Αφηρημένο

Ιστορικό

καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια σημαντική αιτία θανάτου σε όλο τον κόσμο . Ευαίσθητα, μη επεμβατικές μέθοδοι διάγνωσης οθόνη χρειάζονται επειγόντως να βελτιώσουν τα ποσοστά επιβίωσης του. Σταθερό κυκλοφορούν microRNA προσφέρει μοναδικές ευκαιρίες για την έγκαιρη διάγνωση πολλών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Στόχος μας ήταν να βρούμε νέες miRNAs πλάσμα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για την ανίχνευση της CRC.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των miRNA διαμόρφωση της γενικής εικόνας πραγματοποιείται σε συνένωση δειγμάτων πλάσματος σχηματίζουν 10 ασθενείς CRC ή 10 υγιείς μάρτυρες, ένα πάνελ των miRNAs (HSA-miR-10a, -19a, -22 *, -24, -92a, 125α-5P, -141, -150, -188-3p, -192, -210, -221, -224 *, -376a, -425 *, -495, -572, -601, -720, -760 και HSA-ας-7α, -7e) έχουν απελευθερωθεί σε CRC πλάσμα με αναδιπλούμενη αλλαγές & gt ? 5. Μετά κλίμακας επικύρωση από qRT-PCR μεγάλο εκτελούνται σε ένα άλλο 191 ανεξάρτητα άτομα (90 CRC, 43 προηγμένη αδενώματος και 58 υγιείς συμμετέχοντες), βρήκαμε ότι τα επίπεδα πλάσματος miR-601 και miR-760 μειώθηκαν σημαντικά σε ορθοκολικό νεοπλασία (καρκινώματα και προηγμένα αδενώματα) σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες. ανάλυση καμπύλης ROC έδειξε ότι το πλάσμα miR-601 και miR-760 ήταν σημαντική διαγνωστική αξία για την προηγμένη νεοπλασία. Αυτά τα δύο miRNAs μαζί δώσει μια AUC των 0.792 με 83,3% ευαισθησία και 69,1% ειδικότητα για το διαχωρισμό του ΣΔΠ από την κανονική τους ελέγχους, και να δώσει μια AUC των 0.683 με 72,1% ευαισθησία και 62,1% ειδικότητα στη διάκριση προηγμένα αδενώματα από φυσιολογικούς μάρτυρες.

Συμπεράσματα /Σημασία

Plasma miR-601 και miR-760 μπορεί ενδεχομένως να χρησιμεύσει ως πολλά υποσχόμενη μη επεμβατική βιοδείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση της CRC

Παράθεση:. Wang Q, Huang Ζ, Ni S, Xiao X, Xu Q, Γουάνγκ L, et al. (2012) Plasma miR-601 και miR-760 είναι νέα βιοδείκτες για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (9): e44398. doi: 10.1371 /journal.pone.0044398

Επιμέλεια: Ajay Goel, Πανεπιστήμιο Baylor Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 του Φλεβάρη 2012? Αποδεκτές: 6, Αύγ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 6η Σεπτεμβρίου του 2012

Copyright: © Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο. 81000867 και 81071791), Επιστήμη και TechnologyCommission του Δήμου Σαγκάης (Grant Νο 09JC1403700 και 10XD1401300), και εκκίνηση Mérieux Κονδυλίων Έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή λογαριασμούς

CRC σε όλο τον κόσμο για 600 χιλιάδες θανάτους ετησίως. Στην Κίνα, CRC παραμένει το 4ο πιο κοινή αιτία των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται με ημερομηνία [1], [2]. Το στάδιο του όγκου κατά τη διάγνωση είναι ο πιο σημαντικός προγνωστικός παράγοντας για CRC, καθιστώντας την έγκαιρη ανίχνευση των αποφασιστικής σημασίας για τη μείωση της θνησιμότητας και τη βελτίωση των ποσοστών συμμόρφωσης. Μυθιστόρημα βιοδείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση χρειάζονται επειγόντως. Τα προηγμένα αδενώματα συνήθως ορίζεται ως αδενώματα του 1 cm ή μεγαλύτερη, και εκείνοι με λαχνών συστατικά (tubulovillous ή λαχνών) ή υψηλού βαθμού δυσπλασία [3], [4]. Σύνθετη αδενώματα συνδέουν ξεκάθαρα την αλυσίδα από καλοήθεις αδένωμα σε προηγμένες CRC. Έτσι, οι περισσότερες στρατηγικές CRC ελέγχου επικεντρώνονται στο ποσοστό ανίχνευσης των δύο CRC και προηγμένων αδενωμάτων.

miRNAs είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs (18-22 nt σε μήκος) που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων στο μετά μεταγραφικό επίπεδο με σύνδεση προς στόχευση του mRNA. Από την ανακάλυψή τους το 1993, έχουν αλλάξει εκφράσεις miRNAs έχουν συσχετισθεί με πολλά είδη όγκων, συμπεριλαμβανομένων CRC [5], [6]. τη σχέση τους με τη γένεση του όγκου δείχνει τις δυνατότητές τους ως διαγνωστικοί δείκτες και θεραπευτικών στόχων [7], [8].

Κυκλοφορούν miRNAs είναι σταθερά ανιχνεύονται στο πλάσμα /ορό και να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες για διάφορες ασθένειες [9], [10 ], [11], [12], [13], [14], που τους καθιστά πιθανώς χρήσιμα μη επεμβατική δείκτες για την έγκαιρη διάγνωση ή στην πρόοδο του καρκίνου παρακολούθησης. Έχουμε διαπιστώσει προηγουμένως ότι τα αυξημένα επίπεδα του miR-29a και miR-92a στο πλάσμα έχουν σημαντική διαγνωστική αξία για CRC [15]. Για να ενισχυθεί η διαγνωστική αποτελεσματικότητα των κυκλοφορούντων miRNA, είναι απαραίτητο για τον εντοπισμό νέων στόχων. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το πλάσμα miR-601 και miR-760 συγκεντρώσεις θα μπορούσε να συμβάλει στην έγκαιρη ανίχνευση του CRC, ανάλογα με το προφίλ τσιπ και την επακόλουθη επικύρωση μεγάλης κλίμακας χρήση qRT-PCR.

Υλικά και Μέθοδοι

Πληθυσμός μελέτης

Μια ομάδα 10 CRCs (συμπεριλαμβανομένων των 5 σταδίου ΙΙ και 5 σταδίου ΙΙΙ ασθενείς) και 10 φυσιολογικούς μάρτυρες για πρώτη φορά προετοιμασμένοι για miRNA προφίλ (Πίνακας S1). Ανεξάρτητη 191 ετών και τα άτομα του φύλου ταιριαστό στρατολογήθηκαν σε μεγάλης κλίμακας qRT-PCR επικύρωση, συμπεριλαμβανομένων 90 ασθενών CRC (Στάδιο Ι-IV), 43 ασθενείς με προχωρημένο αδένωμα και 58 υγιείς συμμετέχοντες (Πίνακας S2, S3). Δείγματα ιστού ζεύγη που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση των επιλεγμένων έκφρασης miRNAs δόθηκαν από άλλα 19 CRC ασθενείς (Πίνακας S4). Ασθενείς με προηγούμενο ιστορικό κακοήθων όγκων, κληρονομική CRC μη πολυποδίαση ή οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση αποκλείστηκαν από τη μελέτη αυτή. Δείγματα αίματος συλλέχθηκαν πριν συλλέχθηκαν δείγματα λειτουργίας και ιστού μετά από χειρουργική επέμβαση. Όγκου ανέβηκε σύμφωνα με τη Διεθνή Ένωση κατά του Καρκίνου (UICC) κατευθυντήριες γραμμές. Η Κλινική Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Fudan Αντικαρκινικό Νοσοκομείο ενέκρινε τα ερευνητικά πρωτόκολλα και γραπτές πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από τους συμμετέχοντες.

Απομόνωση RNA

Το ποσό των 5 έως 10 χιλιοστόλιτρα ολικού αίματος ελήφθησαν από κάθε συμμετέχοντα. Το πλάσμα λήφθηκε με φυγοκέντρηση σε 1200 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Για να ολοκληρωθεί η απομάκρυνση του υπολειμματικού κυτταρικών συστατικών, δείγματα πλάσματος εκ νέου σε φυγοκέντρηση σε 12,000 g για περαιτέρω 10 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο πλάσμα καταψύχθηκε ως ξεχωριστά δείγματα στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιείται μέσα σε 2 ώρες μετά τη λήψη τους. Ένας όγκος 600 μΐ αποψυγμένων πλάσμα θερμάνθηκε στους 65 ° C για 10 λεπτά και στη συνέχεια επωάζονται στους 42 ° C για 1 ώρα για να μετουσιωθεί η πρωτεΐνη. Ολικό RNA εξήχθη από το πλάσμα προ-θέρμανσης που χρησιμοποιούν MirVana PARIS Kit (Ambion, USA), εκλούοντας αυτό μέσα 60 ​​υί (95 ° C) χωρίς ΚΝάση νερό. Στη συνέχεια, τα RNA πλάσματος συμπυκνώθηκαν σε τελικό όγκο 20 μι χρησιμοποιώντας ένα Eppendorf Concentrator Plus 5301 (Eppendorf, Γερμανία). Για την ομαλοποίηση του δείγματος προς δείγμα μεταβολή κατά τη διάρκεια της απομόνωσης του RNA και ως εσωτερικός έλεγχος, ίδιες ποσότητες (25 fmol) από συνθετικές C. elegans miRNA-39 (CEL-miR-39) προστέθηκε σε κάθε δείγμα μετουσιώνεται. Ολικό RNA από ιστούς CRC εξήχθη χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχονται. Η συγκέντρωση του RNA δείγματα ποσοτικά με NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, ΗΠΑ).

Mirna Profiling

Mirna χαρακτηριστικών έγινε με ένα σύστημα miRCURY LNA ™ Οικουμενική RT microRNA PCR (Exiqon, Demark ) στις 2 συγκεντρωμένα δείγματα πλάσματος από 10 CRCs (συμπεριλαμβανομένων των 5 σταδίου ΙΙ και 5 σταδίου ΙΙΙ ασθενείς) και 10 φυσιολογικούς μάρτυρες. Η μέθοδος βασίζεται στην καθολική αντίστροφης μεταγραφής (RT) που ακολουθείται από ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ενίσχυση με LNA ™ ενισχυμένη εκκινητές χρησιμοποιώντας SYBR Green. Προ-δειγματίστηκαν εκκινητές LNA ™ PCR τέθηκαν σε 384-φρεατίων πλάκες PCR για κάθε αντίδραση ανά φρεάτιο [16]. Ένας όγκος 600 μΐ κάθε δειγμάτων πλάσματος πάρθηκε έξω και αναμιγνύονται ομοιόμορφα. Ολικό RNA παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε παραπάνω και μια ποσότητα 500 ng χρησιμοποιήθηκε για την επόμενη προφίλ. Ένα σύνολο 742 miRNAs στόχος εντοπίστηκε και διπλώστε τις αλλαγές της κάθε έκφρασης των miRNAs υπολογίστηκαν.

Ποσοτικοποίηση των miRNAs από qRT-PCR

Περίπου 30 ng εμπλουτισμένο RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με TaqMan microRNA αντίστροφη Kit μεταγραφής (Applied Biosystems, USA) σε έναν όγκο αντίδρασης 10 μι. προϊόντα RT χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα για την επόμενη διαδικασία της PCR μετά από μια αραίωση 1:10. Τα επίπεδα έκφρασης του miRNAs ποσοτικοποιήθηκαν εις τριπλούν με qRT-PCR χρησιμοποιώντας ανθρώπινη TaqMan microRNA Δοκιμασία Kits (Applied Biosystems, USA) σε έναν ΑΒΙ 7900 HT qRT-PCR όργανο (Applied Biosystems, USA). Εκτινάχθηκαν στις cel-miR-39 και ενδογενούς miR-16 χρησιμοποιήθηκαν ως ομαλοποίηση για miRNA πλάσμα ποσοτικοποίησης, ενώ RNU6B για τα δείγματα ιστού.

miRNA Σταθερότητα σε Πλάσμα

Το ίδιο δείγμα πλάσματος, διαιρούμενο σε πολλά κλάσματα, υποβλήθηκε σε μια σειρά θεραπειών, όπως επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για διαφορετικούς χρόνους (1, 2, 4, 8, 16, 24 h) ή την υποβολή τους σε διαφορετικούς αριθμούς κύκλων ψύξης /απόψυξης από τη θερμοκρασία αποθήκευσης ( -80 ° C) έως θερμοκρασία δωματίου (22 ° C). Για την εκτίμηση της σταθερότητας του πλάσματος miR-601 και miR-760, οι τιμές Ct ανιχνεύονται από qRT-PCR που αντανακλά τις συγκεντρώσεις των δειγμάτων πείραμα συγκρίθηκαν με αυτά που υποβάλλονται τα τυποποιημένα πρωτόκολλα.

Στατιστική Ανάλυση

Η σχετική έκφραση των miRNAs αναλύθηκε από το 2

– μέθοδος △△ Ct. Το Mann-Whitney U χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η έκφραση του miRNAs πλάσματος μεταξύ των διαφόρων ομάδων. Δέκτη-λειτουργίας-χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλη και η περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUC) αξιολόγησε τη σκοπιμότητα της χρήσης του πλάσματος miRNA ως διαγνωστικό εργαλείο για CRC. Ο δείκτης Younden καθοριστεί το όριο για τις συγκεντρώσεις miRNA πλάσμα. Η συσχέτιση μεταξύ κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά και τα επίπεδα miRNA πλάσμα προσδιορίστηκε με Mann-Whitney U test, t-test ή Χ2 τεστ Student. Όλες οι δοκιμές ήταν 2 όψεων και ένα επίπεδο σημαντικότητας P & lt? 0,05 (95% CI) θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Η στατιστική ανάλυση στηρίχθηκε σε SPSS 16.0 (SPSS Ltd., UK) και γραφήματα δημιουργήθηκαν με Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc, USA).

Αποτελέσματα

Mirna Profiling

Μετά τον αποκλεισμό αρκετών στόχων miRNA με τιμές Ct & gt? 35 σε δείγματα καρκίνου του για την εξαιρετικά χαμηλή έκφραση τους, 86 miRNAs εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ CRC και ελέγχου με τις αλλαγές φορές & gt? 2 (Πίνακας S5). Τόσο miR-29a και miR-92a συμπεριλήφθηκαν στην επάνω ρυθμισμένη λίστα όπως έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν [15]. Κάποια άλλα απορυθμισμένη στόχους, όπως έχει-miR-95, -181b, -200 ° C, -220 και -221, είχαν αναφερθεί προηγουμένως σε CRC [13], [17]. Η ανεπεξέργαστα δεδομένα των miRNA προφίλ έχει αναρτηθεί στη βάση δεδομένων GEO (GSE38716). Προκειμένου να περιορίσει το πεδίο της μελέτης, ένα πάνελ 9 έως ρυθμιζόμενων miRNAs (HSA-miR-19a, -22 *, -24, -92a, -125a-5P, -210, -221, -376a και HSA- ας-7ε) και ένα πάνελ 13 κάτω-ρυθμίζονται miRNAs (HSA-miR-10a, -141, -150, -188-3p, -192, -224 *, -425 *, -495, -572, -601 , -720, -760 και HSA-ας-7α) επιλέχθηκαν με φορές αλλαγών & gt? 5. Κατά την εξέταση του στόχου μας για την εξεύρεση νέων βιοδεικτών πλάσμα, 5 προηγούμενα αναφερθεί στόχους (HSA-miR-92a, -141, -210, -221 και HSA-ας-7α) απομακρύνθηκαν [13], [17], [18], [19], [20], [21], [22], και επιλέχθηκαν οι υπόλοιπες 17 miRNAs για περαιτέρω μεγάλης κλίμακας qRT-PCR επικύρωση.

διαγνωστική αξία του miR-601 και miR-760 για CRCs

για να προσδιορίσει τις 17 διαφορικά εκφρασμένων miRNAs πλάσμα προσδιορίζονται από προφίλ έκφρασης, τα επίπεδα μετρήθηκαν με qRT-PCR σε 90 CRCs και 58 φυσιολογικούς μάρτυρες ομαλοποιήθηκε να εμβολιάζεται σε cel-miR-39. Τόσο miR-601 και miR-760 μειώθηκαν σημαντικά το CRC πλάσμα σε σύγκριση με τους μάρτυρες (P & lt? 0.0001, Εικόνα 1). ανάλυση καμπύλης ROC έδειξε δυνητική διαγνωστική αξία τους και τις AUCs για miR-601 και miR-760 ήταν 0,747 (95% CI: 0,666 – 0,828) και 0,788 (95% CI: 0,714 – 0,862), αντίστοιχα. Από το όριο του -11,50 για miR-601, η βέλτιστη ευαισθησία και ειδικότητα ήταν 69,2% και 72,4% για τον διαχωρισμό CRC από φυσιολογικούς μάρτυρες. Σε ένα όριο -8,09 για miR-760, η ευαισθησία και η ειδικότητα ήταν 80,0% και 72,4%, αντίστοιχα. Ταυτόχρονη ανάλυση των miR-601 και miR-760 έδειξε μια παρόμοια AUC των 0.792 (95% CI: 0,719 – 0,865) ως miR-760, με 83,3% ευαισθησία και 69,1% ειδικότητα, υποδεικνύοντας μια κακή αθροιστική επίδραση των 2 miRNAs (Σχήμα 2). Εμείς που είχαν διαπιστωθεί ότι το πλάσμα miR-29a και miR-92a έχουν σημαντική διαγνωστική αξία για CRC [15]. Για τις περισσότερες περιπτώσεις σε αυτή τη μελέτη ήταν η ίδια όπως εκείνη στο παρόν έγγραφο, οι δύο αυτοί στόχοι προστέθηκαν για συνδυασμένη ανάλυση καμπύλης ROC με miR-760. Η προκύπτουσα AUC αυξήθηκε σε 0,943 (95% CI: 0,908 – 0,979) με 83,3% ευαισθησία και 93,1% ειδικότητα στη διάκριση CRC από τον έλεγχο, γεγονός που υποδηλώνει την αθροιστική επίδραση στη διαγνωστική αξία αυτών των 3 miRNAs (Σχήμα S1, S2). Εκτός του miR-601 σε αυτά τα τρία miRNAs δεν βελτίωσε τη διαφοροποίηση τους δύναμη μεταξύ των ασθενών CRC και υγιών μαρτύρων και οδήγησε σε μια ίδια AUC του 0,943 (95% CI: 0,907 – 0,978). Επιπλέον, δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ ασθενών και ελέγχων CRC στα υπόλοιπα 15 miRNAs (

P

& gt? 0,05, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όταν τα δεδομένα qRT-PCR κανονικοποιήθηκε προς miR-16 [15], το πλάσμα miR-601 και miR-760 ήταν ακόμη σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε CRC σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες (

P

= 0,002 για ΜΙΚ 601 και

P

& lt?. 0.0001 για miR-760, Σχήμα S3)

Η μεγάλης κλίμακας επικύρωση του miR-601 και miR-760 σε δείγματα πλάσματος (n = 191). οικόπεδα Scatter των επιπέδων στο πλάσμα του miR-601 (Α) και miR-760 (Β) σε υγιείς εθελοντές (n = 58), η προηγμένη αδενώματα (n = 43) και οι ασθενείς CRC (n = 90). τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs ομαλοποιήθηκαν με cel-miR-39. Η γραμμή αντιπροσωπεύει την μέση τιμή. Mann-Whitney U test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα.

Η

διαγνωστική αξία του miR-601 και miR-760 για προχωρημένους αδενώματα

Για να συνεχίσουμε την έρευνά μας για την διαγνωστική αξία του miR -601 και miR-760 στην ανάπτυξη CRC, μετρήσαμε την έκφραση τους στο πλάσμα σε 43 προηγμένα αδενώματα, που ορίστηκαν ως προκαρκινικές αλλοιώσεις της CRC. Τα επίπεδα πλάσματος του miR-601 και miR-760 παρουσίασαν σημαντική μείωση σε προχωρημένο αδενώματα σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες (

P

= 0,018 και για τις δύο miR-601 και miR-760, Εικόνα 1). Τόσο οι 2 miRNAs μπορούσε ασθενώς διαφοροποιηθούν advanced αδενωμάτων από κανονικά συγκριτικά όπως δείχνεται με ανάλυση καμπύλης ROC? και η AUC ήταν 0,638 (95% CI: 0,530 – 0,747) για το miR-601 και 0,682 (95% CI: 0,576 – 0,789) για το miR-760. Η βέλτιστη ευαισθησία και ειδικότητα του miR-601 ήταν 72,1% και 51,7% σε cut-off τιμή -10,73? αυτές οι τιμές του miR-760 ήταν 69,8% και 62,1% σε cut-off τιμή -7.63. Συνδυασμένη ανάλυση του miR-601 και miR-760 απέτυχε να βελτιώσει τη διαγνωστική αποτελεσματικότητα του miR-760 και έδειξε μια παρόμοια AUC των 0.683 (95% CI: 0,576 – 0,789), με 72,1% ευαισθησία και 62,1% ειδικότητα (Σχήμα 2). Επιπλέον, η έκφραση του πλάσματος miR-601 και miR-760 σε προηγμένα αδενώματα ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με CRCs (

P

= 0,0174 για το miR-601,

P

= 0.0214 για το miR-760, Φιγούρα 1). Όταν έγινε κανονικοποίηση ως προς το miR-16, πλάσμα miR-601 και miR-760 παρέμεινε κάτω-ρυθμίζονται σε προηγμένα αδενώματα σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες (

P

= 0,0198 για το miR-601 και

P

= 0,0184 . για miR-760, Σχήμα S3)

(Α, Β, Γ) miR-601 δώσει ένα AUC του 0,747 (95% CI: 0,666 – 0,828) με 69,2% ευαισθησία και 72,4% ειδικότητα (cut- off value = -11,50), και miR-760 αποδώσει ένα AUC του 0,788 (95% CI: 0,714 – 0,862) με 80,0% ευαισθησία και 72,4% ειδικότητα (cut-off value = -8,09) για τη διάκριση CRC από φυσιολογικούς μάρτυρες. Συνδυασμένη ανάλυση του miR-601 και miR-760 αποκάλυψε μια AUC των 0.792 (95% CI: 0,719 – 0,865), με 83,3% ευαισθησία και 69,1% ειδικότητα. (D, E, F) MiR-601 απέδωσε ένα AUC του 0,638 (95% CI: 0,530 – 0,747) με 72,1% ευαισθησία και 51,7% ειδικότητα (cut-off value = -10,73), και miR-760 αποκάλυψε μια AUC της 0,682 (95% CI: 0,576 – 0,789) με 69,8% ευαισθησία και 62,1% ειδικότητα (cut-off value = -7,63) για τη διάκριση προηγμένα αδενώματα από τους ελέγχους. Συνδυασμένη ανάλυση του miR-601 και miR-760 δεν βελτίωσε τη διαγνωστική απόδοση, και έδωσε μια παρόμοια AUC των 0.683 (95% CI: 0,576 – 0,789). Με 72,1% ευαισθησία και 62,1% ειδικότητα ως miR-760

συνδυασμό με κλινικά χαρακτηριστικά

Για να αποδείξει τη μειωμένη τάση του πλάσματος miR-601 και miR-760 έκφρασης στην ανάπτυξη CRC, περιπτώσεις CRC περαιτέρω στρωματοποιημένη κατά TNM στάσης τους. Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε 5 ομάδες, από προχωρημένο αδένωμα (το λιγότερο προχωρημένο βλάβη) στο Στάδιο IV CRC (η πιο προηγμένη βλάβη). Σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες, τα επίπεδα πλάσματος miR-601 και miR-760 μειώθηκαν σε όλες τις 5 ομάδες. Το πιο σημαντικό, αυτό ήταν σύμφωνο με την ρύθμιση προς τα κάτω τάση των επιπέδων των 2 miRNAs είναι χαμηλότερη σε στάδιο IV ασθενείς και το υψηλότερο στη φάση ασθενείς μου. Τόσο τα επίπεδα του miR-601 και miR-760 στο πλάσμα μειώθηκαν κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της CRC από την κανονική μέσω προηγμένων αδένωμα στο CRC (Σχήμα 3). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ αυτών των 2 miRNAs και το φύλο, την ηλικία, κομβική θέση, θέση του όγκου, το μέγεθος του όγκου ή ιστολογία. (

P

& gt? 0,05, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται)

Κουτί οικόπεδα επίπεδα πλάσματος του miR-601 (Α) και miR-760 (Β) σε φυσιολογικά άτομα (n = 58), η προηγμένη αδενώματα (n = 43) και οι ασθενείς CRC (n = 90) με διαφορετικό στάδιο ΤΝΜ (26 με Ι, 25 με II, 29 με III και 10 με IV). τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs κανονικοποιούνται με cel-miR-39. Οι γραμμές μέσα στα κουτιά υποδηλώνουν τις διαμέσους. Mann-Whitney U test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα.

Η

καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) είναι μια βιοδείκτης που χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της CRC επανάληψη και δεν είναι έγκυρος διαγνωστικός βιοδείκτης από κλινική άποψη για τη χαμηλή ευαισθησία του και ειδικότητα. Ωστόσο, δεν υπάρχει ιδανική δυναμικό βιοδείκτες για CRC έλεγχο μέχρι σήμερα και CEA εξακολουθεί να σερβίρεται ως προκαταρκτική ένδειξη όγκου σε υγειονομική εξέταση. Για να αξιολογηθεί η πιθανή συμπλήρωση του πλάσματος miRNA και CEA για την έγκαιρη ανίχνευση του ΚΕΣ, τα δεδομένα CEA συγκρίθηκαν με miR-601 και τα επίπεδα του miR-760 σε 51 στάδια Ι και ΙΙ οι ασθενείς σταδίου. Οι τιμές αποκοπής του miR-601 και miR-760 από την ανάλυση της καμπύλης ROC ήταν -11.50 και -8.09 αντίστοιχα. Η τιμή αποκοπής για το CEA ήταν 5,0 ng /mL (ln 5 = 1.609). MiR-601 ή miR-760 εντοπίστηκαν επιπλέον 26 ή 29 περιπτώσεις αναπάντητες από CEA και μόνο, δείχνει μεγαλύτερη δύναμη στη διαφοροποίηση νωρίς CRCs στάδιο. Η συνδυασμένη χρήση του miR-601 και miR-760 θα μπορούσε να ανιχνευθεί 30 CEA-αναπάντητες περιπτώσεις σε όλα. ανάλυση καμπύλης ROC έδειξε ότι ο συνδυασμός του miR-601 και miR-760 θα μπορούσε να βελτιώσει τη διαγνωστική ευαισθησία της CEA από 29,4% έως 80,4% με την AUC του 0,805 (95% CI: 0,457 – 0,683). (Σχήμα S4)

miR-601 και miR-760 έκφρασης στο CRC ιστοί

Για τους σκοπούς της σκάψιμο έξω την εσωτερική σχέση της έκφρασης των miRNAs μεταξύ του πλάσματος και τα αντίστοιχα δείγματα καρκινικού ιστού, miR-601 και miR-760 μετρήθηκαν σε όγκο ιστών από άλλες 19 περιπτώσεις CRC. Δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές για τις δύο 2 miRNAs μεταξύ καρκίνου και noncancerous ιστούς (

P

= 0,32 για το miR-601 και

P

= 0.43 για το miR-760, Εικόνα 4). Η απελευθέρωση των miRNAs από τα καρκινικά κύτταρα στην κυκλοφορία επηρεάζεται από πολλές παραμέτρους μπορεί να εξηγήσει την ασυνέπεια. Επιπλέον, είναι άγνωστο αν τα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να αλλάξει τα miRNAs απελευθερώνοντας στο αίμα από άλλα όργανα ή κύτταρα. Μεγαλύτερες επικύρωση δείγματα ήταν απαραίτητη για να επιβεβαιώσετε miR-601 και miR-760 έκφρασης σε ιστούς CRC.

Δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές σχετικά με το miR-601 (Α) και (Β) συγκεντρώσεις miR-760 βρέθηκαν μεταξύ των ιστών CRC και ζεύγη μη-καρκινικούς ιστούς (NCT) (n = 19). τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs ομαλοποιήθηκαν σε RNU6B. Η γραμμή αντιπροσωπεύει την μέση τιμή. Mann-Whitney U test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα.

Η

MiR-601 και miR-760 Σταθερότητα στο πλάσμα

επίπεδα του miR-601 και miR-760 στο πλάσμα βρέθηκαν να να είναι σταθερή αφού υποβληθεί σε παράταση του χρόνου επώασης σε θερμοκρασία δωματίου, και οι τιμές Ct δεν έδειξαν σημαντικές διακυμάνσεις. Τα παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν στο πείραμα κύκλους επόμενη ψύξης-απόψυξης (Εικόνα 5). Ως εκ τούτου, θεωρήσαμε ότι ήταν αρκετά σταθερό σε δείγματα πλάσματος και σχεδόν υποβαθμίζονται κατά τη διάρκεια των ρυθμίσεων του πρωτοκόλλου και την αποθήκευση. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το miR-601 και miR-760 ανταποκριθεί ουσιαστικά στις απαιτήσεις για κλινική εφαρμογή.

επίπεδα του miR-601 και miR-760 στο πλάσμα ήταν σταθερά μετά από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου παρατεταμένη 1-24 ωρών (Α) ή τουλάχιστον 4 κύκλους ψύξης-απόψυξης (Β).

Η

Συζήτηση

miRNAs να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. Η απορρύθμιση της έκφρασης των miRNAs εμφανίζεται σε διάφορες μορφές καρκίνου, κυρίως του miR-143 και miR-145 στο CRC [23]. MiRNAs μπορεί να συμβάλει στην θεραπευτικές στρατηγικές ως διαγνωστικοί βιοδείκτες και προγνωστικοί παράγοντες σε καρκίνους [5], [6]. Ωστόσο, οι μέθοδοι ανίχνευσης βιοψία που βασίζονται παραμένουν επεμβατική και χρονοβόρα για τον έλεγχο και την παρακολούθηση των ασθενών με καρκίνο. miRNAs προέρχονται από όγκους που περιγράφηκε πρώτα από Mitchell et al. δείχνουν σαφώς ότι η σταθερή miRNAs είναι παρούσες στο ανθρώπινο πλάσμα και ορό, η οποία ανοίγει ένα εξαιρετικά ευρύ πεδίο για την κλινική εφαρμογή [9], [24], [25], [26], [27].

Δημοσίευση εκθέσεις των κυκλοφορούντων miRNAs σε CRC είναι περιορισμένες. Ωστόσο, Ng et al. Βρέθηκε ότι miR-17-3p και miR-92 ήταν σημαντικά αυξημένα στον ορό των ασθενών με CRC σημαντική μείωση μετά από χειρουργική επέμβαση. Περαιτέρω επικύρωση με ένα ανεξάρτητο σύνολο 180 δειγμάτων έδειξε ότι τα επίπεδα miR-92 στο πλάσμα μπορούν να διακρίνουν μεταξύ του παχέος εντέρου και του γαστρικού καρκίνου, φλεγμονώδους νόσου του εντέρου ή φυσιολογικά άτομα [13]. Και έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι το πλάσμα miR-29a και miR-92a ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε ασθενείς CRC με καλές τιμές διάγνωσης για CRC ελέγχου [15].

MiR-601 και miR-760 ήταν 2 miRNAs των λιγότερο ανησυχία σε κακοήθειες. MiR-601, το οποίο βρίσκεται μέσα στο

DENND1A

γονίδιο που ρυθμίζεται προς τα πάνω σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, θα μπορούσαν να επηρεάσουν την πυρηνική οδούς παράγοντα-kappa Β σηματοδότηση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 [28], [29]. MiR-760, το οποίο βρίσκεται εντός εσώνιο-1 του

BCAR3

γονιδίου, ρυθμίζεται από τα οιστρογόνα και έχει χαμηλότερη έκφραση σε ιστούς CRC [30]. Καμία περαιτέρω λειτουργικές μελέτες έχουν από τότε που διεξάγονται στις 2 miRNAs. Πληροφορίες για τις σχέσεις τους με την καρκινογένεση παραμένει περιορισμένη, αλλά τα νέα ευρήματά μας δείχνουν ότι το πλάσμα miR-601 και miR-760 μπορεί να λειτουργήσει ως κατάλληλο νωρίς διαγνωστικοί δείκτες για CRC.

Σε αυτή τη μελέτη, πρώτον βρέθηκαν miR-601 και miR-760 ήταν κάτω-ρυθμίζονται CRC πλάσμα από miRNA προφίλ και να επικυρωθεί από qRT-PCR από ένα σύνολο 17 επιλεγμένων miRNAs. Δείξαμε ότι τα επίπεδα του miR-601 και miR-760 στο πλάσμα μειώθηκαν στις προηγμένες παχέος νεοπλασίας σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες, και ότι miR-760 ήταν πιο σημαντικό από ό, τι miR-601 ως βιοδείκτη CRC. Σύμφωνα με την εμπειρία μας και τις προηγούμενες μελέτες, το 11% συμφωνία μεταξύ διαλογή τσιπ και επικύρωσης ήταν χαμηλή, αλλά αποδεκτή. ανάλυση καμπύλης ROC έδειξε αδύναμη έκφραση αυτών των 2 miRNAs θα μπορούσε να συμβάλει στην έγκαιρη ανίχνευση του CRC με 69,2% ευαισθησία και 72,4% ειδικότητα για το miR-601 (AUC = 0,747) και 80,0% ευαισθησία και 72,4% ειδικότητα για το miR-760 (AUC = 0.788). Ο συνδυασμός αυτών των βιοδεικτών συμπληρώνονται CEA στην ανίχνευση CRCs πρώιμο στάδιο (στάδια Ι και ΙΙ), πήρε μια AUC των 0.805 με 80,4% ευαισθησία και 65,5% ειδικότητα. Επιπλέον, σε συνδυασμό miR-601 και miR-760 θα μπορούσε επίσης διακρίσεις προηγμένα αδενώματα από υγιείς μάρτυρες δίνοντας μια AUC των 0.683 με 72,1% ευαισθησία και 62,1% ειδικότητα. Πιο εντυπωσιακά, τα επίπεδα τόσο της miR-601 και miR-760 έπεσε στα στάδια Ι και ΙΙ CRC, η οποία είναι αυξημένα έντονα δυνητική αξία τους για την έγκαιρη ανίχνευση της CRC. Παρά το γεγονός ότι η διαγνωστική αξία του miR-601 και miR-760 μπορεί να υπολείπονται του να είναι βέλτιστη, μια ομάδα τριών miRNA πλάσματος (miR-760, -29a και -92a) δείκτες αποκάλυψε καλή διαγνωστική απόδοση.

Όχι συναίνεση οι εσωτερικοί έλεγχοι που είναι ζωτικής σημασίας στην ακριβή ποσοτικοποίηση των επιπέδων RNA με qRT-PCR έχουν συσταθεί μέχρι σήμερα. Επιβεβαιώθηκε ότι μια γραμμική συσχέτιση υπήρχε μεταξύ της ποσότητας που εισάγεται συνθετικά miRNA και τις τιμές Ct στα qRT-PCR [31]. Σε αυτή τη μελέτη, cel-miR-39 προστέθηκε σε κάθε δείγμα μετουσιώνεται κατά τη διάρκεια των διαδικασιών απομόνωσης RNA για ομαλοποίηση [32]. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε επίσης miR-16, μια προτεινόμενη εσωτερικού ελέγχου από την προηγούμενη εργασία μας, για την εξομάλυνση των δεδομένων qRT-PCR μας και λαμβάνονται παρόμοια αποτελέσματα (Εικόνα S3) [15]. Ωστόσο, φάνηκε ότι μπορούμε να πάρουμε μια καλύτερη AUC όταν η ομαλοποίηση με cel-miR-39, οπότε επελέγη cel-miR-39 για την ομαλοποίηση των δεδομένων qRT-PCR σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα S5).

Plasma δείγματα μπορούν να συλλεχθούν με μη επεμβατικό τρόπο και δεν είναι χρονικά περιορισμένη. Έχουμε αποδείξει ότι η κυκλοφορούσα miRNAs εξάγεται από ένα ελάχιστο δείγμα πλάσματος ήταν κατάλληλη για τους σκοπούς της ποσοτικοποίησης. Σε σύγκριση με άλλα μόρια νουκλεοτιδίων που περιέχουν, όπως DNA και mRNA, miRNAs είναι πιο ανθεκτικές σε DNase και RNase δραστηριότητα, καθιστώντας τους σχετικά σταθερή στην κυκλοφορία. Έχουμε αποδείξει ότι το miR-601 και miR-760 ήταν αρκετά σταθερό σε δείγματα πλάσματος και υποβλήθηκε σε μικρή υποβάθμιση μετά από παρατεταμένη επώαση σε θερμοκρασία δωματίου ή πολλούς κύκλους ψύξης-απόψυξης.

Ένας περιορισμός αυτής της μελέτης ήταν ότι η μοριακή γνώσεις σχετικά με το αιτία της απορρύθμισης δεν έχουν επικείμενη. επίπεδα Circulation miRNA φαίνεται να αντανακλούν την έκφραση ιστό που έχει δειχθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη και του καρκίνου του μαστού [9], [24]. Ενώ miR-601 και miR-760 επίπεδα δεν μειώθηκαν στο CRC ιστούς, τα οποία δεν φάνηκε να αποτελείται με αυτό το πλάσμα. Ένας άλλος περιορισμός αυτής της μελέτης είναι ότι παρόμοιες, αλλά όχι συμπληρωματικές, διαγνωστικές τιμές βρέθηκαν μεταξύ των δύο αυτών miRNAs. Εκτός του miR-601 δεν βελτίωσε την διαφορική δύναμη του miR-760 σε διακρίσεις προηγμένες παχέος νεοπλασία από φυσιολογικούς μάρτυρες. Ωστόσο, προσδιορίζοντας το πλάσμα miR-601 και miR-760 ως βιοδείκτες θα πρέπει τώρα να εντοπίσει με μεγαλύτερη ακρίβεια CRC σε πρώιμο στάδιο. Ακόμη περισσότερο, η προσθήκη miR-760 σε άλλους δύο miRNA προσδιορίζονται προηγουμένως από εμάς αποκάλυψε μια σημαντική βελτιωμένη διαγνωστική αξία, γεγονός που υποδηλώνει ότι μια ομάδα δεικτών miRNA πλάσμα μπορεί να βελτιώσει την ευαισθησία και την ειδικότητα αυτής της δοκιμασίας για CRC διαλογής.

Συμπερασματικά, τα επίπεδα στο πλάσμα miR-601 και miR-760 στο CRC και προηγμένα αδενώματα μειώθηκε σημαντικά, γεγονός που υποδηλώνει την πιθανότητα ότι το πλάσμα miR-601 και miR-760 είναι νέα βιοδείκτες για την κλινική διάγνωση της CRC, αλλά υποκείμενων μηχανισμών της μείωσης τους απαιτούν περαιτέρω έρευνα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Plasma miR-29a και την έκφραση του miR-92a. Πλάσμα miR-29a (Α) και miR-92a (Β) ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε CRCs σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες (

P

& lt? 0,0001,

P

= 0.0005). Αδενωμάτων ήταν ταυτόχρονα διαφοροποιείται από την κανονική τους ελέγχους (

P

= 0,0015,

P

= 0,0003). Η γραμμή αντιπροσωπεύει την μέση τιμή. Mann-Whitney U test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0044398.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2. ανάλυση καμπύλης

συνδυασμένη ROC του miR-29a, miR-92a και miR-760. Συνδυασμένη ανάλυση καμπύλης ROC των 3 miRNAs (miR-29a, miR-92a και miR-760) έδωσε ένα AUC του 0,943 (95% CI: 0,908 – 0,979) με 83,3% ευαισθησία και 93,1% ειδικότητα στη διάκριση CRC από φυσιολογικούς μάρτυρες.

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s002

(JPG)

Εικόνα S3.

Plasma miR-601 και miR-760 έκφρασης ομαλοποιήθηκε με miR-16. Τόσο cel-miR-39 και miR-16 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την κανονικοποίηση. MiR-601 και miR-760 ήταν ακόμα σημαντικά κάτω ρυθμίζονται CRC και προηγμένα αδενώματα σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες όταν τα δεδομένα qRT-PCR ομαλοποιήθηκε με miR-16. Η γραμμή αντιπροσωπεύει την μέση τιμή. Mann-Whitney U test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0044398.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

Διαγνωστικό ευαισθησίες του miR-601 και miR-760 σε σύγκριση με το CEA για το στάδιο Ι και ΙΙ CRCs. Οι τιμές αποκοπής του miR-601 και miR-760 από την ανάλυση της καμπύλης ROC ήταν -11.50 και -8.09 αντίστοιχα. Η τιμή αποκοπής για το CEA ήταν 5,0 ng /mL (ln 5 = 1.609). (Α, Β) ταξινομήσεις Δύο παραμέτρων έδειξε ότι 26 και 29 περιπτώσεις (στάδιο Ι και ΙΙ), έχασε από το CEA ήταν συμπληρωματική ανιχνεύεται από miR-601 και miR-760, αντίστοιχα. (C) MiR-601 και miR-760 ήταν πιο ισχυρή από ό, τι CEA στη διαφοροποίηση σταδίου Ι και ΙΙ CRCs από υγιείς ελέγχους και συνδυασμένη χρήση του miR-601 και miR-760 θα μπορούσε να ανιχνευθεί 30 CEA-αναπάντητες περιπτώσεις σε όλα. (Δ) Η συνδυασμένη χρήση των 3 δεικτών απέδωσε την AUC του 0,805 (95% CI: 0,457 – 0,683). Με υπερυψωμένο ευαισθησία 86,3%

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s004

(ΔΕΘ )

Εικόνα S5.

ROC ανάλυση καμπύλη του πλάσματος miR-601 και miR-760 ομαλοποιήθηκε με cel-miR-39 ή miR-16. (A, B, C) Κανονικοποιημένη να cel-miR-39, πλάσμα miR-601 αποδώσει μια AUC των 0,713 (95% CI: 0,634 – 0,792) με 72,4% ευαισθησία και 62,4% ειδικότητα (cut-off value = -11.50) και miR-760 αποδώσει ένα AUC του 0,754 (95% CI: 0,682 – 0,826) με 72,4% ευαισθησία και 72,2% ειδικότητα (cut-off value = -8,08) για τη διάκριση προηγμένες παχέος νεοπλασία (CRC και προηγμένα αδενώματα) από την κανονική τους ελέγχους . Συνδυασμένη ανάλυση του miR-601 και miR-760 αποκάλυψε μια AUC των 0,824 (95% CI: 0,680 – 0.824), με 74,4% ευαισθησία και 70,0% ειδικότητα. (D, E, F) Κανονικοποιημένη να miR-16, πλάσμα miR-601 απέδωσε μια AUC των 0,668 (95% CI: 0,588 – 0,748) με 74,1% ευαισθησία και 53,4% ειδικότητα (cut-off value = -7,63), και miR-760 αποκάλυψε μια AUC των 0.724 (95% CI: 0,651 – 0,798) με 87,9% ευαισθησία και 48,9% ειδικότητα (cut-off value = -4,81) για τη διάκριση προηγμένες παχέος νεοπλασία από φυσιολογικούς μάρτυρες. Συνδυασμένη ανάλυση του miR-601 και miR-760 αποκάλυψε μια AUC των 0,732 (95% CI: 0,661 – 0,803), με 43,6% ευαισθησία και 94,8% ειδικότητα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0044398.s005

(JPG)

πίνακα S1.

πληροφοριών για τον ασθενή για miRNA προφίλ.

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s006

(DOCX)

Πίνακας S2.

πληροφοριών για τον ασθενή για την επικύρωση μεγάλης κλίμακας.

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s007

(DOC)

Πίνακα S3.

Τα παθολογικά χαρακτηριστικά των προηγμένων αδενωμάτων.

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s008

(DOCX)

Πίνακας S4.

πληροφοριών για τον ασθενή για την επικύρωση της ζεύγη ιστών CRC.

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s009

(DOCX)

Πίνακας S5.

miRNAs απορυθμισμένη στο CRC πλάσμα με FC & gt? 2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s010

(DOCX)