Αφηρημένο

Ο κύριος σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να διερευνηθεί η πιθανή επίδραση του εκχυλίσματος ακετόνης του

Ficus religosa

φύλλο (FAE) σε πολλές σηματοδότηση απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού. θεραπεία FAE επάγεται σημαντικά τη δόση και εξαρτώνται από το χρόνο, μη αναστρέψιμη αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του καρκίνου του μαστού με μέτρια τοξικότητα σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του μαστού. Η παρατήρηση αυτή επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία σουλφοροδαμίνης Β. ανάλυση του κυτταρικού κύκλου από ροής έδειξε κυτταρομετρία διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 φάση και επαγωγή της κορυφής υπο-G0. FAE επαγόμενη συμπύκνωση χρωματίνης και εμφανίζεται μία αύξηση σε αποπτωτικά πληθυσμού Annexin V-FITC /ΡΙ (φλουορεσκεΐνη ισοθειοκυανικό /ιωδιούχο προπίδιο) διπλή χρώση. FAE διέγειρε την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού σε σύγκριση με φυσιολογικό διπλοειδή κύτταρα. Για να κατανοήσουμε τον ρόλο του Bax σε FAE επαγόμενη απόπτωση, χρησιμοποιήσαμε έναν ευαίσθητο πλατφόρμα κυττάρων MCF-7 κυττάρων που εκφράζουν Bax-EGFP. Bax μετατόπιση στα μιτοχόνδρια συνοδεύτηκε από τη διακοπή της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικού και εκσεσημασμένη αύξηση στη δραστηριότητα LEHDase (κασπάσης 9). Συνεπής με αυτά τα δεδομένα, FAE Η ενεργοποίηση της κασπάσης που επάγεται όπως αποδεικνύεται από την αλλαγή αναλογίας αισθητήρα FRET Caspase εκφράζουν MCF-7 κυτταρική γραμμή και η αποκοπή του εξέχοντα κασπάσες και PARP. Είναι ενδιαφέρον, FAE επιταχύνθηκε κυτταρικό θάνατο σε μια μιτοχονδριακή τρόπο που εξαρτάται σε συνεχή λειτουργία απεικόνισης ζωντανό κύτταρο υποδεικνύοντας πιθανή επίδραση φωτοευαισθητοποιητικούς του. Η ενδοκυτταρική παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) με FAE διαδραμάτισε έναν κρίσιμο ρόλο στη μεσολάβηση αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και φωτοευαισθητοποίησης δραστηριότητα. FAE επαγόμενη δόση και εξαρτώμενη από το χρόνο αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων η οποία σχετίζεται με Βαχ μετατόπιση και τα μιτοχόνδρια απόπτωση που διαμεσολαβείται με την ενεργοποίηση της κασπάσης 9 εξαρτώμενων αλληλουχίας κασπάσης. FAE κατείχε επίσης ισχυρή επίδραση φωτοευαισθητοποιητικούς για τον καρκίνο κυτταρική σειρά που διαμεσολαβείται μέσω της ταχείας μιτοχονδριακής μεμβράνης πιθανή απώλεια και τη μερική ενεργοποίηση της κασπάσης που αφορούν την παραγωγή των ενδοκυτταρικών ROS

Παράθεση:. Haneef J, MP, Thankayyan R SK, Sithul Η, Sreeharshan S (2012) Bax Μετεγκατάσταση διαμεσολαβούμενη μιτοχονδριακού απόπτωση και κασπάσης Εξαρτάται φωτοευαισθητοποίησης Επίδραση του

Ficus religiosa

σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (7): e40055. doi: 10.1371 /journal.pone.0040055

Επιμέλεια: Venugopalan Cheriyath, Texas A & amp? Μ University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Νοέμβρη 2011? Αποδεκτές: 4 Ιουνίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 6 του Ιουλ 2012

Copyright: © 2012 Haneef et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Πανεπιστήμιο της Επιτροπής Χορηγιών (UGC) και του Συμβουλίου της Επιστημονικής και Βιομηχανικής Έρευνας (CSIR), η κυβέρνηση της Ινδίας, ως Senior Research υποτροφίες με τον Δρ Haneef και ο Δρ Parvathy Μ αντίστοιχα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

φυτικά φυτά και τα φυτικά φάρμακα παράγωγα έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως σε παραδοσιακούς πολιτισμούς σε όλο τον κόσμο και έχουν κερδίσει σε δημοτικότητα στη σύγχρονη κοινωνία ως φυσικές εναλλακτικές λύσεις για την παραγωγή νέων πιθανών θεραπευτικών ενώσεων για την καταπολέμηση ασθενειών [1]. Η προώθηση επιδράσεις των συστατικών των φυτών και εκχυλίσματα υγείας γίνονται όλο και πιο μελετηθεί και η κατανάλωση τους είναι σε άνοδο [2]. Πολλά βότανα έχουν αξιολογηθεί σε κλινικές μελέτες και σήμερα αντικείμενο έρευνας phytochemically να κατανοήσουν ογκοκτόνο δράσεις τους έναντι διαφόρων μορφών καρκίνου. Δυστυχώς, η πλειοψηφία των μελετών που διεξήχθησαν σε μεμονωμένα μόρια που βρέθηκαν να είναι λιγότερο αποτελεσματικές ως παράγοντες προφύλαξης σε σύγκριση με φυτοχημικό κοκτέιλ που μπορεί να προκαλέσει τη δραστηριότητά τους κατά συνεργίας [3].

Φαρμακολογικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν επί του νωπού φυτικά υλικά του

F.religiosa

παρέχει μια ρεαλιστική υποστήριξη για πολλές παραδοσιακές χρήσεις του. φλοιό, φρούτα, φύλλα, τυχαία ρίζες, λατέξ και οι σπόροι του χρησιμοποιούνται ιατρικώς σε διάφορες μορφές, μερικές φορές σε συνδυασμό με άλλα βότανα [4]. Φυτοχημικές έρευνα που διεξάγεται στο

F.religiosa

είχαν οδηγήσει στην απομόνωση των φυτοστερολών, αμινοξέα, φουρανοκουμαρίνες, φλαβονοειδή, φαινολικές συστατικά, υδρογονάνθρακες, αλειφατικές αλκοόλες, πτητικά συστατικά και λίγες άλλες κατηγορίες δευτερογενών μεταβολιτών, τανίνες, στεροειδή , αλκαλοειδή και β-sitosteryl-ά-γλυκοζίτης, βιταμίνη Κ, η-εικοσιοκτανόλη, μεθύλιο oleanolate, λανοστερόλη, στιγμαστερόλη, Lupen-3-όνη [5], [6]. Singh

et al

[7] είχε προτείνει μια λεπτομερή έρευνα για το δυναμικό του κατά του καρκίνου, των καρδιαγγειακών, νευρο φλεγμονώδη, νευροψυχιατρικές, το οξειδωτικό διαταραχών που σχετίζονται με το στρες και παρασιτικές λοιμώξεις. Οι περισσότερες από τις φαρμακολογικές μελέτες στόχευαν στην επικύρωση παραδοσιακές χρήσεις του για την επούλωση τραυμάτων [8], [9], αντι-βακτηριακή [10], αντι-σπασμωδική [11], αντι-διαβητικό [12], αντι-οξειδωτικό [13] , αντι-φλεγμονώδη [14], ακετύλιο χολινεστεράσης ανασταλτική δράση [15] και δράση κατά του άγχους [16]. Το μεθανολικό εκχύλισμα του

F.religiosa

φύλλο εξασκεί ισχυρή νευροπροστατευτική δράση έναντι της φλεγμονής που προκαλείται από μεσολαβητές όπως μονοξείδιο του αζώτου και κυτοκινών σε LPS (λιποπολυσακχαρίτης) διηγερμένου μικρογλοία μέσω του ΜΑΡΚ (μιτογόνα Activated Protein Kinase) οδού [17] .

είδη Ficus

δείχθηκαν να έχουν αντι δραστικότητα πολλαπλασιασμού σε κυτταρικές σειρές όγκων και τα διάφορα μέρη του έχουν δείξει αποπτωτικά αποτελέσματα, παρέχοντας έτσι μια προκαταρκτική φαρμακολογική υποστήριξη για τη χρήση τους ως αντικαρκινικού φαρμάκου [18] . Μέχρι σήμερα, κανένα λογοτεχνία και πειραματική απόδειξη είναι διαθέσιμες για τεκμηριώνουν την αντικαρκινική και αποπτωτικό αποτέλεσμα

F.religiosa

εκχυλίσματα φύλλων σε πολλαπλές κύτταρα καρκίνου του μαστού. Αυτό μας ώθησε να ερευνήσει την πιθανή μηχανισμός της δραστηριότητας προαγωγή απόπτωσης και για την ταυτοποίηση επιπλέον βιολογική δραστηριότητα, εφόσον υπάρχει.

κυτταρικού κύκλου είναι μια διαδικασία που λειτουργεί ως κλειδί για τον έλεγχο της ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού ενός κυττάρου. Η διατάραξη της διαδικασίας του κυτταρικού κύκλου, θα προκαλέσει μια ανισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου, ακολούθως οδηγεί σε ανάπτυξη καρκίνου. Έτσι, κυτταρικού κύκλου θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως στόχος για αντικαρκινικούς παράγοντες για την ανάσχεση ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και να τα κινεί να υποστούν απόπτωση [19]. Η αποπτωτική διεργασία (ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος) είναι ένας σημαντικός μηχανισμός για την αντιμετώπιση κυτταροτοξική θεραπεία και στην επαγωγή του είναι ένα πολύ επιθυμητό

τρόπο λειτουργίας

για ένα αντικαρκινικό παράγοντα [20]. Μία από τις προκλήσεις στην θεραπεία του καρκίνου είναι ότι τα κακοήθη κύτταρα έχουν την ικανότητα να αποφύγει την απόπτωση, η οποία είναι η κύρια αιτία για την αναποτελεσματικότητα κάθε κυτταροτοξικού φαρμάκου για τη θανάτωση αυτών των κυττάρων. Η παρούσα μελέτη δείχνει την επίδραση του εκχυλίσματος ακετόνης του

F.religiosa

φύλλα με τη δόση και το χρόνο ανάπτυξης εξαρτώμενη αναστολή των πολλαπλών καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές που συνδέονται με Βαχ μετατόπιση και τα μιτοχόνδρια απόπτωση που διαμεσολαβείται με την ενεργοποίηση της κασπάσης 9 εξαρτάται από μονοπάτι. Ακόμα κι αν FAE επάγεται σημαντική ενεργοποίηση κασπάσης τόσο στην ενζυματική δοκιμασία, καθώς και σε ζωντανά μοντέλα κύτταρο αισθητήρα κύτταρο Caspase, η συνεχής έκθεση των κατεργασμένων κυττάρων αποκάλυψε μια απροσδόκητη δραστικότητα φωτοευαισθητοποίησης. Αυτή η μελέτη είναι σημαντική, διότι είναι η πρώτη έκθεση που παρέχει στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι οι βιο-διαθέσιμη συστατικά του

F.religiosa

εκχύλισμα φύλλων εξασκούν φωτοευαισθησία και την απόπτωση που προκαλεί την ικανότητα μέσω της παραγωγής των ενδοκυττάριων ROS.

αποτελέσματα

φυτοχημικές Ανάλυση

το φρεσκομαγειρεμένο ακατέργαστο εκχύλισμα ακετόνης του

Ficus

φύλλα (ΡΑΕ) ήταν ποιοτικά δοκιμάστηκε για την παρουσία των αλκαλοειδών, φλαβονοειδών, φαινόλες, σαπωνίνες και τανίνες ( Πίνακας 1) χρησιμοποιώντας τυποποιημένες διαδικασίες ανάλυσης [21]. χλωριούχο αργίλιο χρωματομετρική μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση φλαβονοειδή [22]. Η φλαβονοειδών περιεχόμενο του εκχυλίσματος σε ισοδύναμο κερκετίνης ήταν 79 ± 4 mg /g ξηράς κόνεως FAE. Οι συνολικές φαινόλες υπολογίζεται με τη μέθοδο Folin Ciocalteu [23] σε ισοδύναμο γαλλικού οξέος ήταν 110 ± 2,18 mg /g σε σκόνη εκχύλισμα.

Η

FAE αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό του Καρκίνου του Μαστού Γραμμές κυττάρων

το αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του FAE επί της ανάπτυξης των μαστικών επιθηλιακών κυττάρων, ΜΟΡ-10Α, MCF-7, MDAMB231, T47D και SKBR3 κύτταρα αρχικά προσδιορίστηκε με ΜΤΤ (3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιου) προσδιορισμός και κυτταροτοξικότητα από trypan δοκιμασία αποκλεισμού μπλε χρωστική ουσία. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του FAE (20 έως 320 μg /ml) για 24, 48 και 72 ώρες. FAE ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του μαστού σε μια δόση και χρονο-εξαρτώμενη τρόπο (Εικόνα 1Α). IC

50 τιμή για κάθε κυτταρικές γραμμές προσδιορίστηκαν από τα δεδομένα ΜΤΤ είναι – 363,6 μg /ml (επιθηλιακά κύτταρα του μαστού), 800 μg /ml (ΜΟΡ10Α), 83.3 μg /ml (MCF-7), 121,2 μg /ml ( MDAMB231), 81.6 μg /ml (T47D) και 75.47 μg /ml (SKBR3). Στις δύο μη ογκογόνα επιθηλιακά κύτταρα μαστού, FAE έδειξε μέτρια κυτταροτοξικότητα από τα καρκινικά κύτταρα. Μια δοκιμασία πρωτεΐνης βασίζεται σουλφοροδαμίνη Β εκτελέστηκε επίσης ότι τεκμηριώνεται τα αποτελέσματα ΜΤΤ (Σχήμα 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι FAE έδειξε μεγάλη εκλεκτικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα από τα φυσιολογικά κύτταρα. Επιπλέον, μικροσκοπική παρατήρηση επί της μορφολογίας των κυττάρων αποκάλυψε ότι η θεραπεία FAE επάγεται αισθητή αλλοιώσεις μορφολογία συμπεριλαμβανομένων διόγκωση της μεμβράνης και συρρίκνωση των κυττάρων, εκτός από τη μείωση στην πυκνότητα κυττάρου σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1 Ε), η οποία ήταν σύμφωνη με τις trypan δεδομένα μπλε χρωστική αποκλεισμού ( Σχήμα 1 C). Έχουμε εκτελέσει δοκιμασία κλωνογονικού κυτταρικής επιβίωσης να εκτιμηθεί η επίδραση της FAE επί του σχηματισμού αποικιών. θεραπεία FAE μείωσε σημαντικά τον αριθμό των αποικιών κατά εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο σε MCF-7 κύτταρα (Σχήμα 1 D).

(Α) MCF-7 πολλαπλασιασμού των κυττάρων εκτιμήθηκε με κύτταρα ΜΤΤ νίτω υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20, 40 , 80, 160 και 320 μg /ml του FAE για 48 ώρες. IC

50 τιμή για κάθε κυτταρικές γραμμές προσδιορίστηκαν από τα δεδομένα ΜΤΤ είναι- 363,6 μg /ml (μαστικά επιθηλιακά κύτταρα), 800 μg /ml (ΜΟΡ10Α), 83.3 μg /ml (MCF-7), 121,2 μg /ml ( MDAMB231), 81.6 μg /ml (T47D) και 75.47 μg /ml (SKBR3). (Β) Η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα τεστ βιωσιμότητας βασίζεται πρωτεΐνη Σουλφοροδαμίνη Β δοκιμασίας (C) Cell βιωσιμότητα με trypan δοκιμασία αποκλεισμού μπλε βαφή, τα κύτταρα MCF-7 υπέστησαν επεξεργασία με IC

50 του FAE για 24, 48 και 72 ώρες. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (D) FAE αναστέλλει σχηματισμό αποικιών κυττάρων καρκίνου του μαστού. Τα κύτταρα MCF-7 σπάρθηκαν σε έξι φρεατίων στα 500 κύτταρα /φρεάτιο σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS. Μετά από 12 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του FAE. Το μέσο με FAE αλλάχθηκε μετά από κάθε 4 ημέρες. Μετά από 14 ημέρες επώασης, οι αποικίες χρώθηκαν με 0,3% κρυσταλλικό ιώδες διάλυμα για 2 λεπτά, πλύθηκαν με PBS, ξηραίνονται στον αέρα και μετρήθηκαν. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. (Ε) Η αναστολή της ανάπτυξης και μορφολογικές μεταβολές των κυττάρων MCF-7 σε επεξεργασία σε IC

50 τιμή του FAE για 24, 48 και 72 ώρες, σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν με μια Leica DMIL ανεστραμμένο μικροσκόπιο (200 Χ).

Η

FAE προκάλεσε ήπια διακοπή του κυτταρικού κύκλου και Υπο-Go επαγωγή

αναλύσεις βιωσιμότητας κυττάρων επιβεβαίωσαν την ικανότητα της ΡΑΕ για την αναστολή MCF-7 κυτταρική ανάπτυξη. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής διεξήχθη για να προσδιοριστεί αν η ΡΑΕ επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης MCF-7 ήταν το αποτέλεσμα της επαγωγής της απόπτωσης ή διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή την ταυτόχρονη ενεργοποίηση αυτών των δύο τρόπων. Ένα αντιπροσωπευτικό ιστόγραμμα μαζί με κλειστούς δεδομένων δίνεται (σχήματα 2 Α και Β). Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η θεραπεία FAE στα 100 μg /ml για 24, 48 και 72 ώρες προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη δόση και το χρόνο αύξηση του ποσοστού των κυττάρων σε υπο-G

0 φάση, η οποία συνοδεύεται από μια αντίστοιχη μείωση του ποσοστού των κυττάρων σε S και G

2 /M φάση. Στις 24 ώρες έκθεση, δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή στην κατανομή φάση του κυτταρικού κύκλου. Η θεραπεία με FAE για 48 και 72 ώρες αύξησε τον κυτταρικό πληθυσμό του G

1 φάση σε 60,4% και 58,3% αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον έλεγχο 56.6% (σχήματα 2 Α και Β). Όλα αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι η ΡΑΕ που προκαλείται από ήπια G

1 σύλληψης φάσης και η επαγωγή της υπο-Go πληθυσμού. Όλες οι τιμές ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Σημαντικές διαφορές από την αξία ελέγχου υποδεικνύεται με * (ρ & lt? 0,05), ** (ρ & lt? 0,01) ή *** (ρ & lt? 0.001).

MCF-7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με FAE στα 100 μg /τιμή ml για 24, 48 και 72 ώρες και την κατανομή φάση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με χρώση ΡΙ και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Diva BD (Α). Το ποσοστό των φάσεων του κυτταρικού κύκλου φαίνονται στο ιστόγραμμα (Β).

Η

FAE Induced συμπύκνωση χρωματίνης και την απόπτωση

Hoechst 33342 χρώση των κυττάρων MCF-7 σε κατεργασία με FAE στο IC

50 για 24, 36 και 48 ώρες έδειξε επίσης την εμφάνιση χαρακτηριστικές αλλαγές αποπτωτικών όπως συμπύκνωση της πυρηνικής χρωματίνης (Εικόνα 3Α). FAE απόπτωση που επάγεται επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με διπλή χρώση αννεξίνης V-FITC /PI. Οι κυτταρικές αλλαγές που εμπλέκονται στη διαδικασία της απόπτωσης περιελάμβανε απώλεια του φωσφολιπιδίου ασυμμετρίας. Κατά την έναρξη της απόπτωσης, φωσφατιδυλοσερίνη, η οποία βρίσκεται κανονικά στο εσωτερικό στρώμα μεμβράνης πλάσματος, γίνεται μετατοπίζεται προς το εξωτερικό. Η Annexin V-FITC μπορεί να συνδεθεί με την εκτεθειμένη φωσφατιδυλοσερίνη επί της επιφανείας της πλασματικής μεμβράνης [24]. Αννεξίνη V-θετικών /αρνητικών κυττάρων PI θεωρήθηκαν πρώιμων αποπτωτικών, Αννεξίνη V θετική και ΡΙ θετικών κυττάρων ήταν αργά αποπτωτικά ή νεκρωτικές. Δεν υπήρξε καμία σημαντική αύξηση του πληθυσμού νωρίς ή αργά αποπτωτικό κυτταρικό στις 24 h θεραπεία με FAE (Σχήμα 3Β). Ωστόσο, μετά από 36 ώρες της αγωγής, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε στο 16,85% σε σύγκριση με τον έλεγχο 3,15%. Μετά από 48 ώρες αγωγής, ο συνολικός αποπτωτικό πληθυσμός αυξήθηκε μέχρι 53,4% (41,4% πρώιμων αποπτωτικών και 12% αργά αποπτωτικά, ρ & lt? 0,05? Εικόνα 3C).

(Α) Πυρηνική μεταβολές που συσχετίζονται με MCF-7 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με IC

50 αξία της ΡΑΕ μετά από χρώση Hoechst 33342 σύμφωνα με Eclipse Ε-600 μικροσκόπιο φθορισμού (400 ×). Ο αριθμός των κυττάρων που εμφανίζει χαρακτηριστικές αποπτωτική μορφολογία εκπέμπουν φωτεινή φθορισμού αυξήθηκε κατά εξαρτώμενο από το χρόνο τρόπο. (Β) FACS ανάλυση μέσω χρώσης /ΡΙ αννεξίνης V-FITC χρησιμοποιήθηκε για να τηρήσει την επαγωγή απόπτωσης. Τα κύτταρα στην κάτω δεξιά τεταρτημόριο δείχνουν Αννεξίνη-θετικών /αρνητικών PI, πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων. Τα κύτταρα στο πάνω δεξιά τεταρτημόριο δείχνουν Αννεξίνη-θετικών /PI θετική, αργά αποπτωτικών ή νεκρωτικών κυττάρων. (Γ) Το ποσοστό των κυττάρων που υποβάλλονται σε πρώιμη και όψιμη απόπτωση σε σύγκριση με τον αντίστοιχο έλεγχο σε θεραπεία με FAE για 48 ώρες, σε IC

50 τιμή. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Σημαντική διαφορά από την αξία του ελέγχου υποδείχθηκε από * (p & lt? 0,05).

Η

FAE εξαναγκασμένη μετατόπιση του Bax-GFP στα μιτοχόνδρια και την απώλεια του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικό δυναμικό σε μια εποχή με τρόπο που εξαρτάται

Bax είναι μια ισχυρή multi-domain προ-αποπτωτική πρωτεΐνη που βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα ως ανενεργές μονομερές σε υγιή κύτταρα. Κατά αποπτωτικά ερεθίσματα, Bax υφίσταται διαμορφωτική ενεργοποίηση οδηγεί σε μετατόπιση της στα μιτοχόνδρια. Αρκετές μελέτες είχαν προηγουμένως εμπλακεί ρόλος του Βαχ και διαμορφωτικά ενεργοποίηση της ως τα πρώιμα γεγονότα που συμβάλλουν στην απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια και την επακόλουθη ενεργοποίηση κασπάσης σε επαγόμενη από φάρμακα εγγενή σηματοδοτήσει απόπτωση [25]. Έχουμε απασχολούνται μια πλατφόρμα που βασίζεται ευαίσθητο κύτταρο, MCF-7 κύτταρα που εκφράζουν Bax-EGFP (Ενισχυμένη Πράσινη Φθορίζουσα Πρωτεΐνη) και Mito DsRed να ανιχνεύσει Βαχ μετατόπιση στα μιτοχόνδρια σε FAE θάνατο που επάγεται κυττάρου. Για να βαθμολογηθούν δραστηριότητας σε μεγάλο αριθμό ζωντανών κυττάρων, Διαδρομή Bio εικονοληψίας χρησιμοποιήθηκε με 2 × 2 montages όπως περιγράφεται [26]. Η αντιπροσωπευτική εικόνα των MCF-7 κύτταρα Bax EGFP μετά από αγωγή με 100 μg /ml του FAE δείχθηκε στο Σχήμα 4Α. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, ήδη 3 ώρες της φαρμακευτικής αγωγής σχεδόν 33,3% των κυττάρων παρουσίασαν κοκκώδη μιτοχονδριακή προτύπου στα κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Πριν από τη θεραπεία ΡΑΕ, η Bax-EGFP έδειξε διάχυτο του κυτταροπλάσματος μοτίβο που δείχνει μονομερή καθεστώς τους. Σε μετέπειτα ώρες, η πλειοψηφία των κυττάρων έδειξαν κοκκώδους μοτίβο με μαζική μεγάλο ολιγομερή Βαχ επί μιτοχόνδρια (Σχήμα 4Β). Μια μεγάλη μεγέθυνση της εικόνας του Βαχ αδρανών σε μιτοχόνδρια επίσης φαίνεται στο Σχήμα 4Β. Έχουμε παρατηρήσει μια πρόωρη αυξημένη μετατόπιση Bax σε Βαχ υπερεκφράζουν κύτταρα που συνάδει με την προηγούμενη έκθεση ότι η υπερ-έκφραση του Bax ευαισθητοποιημένων κυττάρων σε θάνατο λόγω της ίδιας της προ-αποπτωτική δραστικότητα του [27]. Το αποτέλεσμα τεκμηριώνεται με σαφήνεια ότι η πρόωρη ενεργοποίηση του Βαχ έπαιξε κρίσιμο ρόλο στη ΡΑΕ σηματοδότηση που προκαλείται απόπτωση. Αποσιώπηση του Βαχ χρησιμοποιώντας siRNA μειωθεί η συμπύκνωση της χρωματίνης σε FAE κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με κωδικοποιημένο αλληλουχία επιμολυσμένα κύτταρα (σχήματα 4 II και III). Περαιτέρω, είχαμε χρησιμοποιηθούν επιπλέον τρεις γραμμές κυττάρων καρκίνου του μαστού, MDAMB 231, SKBR3, T47D και δύο φυσιολογικά διπλοειδή κύτταρα στο προφίλ αποπτωτική δραστικότητα ΡΑΕ. Για την οπτικοποίηση της μιτοχονδριακής δυναμικό της μεμβράνης και συμπύκνωση χρωματίνης ταυτοχρόνως, κυττάρων μετά την αγωγή με 100 μg /ml του FAE επί 36 ώρες βάφτηκαν με μιτοχονδριακή μεμβράνη δυναμικό ειδική χρωστική TMRM και πυρηνική χρώση Hoechst 33342, όπως περιγράφεται [28]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, οι περισσότερες από τις αγωγή του καρκίνου του μαστού κύτταρα έδειξαν μείωση στην ένταση TMRM υποδεικνύοντας ότι το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης χάθηκε ότι συσχετίζεται καλά με συμπυκνωμένη χρωματίνη. Είναι ενδιαφέρον ότι και οι δύο ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα καθώς και τα ανθρώπινα μαστικά επιθηλιακά κύτταρα έδειξαν μικρότερη απώλεια ένταση TMRM και λιγότερο συμπύκνωση χρωματίνης από τα καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι FAE επάγεται κυτταρικό θάνατο στα περισσότερα κύτταρα καρκίνου του μαστού με την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και συμπύκνωση χρωματίνης. Η κανονική πολλαπλασιαζόμενα διπλοειδή κύτταρα ήταν σχετικώς ανθεκτικά σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από το ΡΑΕ. Ωστόσο, έδειξε επίσης μια διαφορά στον φθορισμό TMRM σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η διαπερατότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης μεταβάλλεται.

κύτταρα (Α) MCF-7 που εκφράζουν EGFP Bax και Mito DsRed σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων με γυάλινο πάτο πλάκα (BD, ΗΠΑ) με χαμηλή πυκνότητα και μετά από 48 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με FAE στα 100 μg /ml. Η εικόνα λήφθηκε χρησιμοποιώντας BD Pathway Bioimager 435 (Becton Dickinson, USA) στις 3, 18 και 27 ώρες με τον καθορισμό Montage (2 χ 2) και ειδικών Macro χρησιμοποιώντας λογισμικό AttoVision ™. Το πράσινο κοκκώδες συσσωμάτωμα υποδεικνύει την μετατόπιση του Βαχ στα μιτοχόνδρια, όπως υποδεικνύεται από τα βέλη. Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες συλλέχθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των ποσοστό θετικών κυττάρων με Βαχ EGFP σε μιτοχόνδρια σύγκριση με τις συνολικές στο πεδίο. (Β) Διάγραμμα που δείχνει το ποσοστό των κυττάρων που υποβάλλονται σε Βαχ μετατόπιση σε μιτοχόνδρια κατά την κατεργασία FAE. (Γ) Η MCF-Bax-DS Ερυθρά κύτταρα επεξεργάστηκαν όπως υποδεικνύεται ανωτέρω. Bax-EGFP συσσώρευση στα μιτοχόνδρια ενδείκνυται σε εικόνες υψηλής μεγέθυνσης με βέλη. Μια μεγεθυμένη συγχωνευμένη εικόνα των κατεργασμένων κυττάρων παρουσιάζεται επίσης. κύτταρα (D) MCF-7 επιμολύνθηκαν με ελέγχου (SCR) siRNA ή Βαχ siRNA. Μετά από 48 h επιμόλυνσης, εκχύλισμα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκε και ανοσοστυπώθηκαν για Βαχ και ακτίνη. Τα ίδια κύτταρα επίσης χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 μετά από 48 ώρες θεραπείας FAE να απεικονίσει συμπύκνωση της χρωματίνης (αριστερό πάνελ). Το γράφημα είναι η ποσοτική αναπαράσταση του ποσοστού των κυττάρων με συμπυκνωμένη χρωματίνη σε κωδικοποιημένα επιμολυσμένα και Bax-επιμολυσμένα κύτταρα μετά από θεραπεία FAE.

Η

(Α) Τα καρκινικά κύτταρα του μαστού, MDAMB231, T47D, SKBR3 και φυσιολογικά κύτταρα όπως τα κύτταρα ανθρώπινου μαστού Επιθηλιακά κύτταρα και ανθρώπινα ενδοθηλιακά μετά τη θεραπεία με FAE στα 100 μg /ml για 24 ώρες βάφτηκαν με 50 ηΜ TMRM και 0,5 μg /ml του Hoechst 33342 για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα απεικονίστηκαν υπό μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιώντας ϋΑΡΙ και σετ φίλτρων ροδαμίνης χρησιμοποιώντας 40 × στόχο. Οι εικόνες που έχουν ληφθεί με Retiga Έξι κάμερα χρησιμοποιώντας το λογισμικό στοιχείο NIS (Nikon). (Β) διάσπαση Ac-LEHD-AFC (κασπάση 9 δραστηριότητα) (C) διάσπαση Ac-DEVD-AMC (κασπάσης 3/7 δραστηριότητα). Τα κύτταρα MCF-7 υπέστησαν επεξεργασία σε IC

50 τιμή του FAE για 24, 36 και 48 ώρες. Τα αποτελέσματα μετρήθηκαν φθορομετρικά. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD δειγμάτων εις τριπλούν. Σημαντική διαφορά από την αξία του ελέγχου υποδείχθηκε από * (p & lt? 0.05), ** (p & lt? 0,01) ή *** (p & lt? 0.001). θεραπεία FAE είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη αύξηση φορά στην διάσπαση του Ac-LEHD-AFC (ακετυλο-Leu-Glu-His-Asp-7-αμινο-4-τριφθορομεθυλ κουμαρίνη) υποδηλώνει αυξημένη δραστικότητα της κασπάσης 9 (Σχήμα 5Β). Στις 24 θεραπεία h, χωρίς εξέχοντα διάσπαση του Ac-DEVD-AMC? Παρατηρήθηκε (υπόστρωμα για κασπάσες 3/7 ακετυλο-Asp-Glu-Val-Asp-7-αμινο-4-μεθυλοκουμαρίνη). Αξιοσημείωτη δραστηριότητα DEVDase συνέβη μόνο στα 36 της θεραπείας h με FAE. μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 50 μικρόμετρα.

Η

FAE Triggerd ενεργοποίηση της κασπάσης 9

Για να εξεταστεί η συμμετοχή των κασπασών σε FAE επαγόμενη απόπτωση, τις δραστηριότητες των εμπνευστής κασπάση 9, όπως (LEHDase) και τελεστές κασπάσης 7/3 όπως (DEVDase) δραστηριότητες που ερευνήθηκαν από την δοκιμασία φθορομετρικής πρωτεάσης. Τα κύτταρα MCF-7 υπέστησαν επεξεργασία με FAE στο IC

50 τιμή για 24, 36 και 48 ώρες και δραστηριότητες Caspase προσδιορίστηκαν. θεραπεία FAE είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη αύξηση φορά στην διάσπαση του Ac-LEHD-AFC (ακετυλο-Leu-Glu-His-Asp-7-αμινο-4-τριφθορομεθυλ κουμαρίνη) υποδηλώνει αυξημένη δραστικότητα της κασπάσης 9 (Σχήμα 5Β). Στις 24 θεραπεία h, χωρίς εξέχοντα διάσπαση του Ac-DEVD-AMC (υπόστρωμα για κασπάσες 3/7? Ακετυλο-Asp-Glu-Val-Asp-7-αμινο-4-μεθυλ κουμαρίνη) παρατηρήθηκε. Αξιοσημείωτη δραστηριότητα DEVDase συνέβη μόνο σε 36 ώρες θεραπείας με FAE (Σχήμα 5C).

FAE Induced κασπάσης ενεργοποίησης στο live Μοντέλο κινητό της κασπάσης Ενεργοποίηση

Πάνω αποτελέσματα έδειξαν ότι FAE απόπτωση που επάγεται κυρίως μέσω μιτοχόνδρια με τη μεσολάβηση ενδογενή οδό συμμετοχή Bax μεσολάβηση μιτοχονδριακής διαπερατότητας που ακολουθείται από κασπάση 9 και κασπάσης 3/7 ενεργοποίηση. Περαιτέρω, για να τεκμηριώσει το ρόλο των κασπασών σε FAE θάνατο επαγόμενο κυτταρικό, έχουμε χρησιμοποιήσει ένα FRET (Μεταφορά Ενέργειας Συντονισμού Φθορισμού) με βάση το μοντέλο ζωντανών κυττάρων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28] για να παρακολουθούν ενεργοποιημένα κασπασών σε ζωντανά κύτταρα. Εν συντομία, η κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού που εκφράζει τον ανιχνευτή FRET ECFP-DEVD-EYFP (Enhanced Κυανό φθορισμού Πρωτεΐνη κασπάσης 3 διάσπαση ειδική αλληλουχίας Ενισχυμένη κίτρινη φθορίζουσα πρωτεΐνη) εκτέθηκε σε ΡΑΕ σε 100 μg /ml και απεικονίστηκαν σε λειτουργία αναλογία. Κατά την ενεργοποίηση της κασπάσης, η FRET από το φθοροφόρο δότη στο δέκτη χάθηκε με την αύξηση της ECFP και μείωση του φθορισμού EYFP. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου έδειξε αυξημένο φθορισμό δέκτη από το φθορισμό του δότη που απεικονίζονται σαν μείωση στην αναλογία /EYFP ECFP (0.04) λόγω της αυξημένης φθορισμού μεσολάβηση δέκτη μεταφοράς ενέργειας. Ωστόσο, στα φρεάτια αγωγή, τα περισσότερα κύτταρα έδειξαν μία αυξημένη αναλογία προς 1,005 δείχνει την απώλεια της FRET λόγω κασπάσης με τη μεσολάβηση διάσπαση του συνδέτη DEVD τοποθετείται μεταξύ δότη και δέκτη με αύξηση ECFP και μείωση του φθορισμού EYFP. Τα αργά αποπτωτικά κύτταρα με αισθητή συρρίκνωση κυττάρων θεωρήθηκαν φωτεινά σώματα στην εικόνα με επαρκή μεταβολή αναλογία σε αναλογία εικόνας (Σχήμα 6Α).

(Α) κύτταρα MCF-7 που εκφράζουν Caspase FRET ανιχνευτές εκτέθηκαν σε 100 μg /ml του FAE για 24 ώρες και 48 ώρες. Τα κανάλια ECFP, EYFP-FRET και συγχωνεύθηκαν εικόνες για DMSO θεραπεία και FAE αντιμετωπίζονται τα κύτταρα εμφανίζονται. Η αναλογία εικόνα ECFP /EYFP παρουσιάζεται επίσης. Το γράφημα που παρουσιάζεται είναι η μεταβολή ποσοτική αναλογία σε DMSO και FAE επεξεργασμένα κύτταρα πεθαίνουν όπως αναλύεται στο NIS λογισμικό στοιχεία (n = 4). (Β) Τα ίδια κύτταρα βάφτηκαν με TMRM και εκτέθηκαν σε 100 μg /ml του FAE και απεικονίζεται για TMRM, ECFP, EYFP-FRET σε κατάσταση παρέλευσης του χρόνου σε διάστημα 5 λεπτών, όπως περιγράφεται. Η συγχωνευμένη εικόνα της TMRM, ECFP, EYFP-FRET από τις εικόνες παρέλευση του χρόνου για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία φαίνονται. Η αλλαγή αναλογία ECFP /EYFP σε DMSO και FAE επεξεργασμένα κύτταρα εμφανίζεται ως γράφημα. Το γράφημα δείχνει την αλλαγή ποσοτική αναλογία σε DMSO και FAE επεξεργασμένα θνήσκοντα κύτταρα (Complete πλαισίου παρουσιάζεται ως βίντεο S1). (Γ) Η FRET εκφράζοντα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως παραπάνω και το απεικόνισης διεξήχθη όπως περιγράφεται με μεσοδιάστημα 2 λεπτά. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα για την αναφερόμενη ώρα εμφανίζεται (Πλήρες καρέ εμφανίζεται ως βίντεο S2). (Δ) Τα ίδια κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με DMSO και απεικονίζεται όπως περιγράφεται για C. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα για την αναφερόμενη ώρα εμφανίζεται (Πλήρες καρέ εμφανίζεται ως βίντεο S3).

Η

FAE Δαιμονισμένοι Ισχυρή φωτοευαισθητοποίησης Επίδραση

για την ανάλυση της φωτοευαισθητοποίησης επίδραση της ΡΑΕ, ο αισθητήρας Caspase εκφράζουν κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες πυθμένα 8- καλά θαλάμων γυαλί και βάφτηκαν με μιτοχονδριακή μεμβράνη δυνητικοί ειδικοί φθορίζουσα χρωστική TMRM (τετραμεθυλ ροδαμίνη μεθυλεστέρας) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28 ]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μg /ml του FAE και εκτίθενται σε συνεχή απεικόνισης για TMRM καθώς δότη και δέκτη φθορισμού χρησιμοποιώντας CARV (BD Biosciences) ομοεστιακό μικροσκόπιο για 24 ώρες σε ένα τακτό χρονικό διάστημα από 5 λεπτά. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Β και βίντεο S1, εντός 30 λεπτών από την απεικόνιση, τα κύτταρα έχασαν TMRM φθορισμός υποδεικνύει την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Αξιοσημείωτη απώλεια κυττάρων ήταν εμφανής μετά από 60 λεπτά που προχώρησαν ταχέως σε πλήρη απώλεια των κυττάρων στο επίπεδο απεικόνισης με 7 ώρες. Μόνο μια ήπια μεταβολή στην αναλογία /EYFP ECFP παρατηρήθηκε σε αυτά τα κύτταρα δείχνει μερική ενεργοποίηση Caspase (Σχήμα 6Β). Περαιτέρω, για να τεκμηριώσει την φωτοευαισθητοποίησης ρόλο της ΡΑΕ, έχουμε μειώσει το διάστημα της έκθεσης σε 2 λεπτά με συνεχή απεικόνιση μέχρι 200 ​​καρέ. Είναι ενδιαφέρον ότι, η απώλεια των κυττάρων συσχετίζονται καλά με τον αριθμό πλαισίου και όχι το χρονοδιάγραμμα της θεραπείας FAE τεκμηριώνουν ότι η επίδραση ευαισθητοποίησης ήταν ιδιαίτερα επηρεασμένος από την έκθεση στο φως διέγερσης παρά με τη διάρκεια της θεραπείας ΡΑΕ. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα εκτίθενται σε ίδιες συνθήκες απεικόνισης απέτυχε να δείξει οποιαδήποτε αλλαγή στην αναλογία ή κύτταρο απώλεια μέχρι και για 24 ώρες απεικόνισης επικύρωση ότι η επίδραση που παρατηρήθηκε προκλήθηκε από FAE (Σχήματα 6Β, Γ, Δ και βίντεο S2, S3). Τα κύτταρα διατηρούνται επίσης TMRM φθορισμό υποδεικνύοντας τη συντήρηση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης καθ ‘όλη τη διάρκεια της περιόδου απεικόνισης. Συνολικά, τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι FAE κατείχε φωτοευαισθησία επίδραση που σχετίζεται με την ταχεία απώλεια του δυναμικού και μερική ενεργοποίηση της κασπάσης μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό.

FAE έκφραση που διαμεσολαβείται των Ρυθμιστικών Αρχών αποπτωτικά

Inorder να τεκμηριώσει τη σημασία της κασπάσης καταρράκτη πίσω από την επαγωγή της απόπτωσης, αναλύσαμε την διάσπαση σημαντικών κασπάσες όπως κασπάση 8, κασπάση 7, κασπάση 9 και επίσης PARP (Poly (ADP-ριβόζη) πολυμεράση) σε MCF-7, T47D και ΜΟΡ10Α. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 7Α, η θεραπεία FAE στα 80 και 160 μg /ml επαγόμενη διάσπαση της κασπάσης 8, κασπάσης 7 και κασπάση 9 σε MCF-7 καθώς και σε T47D. Η διάσπαση της PARP παρατηρήθηκε επίσης σε αυτά τα κύτταρα. Ωστόσο, σε ΜΟΡ10Α, μόνο μία ήπια διάσπαση ήταν εμφανής τόσο για κασπάσες και PARP.

(Α) κύτταρα MCF-7 υπέστησαν επεξεργασία με FAE (80, 160 μg /ml) για 48 ώρες και συλλέχθηκαν. Τα ανοσοστυπώματα εκτελέσθηκαν σε εκχύλισμα ολικού κυττάρου χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Η αντίστοιχη πλήρους μήκους και θραύσματα διασπώνται υποδεικνύονται. Για PARP blot, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 160 μg /ml του FAE για 48 ώρες. (Β) MCF-7 και T47D κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μg /ml του FAE για 24 ώρες. FAE επαγόμενη παραγωγή ROS σε MCF-7 καθώς και κύτταρα Τ47ϋ από τον έλεγχο DMSO όπως υποδεικνύεται από την αύξηση του φθορισμού DCF-DA σε επεξεργασμένα κύτταρα. (C) MCF-7 και T47D κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μg /ml του FAE μόνο και μετά την προ-αγωγή με NAC για μια περίοδο 24 h. Όπως φαίνεται, προ-επεξεργασία των κυττάρων με το αντιοξειδωτικό NAC μείωσε την κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από το ΡΑΕ. Ποσοστό των κυττάρων με συμπυκνωμένη χρωματίνη για κάθε ομάδα παρουσιάζεται ως γραφική παράσταση (Ν = 3)

Η

FAE -. Κυτταρικό θάνατο που επάγεται Συμμετέχετε γενιά των ROS

Τα προηγούμενα αποτελέσματα έδειξαν ότι στις περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται, FAE θα μπορούσε να προκαλέσει απώλεια της ακεραιότητας της μιτοχονδριακής μεμβράνης και συμπύκνωση της χρωματίνης πιθανώς μέσω εξαρτώμενο Βαχ τρόπο. Επιπλέον, κατά την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων έχουμε λάθος που παρατηρείται φωτοευαισθητοποίησης επίδραση για εκχύλισμα το FAE σε MCF-7 κυττάρων που εκφράζουν αισθητήρων κασπάσης με επιταχυνόμενη απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Προηγουμένως, είχε αναφερθεί ότι οι περισσότεροι φωτοευαισθητοποιητές κυτταρικό θάνατο που επάγεται μέσω της παραγωγής ROS [29], ένα από τα εξέχοντα ωθήσεις για διαμορφωτική Βαχ ενεργοποίησης. Ως εκ τούτου, είχαμε αναλύσει την ROS μετά την κατεργασία των κυττάρων με 100 μg /ml του FAE για 24 ώρες με FACS. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7 Β, FAE επαγόμενη παραγωγή ROS σε MCF-7 καθώς και κύτταρα T47D υποδεικνύεται από την αύξηση του 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein διοξεικό (H

2-DCF-DA) φθορισμό σε κύτταρα κατεργασμένα από τον έλεγχο . Προ-επεξεργασία των κυττάρων με το αντιοξειδωτικό Ν ακετυλο κυστεΐνη (NAC) μείωσε τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από FAE όπως φαίνεται στα αποτελέσματα συμπύκνωση χρωματίνης (Εικόνα 7 C). Θα επικυρωθεί και πάλι ότι η παραγωγή των ROS εντός των κυττάρων το πρωτεύον έναυσμα για αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και ότι μπορεί να συμβάλει για φωτοευαισθητοποιητικούς δραστηριότητά της.

Συζήτηση

εκχυλίσματα Φυσικό προϊόν έχει δοκιμαστεί ευρέως στη φαρμακευτική της βιομηχανίας και έχουν θεωρηθεί ως μια πολύτιμη πηγή νέων φαρμάκων [30]. Ως μέσο για την ταυτοποίηση αντικαρκινικών παραγόντων, η αντίστροφη φαρμακολογία, ή η «κομοδίνο» με την προσέγγιση «πάγκο» έχει διερευνηθεί η οποία περιλαμβάνει τη μελέτη φαρμακευτικά φυτά που έχουν παραδοσιακά χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία διαφόρων παθήσεων. Διάφορες μελέτες δείχνουν ότι

Οι Ficus

είδη χρησιμοποιούνται ευρέως στην διαχείριση των διαφόρων τύπων των ασθενειών όπως αναπνευστικές διαταραχές, σεξουαλικές διαταραχές, διαταραχές του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ), καρδιαγγειακές διαταραχές (CVS), γαστρικά προβλήματα, λοιμώξεις του δέρματος και διαβήτης κλπ [31], [6]. Οι περισσότερες από τις φαρμακολογικές μελέτες που στοχεύουν στην επικύρωση παραδοσιακές χρήσεις του [32]. Αν και μοντέρνο σχεδιασμό φαρμάκων υπογραμμίζει την ανάπτυξη της ενιαίας παραγόντων με συγκεκριμένους στόχους, το γεγονός ότι ολόκληρο το εκχύλισμα έχει αποδειχθεί ότι είναι πιο αποτελεσματική από τα επιμέρους συστατικά του (α έννοια που είναι γνωστή ως φυτικό συνεργίας) δείχνει τους περιορισμούς αυτής της προσέγγισης [3]. Η θανάτωση των κυττάρων του όγκου μέσω της επαγωγής της απόπτωσης αναγνωρίζεται πλέον ως μια στρατηγική για την ταυτοποίηση αντικαρκινικών φαρμάκων [33]. Στην παρούσα έκθεση, επιδιώξαμε να καθορίσει τους μηχανισμούς με τους οποίους η ακετόνη κλάσμα του

F.religiosa

εκχύλισμα φύλλων ασκεί αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση σε πολλαπλά κύτταρα καρκίνου του μαστού.

Αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση