Αφηρημένο

Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι οι χρωμοσωμικές περιοχές που περιέχουν microRNAs είναι λειτουργικά σημαντικό καρκίνους. Εδώ, δείχνουμε ότι γονιδιωματικό loci κωδικοποιεί miR-204 είναι συχνά χάνονται σε πολλαπλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων των ωοθηκών, παιδιατρική νεφρικών όγκων, και καρκίνων του μαστού. MiR-204 δείχνει μείωσε δραστικά την έκφραση σε διάφορους καρκίνους και δρα ως ισχυρός καταστολέας όγκου, την αναστολή της μετάστασης των όγκων σε βιολογικό περιβάλλον όταν συστημικά παραδοθεί. Έχουμε αποδείξει ότι miR-204 ασκεί τη λειτουργία του από τα γονίδια που εμπλέκονται στόχευση στην ογκογένεση συμπεριλαμβανομένης

νευροτροφικού παράγοντα

προερχόμενο από τον εγκέφαλο (

BDNF

), ένα μέλος της οικογένειας νευροτροφινών ο οποίος είναι γνωστό ότι προάγει την αγγειογένεση των όγκων και διεισδυτικότητα . Ανάλυση των πρωτογενών όγκων δείχνει ότι αυξημένη έκφραση του BDNF ή τον υποδοχέα tropomyosin σχετίζονται κινάση Β της (TrkB) παράλληλη μια σημαντικά μειωμένη έκφραση του miR-204. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ότι η απώλεια του miR-204 οδηγεί σε BDNF υπερέκφραση και μετέπειτα ενεργοποίηση του μικρού ΟΤΡάσης Rac1 και αναδιοργάνωση ακτίνης μέσω της ΑΚΤ /mTOR μονοπάτι που οδηγεί σε μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή σηματοδότησης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι microdeletion της γονιδιωματικής τόπων που περιέχουν miR-204 συνδέεται άμεσα με την απελευθέρωση των βασικών ογκογόνων μονοπάτια που παρέχουν ζωτικής σημασίας κίνητρο για την ανάπτυξη και μετάσταση όγκου. Τα ευρήματά μας παρέχουν μια ισχυρή λογική για το χειρισμό των επιπέδων του miR-204 θεραπευτικά για να καταστείλει τη μετάσταση των όγκων

Παράθεση:. Ιμάμ JS, Plyler JR, Bansal Η Πρατζαπάτι S, Bansal S, Rebeles J, et al. (2012) Γονιδιωματική Απώλεια Ογκοκατασταλτικής miRNA-204 Προωθεί Καρκίνος μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή από Ενεργοποίηση AKT /mTOR /Rac1 Σηματοδοσίας και ακτίνη Αναδιοργάνωση. PLoS ONE 7 (12): e52397. doi: 10.1371 /journal.pone.0052397

Επιμέλεια: Giuseppe Viglietto, Πανεπιστήμιο Magna Graecia, Ιταλία

Ελήφθη: 8 του Ιουνίου 2012? Αποδεκτές: 14 Νοέμβρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 21 Δεκ, 2012

Copyright: © 2012 Ιμάμ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση William και Ella Ιατρικό Ίδρυμα Ερευνών (MKR), GCCRI εκκίνηση ταμείο (MKR), CPRIT υποτροφία (BZ), Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) επιχορήγηση της κατάρτισης Τ32 (YFC), και ο καρκίνος του ΝΙΗ /Εθνικό Ινστιτούτο καρκίνου κέντρο επιχορήγησης (P30 CA054174-17). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ταυτοποίηση των χρωμοσωμικών περιοχών που φιλοξενούν τα ογκογονίδια και τα ογκοκατασταλτικά είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση της παθογένειας του όγκου και βελτίωση των αποτελεσμάτων της θεραπείας [1]. Αν και έχουν αρκετά γονίδια σχετίζονται με τον καρκίνο έχουν ταυτοποιηθεί σε περιοχές με χρωμοσωμικές ανωμαλίες [2], επιπρόσθετες περιοχές με τυχαία ή υποτροπιάζουσα χρωμοσωμικών ανωμαλιών που φιλοξενούν παράγοντες σημαντικοί στην ανάπτυξη και την πρόοδο του καρκίνου παραμένουν να προσδιοριστούν. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η microRNAs (miRNAs) είναι μία τέτοια ομάδα παραγόντων [3]. MiRNAs είναι μικρά, ενδογενή, μη-κωδικοποίησης RNAs που ρυθμίζουν μετα-μεταγραφική γονιδιακή έκφραση με σύνδεση προς 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (UTRs) του mRNAs στόχου. MiRNAs είναι γνωστό ότι παίζουν κρίσιμο λειτουργίες σε πολλαπλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης και της διαφοροποίησης [4], και απορρυθμισμένη έκφραση του miRNAs έχει εμπλακεί σε αρκετές ανθρώπινες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [5]. Όλο και περισσότερες ενδείξεις δείχνουν ότι miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκων [6].

Σε αυτή τη μελέτη, εστιάσαμε στην χρωμοσωμικών γενετικών τόπων που περιέχουν miR-204. MiR-204 έχει αναφερθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ασβεστοποίηση των λείων μυϊκών κυττάρων καθώς και ενδοπλασματικό δίκτυο απόκριση στρες σε κύτταρα δοκιδωτού δικτύου [7], [8]. Επιπλέον, πρόσφατες αναφορές έχουν δείξει εξίσου σημαντικούς ρόλους για miR-204 στην ογκογένεση, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης της καρκινογένεσης στο περιφερικό νεύρο όγκους θήκη, και τη μετανάστευση και την εισβολή του ενδομητρίου καρκινικές κυτταρικές γραμμές [9], [10]. Ωστόσο, πολύ λίγα είναι γνωστά για το μηχανισμό με τον οποίο miR-204 ρυθμίζει την ογκογένεση σε γενικές γραμμές, και την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση σε καρκίνους μαστού και ωοθήκης ειδικότερα. Επιπλέον, σχεδόν τίποτα δεν είναι γνωστό για το αν miR-204 μπορούν να απευθύνονται θεραπευτικά και πώς η έκφραση του miR-204 ρυθμίζεται σε καρκίνους. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ότι χρωμοσωμικές θέσεις που περιέχουν miR-204 είναι συχνά χάνεται, με αποτέλεσμα την μείωση της έκφρασής του σε πολλαπλούς καρκίνους. Έχουμε αποδείξει ότι miR-204 δρα ως ισχυρός ανάπτυξη και μετάσταση όγκου καταστολέα. Σημαντικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η miR-204 μπορούν να στοχεύσουν θεραπευτικά ως συστημική απελευθέρωση του miR-204 ανέστειλε μαστού μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα χωρίς να προκαλούν ηπατοτοξικότητα. Βρήκαμε ότι miR-204 δρα ως καταστολέας όγκου μέσω στόχευσης της λειτουργίας των γονιδίων που σχετίζονται με ογκογένεση, συμπεριλαμβανομένων

προερχόμενο από εγκέφαλο νευροτροφικό παράγοντα

(

BDNF

). BDNF είναι ένα φυσιολογικά σημαντικό παράγοντα ανάπτυξης νεύρου που παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος με δέσμευση και στη συνέχεια ενεργοποίηση του υποδοχέα κινάσης τυροσίνης, που σχετίζονται με τροπομυοσίνη κινάση Β (TrkB) [11], [12]. Επιπλέον, η οδός /TrkB BDNF αναφέρεται ότι έχει ένα κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση δεδομένου ότι προωθεί τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την αγγειογένεση και η εισβολή όγκου [13]. Η υπερέκφραση του BDNF /TrkB έχει επίσης εμπλακεί σε κακή πρόγνωση αρκετών συμπαγών όγκων, συμπεριλαμβανομένων του νευροβλαστώματος, των ωοθηκών, του μαστού, του προστάτη και του πνεύμονα [14], [15], [16]. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η απώλεια του miR-204 οδηγεί σε BDNF /υπερέκφραση TrkB και ταυτόχρονη ενεργοποίηση του /mTOR /σηματοδοτικό μονοπάτι Rac1 ΑΚΤ, οδηγώντας σε αναδιοργάνωση της ακτίνης κατά τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή. Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν τη λειτουργική σημασία των χρωμοσωμικών περιοχών που περιέχουν συγκεκριμένες miRNAs στην ανάπτυξη και μετάσταση όγκου.

Αποτελέσματα

Σωματικά Απώλεια miR-204 σε καρκίνους

Για την αναγνώριση miRNAs που είναι σχετίζεται με παρεκκλίνουσα χρωμοσωμικές περιοχές σε ανθρώπινους καρκίνους, χρησιμοποιήσαμε υψηλής ανάλυσης έθιμο miRNA συγκριτική γενωμική υβριδοποίησης (CGH) και υψηλής πυκνότητας CGH σύνολα δεδομένων δημόσιο τομέα για ωοθηκών καρκίνους, καρκίνους του μαστού και παιδιατρικούς νεφρικών όγκων. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε αρκετές miRNAs στις ελάχιστες χρωμοσωμική διαγραφή και την ενίσχυση των περιφερειών αυτών των όγκων. Για να αρχίσουμε να καταλαβαίνουμε τη λειτουργική σημασία των χρωμοσωμικών γενετικών τόπων που σχετίζονται με miRNAs στην καρκινογένεση, αρχικά επικεντρώθηκε στην miRNAs παρουσιάζουν γονιδιωματική απώλεια (Σχήμα S1 Α). Η 9q21.12 χρωμοσωμική περιοχή που περιέχει miR-204 ήταν συχνά χάνεται στο 44,63% (158/354) των καρκίνων των ωοθηκών, το 28% (10/35) των καρκίνων του μαστού και 40% (15/38) των παιδιατρικών νεφρικών όγκων (Σχήμα 1Α , 1Β, και το Σχήμα S1B), το οποίο περαιτέρω επιβεβαιώθηκε με ποσοτική γενωμική PCR πραγματικού χρόνου ανάλυση (Σχήμα 1 C και 1 D). Επιπλέον, η μείωση των επιπέδων της ώριμης miR-204, επίσης, στενά με γενωμική DNA περιεχόμενο της σε όλους τους τρεις τύπους όγκων (Σχήμα 1Ε-1G).

Ένα, υψηλής ανάλυσης miRNA-CGH σε επιλεγμένα παιδιατρική νεφρικών όγκων με (αριστερά) ή χωρίς (δεξιά) διαγραφές miR-204. Η διαγραφή του γενωμικού τόπων που περιέχει το miRNA υποδεικνύεται με διακεκομμένες κάθετες γραμμές. Κόκκινο και πράσινες κουκκίδες υποδεικνύουν τη θέση και την αξία του κάθε ανιχνευτή που αντανακλά την αλλαγή του αριθμού αντιγράφων, που εκπροσωπούνται στο τριπλούν για το array CGH. Το γκρι γραμμή τάσης αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή της τριπλούν ανιχνευτή για κάθε όγκο. Β, γραφικές παραστάσεις που λαμβάνονται από μετα-ανάλυση υψηλής ευκρίνειας CGH των καρκίνων των ωοθηκών (

n = 354

? Λαμβάνεται από TCGA) που αντιπροσωπεύει ένα υποσύνολο των όγκων, με ή χωρίς διαγραφή. Η διαγραφή των γονιδιωματικών τόπων που περιέχουν miR-204 υποδεικνύεται με διακεκομμένες κάθετες γραμμές. Γ και Δ, αλληλικές PCR του miR-204 γενωμικού τόπου σε παιδιατρικούς νεφρικών όγκων (C) και καρκίνους των ωοθηκών (D). Ο άξονας y δείχνει ημερολόγιο

2 μεταμορφωθεί σε σχέση με τις τιμές ποσοτικοποίηση. Διακεκομμένες γραμμές δείχνουν την απώλεια του ορίου αντίγραφο. E-G, γραφική αναπαράσταση της ανάλυσης qRT-PCR δείχνει τα επίπεδα του miR-204 σε παιδιατρικούς νεφρικών όγκων (

n

= 38? Ε), σε καρκίνους των ωοθηκών σε προχωρημένο στάδιο (

n = 11

? F) και, σε καρκίνους του μαστού (

n

= 10? G), σε σύγκριση με την κανονική συμφωνημένα νεφρό ελέγχου (

n

= 38), φυσιολογικούς ιστούς ωοθηκών (

n

= 5) και η κανονική συμφωνημένα ιστούς του μαστού (

n

= 10).

η

MiR-204 Πράξεις σαν Ανάπτυξης Ισχυροί και μετάσταση όγκου Suppressor

η δραστικά μειωμένη έκφραση του miR-204 σε πολλούς καρκινικούς ιστούς μας ώθησε να εξεταστεί ο ρόλος των miR-204 στην ογκογένεση. Για τον προσδιορισμό αυτό, αξιολογούνται πρώτα την επίδραση του miR-204 στην αγκύρωση ανεξάρτητη ανάπτυξη. Κύτταρα ΗΕΚ-293 εμβρυϊκός νεφρός (κύτταρα ΗΕΚ-293 περάστηκαν πάνω από 52 φορές αναφερθεί ότι είναι εξαιρετικά ογκογόνα [17]) που υπερεκφράζουν miR-204 παρουσίασαν μειωμένη ικανότητα σχηματισμού αποικιών, η οποία διασώθηκε με την υπερέκφραση ενός αναστολέα του miR-204 ( Σχήμα 2Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης με miR-204 καρκίνου του μαστού που υπερεκφράζουν MDA-MB-231 και του καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το δυναμικό ογκοκατασταλτικό δραστικότητα παρόμοια miR-204, τα κύτταρα υψηλής διόδου ΗΕΚ-293 που υπερεκφράζουν σταθερά είτε miR-204 ή με ένα ανακατωμένο αλληλουχία εγχύθηκαν μέσα στις κάψουλες νεφρό γυμνών ποντικών και η ανάπτυξη του όγκου και την μετάσταση αξιολογήθηκαν 24 ημέρες μετά την ένεση . Σε έντονη αντίθεση με τον έλεγχο όγκους, miR-204 όγκοι υπερεκφράζουν μειώθηκαν δραματικά σε μέγεθος (Σχήμα 2Β). Στη συνέχεια, εξετάσαμε αν miR-204 αναστέλλει επίσης την εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Η ιστολογική ανάλυση των τμημάτων του όγκου ξενομοσχεύματος υποδεικνύεται δραστικά μειωμένη ή μηδενική διεισδυτικότητα των όγκων σε νεφρικούς ιστούς που υπερεκφράζονται miR-204 σε σύγκριση με το μάρτυρα (Σχήμα 2C). Σε συμφωνία με αυτό, miR-204 υπερέκφραση μειωθεί δραστικά τα μεταναστευτικά και επεμβατικές δυνατότητες του καρκίνου του μαστού (MDA-MB-231) και καρκίνου των ωοθηκών (SKOV3) κύτταρα (Σχήμα 2D και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) in vitro.

Α , miR-204 αναστέλλει την αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη. κατανάλωση θρεπτικών συστατικών (αριστερά) και γράφημα (δεξιά) απεικονίζουν τον αριθμό των αποικιών που σχηματίστηκαν σε μαλακό άγαρ πηγάδια από τα κύτταρα ΗΕΚ-293 που υπερεκφράζουν σταθερά είτε αγωνίζομαι ή miR-204, περαιτέρω επιμολυσμένα με αναστολέα miR-204. (*)

P

& lt? 0,05? (**)

P

& lt? 0,01. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β, miR-204 υπερέκφραση αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου. Η φωτογραφία δείχνει αντιπροσωπευτικά χαρακτηριστικά της ανάπτυξης του όγκου σε ποσοστό

RAG2

– /-, γc

– /- ποντίκια SCID ένεση (στην κάψουλα του νεφρού) με κύτταρα ΗΕΚ-293 που υπερεκφράζουν σταθερά είτε αγωνίζομαι έλεγχο ή miR -204. Μπαρ γράφημα δείχνει ο μέσος όγκος του όγκου για miR-204 (

n

= 9) και αγωνίζομαι (

n

= 9) επιμολύνσεων. (*)

P

& lt? 0.001. C, ιστολογική ανάλυση των τμημάτων αυτών από ξενομοσχευμάτων όγκου που υπερεκφράζουν είτε σκαρφάλωμα (έλεγχος) ή miR-204. Εικόνες που εμφανίζονται στο δεξιό πίνακα αντιπροσωπεύουν μεγεθυμένη εικόνα της εγκλωβιστούμε περιοχής που αναφέρεται στον αριστερό πίνακα. Όγκων εισβολή σε επιμολύνσεις ελέγχου αντανακλάται από την εισβολή του όγκου εντός νεφρικού ιστού. D, βασικής μεμβράνης δοκιμασία μήτρα εισβολή των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα επιμολυσμένα με 75 ηΜ περιπλεγμένο αλληλουχία (έλεγχος) ή miR 204-μιμητικό (MIR-204) ή miR-204 μιμητικό επιμολυσμένα κύτταρα περαιτέρω επιμολυσμένα με αναστολέα miR-204 (ΜΙΚ 204 + αναστολέας). γράφημα Bar δείχνει τον μέσο αριθμό των κυττάρων που μετρήθηκαν εισέβαλαν μικροσκοπικά σε πέντε διαφορετικά πεδία ανά φίλτρο. (***)

P

& lt?. 0.001

Η

Θεραπευτική Στόχευση του miR-204

Για να τεκμηριώσει περαιτέρω τη δραστηριότητα μετάσταση καταστολέα του miR-204 πραγματοποιήσαμε θεραπευτική πειράματα στο μοντέλο πνεύμονα μετάστασης του καρκίνου του μαστού. Ιδρύσαμε πρώτα πνευμονικών μεταστάσεων με ουρά ένεση φλέβα του MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού εκφράζουν λουσιφεράση-GFP, και στη συνέχεια με ένεση miR-204 ή miR-204 μεταλλαγμένο ολιγο (αρνητικός έλεγχος) σε φλέβα της ουράς γυμνών ποντικών κάθε 5 ημέρες για 30 ημέρες χρησιμοποιώντας LANCErII, μια in vivo όχημα μεταφοράς που βασίζονται σε λιπίδια. Είναι ενδιαφέρον, συστημική απελευθέρωση miR-204 είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση ή εξάλειψη των μεταστάσεων του πνεύμονα, ενώ miR-204 μεταλλαγμένο ολιγο εγχέεται ποντίκια είχαν σοβαρή μετάσταση πνεύμονα, όπως μετράται κατά τη διάρκεια της περιόδου των 60 ημερών (Σχήμα 3Α-3D και σχήμα S2). Σημαντικά, τα ποντίκια ενέθηκαν με miR-204 δεν έδειξε εμφανή παρενέργειες όπως αποκαλύπτεται από την απουσία ηπατοτοξικότητα ή αλλαγές στο σωματικό βάρος (Σχήμα 3Ε και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-204 μπορεί να είναι μια ασφαλής και βιώσιμη θεραπευτική αγωγή για τη θεραπεία της ανάπτυξης του όγκου και της μετάστασης.

Α, ένεση miR-204 ολιγονουκλεοτιδίου σε φλέβα της ουράς μετάσταση καταστέλλεται πνεύμονα. Ζωντανές εικόνες βιοφωτισμός ποντικών που ενέθηκαν με miR-204 (

n

= 6) ή miR-204 μεταλλαγμένο (αρν ελέγχου?.

n

= 6) ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιώντας το Xenogen Στην σύστημα απεικόνισης Vivo ( IVIS) (Xenogen). Εικόνες ελήφθησαν μετά υποδόρια ένεση 150 mg /kg D-λουσιφερίνης υπόστρωμα σε PBS σε αναισθητοποιημένους ποντικούς. Β, όγκος μετάσταση όγκου εκτιμήθηκε ξεκινώντας από την ημέρα 10 μέχρι ζώα θανατώθηκαν την ημέρα 60. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση ROI, όγκος ένταση φωτός υπολογίστηκε σε φωτόνιο /s, η οποία αντιστοιχεί με τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων in vivo. C, εκπρόσωπος εικόνες πνεύμονα δείχνει GFP

+ ve εστίες (κόκκινος κύκλος) σε αρνητικά. ομάδες ελέγχου. D, εκπρόσωπος τμήματα του πνεύμονα παρουσιάζει μεταστατικές εστίες σε αρνητικά. ομάδες ελέγχου. Ε, δεν ηπατοτοξικότητα σε miR-204 ένεση ποντίκια. Τμήματα του ήπατος από miR-204 ένεση ποντίκια δεν παρουσιάζουν συμπτώματα ηπατοτοξικότητας. Η παρουσία των πολυεστιακών περιπυλαία λεμφοκύτταρα δεν είναι ασυνήθιστο και είναι ένα συχνό εύρημα σε νεαρά ζώα.

Η

MiR-204 Στόχοι γονιδίων που σχετίζονται με Ογκογένεση

Για να κατανοήσουμε το μηχανισμό με τον οποίο το miR-204 μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ογκογένεση, προσδιορίσαμε γονίδια που ρυθμίζονται από miR-204. Δεδομένου ότι τα περισσότερα miRNAs ενεργούν για να μειώσουν τα επίπεδα του mRNA-στόχου [18], πραγματοποιήσαμε γονίδιο αναλύσεις έκφρασης σε κύτταρα που υπερεκφράζουν το miR-204 και καθορίζονται οι πιθανοί στόχοι του miR-204. Των γονιδίων αλλοιώνονται με miR-204 κύτταρα που υπερεκφράζουν, μειωτικά γονίδια είναι πιο πιθανό να στοχεύουν άμεσα από miR-204. Είναι ενδιαφέρον ότι, πολλές από τις μειωτικά γονίδια που σχετίζονται με τις διαδικασίες που σχετίζονται με τον καρκίνο και φυσικώς ή λειτουργικώς αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, όπως αποκαλύπτεται από τις αναλύσεις βάσει διαδρομής (Σχήμα S3). Πραγματοποιήσαμε λεπτομερείς αναλύσεις σε δύο τέτοια γονίδια:

BDNF

και

Ezrin

που έδειξαν υψηλότερα επίπεδα μεταβολή στην ανάλυση μικροσυστοιχιών μας και εμφανίζεται σε όλες τις προβλεπόμενες βιολογικών οδών με την υψηλότερη λειτουργική σημασία εμπλουτισμού. BDNF με TrkB υποδοχέα του είναι γνωστή παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στην αγγειογένεση και μετάσταση όγκου? και εζρίνη, μία κυτταροσκελετική πρωτεΐνη διοργανωτής, έχει ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη του όγκου μετάσταση αρκετών ενηλίκων και παιδιατρικών όγκων, συμπεριλαμβανομένων οστεοσάρκωμα, μαστικούς και παγκρεατικά αδενοκαρκινώματα, καρκίνωμα των ωοθηκών καθώς και ραβδομυοσάρκωμα και παιδιατρικούς νεφρικών όγκων [19], [20], [21 ]. Επιπλέον, πολλαπλές αλγόριθμους πρόβλεψης στόχων, συμπεριλαμβανομένων SvMicrO [22], η προσέγγιση Bayesian απόφαση σύντηξης [23], και miRmate [24] που έχουμε δημιουργήσει πρόσφατα, καθώς και TargetScan [25] και Pictar [26], προέβλεψε επίσης

BDNF

και

Ezrin

να απευθύνονται από miR-204. Επιπλέον, θέσεις δέσμευσης miR-204 βρέθηκαν να συντηρημένη εξελικτικά όλη σπονδυλωτά, προτείνοντας να έχει μία σημαντική ρυθμιστική λειτουργία σε μια ποικιλία ειδών. Είναι σημαντικό, miR-204 και

BDNF

/

TrkB

καθώς και

Ezrin

έκφρασης έδειξε μια ισχυρή αντίστροφη συσχέτιση με διάφορους όγκους (Εικόνα 4Α-4C και το σχήμα S4A-S4C) .

Α-Ο, αυξημένη έκφραση BDNF συσχετίζεται ισχυρά με χαμηλότερο miR-204 έκφραση σε πολλαπλές μορφές καρκίνου. Γραφική αναπαράσταση της ανάλυσης qRT-PCR που δείχνει την αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του miR-204 και

BDNF

σε παιδιατρικούς νεφρικών όγκων (

n

= 38? Α), καρκίνοι των ωοθηκών σε προχωρημένο στάδιο (

n

= 11? Β) και καρκίνους του μαστού (

n

= 10? C), σε σύγκριση με την κανονική συμφωνημένα νεφρό ελέγχου (

n

= 38), η κανονική ωοθηκών ιστούς (

n

= 5) και η κανονική συμφωνημένα ιστούς του μαστού (

n

= 10). D-H,

BDNF

είναι μια καλόπιστους στόχος του miR-204. D, σχηματική του υποτιθέμενου αλληλουχία δέσμευσης miR-204 στο

BDNF

3 ‘UTR. Ε, τα κύτταρα ΗΕΚ-293 συν-επιμολύνθηκαν με έκφραση λουσιφεράσης Renilla κατασκεύασμα ρΡΙ_-ΤΚ και λουσιφεράση πυγολαμπίδας κατασκευάσματα που περιέχουν είτε pMIR-

BDNF

3 ‘UTR εν απουσία και παρουσία του miR-204 μιμούνται ή pMIR-

BDNF

3 ‘UTR μεταλλαγμένα. δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly κάθε δείγματος κανονικοποιήθηκε προς δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla. Η μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (εκτελέστηκαν εις διπλούν για κάθε πείραμα). (**)

P

& lt? 0,01? (***)

P

& lt? 0.001. F, ανάλυση qRT-PCR του miR-204 που υπερεκφράζουν κύτταρα και κύτταρα επιμολυσμένα με αναστολείς miR-204 χρησιμοποιώντας το

BDNF

-ειδικών εκκινητών. G, ανάλυση κηλίδας Western των κυττάρων ΗΕΚ-293 διαμολυνθέντα με miR-204 μιμούνται τη χρήση αντισώματος αντι-BDNF (1:1000). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. φωτογραφίες Gel είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Η, γραφική αναπαράσταση των εντάσεων ζώνης ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης γέλης Σύνολο Labs TL100 1D (

n

= 3? Nonlinear). το επίπεδο της πρωτεΐνης BDNF για τον έλεγχο ορίστηκε σε 100.

Η

Για την επικύρωση των μικροσυστοιχιών μας και στοχεύουν αποτελέσματα πρόβλεψης, πρέπει πρώτα να εξεταστεί κατά πόσον miR-204 στόχους

BDNF

/

Ezrin

με σύνδεση προς την προβλεπόμενη θέση σε 3 ‘UTR του (εικόνα 4D και Σχήμα S4D). Πράγματι, η δραστηριότητα της λουσιφεράσης ενός μορφώματος pMIR-ρεπόρτερ που περιέχει το

BDNF

ή

Ezrin

3 ‘UTR σημαντικά καταπιεσμένη, η οποία μειώθηκε περαιτέρω σε κύτταρα που υπερεκφράζουν το miR-204 σε σύγκριση με την κατασκευή χωρίς η 3 ‘UTR (Σχήμα 4Ε και Σχήμα S4D). Αντίθετα, η μετάλλαξη της αλληλουχίας σπόρων σε

BDNF

3 ‘UTR που περιέχει κατασκεύασμα όχι μόνο αποκατασταθεί δραστικότητα λουσιφεράσης κοντά εκείνη του κατασκευάσματος άγριου τύπου αλλά επίσης καθίστανται μεταγραφές από αυτά τα κατασκευάσματα ευαίσθητα στην miR-204 υπερέκφραση ( Σχήμα 4Ε), επιβεβαιώνοντας μια συγκεκριμένη αλληλεπίδραση μεταξύ miR-204 και την προβλεπόμενη θέση δέσμευσης στην 3 ‘UTRs αυτών των γονιδίων. Να τεκμηριώσει αυτά τα αποτελέσματα, καθορίζονται τα επίπεδα του BDNF /Ezrin σε κύτταρα που υπερεκφράζουν το miR-204. MiR-204 υπερέκφραση οδήγησε σε σημαντική μείωση του BDNF /Ezrin τόσο στα επίπεδα του RNA και της πρωτεΐνης (Σχήμα 4F-4Η και το Σχήμα S4E και S4F). Στη συνέχεια, θα εξεταστεί κατά πόσον ή όχι BDNF και Ezrin είναι λειτουργικά σημαντικοί στόχοι του miR-204. Για την αντιμετώπιση που πραγματοποιήσαμε πειράματα διάσωσης. Επαναφορά του

BDNF

ή

Ezrin

διασωθεί miR-204 που επάγεται φαινοτύπους περιλαμβανομένων ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολής (Σχήμα S5 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-204-μεσολάβηση ρύθμιση του

BDNF

και

Ezrin

είναι ένα σημαντικό γεγονός στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή.

Απώλεια του miR-204 ενεργοποιεί AKT /mTOR σηματοδοσίας και Rac1 Μετεγκατάσταση σε καρκινικά κύτταρα

για να προσδιοριστεί ο μηχανισμός με τον οποίο το miR-204 μπορεί να παρουσιάζει την ανάπτυξη του όγκου του και κατασταλτική δράση μετάσταση, εξετάσαμε την επίδραση της miR-204 στην σηματοδότηση AKT /mTOR, όπως τόσο BDNF και Ezrin έχουν δειχθεί ότι ενεργοποιούν ΑΚΤ οδός [27], και επιλεκτική ενεργοποίηση ΑΚΤ με mTOR έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή [28]. Είναι ενδιαφέρον ότι, miR-204 υπερέκφραση οδήγησε σε μειωμένη δράση της ΑΚΤ και mTOR κατάντη στόχοι 4Ε-ΒΡ1 και S6 (Σχήμα 5Α). 4E-BP1 είναι ένας αναστολέας μετάφρασης που διίσταται από eIF4E κατόπιν φωσφορυλίωση για να επιτρέψει μετάφραση πρωτεΐνης και S6 είναι μια ριβοσωμική πρωτεΐνη της οποίας η φωσφορυλίωση διευκολύνει την συναρμολόγηση του ριβοσώματος και την επακόλουθη μετάφραση του mRNA. Για να επιβεβαιώσετε μας in vitro ευρήματα, αναλύσαμε την έκφραση της φωσφο-ΑΚΤ (ρΑΚΤ) και φωσφο-S6 (PS6) σε ξενομόσχευμα όγκου που υπερεκφράζουν το miR-204. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S6, τα επίπεδα της ρΑΚΤ και PS6 μειώθηκαν σημαντικά, ενώ η συνολική ΑΚΤ και ολικά επίπεδα S6 παραμένουν αμετάβλητα σε όγκους που υπερεκφράζουν miR-204 σε σύγκριση με τον έλεγχο των όγκων επιμόλυνσης, όπως αποκαλύπτεται από ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Για να τεκμηριώσει περαιτέρω την ιδέα ότι η AKT /mTOR μονοπάτι είναι πράγματι ένας σημαντικός στόχος του miR-204, που συν-επιμολυσμένα miR-204 με την ιδιοσυστατικά ενεργό μεταλλαγμένο AKT T308D /S473D και έδειξε ότι ουσιαστικά δραστική ΑΚΤ έσωσαν τις αρνητικές επιπτώσεις της ΜΙΚ 204 στην κατάντη PS6 και τα επίπεδα φωσφο-4E-BP1 (p4E-BP1) (Σχήμα 5, συγκρίνετε 5Α και 5Β). Ωστόσο, δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσει την διάσωση των αρνητικών αποτελεσμάτων που προκαλούνται από miR-204 επί ρΑΚΤ επίπεδα σε κύτταρα συν-επιμολυσμένα με ιδιοσυστατικά ενεργή ΑΚΤ (Σχήμα 5Β). Αυτό οφείλεται στη μετάλλαξη του Ser

473 σε Asp

473 σε ουσιαστικά δραστική ΑΚΤ, και ως εκ τούτου η αντι-φωσφο-Ser

473-ΑΚΤ αντίσωμα που χρησιμοποιείται για την ανάλυση της δυτικής κηλίδος ανιχνευθούν μόνο ενδογενή ρΑΚΤ, η οποία μειώνεται σε επίπεδο με την παρουσία του miR-204 (Σχήμα 5Α και 5Β).

Α, miR-204 καταστέλλει την ενεργοποίηση του ΑΚΤ και σηματοδότηση mTOR. Κύτταρα ΗΕΚ-293 διαμολυνθέντα με miR-204 αναπτύχθηκαν σε συνθήκες χωρίς ορό και υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-Ser

473-ΑΚΤ (1:1000), αντι-ολική-ΑΚΤ (1:1000) , αντι-φωσφο-Ser

235/236-S6 (1:1000), αντι-ολική-S6 (1:1000), αντι-φωσφο-Thr

37 /46-4E-BP1 (1:1000 ) και αντι-ολική-4E-BP1 (1:1000). β-ακτίνης (1:10,000) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. φωτογραφίες Gel είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. κύτταρα Β, ΗΕΚ-293 διαμολυνθέντα με ιδιοσυστατικά ενεργή ΑΚΤ T308D /S473D μεταλλαγμένο (CA-ΑΚΤ) απουσία και παρουσία του miR-204 αναπτύχθηκαν σε κατάσταση ελεύθερης ορού και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western που περιγράφεται στον Α C, η υπερέκφραση του miR-204 καταργεί ruffling μεμβράνη BDNF που προκαλείται και Rac1 μετατόπιση. Κύτταρα ΗΕΚ-293 διαμολυνθέντα με miR-204 ή miR-185 αναπτύχθηκαν σε συνθήκες χωρίς ορό και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς BDNF (100 ng /mL) για 10 λεπτά και χρωματίστηκαν με αντίσωμα Rac1 (κόκκινο) και ΡΙΤΟ-φαλλοϊδίνη (πράσινο) . Τα βέλη δείχνουν τις περιοχές της μεμβράνης-ruffling. D, miR-204 αυξάνει την ευαισθησία των κυττάρων ΗΕΚ-293 στην απόπτωση όπως προσδιορίζεται με χρώση αννεξίνης V /ΡΙ χρησιμοποιώντας το FITC-αννεξίνης V απόπτωση Detection Kit. Ο πληθυσμός ποσοστό των κυττάρων που δείχνεται είναι ο μέσος όρος ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Ε, ανάλυση κηλίδας Western των κυττάρων ΗΕΚ-293 διαμολυνθέντα με miR-204 χρησιμοποιώντας (1:500) αντίσωμα-3 αντι-κασπάση και αντι-PARP (1:1000) δείχνουν αυξημένη διάσπαση της κασπάσης-3 και PARP. β-ακτίνης (1:10,000) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. φωτογραφία Gel είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

ΑΚΤ ελέγχει κύτταρο διεισδυτικότητα ρυθμίζοντας πολλαπλές διεργασίες που εμπλέκονται στην οργάνωση της ακτίνης, κύτταρο προς κύτταρο προσκόλληση, και την κινητικότητα του κυττάρου [28], [29] , [30]. Για να εξεταστεί κατά πόσον miR-204 μπορεί να παίζει άμεσο ρόλο σε αυτή τη διαδικασία, εκτιμήσαμε την επίδραση της miR-204 υπερέκφραση για την ενεργοποίηση της μικρής πρωτεΐνης ΟΤΡάσης Rac1, η οποία αλληλεπιδρά λειτουργικά με ΑΚΤ /mTOR και φέρεται να παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο στη κυτταρική μετανάστευση και αναδιοργάνωση ακτίνης μετά από επαγωγή με BDNF [31] ή του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) [28]. Η διέγερση των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα (και SKOV3 ή κύτταρα ΗΕΚ-293) με BDNF ή EGF προκάλεσε μεμβράνη ruffling και προκάλεσε Rac1 να μετατοπίζεται προς το ruffling περιοχή (Σχήμα 5C, Εικόνα S7, και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αντίθεση, η ruffling μεμβράνη και Rac1 μετατόπιση δεν παρατηρήθηκαν σε κύτταρα που υπερεκφράζουν miR-204 όταν επάγεται με BDNF ή EGF (Σχήμα 5C, Εικόνα S7, και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Evasion της απόπτωσης, η οποία είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη του όγκου και την εξέλιξη [32] θα μπορούσε να είναι ένας άλλος μηχανισμός κεντρικής σημασίας για την ογκογένεση σε καρκίνους που παρουσιάζουν απώλεια του miR-204. Επιπλέον, η αυξημένη δραστηριότητα ΑΚΤ /mTOR έχει επίσης συσχετιστεί με μειωμένη απόπτωση σε καρκίνους [33]. Πράγματι, miR-204 υπερέκφραση προκάλεσε σημαντική αύξηση στα επίπεδα τόσο του ενεργοποιημένου κασπάσης-3 και πολυ ΑϋΡ ριβόζης πολυμεράσης (PARP), οι δείκτες των μη αναστρέψιμη βλάβη στην ακεραιότητα του κυττάρου και γονιδιώματος, με αποτέλεσμα την αύξηση της αποπτωτικής δραστηριότητας (Εικόνα 5D και 5Ε). Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η απώλεια του miR-204 προάγει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή, με την ενεργοποίηση γονιδίων στόχων της που είναι γνωστοί ρυθμιστές των ογκογόνων καταρράκτη σηματοδότησης.

Συζήτηση

Πολλοί miRNAs που σχετίζεται με τα καρκίνους που είναι γνωστό ότι εντοπίζεται σε γενωμική εύθραυστο χώρων [34]. Ωστόσο, εκπληκτικά λίγα είναι γνωστά για την λειτουργική σημασία των περιοχών με χρωμοσωμικές εκτροπές που περιέχουν miRNAs. Είναι πιθανό ότι η αρχική γενετική οθόνες (με χαμηλότερη συγκριτική γενωμική ανάλυση υβριδισμού) με στόχο την ανακάλυψη χρωμοσωμικών ανωμαλιών αγνοηθεί αλλαγές στις περιοχές του γονιδιώματος που περιέχουν miRNAs. Επειδή miRNAs επηρεάσει αρκετά γονίδια σε ένα ή περισσότερα μονοπάτια που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση και συμβάλλουν στο σχηματισμό όγκων, όταν απελευθερωθεί, μια πιο προσεκτική εξέταση των μικρότερων περιοχές του γονιδιώματος που κωδικοποιούν miRNAs θα δώσει πιθανότατα σημαντικές γνώσεις σχετικά με το μηχανισμό της ογκογένεσης. Δεδομένου ότι οι περισσότερες miRNAs προτείνεται να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνους, πιστεύουμε ότι microdeletion των γενετικών περιοχών που περιέχουν συγκεκριμένες miRNAs είναι πιο συχνή εκδήλωση που παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των ανθρώπινων καρκίνων και αξίζει μεγαλύτερη προσοχή.

στη μελέτη αυτή παρέχει αποδείξεις ότι miR-204, το οποίο δρα ως ισχυρός ανάπτυξη και μετάσταση όγκου καταστολέα, είναι σωματικώς χάνεται σε ανθρώπινους καρκίνους. Έχουμε αποδείξει ότι miR-204 ρυθμίζει την έκφραση και τη λειτουργία του προ-αγγειογενετική πρωτεΐνη BDNF και TrkB υποδοχέα της σε όγκους. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η απώλεια του miR-204 προωθεί BDNF (ή EGF) επαγόμενη από καρκίνο μετανάστευση κυττάρων και εισβολή από την ενεργοποίηση AKT /mTOR μονοπάτι που οδηγεί στην Rac1 μετατόπιση και την αναδιοργάνωση της ακτίνης. Από ΑΚΤ και Rac1 απαιτούν ο ένας τον άλλο για την ενεργοποίηση τους [28], [35], τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η απώλεια του miR-204 έκφρασης σε ανθρώπινους όγκους μπορεί να προκαλέσει τη θετική βρόχος ανάδρασης μεταξύ BDNF /ΑΚΤ1 /mTOR και Rac1 κατά τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή. Υποστηρίζοντας αυτό, τόσο mTOR σύμπλοκα mTORC1 και mTORC2 έχουν αναφερθεί για τη ρύθμιση της κινητικότητας και της μετάστασης του καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω της οδού σηματοδότησης Rac1 [36], και Rac1 έχει δειχθεί να ρυθμίζει ταυτόχρονα mTORC1 και mTORC2 [37]. Επιπλέον, BDNF, το οποίο ενεργοποιεί GTP-δεσμευμένη επίπεδα Rac1 [38], έχει δειχθεί να παρεμποδίζεται από αναστολέα mTOR ραπαμυκίνη [39]. Αυτές οι μελέτες, μαζί με τα αποτελέσματά μας που δείχνουν μείωση των επιπέδων του ρΑΚΤ /pS6K σε κυτταρικές σειρές και σε όγκους που υπερεκφράζουν miR-204, υποδεικνύουν έντονα ότι ο BDNF /ΑΚΤ /mTOR /Rac1 καταρράκτη σηματοδότησης είναι ένας από τους κύριους στόχους του miR-204. Μελλοντικές μελέτες με στόχο την αντιμετώπιση της επίδρασης του miR-204 στο mTORC1 και mTORC2 συστατικά όπως Raptor /SIN1 θα δώσει πιθανότατα πρόσθετες πληροφορίες. Παρόμοια με BDNF, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η miR-204 αναστέλλει την ΕΟΡ-επαγόμενη ενεργοποίηση της Rac1. Αυτό είναι σημαντικό ως αλληλοπαρεμβολές μεταξύ EGFR και TrkB υποδοχέων BDNF έχει αποδειχθεί ότι επάγει μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων [40] και την απόκριση σε EGF είναι ένα βασικό βήμα κατά τη διάρκεια της εισβολής των καρκινικών κυττάρων και συνδέεται άμεσα με τη μετάσταση [41]. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι το miR-204 μπορεί να έχει ένα ευρύτερο ρόλο στην αλλαγή της ανάπτυξης μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων παράγοντα που προκαλείται και εισβολή σε γενικές γραμμές. Εκτός από την μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή, η ενεργοποίηση του BDNF σηματοδότησης /TrkB μπορεί επίσης να συμβάλει στη διαφυγή απόπτωσης σε miR-204 εξαντλημένα κύτταρα ως BDNF /TrkB υπερέκφραση έχει συνδεθεί με τη σταθεροποίηση και την ενεργοποίηση του ΑΚΤ με αποτέλεσμα την μειωμένη απόπτωση [42]. Σύμφωνα με αυτό, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το miR-204 υπερέκφραση οδηγεί σε μειωμένη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση του mTOR κατάντη στόχους 4E-BP1 και S6 κινάση.

Επειδή miR-204 βρίσκεται μέσα στο

δυναμικό κανάλι κατιόντων παροδική υποδοχέα μέλος 3

(

TRPM3

) γονίδιο, το οποίο είναι ένα μέλος της παροδικής υποδοχέα δυναμικού κανάλια οικογένεια πρωτεϊνών που είναι γνωστές ότι είναι σημαντικές για την κυτταρική σηματοδότηση και την ομοιόσταση του ασβεστίου, θα είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι οι φαινότυποι που σχετίζονται με η γονιδιωματική απώλεια των χρωμοσωμικών γενετικών τόπων που περιέχουν miR-204 μπορεί επίσης να εισφέρει το γονίδιο υποδοχής

TRPM3

. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν καταστολή της ανάπτυξης του όγκου και των μεταστάσεων μετά την εισαγωγή του και μόνο miR-204, και καμία μεταβολή στα επίπεδα του

TRPM3

γονιδίου σε miR-204 μιμούνται ή αναστολέα υπερεκφράζει καρκινικών κυττάρων (Σχήμα S8), υποδεικνύουν σαφώς ότι miR-204 συνδέεται ογκοκατασταλτικό φαινότυπος δεν διαμεσολαβείται μέσω

TRPM3

. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι miR-204 και το γονίδιο υποδοχής του

TRPM3

δρουν συνεργικά για τη ρύθμιση καταστολή της ανάπτυξης του όγκου, καθώς και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή. Από μια σαφή ρόλο για

TRPM3

στην ογκογένεση δεν έχει αναφερθεί, μια λεπτομερής μελέτη εξετάζει

TRPM3

‘s δυναμικό ογκοκατασταλτικό ρόλο και τη συνεργιστική δράση της με miR-204 (αν υπάρχουν) θα είναι με την επιφύλαξη των μελλοντικών ερευνών.

στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η γενετικών τόπων που περιέχουν συγκεκριμένο miRNA μπορεί να διαδραματίσει έναν αιτιώδη ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση από τη ρύθμιση κλειδί ογκογόνο οδό. Η ικανότητα του miR-204 για να στοχεύσετε

BDNF

/

TrkB

και

Ezrin

, που έχουν σημαντικούς ρόλους στις κανονικές κυτταρικές διαδικασίες και υπερεκφράζεται σε επιθετικές μορφές καρκίνου, δείχνει ότι το miR -204 μπορεί να ελέγχει βασικών ρυθμιστικών μηχανισμών, απορύθμιση των οποίων μπορεί να προδιαθέτουν φυσιολογικά γεγονότα αναπτυξιακές /διαφοροποίηση να υποβληθούν σε μετασχηματισμό. Ως εκ τούτου, οι στρατηγικές που στοχεύουν στη χρησιμοποίηση miR-204 ως θεραπευτικές αγωγές θα έχει το πλεονέκτημα της αναστροφής ανάρμοστα ενεργοποιημένων βήματα σε καρκινικά κύτταρα σε μια πιο φυσιολογική κατάσταση. Η ταυτοποίηση των miR-204 ως ένας ισχυρός καταστολέας των όγκων σε συνδυασμό με την επίδειξη των θεραπευτικών δυνατοτήτων της και αμελητέα ηπατοτοξικότητα δημιουργήσει μια ισχυρή λογική για την ανάπτυξη miR-204 ως μια βιώσιμη θεραπευτική αγωγή για τη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα φυσιολογικών και καρκινικών ιστών και κυτταρικών σειρών

Οι κυτταρικές σειρές που αντιπροσωπεύουν παιδιατρικούς νεφρικών όγκων (ΗΕΚ-293? εμβρυϊκή νεφρική κυτταρική γραμμή), των ωοθηκών (SKOV3), και του μαστού (MDA-MB-231) καρκίνους που χρησιμοποιούνται για πειράματα ελήφθησαν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που παρέχονται. Εβδομήντα έξι παιδιατρικές νεφρικών όγκων και φυσιολογικό ταιριάζουν νεφρού αποκτήθηκαν από την Παιδική Oncology Group (Αρκαδία, CA). Έντεκα προχωρημένους όγκους ωοθηκών στάδιο και πέντε φυσιολογικούς ιστούς ωοθηκών ελήφθησαν από UT MD Anderson Cancer Center (Houston, ΤΧ). Δεκαπέντε ιστούς καρκίνου του μαστού και της κανονικής συμφωνημένα ιστοί ελήφθησαν από UT Science Κέντρο Υγείας (San Antonio, ΤΧ).

RNA και πρωτεΐνης αναλύσεις

Ολικό RNA εξήχθη από όγκους και κανονικούς ιστούς, καθώς επίσης ως όλες τις κυτταρικές σειρές, και υποβλήθηκε σε ανάλυση qRT-PCR, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43]. Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43]. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.