Αφηρημένο

Παρά τις δεκαετίες της προσπάθειας για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών και να εντοπίσει πολλά υποσχόμενη νέα φάρμακα, ο καρκίνος του προστάτη είναι θανατηφόρο αφού εξελίσσεται σε castration- ανθεκτική νόσο. Οι μελέτες δείχνουν λανθασμένη ρύθμιση των πολλαπλών διαδρομών σε ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC), αντανακλώντας την ετερογένεια των όγκων και επίσης υπαινίχθηκε ότι η στόχευση των υποδοχέων των ανδρογόνων (AR) μονοπάτι από μόνη της δεν μπορεί να είναι επαρκής για την αντιμετώπιση CRPC. Σε αυτή τη μελέτη, παρουσιάζουμε απόδειξη ότι η οδός /β-κατενίνης Wnt μπορεί να ενεργοποιείται σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη μετά από στέρηση ανδρογόνου για την προώθηση της ανδρογόνο-ανεξάρτητη ανάπτυξη, εν μέρει μέσω ενισχυμένη αλληλεπίδραση των β-κατενίνης με TCF4. Ανεξάρτητος από ανδρογόνο καρκίνου του προστάτη κύτταρα ήταν πιο επιρρεπείς να ενεργοποιεί μια Wnt-ρεπόρτερ, και η αναστολή της οδού /β-κατενίνης Wnt αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων αυτών στην αντιανδρογόνο δεύτερης γενιάς, enzalutamide. Συνδυασμένη θεραπεία enzalutamide και αναστολέα /β-κατενίνης Wnt έδειξαν αυξημένη καταστολή της ανάπτυξης και στις δύο ανδρογόνων που εξαρτώνται και ανεξάρτητη από κύτταρα καρκίνου του προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει θεραπευτικές δυνατότητες για την προσέγγιση αυτή

Παράθεση:. Λι Ε, Ha S, Logan SK (2015) Αποκλίνουσες ανδρογόνων υποδοχέων και βήτα-κατενίνης Σηματοδοσίας σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 10 (10): e0141589. doi: 10.1371 /journal.pone.0141589

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ΑΥΣΤΡΙΑ

Ελήφθη: 4 Αυγ 2015? Αποδεκτές: 9 Οκτ του 2015? Δημοσιεύθηκε: 28 Οκτ 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας R01CA112226 (SL) και American Cancer Society ΕΓΓ-11-108-01-CDD (SL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Συντομογραφίες : AR, υποδοχέα ανδρογόνων? APC, αδενωματώδη πολυποδίαση coli? CRPC, ο ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη? DHT, διυδροτεστοστερόνη? GSK3, γλυκογόνο συνθάσης κινάσης 3? iCRT3, αναστολέας της κατενίνης ανταποκρίνεται μεταγραφής 3? PI3K, phosphatidylinostitol-3 κινάσης? PTEN, φωσφατάση και tensin ομόλογο? TCF4, παράγοντας Μεταγραφή 4? UBE2C, ουβικουϊτίνη σύζευξη ενζύμου E2C

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες [1]. Με δεδομένο το σημαντικό ρόλο των ανδρογόνων υποδοχέων (AR) σηματοδότησης στην εξέλιξη της νόσου, η τρέχουσα συμβατική προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη είναι η στέρηση της θεραπείας ανδρογόνων συχνά σε συνδυασμό με τη θεραπεία με αντι-ανδρογόνο. Παρά την αρχική υποχώρηση του όγκου, επιθετική ασθένεια εξελίσσεται σε ευνουχισμό ανθεκτικά καρκίνου του προστάτη (CRPC), για την οποία η θεραπεία είναι η μεγάλη πρόκληση στον τομέα αυτό. Νέα φάρμακα που στοχεύουν το μονοπάτι AR, όπως η αντι-ανδρογόνο δεύτερης γενιάς, enzalutamide [2] και αμπιρατερόνη που εμποδίζει εγκριθεί εντός του όγκου παραγωγής ανδρογόνων [3] Έχουν FDA για τη θεραπεία της CRPC. Παρά την υπόσχεση αυτών και άλλων θεραπευτικών, που παρατείνουν τη ζωή μόνο 6-8 μήνες [4, 5], υποδεικνύοντας την ανάγκη για μια νέα προσέγγιση για τη θεραπεία της νόσου σε προχωρημένο στάδιο.

Λόγω των πολύπλοκων δικτύων σηματοδότησης σε προχωρημένο ασθένεια, αναστολή μίας οδού μπορεί να προκαλέσει απρόβλεπτες αποκρίσεις [6, 7]. Στο πλαίσιο αυτό, έχει προταθεί ότι οι όγκοι του προστάτη μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει εναλλακτικά μονοπάτια σηματοδότησης για την αντιστάθμιση των συνεπειών της αναστολής AR [8, 9]. Η αλληλεπίδραση μεταξύ των οδών ΡΙ3Κ και AR έχει μελετηθεί καλά και στην πραγματικότητα έχει αναφερθεί αμοιβαία ανάδραση μεταξύ των δύο οδών σε ΡΤΕΝ-διαγράφονται καρκίνο του προστάτη, που δείχνει τη σημασία της στόχευσης των δύο οδών σε ΡΤΕΝ-διαγράφεται ασθένεια [10]. Πιο πρόσφατα, προς τα πάνω ρύθμιση του υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών (GR) αναφέρθηκε στο enzalutamide ανθεκτικά όγκους [11], και φαίνεται να είναι αναγκαία για την ανθεκτική φαινότυπο. Ως εκ τούτου, θεραπευτικές προσεγγίσεις που στοχεύουν ταυτόχρονα πολλαπλές οδούς μπορεί να είναι πιο αποτελεσματική στη θεραπεία CRPC [6].

Πρόσφατα δεδομένα αλληλούχισης του γονιδιώματος έδειξε απορρύθμιση του Wnt-μονοπάτι στον καρκίνο του προστάτη με την εξέλιξη της νόσου. Η συγκριτική ανάλυση των δύο χωριστών αλληλούχιση ολόκληρου exome των δεδομένων, το ένα από πρωτογενείς όγκους [12] και το άλλο από θανατηφόρο μεταστατικών όγκων ευνουχισμός ανθεκτικών [13], αποκάλυψε ότι το γονίδιο APC (αδενωματώδη πολυποδίαση coli) ήταν μεταλλάσσονται συχνά στον πρωτογενή όγκους, αλλά μεταλλάσσεται πιο σημαντικά σε προχωρημένο στάδιο της νόσου [14]. Στην πραγματικότητα, η μεταγενέστερη στοιχεία δείχνουν ότι η Wnt-οδός είναι ένα από τα πιο σημαντικά μεταλλαγμένα περιόδων CRPC [13]. Σε συμφωνία με αυτό, WNT16B έκκριση στο μικροπεριβάλλον του όγκου προωθείται θεραπεία αντοχής στον καρκίνο του προστάτη μέσω της ενεργοποίησης του μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης [15]. Πιο πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι το 18% των περιπτώσεων του καρκίνου του μεταστατικού ευνουχισμού ανθεκτικά προστάτη εμφάνισαν μεταβολές στην οδό σηματοδότησης Wnt [16]. Οι εκθέσεις αυτές υποδεικνύουν ότι η οδός /β-κατενίνης Wnt μπορεί να είναι μία από τις αντισταθμιστικές μονοπάτια ενεργοποιούνται στον καρκίνο του προστάτη σε απόκριση σε θεραπεία στέρησης ανδρογόνων. Υποστηρίζοντας την ιδέα αυτή, η έκφραση μιας μετάλλαξης ενεργοποίησης της β-κατενίνης στον προστάτη του ποντικιού να ενεργοποιήσετε την συνεχή ανάπτυξη του προστάτη μετά τον ευνουχισμό [17].

ομάδα δημοσιευθεί προηγουμένως απόδειξη των μελετών έννοια δείχνουν μας ότι ένας μικρός αναστολέας μόριο του Wnt /β-κατενίνης οδού, iCRT3 (συντομευθεί C3) θα μπορούσε να μειώσει την έκφραση του mRNA AR και μεταγραφή των κατάντη γονιδίων στόχων με αλληλεπίδραση με β-κατενίνης αλληλεπίδραση /TCF στον υποκινητή AR. Δείξαμε επίσης ότι C3 θα μπορούσε να παρέμβει με την αλληλεπίδραση AR και β-κατενίνης πρωτεΐνη. Οι μελέτες αλληλεπίδρασης αργότερα πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκαν με την παρουσία υψηλών επιπέδων ανδρογόνων να σταθεροποιηθούν τα επίπεδα πρωτεΐνης AR έτσι ώστε να μην μειώθηκαν παρουσία αναστολέα β-κατενίνης [18].

εργασία που περιγράφεται σε αυτό το χειρόγραφο δείχνει ότι η δραστηριότητα του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt είναι χαμηλή σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη πιθανόν να οφείλεται στην προτίμηση για β-κατενίνης αλληλεπίδραση με AR παρά TCF4 σε αυτά τα κύτταρα. Παρατηρούμε ότι η καταστολή της δραστηριότητας AR από αποστέρησης ανδρογόνων, θεραπεία αντι-ανδρογόνο ή AR νοκ ντάουν προωθούνται γονιδιακή έκφραση Wnt /β-κατενίνης-στόχο και αυτό συσχετίζεται με αυξημένη αλληλεπίδραση μεταξύ TCF4 και β-κατενίνης. Η ενισχυμένη ενεργοποίηση της οδού /β-κατενίνης Wnt προκάλεσε την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP εξαρτώμενων από ανδρογόνα σε απουσία ανδρογόνων ή με την παρουσία αντι-ανδρογόνο. Η ενεργοποίηση του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt εξετάστηκε επίσης σε ένα ανεξάρτητο από ανδρογόνα υποσειρά των κυττάρων LNCaP, LNCaP-abl (abl). Abl κύτταρα που δημιουργούνται από τη συνεχή διέλευση σε ανδρογόνων εξαντλημένο μέσα και επιλέγονται για την ικανότητά τους να πολλαπλασιάζονται σε ανδρογόνο στερούνται κατάσταση [19]. Abl κύτταρα ήταν πιο επιρρεπείς σε ενεργοποίηση /β-κατενίνης Wnt από τα κύτταρα LNCaP, και η αναστολή της δραστικότητας β-κατενίνης από ένα μικρό μόριο αναστολέα ή siRNA αυξημένη ευαισθησία σε enzalutamide abl κύτταρα. Επιπλέον, συνδυασμένη αγωγή enzalutamide και ενός αναστολέα /β-κατενίνης Wnt παρουσίασαν αυξημένη αναστολή αύξησης τόσο σε LNCaP και abl κύτταρα, υποδεικνύοντας το θεραπευτικό δυναμικό αυτής της προσέγγισης.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

LNCaP (ATCC, CRL-1740) και LNCaP-abl (abl) [19] κύτταρα (δώρο από το Ζ Culig) καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Cellgro) συμπληρωμένο με 10% FBS (Hyclone), και 10% απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα FBS (cFBS? ορού εξαντλημένο στεροειδών συμπεριλαμβανομένου ανδρογόνα), αντίστοιχα, και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (Cellgro). 22Rv1 (ATCC, CRL-2505) και ΗΕΚ293 (ATCC, CRL-1573) κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Cellgro) συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Οι ακόλουθες ενώσεις χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση κυττάρων: C3 (ChemDiv, C523-1410), enzalutamide (Σέλεκ Chemicals) και αναστολέα GSK-3 (CHIR99021? Stemgent). Για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, qRT-PCR, ανοσοστύπωμα, προσδιορισμοί ανοσοκαθίζησης και το chip, LNCaP κύτταρα ορμόνη στερηθεί σε 5% μέσα ενημέρωσης cFBS για 2-3 ημέρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με ανδρογόνο, με ή χωρίς τις ανωτέρω ενώσεις.

Σταθερό ολοκλήρωση της eGFP Wnt-ρεπόρτερ σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Η λεντοϊού eGFP Wnt δημοσιογράφος, 7xTcf-eGFP /SV40-mCherry αγοράστηκε από Addgene (24.304). κύτταρα συσκευασίας (ΗΕΚ293Τ /17) (ATCC, CRL-11268) διαμολύνθηκαν παροδικά με 6 μg του κατασκευάσματος ανταποκριτή eGFP Wnt, 4 μg πλασμιδίου συσκευασίας (psPAX2) και 2 μg του φακέλου που εκφράζουν πλασμίδιο (pMD2.G) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μέσα προσαρμοσμένα από τα προϊόντα επιμόλυνσης συλλέχθηκε μετά από 24 και 48 ώρες. LNCaP, abl και 22Rv1 κύτταρα μολύνθηκαν με επώαση σε ρυθμισμένα μέσα όλη τη νύκτα και αφέθηκαν να ανανήψουν για μια ημέρα. Τα μολυσμένα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν και επιλέχθηκαν με έκφραση mCherry χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής.

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR)

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy (Qiagen), και έπειτα μεταγράφηκε ανάστροφα στους 55 ° C για 1 ώρα χρησιμοποιώντας Superscript III ανάστροφης μεταγραφάσης και ολιγο- (dT) 20 εκκινητές (Invitrogen). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του γονιδίου-ειδικούς εναρκτήρες και 2XSYBR πράσινο Taq-έτοιμο μίγμα (Sigma). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη μέθοδο DDCT χρησιμοποιώντας RPL 19 ως γονίδιο ελέγχου και ομαλοποιήθηκε ως προς τον έλεγχο δείγματα, τα οποία αυθαίρετα την τιμή 1.

ανοσοστυπώματος, ανοσοκαθίζηση και ανοσοχρώση

Για ανάλυση ανοσοστυπώματος, τα κύτταρα λύθηκαν σε Triton ρυθμιστικό διάλυμα και συμπληρωμένο με 1 mM PMSF, 1 mM Να

3νο

4, 10 mg /ml λευπεπτίνη και 10 mg /ml απροτινίνης. Πρωτεϊνικά λύματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με τα ακόλουθα αντισώματα έναντι: AR (441), β-κατενίνης (Η-102), TCF4 (Η-125, Santa Cruz Biotechnology)? ενεργός β-κατενίνης (κλώνος 8E7, Millipore)? τουμπουλίνης (Covance). Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια ανίχνευσης ECL Western Blotting (GE Healthcare). Image J λογισμικό (ΝΙΗ) χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων της πρωτεΐνης.

Σε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης κύτταρα λύθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω. Πρωτογενή αντισώματα που αναφέρονται παραπάνω προστέθηκαν σε τουλάχιστον 1,5 mg συνολικής πρωτεΐνης και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C που ακολουθείται από την προσθήκη σφαιριδίων αγαρόζης /G πρωτεΐνη Α (Santa Cruz Biotechnology) για 2 ώρες. Τα ανοσοσυμπλέγματα πλύθηκαν εκτενώς με ρυθμιστικό διάλυμα Triton και διαλυτοποιηθεί χρησιμοποιώντας Laemmli ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος (BioRad). Κανονική IgG ποντικού (Santa Cruz Biotechnology) ή κανονικό ορό κουνελιού (Sigma) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Για τη χρώση ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη σε PBS για 20 λεπτά, πλύθηκαν με PBS τρεις φορές, διαπερατά με 0.2% Triton-X σε PBS για 20 λεπτά, αποκλείστηκαν με 5% κανονικό γίδινο και 5% φυσιολογικό ορό αλόγου σε PBS για 1 ώρα και επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι δραστική β-κατενίνης (Millipore) αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα φραγμού, όλη τη νύχτα σε 4 ΝΤΟ. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με FITC (Vector Lab) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Ακολούθως, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS τρεις φορές και τοποθετείται με διάλυμα στερέωσης DAPI (Vector Lab). Για την ανάλυση των επιπέδων eGFP και mCherry σε κύτταρα σταθερά ενσωματωμένο με 7xTcf ΕΟΡΡ /SV40-mCherry κατασκευάσματα, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, πλύθηκαν και κατέστησαν διαπερατά όπως περιγράφεται παραπάνω και τοποθετείται με διάλυμα στερέωσης DAPI.

Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων

Για τη δοκιμασία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων CyQUANT, 3 με 4 Χ 10

3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο μαύρη πλάκα 96 φρεατίων. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα με ορμόνες στερούνται που περιέχει 5% cFBS και καλλιεργήθηκαν για 2 έως 3 ημέρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αντιδραστήρια που υποδεικνύονται για κάθε πείραμα. Τα αντιδραστήρια προστέθηκαν κάθε δύο μέρες με περισσότερα μέσα και ίση ποσότητα οχήματος προστίθενται στην ομάδα ελέγχου. Σε διαστήματα 2-3 ημερών, δοκιμασία CyQUANT (Invitrogen, C35006)

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και αναλύθηκαν σε μία συσκευή ανάγνωσης πλακών SpectraMax M5 (Molecular Devices) τρέχει το λογισμικό SoftMax Pro®.

ChIP διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Οι πρωτεΐνες με διπλούς σταυροδεσμούς με DSP (Pierce) για 20 λεπτά και 1% φορμαλίνη για 10 λεπτά. Τα κύτταρα λύθηκαν, οι πυρήνες συλλέγονται και επαναιωρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα επεξεργασίας με υπερήχους, και sonicationed για 12 λεπτά (30 sec. Επί 30 δευτ. Off) σε συσκευή υπερήχων Bioruptor (Diagenode, μοντέλο XL). Ήχο διασπώμενα υλικά λύσεως προ-καθαριστεί για 2 ώρες με σφαιρίδια αγαρόζης /G πρωτεΐνη Α αποκλείσθηκαν με DNA σπέρματος σολομού (Millipore). Τα υπερκείμενα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα με τα ακόλουθα αντισώματα: ένα AR μίγμα (441) και AR (Ν-20), ή β-κατενίνης (Η-102). Τσιπ ελέγχουν διεξήχθη με φυσιολογική IgG ποντικού και φυσιολογικούς ορούς IgG κουνελιού. Ανοσοσύμπλοκα στη συνέχεια πλύθηκαν και cross-linking αντιστραφεί. DNA απομονώθηκε με κιτ καθαρισμού Qiagen PCR και qPCR διεξήχθη. Σχετική εμπλουτισμού υπολογίστηκε ως ποσοστό της εισόδου 4% κανονικοποιημένη σε IgG.

RNA-παρεμβολή (RNA-i)

Για την β-κατενίνης και AR νοκ ντάουν, siGENOME SMARTpool τα siRNA εναντίον της β-κατενίνης ή AR χρησιμοποιήθηκαν (Dharmacon). Για APC νοκ ντάουν, χρησιμοποιήθηκαν η ομάδα των τριών Silencer® Επιλέξτε τα siRNA εναντίον της APC (Ambion, s1433, s1434 και s1435). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με αντιδραστήριο διαμόλυνσης HiPerFect (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 1 Χ 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 24 φρεατίων σε μέσα με ορμόνες στερούνται που περιέχει 5% cFBS και το μίγμα του αντιδραστηρίου HiPerFect και siRNAs προστέθηκαν κατευθείαν στην κορυφή των κυττάρων. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 2 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αντιδραστήρια που υποδεικνύονται για κάθε πείραμα. Για δοκιμασία πολλαπλασιασμού CyQUANT, 3 με 4 Χ 10

3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο μαύρες πλάκες 96 φρεατίων σε μέσα με ορμόνες στερούνται που περιέχει 5% cFBS και το μίγμα των HiPerFect αντιδραστηρίου και APC siRNAs προστέθηκαν απευθείας πάνω από το κύτταρα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 2 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αντιδραστήρια που υποδεικνύονται για κάθε πείραμα. CyQUANT δοκιμασία διεξήχθη σε διαστήματα 2-3 ημερών, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Οι κυτταρικές σειρές σταθερά εξαντλημένο του β-κατενίνης παρήχθησαν με λεντοϊού pGIPZ shRNA έναντι β-κατενίνης (Open Biosystems, RHS4430-98912789) ή έναν έλεγχο shRNA (Open Biosystems, RHS4743). Μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα απλώθηκαν σε μια πολύ χαμηλή πυκνότητα και επιλέγονται για 10 ημέρες με 1 μg /ml πουρομυκίνη (Sigma). Κάθε αποικία ανθεκτικών κυττάρων συλλέχθηκε και επεκτάθηκε στα μέσα ενημέρωσης επιλογής για την οθόνη για τα επίπεδα της πρωτεΐνης β-κατενίνης. Επελέγησαν δύο κυτταρικές σειρές που δείχνει μέτρια μείωση του β-κατενίνης για τη δοκιμή enzalutamide ευαισθησία (sh-β-cat-1 και -2) για να ελαχιστοποιηθεί η ισχυρή ανασταλτική της ανάπτυξης δράση του β-κατενίνης knockdown (25).

αποτελέσματα

θεραπεία ανδρογόνων καταστέλλει δραστηριότητα Wnt-ρεπόρτερ σε LNCaP κύτταρα εξαρτώμενη από ανδρογόνο

για να μελετήσουμε τη δράση μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης στον καρκίνο του προστάτη, θα παρακολουθείται η ενδογενής δραστηριότητα /β-κατενίνης Wnt για ένα Wnt-δημοσιογράφος ανάντη της eGFP (7xTcf-eGFP /SV40-mCherry). Το κατασκεύασμα εκφράζει επίσης mCherry υπό την ουσιαστικά δραστική προαγωγό SV40 που δείχνει θετικά μολυσμένων κυττάρων [21]. LNCaP, LNCaP-abl (abl) και 22Rv1 κύτταρα καρκίνου του προστάτη μολύνθηκαν με φακοϊό που περιέχουν το κατασκεύασμα ανταποκριτή και τα κύτταρα ενσωματωθεί σταθερά με το κατασκεύασμα επιλέχθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας έκφραση mCherry. Wnt δραστικότητα γονιδίου αναφοράς ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας GSK-3 αναστολέα (GSK3-i? CHIR99021), ένας ισχυρός Wnt-ενεργοποιητής [22, 23]. δραστηριότητα ανταποκριτή eGFP Wnt αυξήθηκε παρουσία GSK3-i, που φαίνεται από την αυξημένη μεταγραφή του eGFP σε LNCaP-ABL κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τον ανταποκριτή. Η μεταγραφή eGFP ελαττώθηκε με την παρουσία του siRNA που στοχεύει β-κατενίνης (Σχήμα 1Α). Χρησιμοποιώντας αυτό το ρεπόρτερ, εξετάσαμε δραστικότητα του /β-κατενίνης μονοπάτι Wnt σε κύτταρα LNCaP ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη ανδρογόνου LNCaP-ABL και 22Rv1 κύτταρα [24, 25]. Παρά άφθονα επίπεδα του ενεργού, της πυρηνικής β-κατενίνης (Σχήμα 1Β), οι τρεις κυτταρικές γραμμές έδειξαν χαμηλή βασική δραστικότητα του Wnt-ανταποκριτή (Σχήμα 1 C). Η θεραπεία με GSK-3 αναστολέα (3μΜ) ενεργοποιείται δραστικότητα Wnt-ανταποκριτή σε μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα abl και κυττάρων 22Rv1 (Σχήμα 1D), υποδηλώνοντας ότι τα αυξημένα επίπεδα του β-κατενίνης χρειάστηκε να ενεργοποιήσετε Wnt /β-κατενίνης αποκρίνεται μεταγραφής. Ωστόσο, η θεραπεία των εξαρτώμενων από ανδρογόνα LNCaP κυττάρων με 3 μΜ GSK3-i είχε πολύ μικρή επίδραση επί της ρεπόρτερ Wnt (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, η Wnt-ρεπόρτερ δεν ενεργοποιήθηκε με την παρουσία υψηλότερων συγκεντρώσεων του αναστολέα GSK-3 (6 ή 9μΜ) (Εικ 1D). Το σχήμα 1 Ε δείχνει τα σχετικά επίπεδα mRNA του eGFP σε κάθε κατάσταση, με αυξημένη μεταγραφή eGFP σε GSK-3 abl κύτταρα επεξεργασμένα αναστολέα, αλλά όχι σε κύτταρα LNCaP.

A

, β-κατενίνης knockdown μειωμένη η ενεργοποίηση Wnt-αναφοράς σε απάντηση σε αναστολέα GSK-3. ABL κύτταρα μολύνθηκαν με eGFP Wnt-ρεπόρτερ (7xTcf-eGFP /SV40-mCherry) και επιμολυσμένα με si-ελέγχου ή σι – κατενίνης. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 2 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, 2 μΜ ή 3 μΜ αναστολέα GSK-3 για 24 ώρες. Τα σχετικά επίπεδα mRNA του eGFP υποδεικνύοντας Wnt δραστηριότητα αναλύθηκαν με qRT-PCR.

B

, τα επίπεδα της β-κατενίνης πυρηνικής (πράσινο) σε LNCaP, abl και 22Rv1 προστάτη καρκινικών κυττάρων προσδιορίστηκε με χρώση ανοσοφθορισμού.

C

, Εκπρόσωπος εικόνες φθορισμού που δείχνει το χαμηλό επίπεδο δραστηριότητας eGFP Wnt δημοσιογράφος σε LNCaP, ABL και 22Rv1 κύτταρα: Wnt δραστηριότητα (πράσινο), παρουσία των κυττάρων (mCherry, κόκκινο), και η πυρηνική τοποθεσία (DAPI, μπλε ).

D και Ε

, μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα abl και τα κύτταρα 22Rv1 είναι πιο επιρρεπή σε ενεργοποίηση των Wnt-ανταποκριτή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με αναστολέα GSK-3 για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε φθορισμού απεικόνισης (

D

) ή qRT-PCR για να μετρηθεί σχετικά επίπεδα mRNA του eGFP (

E

). Στις

Α-Ε

, διεξήχθησαν πειράματα στην κανονική μέσα ανάπτυξης της κάθε κυτταρικής σειράς όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι.

F και G

, ορμόνη-στέρηση αυξημένη ενεργοποίηση του Wnt-ρεπόρτερ σε κύτταρα LNCaP, η οποία μειώνεται από ανδρογόνο θεραπεία. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 9 μΜ αναστολέα GSK-3 σε πλήρη (i) ή ορμόνες στερούνται μέσου με /χωρίς 10 ηΜ δι-hydrotestosterone (DHT) για 24 ώρες (II και III). Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε απεικόνιση φθορισμού (

F

), ή qRT-PCR για να μετρηθεί σχετικά επίπεδα mRNA του eGFP (

G

). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και η ενδεικνυόμενη σφάλμα είναι η τυπική απόκλιση.

Η

Δεδομένου ότι β-κατενίνης αλληλεπιδρά με AR σε ένα ανδρογόνο τρόπο εξαρτώμενο [26-28], εμείς αιτιολογημένη ότι αποστέρησης ανδρογόνων μπορεί να ενισχύσει την αλληλεπίδραση β-κατενίνης με TCF, αυξάνοντας έτσι δραστηριότητα Wnt-δημοσιογράφος. Προς υποστήριξη αυτής της ιδέας, η θεραπεία των κυττάρων LNCaP με αναστολέα GSK-3 σε τακτά ορμόνη που περιέχει μέσα (κατάσταση i) σε σύγκριση με την ορμόνη-στερούνται μέσων (κατάσταση ii) οδήγησε σε αυξημένη ενεργοποίηση ανταποκριτή (Σχήμα 1 F) στην ορμόνη στερούνται κατάσταση. Η θεραπεία με δι-hydrotestosterone (DHT) μειωμένη αυτή την ενεργοποίηση ρεπόρτερ (Σχήμα 1F, προϋπόθεση iii), γεγονός που υποδηλώνει ότι η θεραπεία με ανδρογόνο καταστέλλει δραστικότητα ρεπόρτερ Wnt σε κύτταρα LNCaP. Το σχετικό επίπεδο της eGFP mRNA σε κάθε κατάσταση παρουσιάζεται στο Σχ 1G.

Η αναστολή της δραστικότητας AR ενισχύει Wnt /β-κατενίνης αποκρίνεται μεταγραφή

Όπως παρατηρήθηκε αυξημένη ενεργοποίηση του Wnt-ανταποκριτή σε συνθήκες ορμόνες στερούνται, υποθέσαμε ότι η αναστολή της δραστηριότητας AR θα μπορούσε να ενισχύσει Wnt /β-κατενίνης αποκρίνεται μεταγραφής. Για να δοκιμαστεί αυτή η ιδέα, η δραστηριότητα AR είχε κατασταλεί είτε ορμόνη στέρησης, θεραπεία αντι-ανδρογόνο (enzalutamide? [2]) ή εξάντληση AR siRNA μεσολάβηση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του αναστολέα GSK-3 να επάγει Wnt /β-κατενίνης αποκρίνεται μεταγραφής και τα σχετικά επίπεδα mRNA του Wnt-ανταποκριτή (eGFP) και ενδογενές γονίδιο στόχο Wnt /β-κατενίνης,

Axin2

, αναλύθηκαν. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, υψηλότερη επαγωγή Wnt-reporter και

Axin2

επίπεδα mRNA παρατηρήθηκαν σε κύτταρα LNCaP καλλιεργούνται σε ορμόνες στερούνται των μέσων ενημέρωσης, με την παρουσία ή enzalutamide κατεργάζεται με AR siRNA (Σχ 2Α-2C). Ως εναλλακτική λύση για GSK-3 θεραπεία αναστολέα επαναλάβαμε επίσης το πείραμα χρησιμοποιώντας APC knockdown για την ενεργοποίηση του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt. APC είναι ένα συστατικό του συμπλόκου καταστροφή β-κατενίνης και της διαγραφής APC ή μετάλλαξη απώλειας λειτουργίας έχει δειχθεί για τη σταθεροποίηση β-κατενίνης και ενεργοποιούν Wnt /β-κατενίνης αποκρίνεται μεταγραφής [29, 30]. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα σε GSK 3-αναστολέα επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 2Α-2C), η APC knockdown επαγόμενη υψηλότερη ενεργοποίηση του γονιδίου Wnt-reporter και

Axin2

μεταγραφή σε κύτταρα ορμόνες στερούνται ή αγωγή enzalutamide (Εικ 2Δ και 2Ε ), γεγονός που υποδηλώνει ότι AR καταστολή προωθεί Wnt /β-κατενίνης ενεργοποίηση σε κύτταρα LNCaP. Ωστόσο, abl κύτταρα εμφάνισαν υψηλά επίπεδα Wnt ρεπόρτερ και

Axin2

έκφραση σε απόκριση αναστολέα GSK-3 που μόνο ελάχιστα αυξημένη στις απουσία DHT ή παρουσία enzalutamide (Σχ 2F και 2G), με εξαίρεση του

Axin2

, η οποία δεν επηρεάστηκε από enzalutamide θεραπεία σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 2G). Η εξάντληση των AR με siRNA έδειξαν μία αύξηση στη δραστικότητα γονιδίου ανταποκριτού Wnt και

Axin2

mRNA σε αμφότερα LNCaP και abl κύτταρα (Σχ 2C και 2Η) υποδεικνύοντας ότι η μείωση του AR πρωτεΐνης έχει σαν αποτέλεσμα απελευθέρωση περισσότερων β-κατενίνης σε ένα κυτταρική πισίνα διαθέσιμη για την ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt /β-κατενίνης

LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 6 μΜ ή 9 μΜ του αναστολέα GSK-3 (

AC

).? abl κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 μΜ και 3 μΜ ή του αναστολέα GSK-3 (

F-Η

).

Α και F

, τα κύτταρα ορμόνη-στερηθεί για 3 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή αυξανόμενη συγκέντρωση της GSK-3 αναστολέα με /χωρίς 10 ηΜ DHT για 24 ώρες.

Β και G

, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή αυξανόμενη συγκέντρωση της GSK-3 αναστολέα με /χωρίς 10 μΜ enzalutamide (Enz) για 24 ώρες.

C και Η

, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με SI-έλεγχο ή SI-AR, καλλιεργήθηκαν για 2 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή την αύξηση της συγκέντρωσης του αναστολέα GSK-3 για 24 ώρες.

D και Ε

, κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με SI-έλεγχο ή αυξανόμενες ποσότητες SI-APC και είτε ορμόνης στερηθεί για 2 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή 10 ηΜ DHT για 24 ώρες (

D

), ή καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο για 2 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή 10 μΜ enzalutamide για 24 ώρες (

E

). Τα σχετικά επίπεδα mRNA του υποδεικνύεται γονιδίων αναλύθηκαν με qRT-PCR. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και η ενδεικνυόμενη σφάλμα είναι η τυπική απόκλιση.

Η

Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι σε κύτταρα LNCaP ανδρογόνο-εξαρτώμενη, η αναστολή της AR μπορεί να επιτρέψει τα κύτταρα του όγκου για την ενεργοποίηση μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης. Κάτω από συνθήκες ορμόνη στέρησης αυτό μπορεί να συμβεί κατά την έκθεση σε Wnt-σήματα πιθανόν υπάρχουν στο μικροπεριβάλλον του όγκου [15, 31, 32]. Σε αντίθεση, abl κύτταρα μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα που προέρχονται από κύτταρα LNCaP, φαίνεται έτοιμη για Wnt /β-κατενίνης ενεργοποίηση τόσο παρουσία και απουσία δραστηριότητας AR, υποδεικνύοντας ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ AR και Wnt μονοπάτια /β-κατενίνης μπορεί να ήταν τροποποιηθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε ανδρογόνων ανεξαρτησία.

ορμόνη στέρησης ενισχύει την αλληλεπίδραση της β-κατενίνης με TCF4

Δεδομένου ότι η β-κατενίνης αλληλεπιδρά με AR ή TCF να ενεργοποιήσετε AR ή Wnt /β-κατενίνης-απόκρισης μεταγραφής, αντίστοιχα, στον καρκίνο του προστάτη [33, 34], εξετάσαμε την κατάληψη β-κατενίνης επί AR και TCF θέσεις σύνδεσης χρησιμοποιώντας ανοσοκαθίζηση χρωματίνης (μάρκας) δοκιμασίες. LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DHT, η GSK-3 αναστολέα ή ένα συνδυασμό και των δύο για 4 ώρες σε ορμόνες στερούνται των μέσων ενημέρωσης. Τα σχετικά επίπεδα mRNA της Wnt /β-κατενίνης (eGFP Wnt-δημοσιογράφος και

Axin2

) και AR-στόχο (

PSA

) γονίδια σε κάθε κατάσταση, αναλύθηκαν (Σχήμα 3Α). β-κατενίνης πληρότητας επί TCF ή Ar θέσεις δέσμευσης εξετάστηκε επίσης (Σχήμα 3Β) για να προσδιοριστεί εάν η πρόσληψη β-κατενίνης συσχετίζεται με την έκφραση του γονιδίου στόχου. Όπως αναμενόταν, Wnt-reporter και

Axin2

επίπεδα mRNA αυξήθηκαν σε GSK-3 κύτταρα που κατεργάζονται αναστολέα, αλλά μειώνεται με την παρουσία του DHT και αναστολέα GSK-3 (Εικόνα 3Α). Συνεπής με τα επίπεδα του mRNA, β-κατενίνης είχε προσληφθεί σε θέσεις δέσμευσης TCF στο Wnt-reporter και

Axin2

σε απόκριση σε αναστολέα GSK-3, αλλά όχι στα κύτταρα συν-θεραπεία με αναστολέα GSK-3 και DHT (Σχήμα 3Β). Η μεταγραφή του

PSA

συνέβη σε απόκριση DHT, και αυτό δεν επηρεάστηκε από συν-θεραπεία με DHT και αναστολέα GSK-3 (Εικόνα 3Α). β-κατενίνης πληρότητας παρατηρήθηκε στο

PSA

ενισχυτή κατά την κατεργασία DHT, αλλά ελαττώθηκε κατά τη συν-θεραπεία με DHT και αναστολέα GSK-3 (Εικόνα 3Β), υποδηλώνοντας ότι στο πλαίσιο αυτό β-κατενίνης δεν είναι απαραίτητη για

PSA

μεταγραφή. AR αναλύθηκε επίσης? δείχνοντας πληρότητας στο

PSA

σε απόκριση σε θεραπεία DHT αλλά όχι δεσμευτική ανιχνεύθηκε σε ιστοσελίδες TCF των γονιδίων στόχων Wnt /β-κατενίνης σε κάθε θεραπεία (Εικ 3C).

A

, έκφραση της β-κατενίνης γονιδίων Wnt /στόχο (eGFP δημοσιογράφος και

Axin2

) και το γονίδιο στόχο AR (

PSA

) αναλύθηκε. LNCaP κύτταρα ήταν ορμόνη στερηθεί για 3 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, 10 ηΜ DHT, 9 μΜ αναστολέα GSK-3 ή ένα συνδυασμό και των δύο για 24 ώρες.

Β και Γ

, β-κατενίνης ή Ar δεσμευτική για τα γονίδια-στόχους αναλύθηκε χρησιμοποιώντας χρωματίνης-ανοσοκατακρήμνιση. LNCaP κύτταρα ήταν ορμόνη στερηθεί για 3 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, 100 ηΜ DHT, 9 μΜ GSK3-Ι ή ένα συνδυασμό και των δύο για 4 ώρες.

D και Ε

, κατενίνης αλληλεπίδραση με TCF4 ή AR αναλύθηκε χρησιμοποιώντας συνανοσοκαθίζησης. LNCaP κύτταρα ήταν ορμόνη στερηθεί για 3 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, 100 ηΜ DHT, 9 μΜ αναστολέα GSK-3 ή ένα συνδυασμό και των δύο για 4 ώρες. Τα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης είτε ανοσοστυπώθηκαν με υποδεικνυόμενα αντισώματα (

D

) ή υποβλήθηκαν σε συν-IP μελέτες (

E

) Ποσοτικοποίηση των β-κατενίνης και της ενεργού επίπεδα πρωτεΐνης β-κατενίνης δείχνονται παρακάτω πίνακες σε (

D

). Σχετική πυκνότητας είναι κανονικοποιημένες με όχημα μόνο, που να 1. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και η ενδεικνυόμενη σφάλματος είναι η τυπική απόκλιση.

Η

Για να προσδιορίσετε αν AR και β-κατενίνης πληρότητας στο στόχο γονίδια συσχετίζεται με δεσμευτικό β-κατενίνης είτε AR ή πρωτεΐνη TCF4, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς συνανοσοκαθίζησης. LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται για τις δοκιμασίες ChIP ανωτέρω, και προϊόντα λύσης πρωτεΐνης ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντίσωμα β-κατενίνης. Το σχήμα 3D δείχνει ότι AR σταθεροποιείται με κατεργασία DHT. Ενώ συνολικά επίπεδα β-κατενίνης παρέμειναν αμετάβλητες από 4 ώρες GSK-3 θεραπεία αναστολέα GSK-3 αναστολή αυξήθηκε ελαφρώς την πρωτεΐνη έκφραση της δραστικής μορφής του β-κατενίνης (μη φωσφορυλιωμένη στην σερίνη 37 και θρεονίνη 41, [35]), ανεξάρτητη από την παρουσία του DHT (Εικ 3D). Συνολικά, η θεραπεία DHT αυξημένη αλληλεπίδραση AR /β-κατενίνης και μειωμένη αλληλεπίδραση /β-κατενίνης TCF4 σύγκριση με την θεραπεία του οχήματος (σχήμα 3Ε), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [34, 36]. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα πλινθίου (Σχήμα 3Β), αναστολέα GSK-3 ενίσχυσε την αλληλεπίδραση /β-κατενίνης TCF4 αλλά συνδυαστική θεραπεία με DHT μειωμένη αυτή την αλληλεπίδραση (Σχήμα 3Ε). Επιπλέον, κύτταρα κατεργασμένα με DHT έδειξαν αυξημένη αλληλεπίδραση AR /β-κατενίνης, η οποία μειώθηκε σε παρουσία αναστολέα GSK-3 (Εικόνα 3Ε) σύμφωνο με μειωμένη AR για την για την

PSA

ενισχυτή στην παρουσία της GSK-3 αναστολέα και DHT (Σχήμα 3C). Είναι άγνωστο γιατί AR δεσμευτική για

PSA

και την αλληλεπίδραση με το β-κατενίνης μειώνονται όταν DHT είναι συν-θεραπεία με αναστολέα της GSK-3, αλλά αυτό το μειωμένο επίπεδο της AR για το

PSA

ενισχυτή ήταν ακόμα επαρκή για

PSA

μεταγραφής (Σχήμα 3Α, τα επίπεδα του PSA mRNA σε DHT vs DHT + GSK3-i).

Εν κατακλείδι, τόσο chip και συν-IP αποτελέσματα της ανάλυσης δείχνουν ότι η β- αλληλεπίδραση κατενίνης με TCF4 (Σχήμα 3Ε) και την πρόσληψη στο /β-κατενίνης γονιδίων στόχων Wnt (Σχήμα 3Β) αυξήθηκε σε απουσία ανδρογόνων, συνεπής με την ενισχυμένη /β-κατενίνης αποκρίνεται μεταγραφή Wnt υπό συνθήκες ορμόνη-εξαντλημένο (Σχ 1F, 2Α και 2D).

Αναστολή της AR και Wnt /β-κατενίνης οδών αυξάνει την ανάπτυξη καταστολή των LNCaP κυττάρων

Επειδή ένας από τους κυτταρικές αποκρίσεις του Wnt-οδός είναι να προάγει πολλαπλασιασμό [37, 38], ελέγξαμε εάν η αυξημένη ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt /β-κατενίνης σε απουσία ανδρογόνου ή παρουσία enzalutamide (Σχήμα 2Α, 2Β, 2D και 2Ε) προωθείται επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ορμόνες στερούνται μέσων συνελήφθησαν ανάπτυξη όπως αναμένεται [39], αλλά η GSK-3 θεραπεία αναστολέα ή APC νοκ ντάουν που προκαλείται από την ανάπτυξη παρόμοια με τη θεραπεία DHT (Σχήμα 4Α και 4Ε). επεξεργασία Enzalutamide επίσης καταπιεσμένη ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως [2] Ωστόσο, αυτή η ανασταλτική δράση της ανάπτυξης ανακουφίστηκε μετά από GSK-3 θεραπεία αναστολέα ή APC νοκ ντάουν (Σχήμα 4Β και 4F). Εξετάσαμε επίσης μεταγραφή ενός ρυθμιστικού γονιδίου κυτταρικού κύκλου φάση Μ,

UBE2C

, δείχθηκε προηγουμένως ότι είναι σημαντικά για την ανάπτυξη του μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κύτταρα [40]. Η θεραπεία αναστολέα GSK-3 οδήγησε σε προς τα πάνω ρύθμιση του

UBE2C

μεταγραφή παρόμοια με τη θεραπεία DHT (Σχήμα 4C), καθώς επίσης και απο-καταστολή του

UBE2C

σε enzalutamide συν-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ 4D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση /β-κατενίνης Wnt προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP απουσία ανδρογόνων ή παρουσία του enzalutamide, συνοδευόμενη από αυξητική ρύθμιση του

UBE2C

. Η επεξεργασία των κυττάρων με έναν αναστολέα του μονοπατιού Wnt /β-κατενίνης, iCRT3 (C3) [41], μείωσε την αυξητική δράση του αναστολέα GSK-3 με έναν δοσο-απόκρισης τρόπο (Σχήμα 4G και 4Η), υποδεικνύοντας περαιτέρω ότι η οδός /β-κατενίνης Wnt κατευθύνει ανδρογόνων-ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP.

AF

, η GSK-3 θεραπεία αναστολέα ή APC νοκ ντάουν προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP σε ορμόνες στερούνται ή enzalutamide ( Enz) αντιμετωπίζονται μέσα μαζικής ενημέρωσης.

Α και Β

, τα κύτταρα ορμόνη-στερηθεί για 3 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, 10 ηΜ DHT ή 6 μΜ GSK3-i (

A

), ή 10 ηΜ DHT με /χωρίς 10 μΜ Enz ή 6 μΜ GSK3-i (

B

) κάθε δύο ημέρες.

Γ και Δ

, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο (

A

) ή (

B

) για 24 ώρες και στη συνέχεια τα επίπεδα του mRNA σε σχέση του

UBE2C

αναλύθηκαν με qRT-PCR.

Ε και F

, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με SI-έλεγχο ή SI-APC, ορμόνη-στερηθεί για 2 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή 10 ηΜ DHT (

E

), ή 10 ηΜ DHT με /χωρίς 10 μΜ Enz (

F

) κάθε δύο ημέρες.

G και Η

, επεξεργασία των κυττάρων με τον αναστολέα Wnt /β-κατενίνης (C3) μειώνει την αυξητική επίδραση της GSK3-i. LNCaP κύτταρα ήταν ορμόνη στερηθεί για 3 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή 6 μΜ GSK3-i (

G

), ή 10 ηΜ DHT συν 10 μΜ Enz (

H

) με /χωρίς αυξανόμενες συγκεντρώσεις C3 κάθε δύο ημέρες.

I

, Co-θεραπεία του Enz και C3 δείχνει αυξημένη αναστολή αύξησης των κυττάρων LNCaP.