. Πλύσιμο και λέκιασμα βήματα έγιναν ημι-αυτόματο στην ρευστών Σταθμός Affymetrix 450, τα ενιαία βήματα μετά την Κύκλου πρωτόκολλο Affymetrix One για τυποποιημένες διατάξεις. Μετά το πλύσιμο και χρώση οι συστοιχίες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας το σαρωτή Affymetrix GeneChip 3000 7G και το λογισμικό Command Console σε μήκος κύματος 570 nm και μέγεθος pixel των 1,56 μm.

Η στατιστική ανάλυση

Οι λεμφαδένες και από τις δύο ομάδες ασθενών (PN0 και ρΝ1) αναλύθηκαν ξεχωριστά. Καθώς η εστίαση της εργασίας αυτής ήταν νωρίς τις αλλαγές που προηγείται μετάσταση, μόνο μετάσταση δωρεάν λεμφαδένες αναλύθηκαν. Τα δείγματα κόμβος μακρινό λεμφαδένες όγκου χρησιμοποιήθηκαν ως αναφορά για τα ζεύγη τοπικούς λεμφαδένες.

διόρθωση Ιστορικό και ομαλοποίηση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας διαδικασία RMA και quantile κανονικοποίηση. Μια paired t-test εντός των δύο ομάδων (PN0, ρΝ1) πραγματοποιήθηκε και μια διαδικασία bootstrapping διεξήχθη για να ρυθμίσετε για ψευδώς θετικά κανονισμούς. Όπως αποκοπής τιμές διορθωμένη p-τιμή 0,05, μια πρώτων p-τιμή του 0,01 και ένα σήμα-log-λόγου (SLR) της τάξης του ± 0,7 χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η κορυφή ρυθμιζόμενα γονίδια.

έκφραση Μετά διαφορική γονιδιακή ανάλυση που πραγματοποιήθηκε γονίδιο σύνολο εμπλουτισμό και ανάλυση του δικτύου με το λογισμικό Ingenuity Διαδρομή ανάλυση (Ingenuity Systems, έκδοση 162.830). Για την ανάλυση η διορθωμένη p-τιμή αποκοπής ορίστηκε σε μια λιγότερο αυστηρή τιμή του ± 0,1 για να επιτραπεί η ενσωμάτωση των πιο ανεπαίσθητες αλλαγές.

Επικύρωση μέσω RT-PCR

Δώδεκα του καθορίζεται υποψήφια γονίδια επικυρώθηκαν μέσω RT-PCR με τη χρήση τριών τεχνικών επαναλήψεις ανά δείγμα. Η RT-PCR πραγματοποιήθηκε με πλακίδια των 96 φρεατίων για τη StepOne Plus Real Time PCR System από την Applied Biosystems. Για κάθε δείγμα 2 μΙ με συγκέντρωση 5 ng /μl χρησιμοποιήθηκαν. Να λογοδοτήσουν για τις διακυμάνσεις στην συγκέντρωση του δείγματος βήτα-2-μικροσφαιρίνη (Β2Μ) λήφθηκε ως σημείο αναφοράς καθαριότητας. Για τον προσδιορισμό των κανονισμών σε επίπεδο έκφρασης υπολογίστηκε η μέση τιμή του δέλτα Ct τιμές των τριών τεχνικών επαναλήψεις ». Σημασία των αλλαγών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα paired t-test μεταξύ όγκου στενή και όγκου μακρινό μέση Ct τιμές δέλτα μέσα σε κάθε ομάδα (PN0, ρΝ1).

DKK1 Ανοσοϊστοχημεία

Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε για τομές παραφίνης των διερευνώνται λεμφαδένες χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι DKK1 (1:100, Abcam, # ab61034). Για αποπαραφινοποιήθηκαν τμήματα ανίχνευση ανοσοϊστοχημική, επανυδατώθηκαν, και προ-επεξεργασμένα με 0.1% προνάση για 10 λεπτά για την ενζυματική αποκάλυψης αντιγόνο. Μετά από επώαση σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 15 λεπτά για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης και επωάσεως με 5% BSA για 30 λεπτά για να εμποδίσει μη ειδική δέσμευση αντισώματος εφαρμόστηκε πρωτογενές αντίσωμα. Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Ένα βιοτινυλιωμένο IgG δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (1:200, Dako Cytomation) χρησιμοποιήθηκε, που ακολουθείται από επώαση με στρεπταβιδίνη /ΗΚΡ (1:200, Dako Cytomation) ως τρίτο αντίσωμα. δραστικότητα υπεροξειδάσης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας DAB ως χρωματογόνο υπόστρωμα (Dako Cytomation). Οι τομές με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται, και τοποθετημένα. Εικόνες συλλέχθηκαν σε ένα σαρωτή διαφανειών Zeiss Mirax MIDI (Zeiss) και οι εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Pannoramic Viewer.

Αποτελέσματα

Μετάσταση χωρίς περιφερειακή λεμφαδένες διαφέρουν μεταξύ ρΝ1 και PN0 ασθενείς σε transcriptomic επίπεδο

Σας ρώτησε αν α) η μεταστατική θέση σε λεμφαδένες μπορεί να επηρεαστεί ακόμη και πριν από τη μετάσταση έχει λάβει χώρα και αν β) ακόμα μετάσταση χωρίς λεμφαδένες των ασθενών ρΝ1 θα μπορούσε να είναι περισσότερο στα πρόθυρα της μεταστατικής εισβολής από εκείνες των ασθενών PN0 και εάν γ) Ως εκ τούτου, οι εν λόγω «ρΝ1» λεμφαδένες μπορεί να εμφανίζουν διακριτή μεταγραφική απορρυθμίσεις που σχετίζονται με την προετοιμασία θέση

Εμείς περιλαμβάνονται όγκου των περιφερειακών λεμφαδένες από 14 ασθενείς με καρκίνωμα του οισοφάγου (n = 9 ασθενείς ρΝ1.? n = 5 ασθενείς PN0) για να διερευνήσει την έκφραση γονιδίου στο δυναμικό μεταστατική θέση. Επιπλέον συλλέξαμε ένα αντιστοιχισμένο όγκο μακρινό λεμφαδένα από κάθε ασθενή για να χρησιμεύσει ως αναφορά για τις περιφερειακές κόμβους (Σχ. 1). Στη συνέχεια αναλύθηκαν σε transcriptomic επίπεδο από την τεχνολογία των μικροσυστοιχιών.

Το κλειδί για το έργο που παρουσιάζονται εδώ είναι ότι όλοι οι κόμβοι διερευνηθεί επιβεβαιώθηκαν να είναι ιστοπαθολογικά και ανοσοϊστολογικά μετάσταση και μικρομεταστάσεων-free, ανεξάρτητα από την κατάταξη ρΝ1 /PN0 ασθενών και του θέση σε σχέση με τον όγκο. Αυτό θα πρέπει να είναι δυνατή η αναγνώριση των πρώιμων αλλαγών που συμβαίνουν

πριν

σε μετάσταση παλιννόστησης. Πληροφορίες για τους ασθενείς »ηλικία, το φύλο, ιστολογία ή ταξινομήσεις παρέχεται στον Πίνακα S1.

Για τον εντοπισμό των πιθανών προ-επεμβατική αλλαγές συγκρίναμε τις περιφερειακές λεμφαδένες με τους μακρινούς λεμφαδένες χρησιμοποιώντας ένα paired t-test κατά το δύο ομάδες (PN0, ρΝ1). Τα καρκινικά μακρινό λεμφαδένες χρησίμευσαν ως αναφορά για τις περιφερειακές κόμβους, έτσι ώστε up-κανονισμοί απεικονίζουν εκείνα τα γονίδια με ένα υψηλότερο επίπεδο έκφρασης στα περιφερειακά κόμβους και κάτω κανονισμοί αντίστοιχα αυτά τα γονίδια με ένα χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης. Η T-test ακολουθήθηκε από μια διαδικασία bootstrapping να λογοδοτήσει για πολλαπλές δοκιμές. Όπως τιμές αποκοπής διορθωμένη τιμή ρ 0,05, μία ακατέργαστη ρ-τιμή των 0,01 και ένα σήμα-log-αναλογία (SLR) του ± 0,7 χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η κορυφή ρυθμιζόμενα γονίδια. Οι πιο σημαντικές υποψηφίων που εμφανίζονται στον Πίνακα 1, τα πλήρη στατιστικά στοιχεία που παρέχονται στον Πίνακα S2.

Η

Η εφαρμογή αυτών των κατώτατων ορίων που προσδιορίζονται 173 μεταγραφές (128 γονίδια) σημαντικά ρυθμίζονται μεταξύ των περιφερειακών και μακρινό λεμφαδένες της pN0- διαβαθμισμένων ασθενείς. Αρκετά από αυτά τα γονίδια που σχετίζονται με την ανοσολογική απόκριση (όπως CD64, CD32,

FPR1

και

FPR2

, [18]

IGHG1

,

IL1R2

,

CCL23

,

MSR1

,

C5AR1

,

LILRA5

, [19] ή

LILRB2

[20]). Είναι ενδιαφέρον ότι ένα ζευγάρι του καρκίνου και των γονιδίων που σχετίζονται μετάσταση είχαν απελευθερωθεί, καθώς (όπως

L1CAM

(CD171), [21]

ereg

, [22], [23]

NOVA1

,

HPR

, [24] ή

LAMC2

[25], [26]). Επιρεγουλίνη, π.χ., είναι μια αγγειογενετική παράγοντας που μπορεί να μεταδοθεί μετάσταση, επιτρέποντας τα καρκινικά κύτταρα να παραβιάσει πνεύμονα ενδοθηλιακών εμποδίων και με τη σειρά με την απελευθέρωση τους στο σύστημα κυκλοφορίας [22], [23].

Σε αντίθεση εντοπίσαμε 134 απορυθμισμένη μεταγραφές (109 γονίδια συμπεριλαμβανομένων των

IGF1

,

DKK1

,

PRIMA1

και

LTF

) στις περιφερειακές λεμφαδένες του ρΝ1-ταξινομημένα ασθενείς. Μεταξύ αυτών των γονιδίων pro-πολλαπλασιαστική και αντι-αποπτωτικά μόρια κάτω-ρύθμιση – όπως

IGF1

και

LTF

τα οποία δρουν μέσω της ρύθμισης της ΑΚΤ οδού [27] και /2 οδό ERK1 σηματοδότησης [28] αντίστοιχα. PRIMA1 ρυθμίζει την έκφραση CXCR4 [29] -. Ένα μόριο που έχει ήδη περιγραφεί να συσχετίζονται έντονα με αυξημένη λεμφική μετάσταση [11], [12], [29]

Αξίζει να σημειωθεί ότι

DKK1

εκτεθεί η πιο σημαντική απορρύθμιση (2-φορές αλλαγή? p-value 0.0029). Το γονίδιο ήταν σαφώς κάτω-ρυθμίζονται στο πλαίσιο των περιφερειακών λεμφαδένες του ΡΝ1 ασθενών. DKK1 είναι ένας αναστολέας WNT μονοπάτι που έχει αποδειχθεί ότι είναι προγνωστική σημασία σε διάφορες οντότητες όγκων όπως ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του πνεύμονα, μυέλωμα, αλλά και σε οισοφαγικό καρκίνωμα [30] – [38]. Επιπλέον DKK1 αναφέρθηκε να είναι αυξημένα σε ορό ασθενών ESC [37].

επικυρωμένη 12 από τα πιο σημαντικά γονίδια μέσω RT-PCR (Εικ. 2). Για πέντε από αυτά τα γονίδια (

ISL 1

,

LAMC2

,

NOVA1

,

ereg

,

L1CAM

) ο κανονισμός για τις τάσεις και τις αντοχές επιβεβαιώθηκαν αν και οι ρ-τιμές που προσδιορίστηκαν κατά την ανάλυση PCR κυμάνθηκε μεταξύ 0,08 και 0,15, πιθανώς λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος. Επτά γονίδια (

IGF1

,

ΙΟΡΒΡ5

,

DKK1

,

LTF

,

TBX3

,

FOXG1

,

LILRA

) θα μπορούσε να επικυρωθεί με επιτυχία παρουσιάζοντας σημαντική p-τιμή κάτω από 0,05. Υψηλότερη σημαντικότητας (p-value των 3 * 10e-4) παρατηρήθηκε και πάλι για

DKK1

(βλέπε πίνακα S3).

εμφανίζεται το σήμα-log-αναλογίες των περιφερειακών λεμφαδένες σε σύγκριση στον όγκο μακρινό λεμφαδένες (αναφοράς) για ένα επιλεγμένο σύνολο των κορυφαίων γονιδίων που ρυθμίζονται.

η

μέχρι τη στιγμή πέντε ρΝ1 ασθενείς παρακολούθησης ανάλυση είχε πεθάνει, καθώς και ένα PN0 ασθενή. Ο τελευταίος ασθενής είχε εκτεθεί μετάσταση στους πνεύμονες σε μια εξέταση παρακολούθησης. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτός ο ασθενής αποτελεί μια ακραία άποψη του

DKK1

έκφραση που δείχνει μια ρύθμιση προς τα κάτω στις περιφερειακές λεμφαδένες.

Τα αποτελέσματα που περιγράφονται σε αυτήν την ενότητα δείχνουν ότι αυτά μετάσταση χωρίς ρΝ1 λεμφαδένες παρουσιάζουν κανονισμούς γονίδιο σαφώς διαφορετικές από εκείνες στις PN0 λεμφαδένες. Επιπλέον, δείχνουν ότι DKK1 μπορεί να σχετίζεται σημαντικά με τους υποκείμενους μηχανισμούς.

Τα λειτουργικά μοτίβα σε δείγματα PN0 και ρΝ1 είναι ξεχωριστές, αλλά στενά συνδεδεμένα

Με βάση αυτά τα ευρήματα ρωτήσαμε αν οι παρατηρούμενες κανονισμούς πράγματι απεικονίζουν διαφορετικούς μοριακούς μηχανισμούς – ή απλώς διαφορετικούς αντιπροσώπους των ίδιων μηχανισμών. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήθηκε σειρά γονιδίων εμπλουτισμό και την ανάλυση του δικτύου.

Επειδή το μέγεθος του δείγματος που χρησιμοποιείται στην εργασία μας είναι μάλλον μικρή η κατανομή p-value επηρεάζεται στο T-test. Λαμβάνοντας αυτό υπόψη και να καταστεί δυνατή η ενσωμάτωση των πιο ανεπαίσθητες αλλαγές, οι οποίες, ωστόσο, θα μπορούσε να προσθέσει τη μεγάλη εικόνα, αποφασίσαμε να χρησιμοποιήσουμε μια λιγότερο αυστηρή τιμή p ± 0,1 για τον εντοπισμό ρυθμιζόμενων γονιδίων που πρέπει να περιλαμβάνονται στην ανάλυση.

Η ανάλυσή μας έδειξε εντυπωσιακά διακριτό προφίλ (Εικ. 3) που χαρακτηρίζουν τα καρκινικά γειτονικών λεμφαδένων των ασθενών ρΝ1 και PN0. Τα αποτελέσματα έδειξαν μία σαφή ενεργοποίηση των μηχανισμών ανοσολογικής απάντησης στην ομάδα PN0. Τα ρυθμιζόμενα γονίδια συσχετίστηκαν με αυξημένη φλεγμονώδη αντίδραση, την παρουσίαση αντιγόνου, μειωμένο κυτταρική ανάπτυξη, το ανοσοποιητικό εντοπισμό κυττάρου και κυττάρου-προς-κύτταρο σηματοδότηση, ενώ πολλαπλασιασμό και σχετίζονται με τον καρκίνο των μηχανισμών μειώθηκαν.

εμφανίζονται είναι βιολογικά και μοριακές λειτουργίες και υπο-λειτουργίες που σχετίζονται με τα γονίδια ρυθμίζονται σε τοπικούς λεμφαδένες σε σύγκριση με τους μακρινούς λεμφαδένες (αναφοράς) του ρΝ1 ή PN0 ασθενείς. Τα μονά διαφανείς κύκλοι απεικονίζουν τις κύριες λειτουργίες, το χρωματιστό (κόκκινο: ενεργοποιημένο, μπλε: αδρανοποιημένο) κύκλοι απεικονίζουν κατά τα σημαντικά εμπλουτισμένη υπο-λειτουργίες (π.χ. μέσα ρΝ1 κύκλο κυτταρικού θανάτου: «απόπτωση των κυττάρων λευχαιμίας γραμμές» – κόκκινο, ή «κυττάρων επιβίωση »- μπλε). Μπλε υπο-λειτουργίες έχουν μια ισχυρή πρόβλεψη για να απενεργοποιηθούν, κόκκινο υπο-λειτουργίες που πρέπει να ενεργοποιηθεί. Το βαθύτερο το χρώμα τόσο πιο αξιόπιστη (z-score) είναι η πρόβλεψη του κράτους ενεργοποίησης του. Το μέγεθος των κύκλων αυξάνεται με τη σημασία (p-value) του Καταστατικού της λίστας γονιδίου με τις υπο-λειτουργίες. Η ανάλυση διεξήχθη με το λογισμικό Ingenuity Pathway Analysis. Μπορεί να φανεί καθαρά ότι η μετάσταση χωρίς περιφερειακή λεμφαδένες του ΡΝ1 ασθενείς παρουσιάζουν μια εντελώς διαφορετική ρύθμιση μοτίβου ότι εκείνοι των ασθενών PN0.

Η

Σε αντίθεση περιφερειακών λεμφαδένων ασθενών ρΝ1 παρουσίασαν μείωση του ανοσοποιητικού μηχανισμοί αντίδρασης που σχετίζεται (Εικ. 3). Επιπλέον, μειώνεται ο πολλαπλασιασμός καθώς και μειωμένη ιστός δομή, μορφολογία και ανάπτυξη παρατηρήθηκε από τη μία πλευρά – και ενισχυμένη απόπτωση και υποπλασία από την άλλη. Ώρα σοφός θα πρέπει να αναμένεται ότι αυτές οι λεμφαδένες θα είναι πιο κοντά στο σημείο της μεταστατικής εισβολής έτσι ήταν έκπληξη το γεγονός ότι η ανοσολογική απόκριση μοτίβο κάτω-ρυθμίζονται.

Επιπλέον, η ανάλυση προέβλεψε απενεργοποίηση της β-κατενίνης και κατάντη ρυθμιστές (Εικ. 4α). Μεταξύ των σημαντικότερων στόχων της β-κατενίνης,

VEGFA

,

CCND1

,

MSX1

,

ΙΟΡΒΡ5 και DKK1

παρουσίασαν μειωμένη έκφραση στη μικροσυστοιχία. Αν και μόνο με βάση τις στατιστικές πιθανότητες, η πρόβλεψη είναι αξιοσημείωτη, καθώς η ενεργός β-κατενίνης απαιτείται για

DKK1

έκφρασης. [39] Η πιθανή αδράνεια της β-κατενίνης, ως εκ τούτου μπορεί να συσχετίζονται με την παρατηρούμενη κάτω ρύθμιση του

DKK1

.

Η ανάλυση του δικτύου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Ingenuity Pathway Analysis. α) Μηχανιστικές δίκτυο της β-κατενίνης κατάντη ρυθμιστές προβάλλοντας προβλεπόμενη κατάσταση ενεργοποίησης και του ρυθμιστικού σχέση (ενεργοποίηση ή αναστολή) μεταξύ των μονών ρυθμιστικών αρχών. β-κατενίνης και μια σειρά από ρυθμιστικές κατάντη προβλέπεται να να αδρανοποιηθεί. β) Η ανάλυση δείχνει μια σφιχτή σύνδεση μεταξύ των γονιδίων που ρυθμίζονται στα δείγματα ρΝ1 (ανοιχτό γκρι κόμβους) και εκείνες που ρυθμίζονται στα δείγματα PN0 (σκούρο γκρι κόμβους) που συνδέονται με την ERK1 /2 και DKK1 ενσωματωμένα μέσα στο δίκτυο.

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το πώς σχετίζονται οι υποκείμενες μοριακά μονοπάτια είναι, συμπεριλάβαμε τους κανονισμούς γονιδιακή έκφραση παρατηρήθηκε σε δείγματα ρΝ1 (109 γονίδια) και σε δείγματα PN0 (128 γονίδια) σε ένα κοινό κατάλογο και εκτελείται ανάλυση του δικτύου. Είναι ενδιαφέρον ότι, παρά τη σαφή διαφορά στα προφίλ μοριακού μηχανισμού μεταξύ δειγμάτων ρΝ1 και PN0, η ανάλυση αποκάλυψε ότι πολλά από τα εμπλεκόμενα γονίδια (28/128 γονίδια PN0? 19/109 ρΝ1 γονίδια) φάνηκε να συνδέεται σφικτά (Σχήμα 4β.) Και στα δύο ομάδες -. με DKK1 ενσωματωμένα μέσα στο δίκτυο

στο σύνολό τους αυτές οι παρατηρήσεις προτείνουν ότι η μετάσταση χωρίς περιφερειακή λεμφαδένες των ασθενών ρΝ1 υπόκεινται ήδη σε μοριακές διαδικασίες διαφορετικές από εκείνες των ασθενών PN0 – αν και μετάσταση δεν έχει πραγματοποιηθεί ακόμα σε αυτούς τους κόμβους. Επιπλέον εμπλοκή του

DKK1

ρύθμιση μέσω της οδού /β-κατενίνης WNT φαίνεται πιο πιθανή. Τούτου λεχθέντος, θα μπορούσαν να συνδεθούν τα μοριακά δίκτυα που διέπουν αυτές τις διαφορετικές μορφές. Σε ΟΚΕ ασθενείς λεμφαδένα μετάσταση είναι μόνο θέμα χρόνου, εκτός εάν γίνεται έγκαιρη εκτομή του όγκου. Συνεπώς, φαίνεται ευλογοφανές ότι οι παρατηρούμενες μεταγραφική μοτίβα δεν συσχετίζονται με δύο εντελώς διαφορετικούς μηχανισμούς αλλά μάλλον απεικονίζουν δύο χρονικά σημεία της διαδικασίας προχωρεί.

DKK1 μπορεί να παρατηρηθεί σε διακριτές υποδομές του λεμφαδένα και σε ενδοθηλιακά κύτταρα αιμοφόρων

λόγω της σημασίας του

DKK1

στα αποτελέσματά μας και επειδή DKK1 έχει ήδη αποδειχθεί ότι είναι προγνωστική για την έκβαση ενός αριθμού των κακοήθων όγκων οντότητες [30] – [38] εστιάσαμε σε αυτό το μόριο σε ανοσοϊστοχημικές επικύρωσης. Εμείς χρωματίστηκαν τομές παραφίνης των διερευνήθηκαν λεμφαδένες χρησιμοποιώντας ένα πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι DKK1 και αντίθετη χρώση των τομών με αιματοξυλίνη. Η ανοσοϊστοχημική χρώση αποκάλυψε μια τάση της DKK1 να είναι λιγότερο εκφράζονται σε ρΝ1 ασθενών περιφερειακή λεμφαδένες (Εικ. 5α). Σε DKK1 θετικούς λεμφαδένες έκφραση του θα μπορούσε να παρατηρηθεί σαφώς στο subcapsular κόλπων και σε ορισμένες περιπτώσεις εκτείνεται εντός του διαμεσολαβητή κόλπων και δοκίδες (Εικ. 5β). Επιπλέον, σε ένα ζευγάρι της έκφρασης δείγματα DKK1 θα μπορούσε να παρατηρηθεί σε ενδοθηλιακά κύτταρα δοχείο (Εικ. 5c).

Οι λεμφαδένες βάφτηκαν χρησιμοποιώντας ένα πολύκλωνο αντίσωμα ενάντια DKK1 (1:100, Abcam, # ab61034) και αντίθετα με αιματοξυλίνη. α) Εκπρόσωπος DKK1 αρνητικών λεμφαδένων. μπαρ κλίμακας: 200 μm. β) Εκπρόσωπος DKK1 θετικό λεμφαδένα. Η subcapsular κόλπων σημειώνεται με (Ι) και του ενδιάμεσου κόλπων και δοκίδες με (II). μπαρ κλίμακας: 200 μm. γ) DKK1 θετικά αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα. μπαρ κλίμακα:.. 100 μm

Η

Συζήτηση

Αν και αρκετές ποσοστά εμφάνισης καρκίνου μειώθηκε στις Ηνωμένες Πολιτείες και άλλες δυτικές χώρες κατά τις τελευταίες δεκαετίες το ποσοστό επίπτωσης της οισοφαγικού αδενοκαρκινώματος έχει αυξηθεί [ ,,,0],40] Μία παραμέτρους που δείχνει την εξέλιξη της νόσου είναι επέκταση του όγκου που αποτελεί σήμερα τη βάση για την επιλογή της θεραπείας.