Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του πνεύμονα προκαλεί περίπου 1,2 εκατομμύρια θανάτους ετησίως σε όλο τον κόσμο, και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει το 85% όλων των καρκίνων του πνεύμονα. Η κατανόηση των μοριακών γεγονότων σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), είναι απαραίτητο να βελτιωθεί η έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία για την ασθένεια αυτή.

Μεθοδολογία και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Σε μια προσπάθεια να εντοπίσει τα νέα NSCLC σχετικές γονίδια, πραγματοποιήσαμε ένα γονιδίωμα-ευρεία διαλογή αριθμός χρωμοσωμικό αντίγραφο αλλαγές που επηρεάζουν την έκφραση του γονιδίου χρησιμοποιώντας τη συγκριτική γενωμική συστοιχίες υβριδισμό και την έκφραση του γονιδίου που βασίζονται μικροσυστοιχιών σε 32 ριζικά εκτομή δείγματα όγκων από το στάδιο Ι και II ασθενείς με NSCLC. Μια ενοποιητική εργαλείο ανάλυσης εφαρμόστηκε για να προσδιοριστεί κατά πόσον αριθμό χρωμοσωμικό αντίγραφο επηρεάζει τη γονιδιακή έκφραση. Εντοπίσαμε μια διαγραφή σε 14q32.2-33 ως κοινή μεταβολή NSCLC (44%), η οποία επηρέασε σημαντικά την έκφραση του γονιδίου για την HSP90, που κατοικούν στο 14q32. Η διαγραφή συσχετίστηκε με καλύτερη συνολική επιβίωση (Ρ = 0,008), η επιβίωση ήταν επίσης μεγαλύτερη σε ασθενείς των οποίων οι όγκοι είχαν χαμηλά επίπεδα έκφρασης του HSP90. Έχουμε επεκταθεί η ανάλυση σε τρεις ανεξάρτητες ομάδες επικύρωση των ασθενών με NSCLC, και επιβεβαίωσε χαμηλή έκφραση HSP90 να σχετίζεται με μεγαλύτερη συνολική επιβίωση (P = 0,003, P = 0,07 και P = 0,04). Επιπλέον, in vitro θεραπεία με έναν αναστολέα της HSP90 είχε ισχυρή ανασταλτική δράση σε κυτταρικές σειρές NSCLC.

Συμπεράσματα

Προτείνουμε ότι η στόχευση HSP90 θα έχει κλινικές επιπτώσεις για τους ασθενείς με NSCLC.

Παράθεση: Gallegos Ruiz MI, Όροφος Κ, Roepman P, Ροντρίγκεζ JA, Meijer GA, Mooi WJ, et al. (2008) Ένταξη της δοσολογίας γονιδίου και γονιδιακή έκφραση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, Ταυτοποίηση των HSP90 ως πιθανό στόχο. PLoS ONE 3 (3): e0001722. doi: 10.1371 /journal.pone.0001722

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Christoph Plass, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Δεκεμβρίου 2007? Αποδεκτές: 4η Φεβρουαρίου, 2008? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαρτίου 2008

Copyright: © 2008 Gallegos Ruiz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Παύλος Roepman απασχολείται από Agendia BV

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1] , και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει το 85% των καρκίνων του πνεύμονα. Η καλύτερη κατανόηση των μοριακών γεγονότων που καθορίζουν την ανάπτυξη και την εξέλιξη της νόσου μπορεί να συμβάλει στη βελτίωση της κλινικής διαχείρισης των ασθενών με NSCLC. Ένας αριθμός γονιδίων, π.χ. Ρ53, RAS, Ρ16 και EGFR, έχει αποδειχθεί ότι μεταβάλλεται στην NSCLC [2]. Δεδομένης της ετερογενής και πολύπλοκη φύση αυτού του τύπου του όγκου, είναι πιθανό ότι πολλά γονίδια οδήγηση NSCLC ογκογένεση δεν έχουν ακόμη προσδιοριστεί.

Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες πιστεύεται ότι είναι κρίσιμης σημασίας γεγονότα στην καρκινογένεση στον άνθρωπο, καθώς και αρκετές περιοχές του γονιδιώματος συχνά φιλοξενούν κέρδη DNA (3q, 5ρ, 7q, 8q, 11q και 16ρ) και ζημίες (3ρ, 4ιζ, 5q, 6q, 8ρ 9p και 13q, 17q) έχουν εντοπιστεί σε ασθενείς με ΜΜΚΠ [3]. Χρησιμοποιώντας συστοιχία βάση συγκριτική γενωμική υβριδοποίησης (aCGH) και μικροσυστοιχίες έκφραση γονιδίου, μεταβολές αριθμό αντιγράφων DNA και έκφρασης του γονιδίου μπορεί να μετρηθεί σε όλη την γονιδίωμα των κυττάρων του όγκου. Με το συνδυασμό των δεδομένων από αυτές τις αναλύσεις, είναι δυνατό να ληφθεί ένα ολοκληρωμένο γονιδίωμα ευρεία θέα εκτροπών γονιδίου δοσολογία και η επίδρασή τους επί της έκφρασης γονιδίου, οι οποίες θα μπορούσαν να βοηθήσουν στον εντοπισμό γονιδίων σημαντικών στην NSCLC [4].

ο παρούσας μελέτης, έχουμε διενεργήσει ολοκληρωμένη ανάλυση του αριθμού χρωμοσωμικό αντίγραφο και την έκφραση του γονιδίου σε ριζικά εκτομή δείγματα όγκων από 32 ασθενείς με ΜΜΚΠ. Δύο νέοι αλγόριθμοι, «CGH κλήση» [5] και «ACE-it» [6], εφαρμόστηκαν για την ανάλυση των δεδομένων. Εντοπίσαμε μια διαγραφή στην περιοχή του χρωμοσώματος 14q32.2-33 στο 44% των ασθενών με NSCLC. Η διαγραφή ήταν συνδεδεμένη με βελτιωμένη επιβίωση ασθενών, και συνδέθηκε με μειωμένη έκφραση HSP90, μοριακός συνοδός για αρκετές ογκοπρωτεΐνες που διερευνώνται ως νέο στόχο στην αντικαρκινική θεραπεία. χαμηλή έκφραση HSP90 συσχετίστηκε με βελτιωμένη επιβίωση στο 32 NSCLC ασθενείς που αναλύθηκαν αρχικά. Περαιτέρω ανάλυση των τριών ανεξάρτητων συνόλων των ασθενών με NSCLC επιβεβαίωσε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της επιβίωσης των ασθενών και την έκφραση της HSP90. Επιπλέον,

in vitro πειράματα δείχνουν

κυτταρικές σειρές NSCLC να είναι εξαιρετικά ευαίσθητη στην HSP90 αναστολέα 17-AAG. Τα δεδομένα μας προτείνουν και σημαντικό ρόλο για την HSP90 σε NSCLC.

Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

Το σύνολο δοκιμής αποτελείται από ριζικά εκτομή δείγματα όγκων από 32 ασθενείς με πρώιμο στάδιο NSCLC. Τρεις ασθενείς είχαν ένα χρόνο επιβίωσης λιγότερο από 30 ημέρες και θεωρήθηκαν μετεγχειρητική θανάτους. Ως εκ τούτου, αυτοί οι τρεις ασθενείς δεν περιλαμβάνονται στην ανάλυση η επιβίωση. Οι ασθενείς είχαν μια διάμεση παρακολούθηση 86 μηνών (εύρος 0,4 έως 135,5). Λεκτική συγκατάθεση είχαν ληφθεί από όλους τους ασθενείς και το χειρισμό των δειγμάτων ήταν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την ηθική του σκάφους «subcommissie voor de ethiek van het mensgebonden Onderzoek» από το Πανεπιστήμιο VU Ιατρικού Κέντρου του Άμστερνταμ.

Η πρώτη σύνολο επικύρωσης αποτελούνταν από 140 ριζικά εκτομή ασθενείς με NSCLC από την ευρωπαϊκή κοινοπραξία καρκίνο του πνεύμονα. Οι ασθενείς είχαν μια διάμεση παρακολούθηση 35 μηνών. Όλοι οι ασθενείς που περιλαμβάνονται δεν είχε καμία προηγούμενη κακοήθεια, παθολογικές το στάδιο του όγκου 1 ή 2 (T1-2), το στάδιο κόμβο 0 + 1 (N0-1), δεν μακρινή μετάσταση (M0) κατά τη στιγμή της λειτουργίας, και δεν υπάρχει υπολειμματική νόσος μετά την εκτομή ( R0). Κανένας από αυτούς τους ασθενείς έλαβαν (νεο) επικουρική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Η δεύτερη επικύρωση αποτελούνταν από 111 ασθενείς με πρώιμο στάδιο NSCLC από Bild et al. [7]. Το τρίτο σετ επικύρωση αποτελούνταν από τις διαθέσιμες στο κοινό «σύνολα δεδομένων 1 και 2» από Lu et al. [8] και περιείχε 54 ασθενείς πρώιμο στάδιο NSCLC. Μια πλήρης περιγραφή των χαρακτηριστικών και των τεσσάρων συνόλων ασθενή ασθενή παρέχεται στον Πίνακα 1.

Η

Η απομόνωση του γονιδιακού DNA και σειρά Συγκριτική Γονιδιωματική υβριδοποίηση

Η Cryo-τμήματα των δειγμάτων κατεψυγμένου ιστού, συνοδευτικά τα τμήματα που χρησιμοποιούνται για το RNA και την απομόνωση του DNA, επιβεβαιώθηκαν από τον παθολογοανατόμο μελέτη (WM) να περιέχει τουλάχιστον 50% των κυττάρων του όγκου. Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από κάθε δείγμα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Life Technologies, Breda, The Netherlands). επισήμανση DNA και υβριδοποίησης για CGH 30Κ μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων έγινε όπως περιγράφεται από τους Van den IJssel κ.ά. [9].

απομόνωση RNA και την έκφραση του γονιδίου μικρο συστοιχίες

απομόνωση RNA και την επισήμανση του cDNA που ακολουθείται τυποποιημένα πρωτόκολλα . Ο υβριδισμός διεξήχθη σε πλατφόρμα Agilent σύμφωνα με τυποποιημένες διαδικασίες που περιγράφονται από τον κατασκευαστή και αλλού [10].

Ανάλυση δεδομένων

Για array CGH, ανάλυση επιτόπου και τον έλεγχο της ποιότητας πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας BlueFuse έκδοση 3.2 ( BlueGenome, Cambridge, UK). Σημεία διακοπής, κέρδη, ζημίες και ενισχύσεις ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας την κλήση αλγόριθμο CGH. Αυτός ο αλγόριθμος μετατρέπει πρώτες log2ratios στην απόλυτη μέτρα «απώλεια», «κανονική», «κέρδος» ή «ενίσχυση» με την εφαρμογή ενός αλγόριθμου κατάτμησης σε συνδυασμό με ένα μοντέλο μίγμα πιθανότητα [11]. Προκειμένου να δοκιμαστεί στατιστικώς αν γονιδιακή έκφραση επηρεάστηκε από γονίδιο δοσολογία εφαρμόσαμε μια σειρά CGH εργαλείο ολοκλήρωσης έκφρασης, ACE-it [6], με την οποία το κάλεσε array CGH και κανονικοποιημένες αναλογίες log10 για συστοιχίες έκφραση χρησιμοποιήθηκαν ως δεδομένα εισόδου. ACE-χρησιμοποιεί τα Wilcoxon στατιστικά μονόπλευρη rank ποσό για να ελέγξετε ποια χρωμοσωμικές εκτροπές αριθμό αντιγράφων επηρεάζουν περιοδικά έκφραση RNA. υπολογίζονται p-τιμές προσαρμόζονται για πολλαπλές δοκιμές με τη μέθοδο Benjamini Hochberg [12]. ACE-δοκιμάζει μόνο γονίδια τα οποία πληρούν τα κριτήρια της μόλυνσης και της ισορροπίας, οι οποίες ελέγχονται μέσω ενός κατωφλίου για τον αριθμό των δειγμάτων. Εδώ το όριο καθορίστηκε σε ένα σταθερό προεπιλεγμένη ρύθμιση των 9 δειγμάτων, πράγμα που σημαίνει ότι ελήφθησαν υπόψη το γεγονός ότι είχε τουλάχιστον 9 δείγματα σε ένα CGH καθεστώς και όχι περισσότερο από 9 σε άλλη κατάσταση καλώντας μόνο οι χρωμοσωμικές θέσεις. Το σύνολο του array CGH σύνολο δεδομένων της σειράς των δοκιμών (n = 32) είναι διαθέσιμα σε βάση δεδομένων του GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo, αριθμός ένταξης GSE7878). Τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης και των δύο σετ δοκιμής (n = 32) και επικύρωσης που 1 (n = 140) για τα 359 γονίδια που προσδιορίζονται από ACE-it είναι διαθέσιμη στο Array βάση δεδομένων Express (www.ebi.ac.uk/aerep/σύνδεσης, αριθμός ένταξης Array σχεδιασμού: Α-Μπειραμ-749, τα δεδομένα Πείραμα:. E-TABM-270)

δεδομένα γονιδιακής έκφρασης της επικύρωσης που 2 ελήφθη χρησιμοποιώντας Affymetrix Hu133plus2 μάρκες (GEO αριθμός ένταξη GSE3141). Η μέση τιμή των MAS5 υπολογίζεται εντάσεις σήματος των τεσσάρων probesets ανίχνευση HSP90AA1 χρησιμοποιήθηκε στους υπολογισμούς μας.

Τα περιείχε δεδομένα γονιδιακής έκφρασης τρίτο σετ επικύρωση από Affymetrix Hu95 και Hu133 μάρκες (αριθμός ένταξης GEO GSE6253). Το τσιπ Hu95 περιείχε ένα probeset ανίχνευση HSP90AA1 και το τσιπ Hu133 περιείχε τέσσερα probesets, των οποίων η μέση τιμή των RMA υπολογίζεται εντάσεις σήματος χρησιμοποιήθηκε στους υπολογισμούς μας.

Στατιστικά

Μια μονοπαραγοντική παλινδρόμησης κατά Cox ανάλυση διεξήχθη για να διερευνηθεί η σχέση των αξιών γονιδιακής έκφρασης με το χρόνο επιβίωσης. Οι καμπύλες επιβίωσης κατασκευάσθηκαν με τη χρήση της μεθόδου και των διαφορών Kaplan Meier στη συνολική αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την δοκιμασία log-rank. Στο σύνολο ελέγχου, τρεις ασθενείς με λιγότερο από 30 ημέρες το χρόνο επιβίωσης αποκλείστηκαν από την ανάλυση επιβίωσης, ως το θάνατό τους θεωρήθηκε χειρουργική θνησιμότητα. Για τον προσδιορισμό των ανεξάρτητων αποτελέσματα της έκφρασης HSP90, ιστολογική υπότυπο, το στάδιο του όγκου, την ηλικία και το φύλο, έγινε μια πολυπαραμετρική ανάλυση Cox παλινδρόμησης. AP τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Multiplex απολίνωση εξαρτάται Probe Amplification (MLPA)

Για Multiplex απολίνωση εξαρτάται Probe Amplification (MLPA), το σύνολο ανιχνευτών subtelomere P070 (MRC Holland, Amsterdam, The Netherlands) που περιέχει ένα ανιχνευτή που βρίσκεται εντός της ζώνης 14q32.33 (περιοχή 104874216 να 105,070,384) χρησιμοποιήθηκε. MLPA διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας 100 ng DNA ως είσοδο. DNA που απομονώθηκε από το αίμα μιας δεξαμενής από υγιείς δότες που χρησιμοποιήθηκε ως δείγμα αναφοράς. σήματα Probe κανονικοποιήθηκαν διαιρώντας το εμβαδόν της κορυφής του χρωμοσώματος 14q από την περιοχή κορυφής του χρωμοσώματος 14ρ. MLPA δημιουργούνται 14ιζ /14p αναλογίες συναρτήσει των μέση κανονικοποιημένη log2ratios των ολίγο στην περιοχή 104787271000000000-105.071.522000000000 δισεκατομμύρια από τη συστοιχία (συνολικά 11 ολίγο). Η περιοχή αυτή καλύπτει την περιοχή του ανιχνευτή MLPA.

Ποσοτική RT-PCR

Για να είναι έγκυρη τιμές έκφρασης που λαμβάνονται μέσω συστοιχίες γονιδιακής έκφρασης, πραγματοποιήσαμε ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιώντας την τεχνολογία TaqMan® και το μέσο Sequence Detection System ΑΒΙ PRISM 7500 εξοπλισμένο με την έκδοση 1.3.0 του λογισμικού SDS (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Εμπρός και όπισθεν εκκινητές και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν και παράγονται από την Applied Biosystems για HSP90AA1 (Hs00743767_sH), και για το γονίδιο GUSB ενδογενούς ελέγχου (Hs00939626_mi). PCR διεξήχθη σε ένα 25-μΙ όγκου αντιδράσεως που περιείχε 50 ng cDNA, 1 χ TaqMan PCR καθολική Master Mix, καθώς και τις ομάδες εναρκτήρα και διερευνητή για HSP90AA1 και GUSB. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις διπλούν, και οι τιμές μέσου όρου του κύκλου κατωφλίου (Ct) κάθε δείγματος για GUSB, αφαιρέθηκαν από τις μέσες τιμές Ct για HSP90AA1. Taqman δημιουργείται τιμές ΔCt είχαν καταγραφής μετατραπεί σε τιμές έκφρασης και συναρτήσει των Δlog2ratios μεταξύ GUSB και HSP90AA1 από τη συστοιχία έκφρασης.

μελέτες αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων

Η αναστολή της ανάπτυξης μετά από

in vitro

έκθεση στον κλινικά χρησιμοποιείται Hsp90 αναστολέα 17-AAG (InvivoGen, San Diego, CA) εξετάστηκε σε NSCLC κυτταρικές σειρές άγριου τύπου 4 EGFR (Η460, Η157, Η441 και Α549, που ελήφθησαν από τους Drs. Π Dennis και F. Kaye , NCI, Bethesda, MD). Εν συντομία, 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων ιστοκαλλιέργειας (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), αφέθηκαν να προσκολληθούν, και στη συνέχεια συνεχώς εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις της 17-AAG (0, 10, 30 , 100, 300, 1000 ηΜ) για 24, 48, ή 72 ώρες. Σε κάθε χρονικό σημείο, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν από τα φρεάτια, επωάστηκαν με trypan blue, και βιώσιμων (trypan blue-εξαιρουμένης) του αριθμού των κυττάρων προσδιορίστηκε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας ένα αιματοκυτταρόμετρο. Ο μέσος αριθμός των κυττάρων με πρότυπες γραμμές σφάλματος παρουσιάζεται σε κάθε χρονικό σημείο. Επιπλέον, το IC

50 (συγκέντρωση φαρμάκου στην οποία η αναστολή της ανάπτυξης κατά 50% επιτυγχάνεται) του 17-AAG στις 72 ώρες προσδιορίστηκε για κάθε κυτταρική γραμμή.

Αποτελέσματα

δοσολογία Gene -σχετικών αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης σε NSCLC

οι χρωμοσωμικές εκτροπές ήταν άφθονα στους 32 ασθενείς με NSCLC που αναλύθηκαν. Προκειμένου να εντοπίσει σημεία διακοπής των κερδών και ζημιών εφαρμόσαμε τον αλγόριθμο CGH κλήση [11]. Στον Πίνακα 2 οι χρωμοσωμικές περιοχές στις οποίες τα κέρδη ή οι ζημιές ήταν παρούσα σε τουλάχιστον 20% των ασθενών που παρατίθενται. Η στατιστική ACE-it εργαλείο [6] χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί αν αριθμού αντιγράφων γονιδίου επηρεάζονται γονιδιακής έκφρασης. Ένα σύνολο 359 μεταγραφές αποδείχθηκε να επηρεάζεται σημαντικά από τον αριθμό αντιγράφων. Στο Σχήμα 1, οι περιοχές που επηρεάζονται γονιδίων ενδείκνυται για 32 ασθενείς με NSCLC, εμφανίζεται με πράσινο χρώμα (που αποκτήθηκε περιοχές) ή κόκκινο (έχασε περιοχές).

Περίληψη οικόπεδο ονομάζεται κέρδη και ζημίες σε 32 εκτομή ασθενείς με NSCLC με αντίγραφο DNA αριθμός αλλαγών αναφέρεται σε γκρι. Οι θετικές τιμές δείχνουν το ποσοστό των δειγμάτων που βρέθηκαν με κέρδος. Αρνητικές τιμές δείχνουν το ποσοστό των δειγμάτων που φιλοξενούν μια απώλεια στη συγκεκριμένη θέση χρωμοσώματος. Τα γονίδια σε καθορισμένες περιοχές που πλήττονται από την αύξηση του αριθμού αντιγράφων που αναφέρονται στο πράσινο και τα γονίδια που επηρεάζονται από την απώλεια αριθμό αντιγράφων που αναφέρονται στο κόκκινο. Μια επιλογή των προσβεβλημένων γονιδίων υποδεικνύεται. Ο πλήρης κατάλογος των 359 επηρεαστεί κείμενα μπορούν να βρεθούν στο συμπληρωματικό πίνακα S1.

Η

Η μονοπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης Cox παλινδρόμησης έγινε για την έκφραση όλων των 359 γονίδια που εντοπίστηκαν να επηρεάζεται από τον αριθμό αντιγράφων (βλέπε συμπληρωματική S1 πίνακα). Μετά από πολλαπλές διόρθωση δοκιμή (χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Benjamini Hochberg) κανένα από τα 359 γονίδια παρέμεινε σημαντική για την επιβίωση σε αυτό το μικρό σύνολο των ασθενών (n = 32). Η κορυφή της λίστας των γονιδίων συσχετίζεται με την επιβίωση (κατατάσσεται στις πρώτες p-values) που περιέχεται κυρίως γονίδια βρίσκονται στα χρωμοσώματα 3 και 5 που έχει αποκτηθεί περιοχές. Παρατηρήσαμε επίσης ένα γονίδιο στη λίστα top-20, HSP90AA1, που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 14. Το γονίδιο HSP90AA1 (που γενικά αναφέρονται ως HSP90), που βρίσκεται στο 14q32.2, ήταν το μόνο γονίδιο στην περιοχή αυτή με σημαντικά μειωμένη έκφραση σε ασθενείς που έχουν προσβληθεί από την απώλεια αυτής της περιοχής (Ρ = 0,05). Αυτές οι παρατηρήσεις μας ώθησε να διερευνήσει αυτή την θέση με περισσότερες λεπτομέρειες.

Γονιδιωματική εκτροπές στο 14q και γονιδιακή HSP90AA1 συσχέτιση της έκφρασης με την επιβίωση

Εμείς διερευνηθεί η συσχέτιση της περιοδικής σφιχτό διαγραφή στην περιοχή 14q32.2- 33, με την επιβίωση. Είναι ενδιαφέρον ότι, ασθενείς στους οποίους έχει διαγραφεί η περιοχή αυτή είχε μια βελτιωμένη συνολική επιβίωση (OS) σε σύγκριση με τους ασθενείς που φιλοξενούν ένα φυσιολογικό γονίδιο δοσολογία σε αυτό το τόπο (5ετους OS 69% έναντι 41%, Ρ = 0,004-Σχήμα 2Α).

οι καμπύλες (Α) κατά Kaplan-Meier για ολική επιβίωση εμφανίζεται για 29 ασθενείς σε σχέση με το γονίδιο της δοσολογίας στην περιοχή του χρωμοσώματος 14q32.33. (Β) Η συνολική επιβίωση για τους 29 ασθενείς σε σχέση με την έκφραση HSP90. Χαμηλή έκφραση ορίστηκε ως έκφραση χαμηλότερα από το μέσο του συνόλου των 32 δειγμάτων, «κανονική» έκφραση ορίστηκε ως υψηλότερο από το μέσο 32 δειγμάτων. Τρεις από τους 32 ασθενείς συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση γονιδιακής έκφρασης δοσολογίας και εξαιρέθηκαν από την ανάλυση επιβίωσης εξαιτίας ενός χρόνου επιβίωσης λιγότερο από 30 ημέρες.

Η

Για να διερευνηθεί η έκφραση HSP90 σε σχέση με την επιβίωση, χωρίσαμε τους 32 ασθενείς σε δύο ομάδες με βάση την κατάσταση επιβίωσης τους δύο χρόνια μετά την εκτομή του όγκου. Περίπου οι μισοί από τους ασθενείς είχαν χαρακτηριστεί ως «υψηλού κινδύνου» και το ήμισυ ως «χαμηλού κινδύνου». Να προσδιορίσει αν οι δύο ομάδες κινδύνου θα μπορούσαν να διακριθούν με τη χρήση γονιδιακής έκφρασης της HSP90, κατασκευάσαμε εκτιμήσεις επιβίωσης Kaplan Meier για δύο εξίσου μεγάλες ομάδες με το «χαμηλό» και «κανονική», με βάση το μέσο έκφρασης HSP90. Χαμηλή έκφραση του HSP90 συσχετίστηκε με καλύτερη συνολική επιβίωση (5ετους OS 70% έναντι 40%, Ρ = 0,13-Σχήμα 2Β), αν και οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων ήταν αρχικά δεν είναι σημαντικές λόγω πιθανώς σε ένα συνδυασμό μίας χαμηλής μέγεθος της διαφοράς και ένας μικρός αριθμός των ασθενών που αναλύθηκαν.

Τεχνική επικύρωση της 14ιζ διαγραφής και της έκφρασης HSP90

Για να επικυρώσετε τη διαγραφή παρατηρείται στην περιοχή 14q32.2-33 πραγματοποιήσαμε πολλαπλή ενίσχυση εξαρτάται από την απολίνωση καθετήρα [13] (MLPA) ανάλυση χρησιμοποιώντας ένα probeset subtelomere περιέχει ένα καθετήρα στην περιοχή 14q32.33. Ο συντελεστής συσχέτισης (R

2) μεταξύ της απώλειας αυτής της περιοχής ανιχνεύονται από array CGH και MLPA ήταν 0,439.

Για να επικυρώσετε τα δεδομένα έκφρασης HSP90 που λαμβάνονται με μικροσυστοιχίες που πραγματοποιήθηκε ποσοτική RT PCR χρησιμοποιώντας το TaqMan® τεχνολογία. Παρατηρήθηκε μία καλή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της HSP90 που μετράται με τις δύο διαφορετικές τεχνικές (R

2 = 0,6431).

Επικύρωση της έκφρασης HSP90 και η σχέση με την επιβίωση στην ανεξάρτητη σειρά ασθενών

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης χαμηλή HSP90 και NSCLC πρόγνωση των ασθενών, χρησιμοποιήσαμε τρεις ανεξάρτητες ομάδες επικύρωση των ασθενών με NSCLC. Σε όλες τις τρεις ομάδες ασθενών, η «χαμηλού κινδύνου» /«υψηλού κινδύνου» κατανομή των ασθενών σε ολόκληρη ομάδες ασθενών ήταν περίπου τα δύο τρίτα έναντι ενός τρίτου. Συνεπώς, χρησιμοποιήσαμε την 33-εκατοστημόριο έκφρασης HSP90 ως αποκοπεί για τον διαχωρισμό των ασθενών με «κανονική» (δηλαδή υψηλού κινδύνου) και «χαμηλό» (δηλαδή χαμηλού κινδύνου) έκφρασης. Για όλα τα τρία σετ επικύρωσης, χαμηλή έκφραση HSP90 συσχετίστηκε με βελτίωση της συνολικής επιβίωσης. Η συσχέτιση αυτή ήταν σημαντική για το πρώτο και το τρίτο σετ επικύρωσης (Ρ = 0,003 και Ρ = 0,04), και οριακά σημαντική για το δεύτερο σετ (Ρ = 0,07) (Σχήμα 3). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η HSP90 προγνωστική αξία ήταν ανεξάρτητη από το στάδιο, ιστολογικό υπότυπο, την ηλικία και το φύλο των ασθενών (Πίνακας 3).

Η συνολική επιβίωση για (Α) 140 ασθενείς με ΜΜΚΠ, επικύρωσης που 1 (Β) 111 NSCLC ασθενείς, επικύρωσης που 2 και (Γ) 54 ασθενείς με ΜΜΚΠ, επικύρωσης που 3. Η αποκοπεί για την διάκριση μεταξύ χαμηλής και «κανονική» έκφραση βασίστηκε στο 33-εκατοστημόριο των τιμών έκφρασης.

Η

Επικύρωση Hsp90 ως βιώσιμη μοριακό στόχο σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών NSCLC

Hsp90 είναι ένα μοριακό συνοδό που σταθεροποιεί αρκετές ογκοπρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων EGFR, και αποτελεί μία νέα πιθανός στόχος για αντικαρκινική θεραπεία. Τα παραπάνω στοιχεία έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης της Hsp90 είναι ένα προγνωστικός δείκτης της μακροπρόθεσμης επιβίωσης σε μια μεγάλη σειρά ασθενών NSCLC, και υποδηλώνουν ότι οι αναστολείς της HSP90 μπορεί να έχουν ευρύτερη χρησιμότητα σε αυτή τη νόσο από ό, τι προηγουμένως αναγνωριστεί. Για να εξεταστεί αυτή η πιθανότητα, εξετάσαμε αν φαρμακολογική αναστολή της λειτουργίας Hsp90 θα επηρεάσουν το

in vitro

κυτταρική ανάπτυξη ενός πάνελ κυτταρικών γραμμών NSCLC. Η ανάπτυξη αυτών των κυτταρικών σειρών, όλα φέρουν EGFR φυσικού τύπου, ήταν βαθιά ανέστειλε, σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο, με υπο-μικρομοριακές συγκεντρώσεις του 17-AAG, έναν αναστολέα Hsp90 [14] επί του παρόντος σε κλινική δοκιμασία φάσης II (Σχήμα 4). Στις 72 ώρες, η IC50 ήταν κάτω από 50 ηΜ 17-AAG σε όλες τις περιπτώσεις, και υψηλότερες συγκεντρώσεις φαρμάκου οδήγησε σε αξιοσημείωτη συνέπεια κυτταροτοξικότητα.

(Α-Δ) χρόνου και δοσο-εξαρτώμενη αναστολή της in vitro ανάπτυξη του Η460, Η157, Η441 και Α549 κυτταρικές σειρές NSCLC μετά από έκθεση σε 17-ΑΑΟ. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 105 /φρεάτιο, και αριθμού βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε στις επόμενες ημέρες, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. 17-AAG συγκεντρώσεις στο (Η441) ή πάνω (Α549, Η460 & amp? Η157) 30 ηΜ ομοιόμορφα οδήγησε σε εξαρτώμενη από το χρόνο απώλεια της κυτταρικής βιωσιμότητας. Η τιμή IC50 του 17-AAG (συνεχής έκθεση για 72 ώρες) για κάθε κυτταρική σειρά είναι η εξής:. Η460 = 30 ηΜ, Η157 = 15 ηΜ, Η441 = 8 ηΜ, και Α549 = 20 ηΜ

Η

Συζήτηση

με βάση τα στοιχεία array-CGH στο NSCLC, έχει αποδειχθεί ότι υπάρχουν μονοπάτια πολλών μοριακών καρκινογένεση που είναι πιο πιθανό που σχετίζονται με τις συνήθειες φύλο και το κάπνισμα [15]. Επιπλέον, δείχθηκε ότι υπάρχει μεγάλη αλληλεπικάλυψη μεταξύ εκτροπές που παρατηρείται στην αδενοκαρκίνωμα και πλακώδες καρκίνωμα υπότυπο, εκτός από τα κέρδη 3q οποία φαίνεται να είναι πιο ειδική για τον υπότυπο πλακώδες καρκίνωμα [16]. Διάφορες υπογραφές γονιδιακής έκφρασης έχουν συσχετιστεί με την επιβίωση των ασθενών με NSCLC [17] – [19]. Επιπλέον, μοριακές μελέτες επέτρεψαν την ανάπτυξη εξατομικευμένων προσεγγίσεων θεραπείας σε διάφορους τύπους όγκων [20] – [22]. Ωστόσο, είναι πιθανό ότι πολλά σχετικά με τον καρκίνο γονίδια στόχου δεν έχουν ταυτοποιηθεί ακόμα. Από αυτή την άποψη, ολοκληρωμένη γονιδίωμα ευρεία διαλογή αριθμού αντιγράφων αλλαγές και γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες έχει πρόσφατα διεξαχθεί σε διάφορους τύπους όγκων για την ταυτοποίηση γονιδίων των οποίων η έκφραση επηρεάζεται από γονίδιο δοσολογία [4], [23] – [26]. Οι μελέτες αυτές αποσκοπούν στην ταυτοποίηση νέων γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο και να καθορίσει νέα βιοδεικτών για την αντιμετώπιση ή προγνωστικός υπογραφές. Και στις δύο NSCLC και πορογενές καρκίνο του παγκρέατος, έχουν δύο εστιακά ενισχύσεις των 8p12 και 20q11 έχουν μελετηθεί λεπτομερώς οδηγεί σε δύο υποψήφια γονίδια (WHSC1L1 και TPX2) σημαντική σε αυτές τις ασθένειες [16]

Εμείς εδώ εκτελείται ένα ολοκληρωμένο γονιδίωμα ευρύ διαλογή αριθμού αντιγράφων γονιδίου αλλαγές και γονιδιακή έκφραση σε 32 ριζικά εκτομή ασθενείς με NSCLC, για τον εντοπισμό νέων γονιδίων που σχετίζονται με NSCLC. Με τη χρήση της ACE-it, ένα μυθιστόρημα εργαλείο πληροφορικής για την ενσωμάτωση των γονιδίων δοσολογία και δεδομένων γονιδιακής έκφρασης, εντοπίσαμε 359 μεταγραφές να επηρεάζονται σημαντικά από τον αριθμό αντιγράφων. Μια ανάλυση επιβίωσης COX σε όλα τα 359 γονίδια δεν αποκάλυψε καμία σημαντική σχέση μετά από πολλαπλές δοκιμές. Η κορυφή της λίστας των γονιδίων που σχετίζονται με την επιβίωση περιλαμβάνονται κυρίως γονίδια που κατοικούν σε περιοχές που αποκτήθηκε 3q και 5p. Οι περιοχές αυτές καλύπτουν πολλά γονίδια και να εντοπίσει το γονίδιο της πιο σημαντικό είναι ένα δύσκολο έργο. Περαιτέρω έρευνες θα πρέπει να διευκρινιστεί η σημασία αυτών των γονιδίων σε σχέση με NSCLC, ιδίως όσων βρίσκονται στην κορυφή της λίστας των συσχέτιση με την επιβίωση, όπως SLC45A2, WDR70 και NIPBL (βλέπε συμπληρωματική S1 πίνακα). Στην εργασία αυτή επικεντρώθηκε στην υποτροπιάζουσα διαγραφή στο χρωμόσωμα 14 και την HSP90 γονίδιο, το οποίο ήταν επίσης στην κορυφή της λίστας του σχέση με την επιβίωση και που δεν έχουν προηγουμένως ερευνηθεί λεπτομερώς. Η διαγραφή της περιοχής 14q32.2-33 συσχετίστηκε με βελτιωμένη επιβίωση, υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι μπορεί να περιέχει ένα ή περισσότερα γονίδια που σχετίζονται με την εξέλιξη της NSCLC. Η διαγραφή της περιοχής αυτής έχει περιγραφεί προηγουμένως από μία ομάδα αναφοράς γονιδιωματική εκτροπές σε NSCLC, αλλά δεν διερευνήθηκε με περισσότερες λεπτομέρειες [27]. Από το 109 γονίδια χαρτογράφηση στην περιοχή 14q32.2-33, HSP90 ήταν το μόνο γονίδιο με σημαντικά χαμηλότερη έκφραση σε ασθενείς οι οποίοι φέρουν τη διαγραφή 14q32.2-33. Στην πρώτη σειρά 29 ασθενείς (3 ασθενείς αποκλείστηκαν από την ανάλυση επιβίωσης), παρατηρήσαμε βελτιωμένη επιβίωση σε ασθενείς με χαμηλότερα επίπεδα HSP90. Η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης HSP90 και NSCLC πρόγνωση των ασθενών επιβεβαιώθηκε να είναι σημαντική σε τρεις ανεξάρτητες ομάδες επικύρωση των ασθενών με NSCLC. Πολυπαραγοντική ανάλυση, συμπεριλαμβανομένων στάδιο, ιστολογία, την ηλικία και το φύλο έδειξε ότι HSP90 παρέμειναν ανεξάρτητα σχετίζονται με την επιβίωση.

Ένα κρίσιμο ζήτημα για τον καθορισμό «χαμηλά» και «κανονική» έκφραση είναι η επιλογή του κατάλληλου αποκοπεί αξία. Στις αρχικές αναλύσεις χρησιμοποιήσαμε το μέσο των λόγων έκφρασης όπως αποκοπεί μεταξύ «χαμηλά» και «κανονική» έκφραση, δεδομένου ότι η χαμηλού κινδύνου και ο διαχωρισμός υψηλού κινδύνου των ασθενών ήταν ίση. Ωστόσο, στην επικύρωση ορίζει η χαμηλού κινδύνου και τις ομάδες επιβίωσης υψηλού κινδύνου δεν ήταν εξίσου ισορροπημένη (τα δύο τρίτα σε σχέση με το ένα τρίτο). Κατά συνέπεια, οι κόψει τιμές που χρησιμοποιούνται σε αυτά τα σύνολα δεδομένων δεν ήταν η μέση τιμή, αλλά το 33-εκατοστημόριο.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας ένα γονιδίωμα μεγάλη ενοποιητική ανάλυση του αριθμού αντιγράφων του γονιδίου και της έκφρασης ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει την έκφραση της HSP90 ως ένα σημαντικό γονίδιο σε πρώιμο στάδιο ασθενείς με NSCLC. HSP90 είναι μια πρωτεΐνη συνοδού που εμπλέκονται στην σταθεροποίηση των πολλαπλών ογκοπρωτεϊνών όπως EGFR, Her-2 και Akt [28]. Πρόσφατη εργασία έχει δείξει ότι HSP90 παίζει ένα ρόλο στη διατήρηση της δραστική διαμόρφωση του EGFR και ιδίως μεταλλάκτες EGFR [29], [30]. Δείχνουμε εδώ ότι αρκετές κυτταρικές σειρές που φέρουν NSCLC φυσικού τύπου EGFR είναι ευαίσθητοι στην αναστολή της HSP90, υποδεικνύοντας ότι η ανασταλτική επίδραση του 17-AAG δεν μπορούν να αποδοθούν αποκλειστικά στην μεταλλαγμένη EGFR. HSP90 έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως ένα πιθανό θεραπευτικό του καρκίνου στόχου και έρευνες των αναστολέων της HSP90 βρίσκονται σε εξέλιξη [31], [32]. Από αυτή την άποψη, τα κύτταρα γλοιοβλαστώματος που υπερεκφράζουν EGFR, αλλά ανθεκτική στην αναστολή από αναστολείς κινάσης EGFR, ήταν ευαίσθητα στην αναστολή της HSP90 [33]. Ως εκ τούτου, ενώ η Hsp90 μπορεί να απαιτηθεί για τη σταθεροποίηση υπερεκφράζεται ή μεταλλαγμένες EGFR, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν μια πιο ευρεία και σύνθετο ρόλο για την Hsp90 στη διαμεσολάβηση της ανάπτυξης NSCLC και την επιβίωση. Η χαμηλή ευαισθησία νανομοριακή παρατηρήθηκαν στις κυτταρικές γραμμές 4 δοκιμάζονται σε πειράματα μας, είναι σε συμφωνία με άλλες δημοσιευμένες αναφορές άκρως 17-AAG ευαίσθητες κυτταρικές γραμμές όγκου [34] – [36]. Αυτές οι συγκεντρώσεις είναι εύκολα επιτεύξιμη σε ασθενείς για παρατεταμένες χρονικές περιόδους χρησιμοποιώντας την τρέχουσα προγραμματισμού και τα δοσολογικά σχήματα [37].

Εν ολίγοις, η παρατήρηση ότι το επίπεδο έκφρασης HSP90 είναι ένας προγνωστικός παράγοντας για την επιβίωση του ασθενούς NSCLC (ανεξάρτητα από EGFR κατάστασης μεταλλάξεων ), σε συνδυασμό με την ακραία ευαισθησία των κυττάρων NSCLC EGFR φυσικού τύπου με την Hsp90 αναστολέα 17-AAG, υποδηλώνει ότι οι αναστολείς της HSP90 μπορεί να έχουν μεγαλύτερη κλινική χρησιμότητα σε NSCLC από ό, τι προηγουμένως εξεταστεί και εγγυάται περαιτέρω διερεύνηση της εξάρτησης των άλλων πρωτο-ογκογονίδια σε αυτό συνοδού πρωτεΐνης σε NSCLC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

πίνακα S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0001722.s001

(0,03 MB PDF)

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε την ευρωπαϊκή κοινοπραξία καρκίνου του πνεύμονα για την παροχή δεδομένων γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών του 140 ανεξάρτητους ασθενείς με NSCLC? Ολλανδικό Ινστιτούτο Καρκίνου: Sjaak Burgers, Tony van de Velde? Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Γκντανσκ: Jacek Jassem, Αμέλια Szymanowska, Marcin Skrzypski, Barbara Szostakiewicz, Witold Rzyman? Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Bialystok: Jerzy Laudanski, Miroslaw Kozlowski, Λεχ Chyczewski? Thoraxklinik Χαϊδελβέργη: Michael Meister, Philipp A. Schnabel, Henrik Dienemann και Χανς Χόφμαν. Δίνουμε, επίσης, ιδιαίτερες ευχαριστίες μας προς Sjoerd Vosse (Τμήμα Παθολογίας, VU University Medical Center, Άμστερνταμ, Ολλανδία) για τις χρήσιμες συζητήσεις βιοπληροφορική και να Hans Gille (Τμήμα Κλινικής Γενετικής, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου VU, του Άμστερνταμ, Κάτω Χώρες) για την εκτέλεση ανάλυση MLPA.