Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος παραμένει μία από τις κύριες αιτίες των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο, λόγω της επιθετικής ανάπτυξης, υψηλή μεταστατική ποσοστά κατά τη διάρκεια του πρώιμου σταδίου και της έλλειψης ενός αποτελεσματικού θεραπευτική προσέγγιση. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι Qingyihuaji (QYHJ), επτά βότανο τύπου κινεζική ιατρική, εμφάνισαν σημαντική αντικαρκινική δράση στον καρκίνο του παγκρέατος, που συνδέεται με τις τροποποιήσεις στο μικροπεριβάλλον του όγκου, ιδιαίτερα στην αναστολή της σχετιζόμενης με καρκίνο ινοβλαστών (CAF) ενεργοποίηση. Στην παρούσα μελέτη, δημιουργήσαμε CAF και σε συνδυασμό κανονική ινοβλαστών (NF) καλλιέργειες από εκτομή ανθρώπινη παγκρεατική καρκινικούς ιστούς. Παρατηρήσαμε ότι CAFS παρουσίασαν αυξημένη ικανότητα για την πρόκληση του παγκρέατος μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή σε σύγκριση με NFs, ενώ QYHJ επεξεργασμένο CAFS παρουσίασαν μείωση της μετανάστευσης και τις ικανότητες εισβολής-προώθηση in vitro. Τα αποτελέσματα των περαιτέρω αναλύσεις έδειξαν ότι σε σύγκριση με NFs, CAFS παρουσιάζουν αυξημένη CXCL1, 2 και 8 της έκφρασης, συμβάλλοντας με τις ενισχυμένες δυνατότητες εισβολής-προώθηση αυτών των κυττάρων, ενώ η θεραπεία QYHJ κατέστειλε σημαντικά τις δραστηριότητές πολλαπλασιασμό CAF και την παραγωγή των ΚΠΑ που προέρχονται CXCL1, 2 και 8. Αυτά τα in vitro παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν σε μοντέλα ποντικών ανθρώπινου καρκίνου του παγκρέατος. Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η καταστολή της ικανότητας προαγωγής του καρκίνου της CAFS μέσω κινεζικών φυτικό φάρμακο μειώνει παγκρέατος εισβολή των καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Chen L, Qu C, Chen Η, Xu L, Qi Q, Luo J , et al. (2014) Κινέζικη Βοτανοθεραπεία Καταστέλλει Εισβολή-Προώθηση Χωρητικότητα του Καρκίνου-Associated ινοβλαστών σε καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 9 (4): e96177. doi: 10.1371 /journal.pone.0096177

Επιμέλεια: Donald Gullberg, Πανεπιστήμιο του Μπέργκεν, Νορβηγία

Ελήφθη: 31 Οκτ 2013? Αποδεκτές: 4 του Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 29 του Απριλίου του 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Επιστημονικό Fundation της Κίνας (81001061, 81370068, 81273953, 81173461)? Σαγκάη Φύση Ταμείο Επιστημών, Σαγκάη, Κίνα (09ZR1406800)? Διδακτορική Ίδρυμα Προγράμματα του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (20090071120076)? Σαγκάη Επιστήμης και Τεχνολογίας Επιτροπή Rising-Star Program (11QA1401300)? Ιατρική Ταλέντα Πρόγραμμα Εκπαίδευσης του Γραφείου Υγείας της Σαγκάης (XYQ2011008)? και το πρόγραμμα Πανεπιστήμιο Fudan Zhuo-Xue. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Λόγω επιθετική ανάπτυξη και το υψηλό μεταστατικό ρυθμού κατά τα πρώτα στάδια, ο καρκίνος του παγκρέατος παραμένει ένα εξαιρετικά θανατηφόρος κακοήθη νόσο [1], και μόνο περίπου το 10-20% του καρκίνου του παγκρέατος είναι χειρουργήσιμη κατά τη στιγμή της διάγνωσης [ ,,,0],2]. Γεμσιταμπίνη ήταν η τυπική θεραπεία για προχωρημένο καρκίνο του παγκρέατος? Ωστόσο, η διάμεση επιβίωση είναι 5-6 μηνών, με τη συχνή ανάπτυξη του χημειο-αντίσταση κατά τη διάρκεια της θεραπείας [3]. Έτσι, ο καρκίνος του παγκρέατος παραμένει μια φοβερή ασθένεια, και υπάρχει επείγουσα ανάγκη για περαιτέρω μελέτες για να αποκαλύψει τους μοριακούς μηχανισμούς της εισβολής του όγκου και των μεταστάσεων να αναπτύξουν μια αποτελεσματική θεραπευτική προσέγγιση για την πρόληψη ή /και θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος.

καρκίνος που συνδέονται ινοβλάστες (CAFS), κυρίαρχα συστατικά του στρώματος του όγκου, έχουν εξαχθεί από αρκετές επεμβατικές ανθρώπινων καρκινωμάτων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος [4], [5], [6]. Παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα χαρακτηρίζεται από εκτεταμένη απόκριση στρωματικά ονομάζεται desmoplasia [7]. Εντός του στρώματος του όγκου, CAFS είναι ο κύριος τύπος κυττάρου, που παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του όγκου [5]. CAFS εκκρίνουν πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων CXC, CC χημειοκίνες, και άλλων φλεγμονωδών μεσολαβητών, που προάγουν τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, συσσωρεύοντας στοιχεία έχουν καταδείξει ότι CAFS διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην απόκτηση της ανθεκτικότητας στα φάρμακα στη θεραπεία όγκων [8], η οποία επιδρά αρνητικά κλινικά αποτελέσματα [9], [10]. Ως εκ τούτου, αναστέλλοντας την ενεργοποίηση των CAFS θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει μία πιθανή θεραπευτική προσέγγιση για παγκρεατικό θεραπεία του καρκίνου.

QYHJ, επτά βότανο κινέζικα φάρμακα τύπο που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος στην Κίνα, αναστέλλει τόσο την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση σε γυμνά ποντίκια μοντέλα του καρκίνου του παγκρέατος [11], [12], [13]. Επιπλέον, η συνδυασμένη χρήση QYHJ με συμβατική δυτική ιατρική παρατείνει το χρόνο επιβίωσης σε ασθενείς με ηπατικές μεταστάσεις από καρκίνο του παγκρέατος [14]. Ωστόσο, η υποκείμενη μοριακός μηχανισμός παραμένει ασαφής.

Εδώ, αποδείξαμε ότι CAFS παρουσίασαν αυξημένη ικανότητα για την επαγωγή του παγκρέατος μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή σε σύγκριση με NFs, ενώ QYHJ επεξεργασμένο CAFS εμφάνισε μειωμένη μεταναστευτικής και εισβολή προαγωγής ικανοτήτων in vitro. Επιπλέον, δείξαμε ότι σε σύγκριση με NFs, CAFS εκφράζουν υψηλά επίπεδα CXCL1, 2 και 8, συμβάλλοντας στην αυξημένη ικανότητα εισβολής προαγωγής αυτών των κυττάρων. Έτσι, η θεραπεία θα μπορούσε να καταστείλει QYHJ τις δραστηριότητες διάδοσης και τα επίπεδα CXCL1, 2 και 8 έκφραση σε CAFS. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η καταστολή της ικανότητας προαγωγής του καρκίνου της CAFS με την κινεζική φυτικό φάρμακο μειώνει παγκρέατος εισβολή των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα ζωικά τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές των National Institutes of Health για τη Φροντίδα και Χρήση ζώων Εργαστηρίου. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε επίσης μέσω της Επιτροπής σχετικά με τη χρήση των ζώντων ζώων στη διδασκαλία και την έρευνα, το Πανεπιστήμιο Fudan, Σαγκάη. Στο τέλος της μελέτης, όλα τα ζώα αποκεφαλίστηκαν μέσω του διαχωρισμού του νωτιαίου μυελού στο αυχενικός να ελαχιστοποιηθεί πόνο. Οι ινοβλάστες απομονώθηκαν από εκτομή ιστούς δύο ασθενείς με παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα (PDAC). Πριν από τη συλλογή του δείγματος, γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος, καθώς και η μελέτη εγκρίθηκε μέσω των επιτροπών για την ηθική επανεξέταση της έρευνας στο Κέντρο Καρκίνου Fudan Πανεπιστήμιο της Σαγκάης.

Γραμμές κυττάρων και ποντίκια

Η ανθρώπινη παγκρεατική καρκινική κυτταρική γραμμή Capan1 και BxPC3 ελήφθησαν από την Συλλογή Καλλιεργειών Αμερικανικού τύπου, και καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle Dulbecco (DMEM? Gibco, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? Gibco, Carlsbad, CA) στους 37 ° C με 5% CO

2. Η μορφολογία της κυτταρικής γραμμής Capan1 αξιολογήθηκε τακτικά, και τα κύτταρα ελέγχθηκαν για την απουσία μόλυνσης από μυκόπλασμα (MycoAlert, Lonza, Rockland, ΜΕ, USA). Οι κυτταρικές γραμμές Capan1 και BxPC3 στις 30-40 περάσματα χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη μας.

Θηλυκά BALB /c-nu /nu γυμνοί ποντικοί ηλικίας 4-6 εβδομάδων ελήφθησαν από την Shanghai Institute of Materia Medica, κινέζικα Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα), που στεγάζεται σε γραφεία νηματικής ροής υπό ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων και παρέχονται τροφή και νερό

κατά βούληση

.

Απομόνωση CAFS και σε συνδυασμό NFs

στρωματικά fibrolasts απομονώθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [15]. Εν συντομία χειρουργικά απομονωμένος παγκρεατικό καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν από δύο ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πόρου του παγκρέατος. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε πριν από τη συλλογή των ιστών. Το φρέσκο ​​ιστός παγκρέατος όγκου και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (τουλάχιστον 2 cm από το εξωτερικό περιθώριο του όγκου) τεμαχίστηκαν σε 1-3 mm

3 τεμάχια και υπέστη πέψη με 0,25% θρυψίνη στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα προκύπτοντα θραύσματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 600 xg για 5 λεπτά και πλύθηκαν μία φορά με ϋΜΕΜ που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα θραύσματα των ιστών στη συνέχεια επιστρώθηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C. Το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε δύο φορές την εβδομάδα για 3-4 εβδομάδες. Υπό αυτές τις συνθήκες, ινοβλάστες εκφυτευτεί από θραύσματα ιστού ενώ άλλα κύτταρα ως επί το πλείστον συγκρατείται στον ιστό. Ινοβλάστες που σχηματίζονται αποικίες πολλαπλών στρώσεων διασποράς στο πιάτο πολιτισμού. Μετά από 3-4 εβδομάδες καλλιεργημένα κύτταρα χονδρικά σε επεξεργασία με θρυψίνη και επανα-επιστρώθηκαν σε φιάλες Τ25 καλλιέργειας (πέρασμα ένα). Οι ινοβλάστες στη συνέχεια υπο-καλλιεργήθηκαν για άλλες 2-3 περάσματα μέχρις ότου οι καλλιέργειες ήταν απαλλαγμένα από μόλυνση των επιθηλιακών κυττάρων και στη συνέχεια διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 2% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) . Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

στελέχη 2.NF και CAF χρησιμοποιήθηκαν κατά τις 4-5 περάσματα που περιέχουν.

Ανοσοϊστοχημεία και ανοσοφθορισμό

Ανοσοϊστοχημεία (IHC) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, τα δείγματα ιστού του όγκου μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη κερί. Μη χρωματισμένα τμήματα 3-μm στη συνέχεια κόβονται από τα μπλοκ παραφίνης για ανάλυση IHC. Οι τομές χρωματίστηκαν με τα ακόλουθα αντισώματα: αντι-βιμεντίνη (1:200), κουνελιού αντι-α-SMA (1:100), κουνελιού αντι-CXCL1 (1:100), κουνελιού αντι-CXCL2 (1:200) και κουνελιού αντι-CXCL8 (1:25) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι τομές επωάστηκαν με δευτερογενή αντισώματα, και το σύμπλοκο υπεροξειδάσης αβιδίνης-βιοτίνης χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Vector Laboratories, CA, USA). Μια ανοσοσφαιρίνη-αρνητικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε για να αποκλείσει την μη ειδική σύνδεση. Δύο ανεξάρτητοι ερευνητές και ένας παθολόγος, που όλοι τους είχαν τυφλωθεί με τον τύπο /μοντέλο θεραπείας για την σειρά των δειγμάτων, πραγματοποιούνται όλες τις διαδικασίες. Για να αξιολογηθεί ποσοτικά την CAF προκαλούμενη πολλαπλασιαστική δραστικότητα σε κάθε ομάδα, υπολογίσαμε την αναλογία της περιοχής θετικά για βιμεντίνη και χρώση α-SMA με τη συνολική έκταση σε ιστολογικές τομές από δέκα πεδία κάτω από μικροσκόπιο φωτός (200 ×) [11].

Για τη χρώση ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και επωάστηκαν με αντι-Pan-CK (1:100), αντι-α-SMA (1:100), αντι-βιμεντίνη (1:100) , αντι-Ε-καδερίνης (1:100), αντι-CD31 (1:200) και αντι-D2-40 (1:100) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με φθορισμό για 1 ώρα. Μετά την πλύση, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν με μέσο στερέωσης περιέχει DAPI (Vector Laboratories). Ένας αρνητικός μάρτυρας, στον οποίο είχε παραλειφθεί το πρωτογενές αντίσωμα, χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή για ειδικότητα αντισώματος. Οι εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού Leica.

Φάρμακα και Αντιδραστήρια

QYHJ, επτά βότανο κινεζικά φαρμακευτικά τύπο, που αποτελείται

Scutellria barbata

(Ban Zhi Lian) ,

Heydyotis διάχυτη

(Bai Hua εκείνη που cao),

Amorphophallus kiusianus

(εκείνη Liu Gu),

Coix Lacryma-jobi

(Yi Ren),

Gynostemma pentaphyllum

(Jiao Gu LAN),

Ganoderma luncidum

(Ling Zhi) και

Amomum cardamomum

(Bai Dou Κου), παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11], [12], [13]. Εν συντομία, QYHJ σκόνη ελήφθη από Jiang-γιν Tianjiang Pharmaceutical Co, Ltd. να εξασφαλισθεί η τυποποίηση και να διατηρεί την αξιοπιστία των interbatch QYHJ, μια υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) χρωματογραφικών αποτυπωμάτων αναπτύχθηκε για τον έλεγχο της ποιότητας. Τα χρωματογραφήματα των δακτυλικών αποτυπωμάτων του τύπου QYHJ φαίνεται στην προηγούμενη έκθεσή μας [17]. Το τελικό αφέψημα του QYHJ παρασκευάστηκε μετά τη διάλυση της φυτικά σκόνη σε αποσταγμένο νερό στην απαιτούμενη συγκέντρωση. Η ημερήσια δοσολογία για το κουνέλι και γυμνούς ποντικούς ήταν 15 g /kg και 18 g /kg, αντίστοιχα, υπολογίζεται σύμφωνα με τον ακόλουθο ανθρώπου-κουνελιού ή του τύπου μεταφορά ανθρώπου-ποντικού: Db = Da × (Rb /Ra) × (Wb /Wa ) 2/3, όπου D, R, και το W αντιπροσωπεύει δοσολογία, συντελεστής σχήματος, και το σωματικό βάρος, αντίστοιχα, και τα α και b αντιπροσωπεύουν ανθρώπου και ποντικού ή κουνελιού, αντίστοιχα. Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη CXCL1, 2, και 8 ελήφθησαν από την PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA). Το αντίσωμα αντι-μπλοκαρίσματος CXCR1 ελήφθη από R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ, USA). Ο αναστολέας CXCR2 SB 225002 λήφθηκε από τον Enzo Life Sciences, Inc. (Farmingdale, NY, USA). Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα: αντι-Ε-καδερίνης, αντι-βιμεντίνη, αντι-α-SMA, αντι-CXCL8, αντι-CXCL1 (όλα από Epitomics, Burlingame, CA, USA), αντι-Pan Cytokeratin (ΑΕ1 /ΑΕ3) (Pan-CK? Ascend Βιοτεχνολογίας, Guangzhou, Κίνα)., και αντι-CXCL2 (BIOSs, Πεκίνο, Κίνα)

Προετοιμασία QYHJ-περιέχει ορό

Η QYHJ-περιέχει ορό παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Εν συντομία, 20 θηλυκά κουνέλια, βάρους 1,800 ± 2,200 g, χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες: την QYHJ-ομάδα που περιέχει ορό και την ομάδα ελέγχου φορέα. Η QYHJ-ομάδα που περιέχει ορός καθετηριάζονται με ενδογαστρικό QYHJ μία φορά την ημέρα για 7 συνεχόμενες ημέρες (12,5 g /kg σωματικού βάρους /ώρα), και η ομάδα του μάρτυρα ήταν καθετηριάζονται με ενδογαστρικό απιονισμένο νερό. Το αίμα συλλέχθηκε από την καρωτίδα αρτηρία μέσα σε 2 ώρες μετά την τελευταία χορήγηση και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Ο ορός από το πλήρες αίμα υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση (4000 r /min για 10 min) και αδρανοποιημένο σε υδατόλουτρο 56 ° C για 30 λεπτά. Ο ορός αποθηκεύεται στους -80 ° C, και επανειλημμένη κατάψυξη και απόψυξη αποφεύχθηκαν.

Μετανάστευση και δοκιμασία εισβολής

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας transwell πλάκες μετανάστευση κυττάρων (Corning, ΝΥ, USA) και Matrigel θάλαμοι εισβολής (Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [19]. Εν συντομία, τα κύτταρα (1,0 χ 10

4) σπάρθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού εντός του άνω θαλάμου και αφήνονται να εισβάλουν προς 10% FCS στον κατώτερο θάλαμο ως χημειοελκτικό. Μετά από 12 ώρες (για τις δοκιμασίες μετανάστευσης χωρίς επικάλυψη matrigel) ή 48 ώρες (για τις δοκιμασίες εισβολή με επίστρωση Matrigel), τα κύτταρα που είχαν εισβάλει μέσω της μεμβράνης και προσκολλάται στην κάτω πλευρά της μεμβράνης μετρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

Ανάλυση Western Blot

η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από τα καλλιεργημένα κύτταρα, και ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας δικιγχονινικού οξέος (Pierce, Rockford, IL, USA). Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με προηγούμενη αναφορά μας [16]. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από διαφορετικά δείγματα διαχωρίστηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης SDS-πολυακρυλικό πήκτωμα 10% και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού, περιέχον 5% άπαχο γάλα, χρησιμοποιήθηκε για να εμποδίσει και επωάστε τις μεμβράνες με πρωτεύοντα αντισώματα. Η έκφραση των πρωτεϊνών στόχων εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ένα ενισχύσει χημειοφωταύγειας (ECL) κιτ (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), και η ποσοτική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

απομόνωση RNA και σε πραγματικό χρόνο PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, San Diego, CA, USA), και αντίστροφη μεταγραφή PCR (RT-PCR) διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Takara). Ποσοτικές μετρήσεις PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση πράσινου SYBR Ι (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ, USA). Οι αλληλουχίες εκκινητών για CXCL1, 2, και 8 παρατίθενται στον Πίνακα 1. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκε δύο φορές.

Η

Ρυθμισμένο μέσο (CM) παρασκευή

CM από CAFS και του NFS ελήφθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με ελαφρές τροποποιήσεις [20]. Εν συντομία, τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ στους 37 ° C για 48 ώρες. Το προσαρμοσμένο μέσο από CAFS ή NFs συλλέχθηκαν. Το ρυθμισμένο μέσο διαυγάστηκε μέσω φυγοκέντρησης, που ακολουθείται από 1:01 αραίωση με ορισμένο μέσο πριν από την κατεργασία των κυττάρων Capan 1? το ρυθμισμένο μέσο πρόσφατα μεταφέρθηκε χωρίς αποθήκευση.

Για να αποκτήσετε CM από QYHJ επεξεργασμένο CAFS, απομονωμένες CAFS απλώθηκαν σε φιάλες Τ25 (1 × 10

6 κύτταρα) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% QYHJ- που περιέχει ορό ή Control-που περιέχει ορό. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 5 ml μέσου ϋΜΕΜ φρέσκο ​​για ένα επιπλέον χρόνο 48 ωρών. Το CM στη συνέχεια συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω.

ενζυματικής ανοσοαπορρόφησης (ELISA) ανάλυση

Ο CXCL1 ορού, 2, και 8 συγκεντρώσεις μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ELISA, όπως περιγράφεται προηγουμένως [17]. Το δείγμα αίματος αποθηκεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, φυγοκεντρήθηκε (12.000 χ g) για 15 λεπτά, και κρυοσυντηρήθηκαν στους -80 ° C. Οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ELISA σάντουιτς (Duoset? R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA). Για την ανίχνευση της έκκρισης κυτοκίνης στο μέσο καλλιέργειας, τα κύτταρα επιστρώθηκαν επί πλακών 6-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε ανωτέρω. Μετά από 48 ώρες, τα μέσα συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι περαιτέρω χρήσης.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Η δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Περίπου 5 × 10

3 κύτταρα σε 0,1 ml απλώθηκαν εις διπλούν φρεάτια πλακών 96 φρεατίων. Μετά από ολονύκτια επώαση, το εναιώρημα απομακρύνθηκε και μετατράπηκε σε διαφορετικά μέσα κατάσταση. Στη συνέχεια, οι δείκτες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων αξιολογήθηκαν καθημερινά χρησιμοποιώντας την μέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Molecular Technologies, Inc, Gaithersburg, MD), και η καμπύλη ανάπτυξης συντάχθηκε σύμφωνα με τις τιμές OD λάβουν από CCK-8 δοκιμασία.

Ίδρυση μοντέλα όγκων ξενομοσχεύματος

ξενομοσχεύματος μοντέλα όγκων καθορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, κύτταρα Capan1 (2 × 10

6 σε 0,2 ml) σε λογαριθμική φάση εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά μασχάλη γυμνών ποντικών. Το μήκος και το πλάτος των όγκων (σε mm) μετρήθηκαν εβδομαδιαίως χρησιμοποιώντας καλίμπρες. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο (α χ b

2) × 0,5, όπου a και b είναι οι μεγάλες και μικρές διαστάσεις, αντίστοιχα. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν όταν οι όγκοι έφθασαν 1,5 εκατοστά σε διάμετρο. Οι όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. Κάθε ομάδα αποτελούνταν από τουλάχιστον έξι ποντίκια.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ± τυπική απόκλιση (SD). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ανάλυσης της διακύμανσης (ANOVA) και t-test του Student. Ένα P-τιμή του & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του πακέτου λογισμικού SPSS 15.0.

Αποτελέσματα

Δημιουργία σχετίζονται με τον καρκίνο των ινοβλαστών (CAF) πολιτισμών

Εμείς εξάγεται ινοβλάστες από τις εκτομή δείγματα των δύο παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα. Οι μάζες των όγκων διαχωρίστηκαν, και διαφόρων τύπων κυττάρων διαχωρίστηκαν για να ληφθούν πληθυσμοί CAFS. Απομονώσαμε επίσης ένα δεύτερο πληθυσμό ινοβλαστών από μη καρκινικό περιοχή του παγκρέατος τουλάχιστον 2 cm από το εξωτερικό περιθώριο του όγκου σε κάθε μία από τις ίδιες δύο ασθενείς. Εμείς ονομάζονται αυτά τα κύτταρα «φυσιολογικούς ινοβλάστες (NFS).» Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν μέσω συγκρίσεων μεταξύ CAFS και των αντίστοιχων NFs, αποφεύγοντας έτσι προκατάληψη λόγω ατομικές διαφορές. Η καθαρότητα των καλλιεργημένων κυττάρων ινοβλαστών επαληθεύθηκε μέσω ανοσοκηλιδώσεως με χρησιμοποίηση βιμεντίνη και ΡϋΟΡΡ-β (δείκτης κυττάρων μεσεγχυματικά) και Ε-καδερίνης και κυτοκερατίνη (CK) (δείκτης επιθηλιακών κυττάρων). Επιπλέον, D31 και D2-40 χρησιμοποιήθηκαν για να αποκλείσει το ενδοθηλιακής προέλευσης (Σχήμα 1Α και το Σχήμα S1). Όλες οι κυτταρικές καλλιέργειες βιμεντίνη και θετική ΡϋΟΡΡ-β και 91% έως 100% Ε-καδερίνης, κυτοκερατίνης, CD31 και D2-40 αρνητική. Σε σύγκριση με NFs, οι καθιερωμένες CAFS εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του άλφα λείου μυός ακτίνη (α-SMA), ένα δείκτη των ενεργοποιημένων ινοβλαστών, τυπικά εκφράζεται σε CAF αλλά όχι κανονικά αδρανείς ινοβλάστες. Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω μέσω της ανάλυσης κηλίδος Western (Σχήμα 1Β). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι έχουμε καθιερωθεί με επιτυχία σε συνδυασμό CAF και NF καλλιέργειες από ανθρώπινα PDAC.

Α. Οι ινοβλάστες που εξάγονται από τα εκτομή ιστούς δύο παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα. Η καθαρότητα των καλλιεργημένων κυττάρων ινοβλαστών επαληθεύθηκε μέσω ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση Pan-CK (κόκκινο), Ε-καδερίνης (πράσινο), βιμεντίνη (κόκκινο), α-SMA (κόκκινο), ΡϋΟΡΡ-β (κόκκινο), CD31 (κόκκινο) και D2-40 (κόκκινο). Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε). έχουν θετική ιστούς ελέγχου για CD31 και D2-40 ανοσοχρώση έχουν χρησιμοποιηθεί (Σχήμα S1). Η ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε Β του προτύπου έκφρασης των δεικτών που χρησιμοποιούνται στο Α

Η

παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ρυθμισμένα μέσα από QYHJ επεξεργασμένο CAFS έδειξαν μειωμένη εισβολή

CAFS συμβάλλουν στην επεμβατική και μεταστατική διαδικασία στον ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος [5]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την μετανάστευση και τις επιπτώσεις εισβολή επαγωγής του CAF σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος χρησιμοποιώντας transwell θαλάμους με ή χωρίς επίστρωση Matrigel. Οι δοκιμασίες transwell απέδειξαν ότι το ρυθμισμένο μέσο (CM) από CAFS μάρτυρα παρουσίασαν αυξημένη ικανότητα για την επαγωγή του παγκρέατος μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή (Σχήμα 2 και Σχήμα S2). Στη συνέχεια, θα αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της QYHJ επί CAF επαγόμενη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, το CM από QYHJ ή CAFS μάρτυρα συλλέχθηκαν και τα αποτελέσματα αυτού του μέσου επί του παγκρέατος μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή αξιολογήθηκαν επίσης. Παρατηρήσαμε ότι ο CM από QYHJ επεξεργασμένο CAFS εμφάνισε μειωμένη μετανάστευση και ικανότητες εισβολή προαγωγής σε σύγκριση με εκείνη του CAFS μάρτυρα (Σχήμα 2 και Σχήμα S2), αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η θεραπεία QYHJ μπορούσε να καταστείλει παγκρεατικού μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή μέσω CAFS στόχευσης .

Η μετανάστευση των κυττάρων και την ικανότητα εισβολής των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος που έλαβαν θεραπεία με ρυθμισμένα μέσα (CM) από NFs, Ctrl-αντιμετωπίζονται CAFS και QYHJ επεξεργασμένο CAFS συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας transwell θαλάμους με ή χωρίς επίστρωση Matrigel. Οι αριθμοί των κυττάρων που διανύθηκε μέσω της μεμβράνης μετρήθηκαν σε 10 πεδία κάτω από ένα αντικειμενικό φακό × 20. Αρχική μεγέθυνση, × 200. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD των τιμών που λαμβάνονται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με χρήση ANOVA. *

P

& lt?. 0.05

Η

QYHJ αναστέλλει την έκκριση της CXCL1, 2 και 8 CAFS μορφή

CAFS διεγείρουν άμεσα τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μέσω διαφόρων αυξητικών παραγόντων, ορμόνες και κυτοκίνες σε ένα πλαίσιο με τρόπο που εξαρτάται [5]. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι CAFS προάγουν την μετανάστευση και εισβολή κυττάρων Capan1 in vitro, και αυτή η ιδιότητα ανεστάλη μετά επεξεργάστηκε με QYHJ. Είμαστε δίπλα προσπάθησε να εντοπίσει τα πιθανά μόρια που διαμεσολαβούν τη συσχέτιση μεταξύ ινοβλαστών και καρκινικών κυττάρων. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα μέλη των υποοικογενειών χημειοκίνης CXC, συμπεριλαμβανομένων GRO1 (CXCL1), GRO2 (CXCL2) και IL-8 (CXCL8), είναι μεταξύ ένα από τα πιο υψηλά πάνω ρυθμισμένα γονίδια που ταυτοποιήθηκαν σε CAFS σύγκριση με NFs σε παγκρεατικά του καρκίνου [21]. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε την έκφραση αυτών των παραγόντων στην CAFS και αντιστοιχισμένο NFs. Παρατηρήσαμε ότι CAFS παρουσιάζουν αυξημένη CXCL1, 2 και 8 του mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης σε σύγκριση με NFs. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία QYHJ κατέστειλε σημαντικά την έκφραση του CXCL1, 2 και 8 στις δύο κυτταρικές σειρές CAF (Σχήμα 3Α-Β). δοκιμασία ELISA επιβεβαίωσε επίσης ότι CAFS κατεργάζεται με QYHJ εκκρίνεται χαμηλότερα επίπεδα CXCL1, 2 και 8 μέσα στο μέσο (Σχήμα 3C). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι QYHJ αναστέλλει την έκφραση CXCL1, 2 και 8 σε CAFS.

Α-Β. CAFS υποβλήθηκαν σε αγωγή με QYHJ-που περιέχει ορό ή Control-που περιέχει ορό επί 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, και η έκφραση των CXCL1, 2 και 8 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου (Α) και κηλίδωση Western (Β). C. Τα απομονωμένα CAFS απλώθηκαν σε φιάλες Τ25 (1 × 10

6 κύτταρα) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% QYHJ-που περιέχει ορό ή Control-που περιέχει ορό. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα μέσα απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 5 ml φρέσκου μέσου ϋΜΕΜ για επιπλέον 48 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια συλλέχθηκαν, και το CXCL1, 2 και 8 συγκεντρώσεις ανιχνεύτηκαν μέσω ELISA. ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα. *

P

& lt?. 0.05

Η

QYHJ ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό CAF in vitro

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ο αριθμός των CAFS στο στρώμα συνδέεται σημαντικά με το κακή διαφοροποίηση και την πρόγνωση των καρκίνων [22], [23], [24], και μείωση του αριθμού CAF παρατηρήθηκαν επίσης όταν ο όγκος υποβλήθηκε σε επεξεργασία [11]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι QYHJ επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των ΚΠΑ. Η δοκιμασία πολλαπλασιασμού in vitro έδειξε ότι η θεραπεία QYHJ ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των CAFS στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4), συμβάλλοντας έτσι στην καταστολή CXC χημειοκινών έκκριση από CAFS.

Περίπου 5 × 10

3 CAFS στην 0,1 ml απλώθηκαν εις διπλούν φρεάτια πλακών 96 φρεατίων. Μετά από ολονύκτια επώαση, το εναιώρημα απομακρύνθηκε και μεταφέρθηκε σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% QYHJ-που περιέχει ορό ή Control-που περιέχει ορό. Οι δείκτες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων εκτιμήθηκαν καθημερινά χρησιμοποιώντας την μέτρηση κυττάρων Kit-8. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD των τιμών που λαμβάνονται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0.05.

Η

CXCLs αύξησε την μετανάστευση και την εισβολή ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

έχουν CXC χημειοκίνες έχουν συσχετιστεί με τον καρκίνο των κυττάρων εισβολή σε πολλούς τύπους ανθρώπινων καρκίνων [25]. Όπως έχουμε παρατηρήσει ότι CAF παρουσίασαν αυξημένη CXC χημειοκινών έκφραση και την έκκριση, επιβεβαιώσαμε αν η προς τα πάνω ρυθμισμένη έκκριση χημειοκινών CXC συμβάλλει στην ενίσχυση της ικανότητας για επαγωγή του παγκρέατος μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή. Δοκιμάσαμε τις επιδράσεις των CXC χημειοκινών στην μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή χρησιμοποιώντας transwell θαλάμους με ή χωρίς επίστρωση Matrigel. Η προσθήκη της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης CXCL1, 2 και 8 αύξησε τόσο την μετανάστευση και την εισβολή του 1 κύτταρα Capan στις δοκιμασίες transwell. Επιπλέον, η αναστολή της σηματοδότησης CXC χημειοκίνης χρησιμοποιώντας ανταγωνιστές υποδοχέα μπλοκαριστεί σημαντικά CXC χημειοκίνη επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολής (Σχήμα 5 και το Σχήμα S3).

Μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες διεξήχθησαν σε κύτταρα Capan1 αγωγή με φορέα, 100 /ml CXCL1, 2, και 8, ή antognists τους 20 μg /ml αντισώματος αντι-CXCR1 και 400 nm SB 225002 όπως υποδεικνύεται, χρησιμοποιώντας Transwell θαλάμων κύτταρο. Ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν στην μεμβράνη μετρήθηκε σε 10 πεδία κάτω από την × 20 αντικειμενικό φακό. Αρχική μεγέθυνση, × 200. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD των τιμών που λαμβάνονται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με χρήση ANOVA. *

P

& lt? 0.05.

Η

QHYJ αναστέλλουν την θεραπεία της ογκογένεσης και της έκφρασης των CXCL1, 2, 8 in vivo

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τα αποτελέσματα της QYHJ στα CAF δραστηριότητες διάδοσης και CXCLs παραγωγή in vivo, ιδρύσαμε ποντίκια μοντέλα ξενομοσχεύματος χρησιμοποιώντας κύτταρα Canpan1. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε QYHJ και ελέγχου ομάδων, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με QYHJ (0.2 ml, καθετηριασμό, ημερησίως) ή κανονικό αλατούχο ορό ως έλεγχο, αντίστοιχα. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία QYHJ οδήγησε σε μειωμένη ανάπτυξη του όγκου (Σχήμα 6Α). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των in vitro αναλύσεων, QYHJ μειωμένη πολλαπλασιασμός CAF σε όγκους (Σχήμα 6Β). Επιπλέον, IHC επιβεβαίωσε ότι οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με QYHJ εμφάνισαν την μειωμένη έκφραση του CXCL1, 2, και 8 (Σχήμα 6D). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα μας πρότειναν ότι η θεραπεία QHYJ ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό CAF και την έκφραση του CXCL1, 2, και 8, πιθανώς αντανακλώντας τις αντικαρκινικές επιδράσεις του QHYJ σε καρκίνο του παγκρέατος.

A. Επίδραση της QYHJ στην ανάπτυξη όγκου σε ένα μεταμοσχευμένο υποδορίως μοντέλο όγκου. κύτταρα Capan1 (2 × 10

6cells σε 200 ml) εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά μασχάλη κάθε BALB /c-nu /nu γυμνό ποντίκι. Την επόμενη ημέρα, οι ποντικοί έλαβαν από το στόμα με ή χωρίς QYHJ. Μετρήθηκαν οι μέσοι όγκοι του όγκου του υπό αγωγή με όχημα (αλατούχο νερό) και QYHJ επεξεργασμένο όγκους. Η μέση ± τυπική απόκλιση προσδιορίστηκε σε κάθε ομάδα θεραπείας. Οι καμπύλες ανάπτυξης όγκου που φαίνεται στο άνω φύλλο, και οι φωτογραφίες υποδορίως μεταμοσχευμένους όγκους και από τις δύο ομάδες που δείχνονται στο κάτω πάνελ. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα. *

P

& lt? 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα QYHJ αγωγή. Β IHC χρώση για βιμεντίνη και α-SMA σε τμήματα των όγκων να αξιολογήσει τις δραστηριότητες πολλαπλασιασμού CAF. Ένα βέλος δείχνει ινοβλαστών και αιχμή βέλους υποδεικνύει παγκρεατικό καρκινικό κύτταρο. Αρχική μεγέθυνση, 200 ×. CAF πολλαπλασιαστικές δραστηριότητες (δεξιά) έχουν ποσοτικά αξιολογήθηκαν μετά τον υπολογισμό της αναλογίας της βιμεντίνης ή α-SMA περιοχή χρώση αντισώματος-θετικές προς τη συνολική έκταση σε κάθε πεδίο, και η μέση τιμή από δέκα πεδία κάτω από 200 × μικροσκοπία υποδεικνύονται. *

P

& lt? 0.05. Γ IHC χρώση χρησιμοποιώντας αντι-CXCL1, 2 και 8 αντισώματα εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας τομές μεταμοσχευμένων όγκων. Αρχική μεγέθυνση, × 200. Οι θετικές τιμές του CXCL1, 2, και 8 σε όγκους που φαίνεται στα δεξιά. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα. *

P

& lt? 0.05.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι η QYHJ αναστέλλει παγκρέατος εισβολή των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση με τη στόχευση CAFS, ιδιαίτερα την παραγωγή CXCL1, 2 και 8. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώνεται περαιτέρω προηγούμενες εικασίες μας ότι τα κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως κεντρικό στόχοι για κινεζικών φυτικό φάρμακο [11].

η παραδοσιακή κινέζικη ιατρική (TCM) βασίζεται σε μια μοναδική θεωρία που σχηματίζεται στο μοναχικός διάρκειας πρακτική εμπειρία. Για τα τελευταία χίλια χρόνια, το TCM έχει ευρέως διαδεδομένη πρακτική στην Κίνα, και περισσότερο από το 90% των σύγχρονων ασθενείς με καρκίνο Κινέζοι έχουν λάβει θεραπεία με TCM κατά τη διάρκεια της θεραπείας [26]. Πρόσφατα, TCM έχει χρησιμοποιηθεί στο εξωτερικό και είναι αποδεκτό σε πολλές χώρες, ιδιαίτερα για την θεραπεία της ογκολογίας [27]. TCM βασίζεται στην έννοια της ολότητας, λαμβάνοντας υπόψη την αλληλεξάρτηση του ανθρώπινου σώματος και τον περιβάλλοντα χώρο σε μακροοικονομικό επίπεδο. Κατά τη μικροσκοπική κλίμακα, θεωρούμε την ολιστική σχέση μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και μικροπεριβάλλοντος. Πράγματι, πρόσφατες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι τα καρκινικά κύτταρα δεν ενεργούν μεμονωμένα, αλλά μάλλον υφίστανται σε μια πλούσια μικροπεριβάλλον που παρέχονται από τους ινοβλάστες διαμένουν, φλεγμονώδη κύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα, περικύτταρα, λευκοκύτταρα, και της εξωκυττάριας μήτρας [28]. Καθώς ο καρκίνος εξελίσσεται, η γύρω μικροπεριβάλλον ενεργοποιείται, συνεξελισσόμενης μέσω της συνεχούς επικοινωνίας παρακρινούς, για να υποστηρίξει την καρκινογένεση [29]. Ο καρκίνος του παγκρέατος χαρακτηρίζεται από μια εκτενή ανταπόκριση στρωματικά ονομάζεται desmoplasia [7]. CAFS είναι ο κύριος τύπος κυττάρου στο στρώμα του όγκου, και η σημασία του ρόλου για CAFS στην πρόοδο του όγκου είναι καλά αποδεκτή [5]. Ως εκ τούτου, ο καρκίνος δεν θεωρείται πλέον μια διακριτή οντότητα που ορίζεται μόνο από τα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων εντός του όγκου, τελικά επηρεάζουν ολόκληρο τον οργανισμό, TCM προσφέρει μια ολιστική προσέγγιση για τη ρύθμιση της ακεραιότητας όλων των λειτουργιών του σώματος και την αλληλεπίδραση μεταξύ των ανθρώπων και η περιβάλλοντα χώρο.