Αφηρημένο

KRAS

κατάστασης μεταλλάξεων θεωρείται αρνητική προγνωστική δείκτη της ανταπόκρισης σε θεραπείες αντι-EGFR σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC) ασθενείς. Ωστόσο, υπάρχουν αντικρουόμενες δεδομένα σχετικά με τη μεταβλητή απόκριση στη θεραπεία που στοχεύει EGFR. Τα αποτελέσματα των ογκογόνων

KRAS

σε κατάντη στόχους μελετήθηκαν σε κυτταρικές σειρές με διαφορετικές

KRAS

μεταλλάξεις. Κύτταρα που φέρουν ένα ενιαίο

KRAS

G13D

αλληλόμορφο έδειξε την πιο ογκογόνο προφίλ, με συστατική ενεργοποίηση του κατάντη της οδού, καθιστώντας τα EGF-αδιάφορη. Αντίθετα,

KRAS

A146T

κύτταρα παρουσίασαν πλήρη EGF-αντίδραση από πλευράς των οδών μεταγωγής σήματος, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση ή την πρόσφυση. Επιπλέον, η παγκόσμια acetylome των κυττάρων CRC ήταν, επίσης, εξαρτάται από την

KRAS

κατάστασης μεταλλάξεων. Αρκετά μέλη της οικογένειας hnRNP εντοπίστηκαν εντός των 36 ακετυλιωμένο-πρωτεϊνών. κατάσταση ακετυλίωση είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση της EGF-απόκρισης. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ, hnRNPA1 και L ακετυλίωση προκλήθηκε ως απάντηση στην ΕΤΠ

KRAS

A146T

κύτταρα, ενώ ακετυλο-hnRNPA1 και τα επίπεδα L παρέμεινε αμετάβλητη μετά τη θεραπεία αυξητικού παράγοντα στο

KRAS

G13D

αδιάφορη κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι hnRNPs προκαλείται από-ακετυλίωση εξαρτάται κατάστασης μεταλλάξεων του KRAS. Παρ ‘όλα αυτά hnRNPs ακετυλίωση μπορεί επίσης να είναι το σημείο όπου διαφορετικές ογκογόνο πορείες συγκλίνουν

Παράθεση:. Ρόδα D, Καστίγιο J, Telechea-Fernández M, Gil Α, López-Ρόδας G, Φράνκο L, et al. (2015) EGF-Induced ακετυλίωση Ετερογενών Πυρηνικής ριβονουκλεοπρωτείνες εξαρτάται από

KRAS

κατάστασης μεταλλάξεων στα κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (6): e0130543. doi: 10.1371 /journal.pone.0130543

Επιμέλεια: Matias Α Avila, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα Ιατρική Σχολή και το Κέντρο Εφαρμοσμένης Ιατρικής Έρευνας (CIMA), Ισπανία

Ελήφθη: 1 Απριλίου 2015? Αποδεκτές: 22 του Μαΐου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουνίου 2015

Copyright: © 2015 Roda et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από την ισπανική κυβέρνηση, Ministerio de Economía y Competitividad και επιχορηγήσεις του ΕΤΠΑ (FIS PI09 /02480 και PI12 /02767 με AC? FIS PI12 /02394 για να ERGT και FIS PI12 /02110 για την πράσινη γραμμή) και Generalitat Valenciana (PROMETEO 2013-005 σε εναλλασσόμενο). DR πραγματοποιήθηκε μια υποτροφία από το Ministerio Επιστημών e Innovación (Ρίο Hortega Program) και από Sociedad Española Oncología Médica (SEOM)? MTM είναι ένα προ-διδακτορικό τους συναδέλφους από την Generalitat Valenciana (Prometeo) και AG είναι ο παραλήπτης των μεταδιδακτορικός υπότροφος από Ισπανική Ένωση κατά του Καρκίνου (AECC, Επαρχιακό Διοικητικό Βαλεαρίδες)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια από τις πιο διαδεδομένες όγκους σε όλο τον κόσμο [1] και παρά τις πολλές προόδους στη θεραπεία, μακροπρόθεσμη επιβίωση για ασθενείς με μεταστατική νόσο είναι ακόμα κακή [2]. Αντισώματα έναντι του υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε CRC ασθενείς με προχωρημένη νόσο. Ωστόσο, λιγότεροι από τους μισούς από αυτούς να ανταποκρίνονται στις τέτοια θεραπεία [3].

KRAS

ή

NRAS

μεταλλάξεις είναι τα κύρια αρνητική προγνωστική δείκτες σε EGFR-απάντηση [4]. Επομένως, η θεραπεία με αντισώματα αντι-ΕΟΡΚ είναι μόνο για να ληφθεί υπόψη σε ασθενείς με πλήρη

RAS

άγριου τύπου φαινότυπο [5, 6]. RAS πρωτεϊνών εξασφαλιστεί μεταγωγή σήματος μεταξύ των υποδοχέων μεμβράνης, όπως EGFR, και ενδο-κυτταροπλασματική σερίνης /θρεονίνης κινασών-? συμβάλλοντας έτσι στην ρύθμιση ενός αριθμού των βασικών κυτταρικών λειτουργιών. Μεταλλαγμένα RAS καθιστά την πρωτεΐνη σε μία ιδιοσυστατικά ενεργή μορφή, η οποία με τη σειρά της απορρυθμίζει κατάντη μονοπατιών σηματοδότησης [7]. Ωστόσο, αρκετές κλινικές και πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι δεν είναι όλα

RAS

μεταλλάξεις είναι ίσες στις βιολογικές τους ιδιότητες και ως εκ τούτου, θα μπορούσαν να παρέχουν ποικίλα αποτελέσματα [8, 9]. Οι πιο συχνές μεταλλάξεις KRAS βρεθεί σε ασθενείς CRC είναι στο κωδικόνιο 12 και 13. Ωστόσο, η ενεργοποίηση

KRAS

μεταλλάξεις στα κωδικόνια 61 και 146 έχουν πρόσφατα σχετίζεται με μικρότερη επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε σύγκριση με το αγρίου τύπου

KRAS

σε ασθενείς CRC-θεραπεία [10]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα κάτω από την πίεση αναστολής ογκογόνου οδών τους αναπτύσσουν αυθόρμητες μεταλλάξεις. Πράγματι, μεταστατικό ασθενείς CRC συνεχιζόμενη αντι-καρκινική εμπειρία θεραπείας

KRAS

γονοτυπικές αλλαγές [11]. Παρατηρήσαμε επίσης το αποτέλεσμα αυτό σε καλλιεργημένα κύτταρα? διαγραφή ενός μεταλλαγμένου

KRAS

G13D

αλληλόμορφο σε κύτταρα HCT116 (

KRAS

G13D /WT

) προκάλεσε μια αυθόρμητη

KRAS

A146T

μετάλλαξη στο υπόλοιπο αλληλόμορφο αγρίου τύπου. Να αποκαλύψει τα μοριακούς μηχανισμούς πίσω από τη διαφορική απόκριση που παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα με διαφορετικές μεταλλάξεις σε

KRAS

φαίνεται ένα μείζον θέμα για την ανάπτυξη νέων αντι-καρκινικών θεραπειών και εξατομικευμένη ιατρική.

Πρόσφατα, ένα μυθιστόρημα αποακετυλάσης εξαρτώμενη μηχανισμός έχει προταθεί για να εξηγήσει την αντίσταση σε αντι-EGFR θεραπείες στην μετάλλαξη

KRAS

αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα κυττάρων [12]. Ακετυλίωση είναι μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση αναστρέψιμη ρυθμίζεται από δύο τύπους ενζύμων: λυσίνη αποακετυλάσες (KDACs) και ακετυλτρανσφεράσες λυσίνη (Kats). Πράγματι, δεακετυλάσης αναστολείς έχουν αναδειχθεί ως πιθανοί παράγοντες κατά του όγκου, αυξάνοντας υπερακετυλίωση ιστονών και των δύο και nonhistone πρωτεΐνες [13]. Επιπλέον, ορισμένες εκθέσεις περιγράφουν την αλληλεπίδραση μεταξύ αναστολέων KDAC και το RAS-ΕΚΚ καταρράκτη σε κυτταρικές σειρές σηματοδότησης που παρουσιάζουν διαφορετικά κατάστασης μεταλλάξεων στο

KRAS

,

BRAF ή PI3KCA

[14-17].

Τα κατάντη αποτελέσματα από τα λιγότερο συχνά, αλλά όχι λιγότερο σημαντικό

KRAS

A146T

μετάλλαξη είναι προς το παρόν ασαφές. Σε αυτό το άρθρο θα αξιολογήσει τον αντίκτυπο των

KRAS

A146T

μετάλλαξη

σε σχέση με το γονίδιο KRAS

G13D

επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, την προσκόλληση και μετανάστευση των HCT116 κυτταρικές γραμμές που παράγονται CRC. Με δεδομένη την περιέγραψε πρόσφατα αλληλεπίδραση μεταξύ ακετυλιώσεις και καταρράκτες σηματοδότησης RAS-ΕΚΚ, μελετήσαμε επίσης την επίδραση της κατάστασης μεταλλάξεων του KRAS για τον τύπο πρωτεΐνης ακετυλίωση, προκειμένου να αποκτήσουν γνώση των πιθανών μοριακών μηχανισμών πίσω από τη διαφορική επίδραση των

KRAS μεταλλάξεις

.

Υλικό και Μέθοδοι

2.1. Υλικά |

Τα αντισώματα για να hnRNPA1 (ab5832, ab50492), hnRNPA3 (ab50949), hnRNPA

2 /Β

1 (ab64800), hnRNPL (ab6106, ab65049) και GAPDH (ab8245) ή β- ακτίνη (ab8227) ως μάρτυρες φόρτωσης, ήταν από Abcam. Αντισώματα έναντι ακετυλο-Lys (9441), ρΑΚΤ (40.665) και ΑΚΤ (9272) ήταν από την Cell Signaling Technology. Άλλα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: ΕΚΚ (sc-93) και pERK (sc-7383) από την Santa Cruz Biotechnology? KRAS (05-516) από την Millipore και Talin (T3287) από την Sigma-Aldrich.

επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF 20 ng /ml), τριχοστατίνη (TSA, 0.5 μΜ) και βουτυρικού νατρίου ήταν από την Sigma-Aldrich, UO126 (10μΜ) από την Promega, LY294002 (10μΜ) από την Calbiochem και Ινονεκτίνης από την BD Biosciences.

2.2. Κυτταρικής καλλιέργειας

Καρκίνος του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές HCT116 και τα παράγωγά τους HAE6 και HAF1 ήταν εμπορικά αποκτήθηκαν από την GRCF Biorepository και Κέντρο κυττάρων, στο Πανεπιστήμιο Johns Hopkins. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε McCoy 5Α Τροποποιημένο Μέσο (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και L-γλουταμίνη και διατηρήθηκαν κάτω από πρότυπες συνθήκες.

2.3. εκχύλιση πρωτεΐνης και ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Σύνολο πρωτεΐνες εξήχθησαν σε ρυθμιστικό RIPA συμπληρώνονται με αναστολείς και βουτυρικό νάτριο. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτές SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και ανοσοστυπώθηκαν όπως περιγράφεται αλλού [18]. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν με ενισχυμένη chemoluminiscence (ECL Detection Kit, GE Healthcare). Τα επίπεδα πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία και κανονικοποιήθηκε με έκφραση β-ακτίνης ή GAPDH.

2.4. 2D-ηλεκτροφόρηση και acetylome ανάλυση

εκχυλίσματα πρωτεΐνης (100μg) διαχωρίστηκαν με δισδιάστατη (2D) ηλεκτροφόρησης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Πρωτεομική εικόνες αποκτήθηκαν με Typhoon Trio Imager. Παράλληλα, 2D-πηκτώματα ηλεκτροστυπώθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και αναλύεται με στύπωμα western με αντι-ακετυλιωμένο αντίσωμα λυσίνης. Ακετυλιωμένες πρωτεΐνες επικάλυψη με τις SYPRO Ruby-βάφονται τζελ αποκόπηκαν για ανάλυση MS. δείγματα gel υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα σταθμό MassPrep (Waters). NanoLC-ESI-MS /MS και ανάλυση δεδομένων έγιναν όπως περιγράφεται [19] από την πρωτεϊνωματικής και της βιοπληροφορικής Μονάδας, (CIMA Πανεπιστημίου της Ναβάρα, Ισπανία).

2.5. Ανοσοκαταβύθιση

500μg πρωτεϊνών ανοσοκαταβυθίστηκαν όλη τη νύχτα με ειδικά αντισώματα ή φυσιολογική IgG στον ορό (Dako) στους 4 ° C σε μια περιστρεφόμενη συσκευή. σύμπλοκα πρωτεΐνης-αντισώματος τράβηξε προς τα κάτω με 50% (ν /ν) Dynabeads (Invitrogen, Life Technologies). Μετά από αρκετές πλύσεις σε PBS, ανοσοσυμπλέγματα ανακτήθηκαν με βρασμό σε LB και μετά αναλύθηκαν με κηλίδα Western, όπως περιγράφεται. 1% των εκχυλισμάτων πρωτεΐνης που χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοκατακρήμνιση φορτώθηκε ως είσοδο.

2.6. RNA απομόνωση και ανάλυση έκφρασης με qPCR

εκχύλιση RNA, συμπληρωματικό σύνθεση του DNA και qRT-PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται πολύτιμα. [18]. Αλληλουχίες εκκινητή για

hnRNPA1

,

hnRNPA3

,

hnRNPA2 /Β1

,

hnRNPL

και

GAPDH

φαίνονται στην συμπληρωματικά στοιχεία. Προ-ανέπτυξε εκκινητών Taqman για

KRAS

,

ADAM19

,

ΚΑΘΕΨΙΝΗΣ C

,

καθεψίνης ί

και

18S

ήταν από την Applied Biosystems. Σχετική έκφραση γονίδιο εκφράστηκε ως 2

-Δ (ΔCt) Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με

18S

ποσοτικοποίηση στην ίδια αντίδραση δείγματος. Όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν.

2.7. γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών. Ο υβριδισμός και ανάλυση δεδομένων

Ολικό RNA (5μg) χρησιμοποιήθηκε για να πάρετε βιοτινυλιωμένη cRNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Affymetrix). Ποιότητα του επισημασμένου cRNA επιβεβαιώθηκε με υβριδισμό σε ένα τσιπ Affymetrix δοκιμή (Test3-chip). Επισημασμένα cRNA υβριδίστηκε σε μια Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0ST. δεδομένα μικροσυστοιχιών ελήφθησαν από το λογισμικό AGCC Affymetrix. Ακατέργαστα δεδομένα από τρεις επαναλήψεις για κάθε κυτταρική σειρά αναλύθηκαν με R /Bioconductor χρησιμοποιώντας το πακέτο Limma [20]. F-στατιστικά στοιχεία, t-στατιστικές και συνδεθείτε πιθανότητες της διαφορικής έκφρασης υπολογίστηκαν από την εμπειρική Bayes συγκράτηση των τυπικών σφαλμάτων προς μια κοινή αξία. Διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια ταυτοποιήθηκαν με σύγκριση ανά ζεύγος, (ρ-τιμή αποκοπής = 0.05). Μόνο τα γονίδια με μια πτυχή της αλλαγής πάνω από 1,5 και κάτω από -1, θεωρήθηκαν διαφορικά εκφρασμένων για περαιτέρω αναλύσεις και ταξινομούνται σύμφωνα με τη βιολογική κατηγορία διαδικασία σύμφωνα με τα κριτήρια του Gene Ontology Consortium [21].

2.8. BrdU Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εξετάστηκε με ένα κιτ δοκιμασίας ενσωμάτωσης βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU) (Calbiochem). Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5χ103 κύτταρα /φρεάτιο σε μια πλάκα καλλιέργειας 96 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες ασιτία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGF (20 ng /ml) σε μέσο χωρίς ορό. Το αντιδραστήριο BrdU προσετέθη στα φρεάτια για 4h υπό την παρουσία ή απουσία EGF. Στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια 30min σε σταθεροποιητικό /διάλυμα μετουσίωσης. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-BrdU (1: 100) για 1 ώρα και μετά από αρκετές πλύσεις, επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP IgG για 30 λεπτά. υπόστρωμα βενζιδίνη τετρα-μεθυλ συνέχεια προστέθηκε επί 15 λεπτά και η αντίδραση σταμάτησε με την προσθήκη 1,25Μ διαλύματος θειικού οξέος stop. Η απορρόφηση μετρήθηκε σε κάθε φρεάτιο σε διπλά μήκη κύματος 450-540nm.

2.9. Επούλωση πληγών δοκιμασία

Οι τρεις κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν κάτω από πρότυπες συνθήκες. Συρρέουσες μονοστιβάδες γδαρμένο με 10μl ρύγχος πιπέτας για να προκαλέσει μια πληγή. Οι τραυματίες ακμές απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο μικροσκόπιο Nikon Eclipse Ti (10Χ μεγέθυνση). Εικόνες συλλέχθηκαν στις 0, 24 και 48 ώρες μετά την αρχή.

2,10. Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Σημαντικές διαφορές προσδιορίστηκαν με δοκιμασία t του Student ενός δείγματος. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε

σ

& lt? 0,05. Αντιπροσωπευτικά κηλίδες εμφανίζονται.

Αποτελέσματα

3

.

1

. Διαφορική επίδραση του

KRAS

A146T

και KRAS

G13D σε EGF-επεξεργασμένα κύτταρα CRC

κυτταρική σειρά HCT116 CRC, υπόθαλψη ενδογενής ενεργοποίηση

KRAS

G13D /κβ μετάλλαξη, και δύο ισογονικούς HAF1 (

KRAS

κβ /-) και HAE6 (

KRAS

G13D /-) κλώνοι χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη. Όλα αυτά τα γονίδια, συνιστάται να προβλέψει μια κλινική έκβαση για την θεραπεία του καρκίνου αλληλουχήθηκαν στις τρεις κυτταρικές γραμμές [22] (S1 πίνακα). Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ όλες οι μεταλλάξεις βρέθηκαν σε HCT116 παρατηρήθηκαν επίσης σε κύτταρα HAE6, βρήκαμε ότι σε κύτταρα HAF1 ένα

KRAS

A146T

μετάλλαξη hotspot είχε αυθόρμητα προκύψει σε αυτό που μέχρι τώρα προορίζονταν να είναι ένα αλληλόμορφο άγριου τύπου. Με δεδομένο το αποτέλεσμα αυτό, θα χαρακτηρίζεται

KRAS

A146T

κύτταρα και τα συνέκριναν με κυτταρικές σειρές HAE6 (S1 σχήμα και S1 αρχείου) HCT116 ή. κύτταρα HAE6 έδειξε το υψηλότερο ποσοστό πολλαπλασιασμού και τα χαμηλότερα επίπεδα της κυτταρικής προσκόλλησης. Μια πληγή ανάλυση της κυτταρικής μετανάστευσης επούλωση αποκάλυψε διαφορές μεταξύ των τριών κυτταρικών σειρών (με HCT116 δείχνει ένα υψηλότερο ποσοστό από ό, τι HAF1 αλλά χαμηλότερο από κύτταρα HAE6. Σε αντίθεση με τα προηγούμενα αποτελέσματα,

KRAS

κατάστασης μεταλλάξεων δεν είχε εμφανή επίδραση για ERK και ΑΚΤ φωσφορυλίωσης, υπό βασικές συνθήκες. Αυτό δεν αποτελεί έκπληξη, δεδομένου ότι οι τρεις κυτταρικές σειρές λιμάνι ένα PIK3CA ενεργοποίηση μετάλλαξη.

KRAS

A146T

φαινόταν να είναι το λιγότερο ογκογόνο μετάλλαξη. Παρ ‘όλα αυτά, μη συγχρονισμένη καλλιέργεια κυττάρων υπό βασικές συνθήκες, θα μπορούσε να καλύψει την επίδραση της μετάλλαξης του KRAS σε απάντηση σε ένα συγκεκριμένο ερέθισμα. ως εκ τούτου, για να διερευνηθεί περαιτέρω η κατάντη επίδραση του

KRAS

A146T

έναντι το καλά χαρακτηρισμένο

KRAS

G13D

μετάλλαξη, HAF1 και HAE6 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ορό στερούνται των μέσων ενημέρωσης και στη συνέχεια διεγείρονται με το ΕΤΠ. Για να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι η μετάλλαξη θα μπορούσε να επηρεάσει

KRAS

έκφραση, qPCR διεξήχθη και

KRAS

επίπεδα mRNA βρέθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές ήταν παρόμοια (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αν και EGF-θεραπεία προκάλεσε την ταχεία φωσφορυλίωση των ERK1 /2 και ΑΚΤ σε HAF1, αυτή η απόκριση ήταν φτωχό σε κύτταρα HAE6 (Σχήμα 1Α). Αξιοσημείωτη, pERK επίπεδα ήταν ήδη υψηλά σε μη κατεργασμένους ελέγχους HAE6. Επιπλέον, όπως έχει ήδη περιγραφεί σε άλλες κυτταρικές σειρές με μια υπερενεργοποιημένη οδό ERK [23], EGF μειωμένα ρΑΚΤ επίπεδα σε αυτή την κυτταρική σειρά HAE6.

A. Κατάντη στόχοι του KRAS μονοπατιού σηματοδότησης αναλύθηκαν με κηλίδα western για να προσδιοριστεί ρΑΚΤ και τα επίπεδα pERK1 /2 μετά EGF-θεραπεία. B. προσκόλληση των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση στυπώματος Western της διάσπασης Talin σε κύτταρα HAF1 και HAE6. αναλογία Γ μετανάστευση μελετήθηκε μετά EGF (/mL 20 ng) η επεξεργασία με επούλωσης πληγών δοκιμασία. Η γραφική παράσταση δείχνει το ποσοστό των κυττάρων που μετανάστευσαν στην περιοχή του τραύματος μετά από 24 ώρες. D. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, μετράται με τη δοκιμασία BrdU, να αναλύσει πολλαπλασιαστική δραστικότητα σε κύτταρα EGF-αγωγή (20 ng /mL). * Ρ & lt? 0,05 EGF-αγωγή έναντι μη επεξεργασμένους μάρτυρες (η = 4)

Η

πειράματα προσκόλλησης κυττάρου δεν μπορούσε να εκτελεστεί εντός μέσου χωρίς ορό επειδή τα κύτταρα HAF1 ήταν ευαίσθητα στην επεξεργασία με θρυψίνη μετά από στέρηση 24h-ορού.. Ένα υψηλότερο Talin-διάσπαση έχει συσχετισθεί με χαμηλότερη προσκόλλησης κυττάρου [24]. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε διασπάστηκε-ταλίνη ως έμμεση μέθοδος για τη μέτρηση της προσκόλλησης των κυττάρων. Σε μη διεγερμένα κύτταρα, ταλίνη-διάσπαση ήταν ήδη υψηλότερο σε HAE6 ό, τι σε HAF1 κύτταρα. Επιπλέον, ενώ ταλίνη-διάσπαση προκλήθηκε σε απόκριση προς EGF σε κύτταρα HAF1, αυτό πρωτεολυτική διάσπαση ήταν EGF-ανεξάρτητος σε κύτταρα HAE6 (Σχήμα 1Β). Εμείς επόμενη αναλύθηκαν κυτταρική μετανάστευση και βρέθηκε ότι τα κύτταρα ήταν επίσης HAE6 ανταποκρίνονται σε EGF, σε αντίθεση με την κυτταρική μετανάστευση που προκαλείται από EGF στην κυτταρική σειρά HAF1 (Σχήμα 1 C). Τέλος, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αν και επάγεται από EGF σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, αυξήθηκε σε μικρότερο βαθμό σε σχέση με το HAE6 HAF1 κύτταρα (Σχ 1D). Εμείς αιτιολογημένη ότι η υπερενεργοποίηση των ERK1 /2 που προκαλείται από KRAS

G13D θα μπορούσε να φθάσει σε ένα οροπέδιο, πέραν του οποίου τα κύτταρα δεν μπορούν να διεγερθούν περαιτέρω από το ΕΤΠ.

3.2. επίπεδα διαφορικό mRNA σε KRAS

G13D vs KRAS

A146T κυτταρικές σειρές CRC

Εμείς εξέτασε τις πιθανές KRAS-εξαρτώμενη μεταγραφική επιπτώσεις και στις δύο κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας Affymetrix μικροσυστοιχίες DNA (S2 και S3 Files). Υπό την παρουσία του

KRAS

G13D

μετάλλαξη, τα περισσότερα διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων κάτω-ρυθμιζόμενη (Σχήμα 2Α και 2Β? S2 σχήμα) σε σύγκριση με το

KRAS

A146T

μετάλλαξη (HAF1). Ωστόσο, η έκφραση της πλειοψηφίας των γονιδίων δεν αλλάζει ουσιαστικά, και μόνο λίγα από αυτά ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω. Για την επικύρωση των στοιχείων αυτών, η έκφραση μιας επιλογής μέχρι ρυθμιζόμενα γονίδια αναλύθηκε με qPCR. Αυτά τα γονίδια επιλέχθηκαν για εξέχοντα ρόλο τους στην μετάσταση όγκου, παράγοντα ανάπτυξης ή απόπτωση CRC φάρμακο αντίσταση [25, 26]. Η έκφραση αυτών των γονιδίων ήταν δραματικά up-ρυθμίζονται σε κύτταρα με ένα μεταλλαγμένο

KRAS

G13D

αλληλόμορφο, επιβεβαιώνοντας έτσι τα δεδομένα μικροσυστοιχιών (Σχήμα 2C και S2 σχήμα). Μεταξύ των γονιδίων κάτω-ρυθμίζονται σε HAE6 εναντίον κυττάρων HAF1, το πιο αντιπροσωπευτικό μονοπάτι που επλήγησαν ήταν EGFR1 σηματοδότησης? 43 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω έξω από το 156 που περιγράφεται για την κανονική οδό EGFR1. Ωστόσο, άλλες οδοί ενεργοποιούνται από κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες, όπως VEGF, PDGF, HGF, IGF1, ΤΟΡβ, ΤΝΡα και αρκετές ιντερλευκίνες, επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω. Αυτό δεν αποτελεί έκπληξη δεδομένου ότι οι περισσότεροι από αυτούς μοιράζονται πολλά βήματα εντός της οδού σηματοδότησης Ras.

Ολικό RNA από κύτταρα CRC καλλιεργήθηκαν σε βασικές συνθήκες με 10% FBS αναλύθηκε με μικροσυστοιχίας. Α Βεν-διάγραμμα που δείχνει το ποσοστό της πάνω και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια που βρέθηκαν στην κυτταρική σειρά φιλοξενεί ένα

KRAS

G13D

μετάλλαξη (HAE6), σε σύγκριση με τα επίπεδα του mRNA βρέθηκαν σε HAF1 κύτταρα (

KRAS

A146T

)

. Β Μπαρ γράφημα που αντιπροσωπεύει διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (p-value ≤ 0,001) μεταξύ των δύο κυτταρικές σειρές HAE6

έναντι

HAF1 κύτταρα, λαμβάνοντας υπόψη μόνο-log2 αλλαγή φορές & gt? 1.5 και & lt? -1.5. σύμβολο Gene για κάθε γονίδιο υποδεικνύεται στα αριστερά. Γ Τρία γονίδια,

καθεψίνης ί

,

ΚΑΘΕΨΙΝΗΣ C

και

ADAM19

επιλέχθηκαν με βάση το δυναμικό τους ρόλο στην κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση, για την επικύρωση των μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας qPCR. * P & lt? 0,05 έναντι κυττάρων HAF1.

Η

3.3. Επίδραση των μεταλλάξεων KRAS στην παγκόσμια acetylome της CRC

Ένα από τα πιθανά μονοπάτια που επηρεάζονται από κατάστασης μεταλλάξεων του KRAS που μπορούν να ρυθμίζουν διάφορες βιολογικές διεργασίες είναι η πρωτεΐνη ακετυλίωση. Επιδιώξαμε να μελετήσει κατά πόσον η παγκόσμια προφίλ ακετυλίωση στο CRC επηρεάστηκε διαφορετικά από ενεργοποιημένα KRAS

G13D και ενεργοποιείται KRAS

A146T. Απομονωμένες πρωτεΐνες και από τις δύο κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε 10% FBS, ανοσοκαταβυθίστηκαν και αναλύθηκαν με στύπωμα western με αντι-ακετυλο-Lys αντισώματα (Σχήμα 3Α). Ένα 2D στύπωμα western πρωτεομική προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση βαθιά ακετυλιωμένης πρωτεΐνες από τις δύο κυτταρικές σειρές. Παγκόσμια πρωτεΐνη Lys-ακετυλίωση ήταν αυξημένη σε σύγκριση με HAE6 HAF1 κύτταρα, σύμφωνα με την αύξηση του αριθμού των διαπιστωμένων σημεία (Σχήμα 3Β).

Α. ομογενοποιήματα κυττάρων ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ακετυλο-λυσίνη αντίσωμα και τα ιζήματα στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν έναντι ακετυλο-λυσίνης, συμπεριλαμβανομένης μιας ίση ποσότητα αρχικού ομογενοποιήματος (που ονομάζεται Input). IgG: ομογενοποιήματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με φυσιολογική IgG στον ορό. Μοριακή μάζα δείκτες (kDa) βρίσκονται στην αριστερή του πήγματος. B. προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης και των δύο κυτταρικών σειρών που διαχωρίζονται από IEF δισδιάστατη PAGE, χρωματισμένο με SYPRO Ruby (αριστερός πίνακας) ή ανοσοστυπώθηκαν έναντι ακετυλο-λυσίνη αντισώματος για να ταυτοποιηθούν ακετυλιωμένη πρωτεΐνες (δεξί πάνελ). Οι αυξήσεις ρΗ από αριστερά προς τα δεξιά στην τετμημένη και η μοριακή μάζα μειώνεται από πάνω προς τα κάτω στην τεταγμένη. Γ Διανομή GO Βιολογικών καθήκοντα που ανατίθενται στους ακετυλιωμένες πρωτεΐνες που εντοπίζονται στην acetylome των κυττάρων HAE6.

Η

Θετικά σημεία από την acetylome HAE6 αποκόπηκαν και προσδιορίζονται με φασματομετρία μάζας. 67 κηλίδες ανιχνεύθηκαν αλλά μόνο επιλέχθηκαν εκείνες με αυτοπεποίθηση βαθμολογία ιόντων μασκότ και υψηλό πεπτίδιο που ταιριάζουν (S2 Πίνακας). Η (GO) βιολογική ανάλυση λειτουργίας 36 ακετυλιωμένου πρωτεϊνών μας αποκάλυψαν ότι οι πρωτεΐνες-στόχοι εμπλουτισμένο σε τέσσερις κύριες κατηγορίες που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη, το μεταβολισμό της ενέργειας, μεταβολική διαδικασία RNA και το μεταβολισμό των πρωτεϊνών (Σχήμα 3C). Πολλές από αυτές τις πρωτεΐνες που έχουν ήδη περιγραφεί για να είναι οι στόχοι των θεωρούμενων ακετυλτρανσφεράσες ή αποακετυλάσες και να καταστούν ακετυλιωμένη κάτω από διαφορετικές πειραματικές συνθήκες (ανασκόπηση στο S2 Πίνακα). Αποτελέσματα μικροσυστοιχίας μας επιβεβαίωσαν ότι οι διαφορές στο πρότυπο ακετυλίωση δεν οφείλονταν σε αυξημένη έκφραση mRNA. Πράγματι, αυτά τα γονίδια των οποίων τα προϊόντα εντοπίστηκαν στην ανάλυση acetylome μας παρέμεινε αμετάβλητη σε HAE6 σε σύγκριση με HAF1 κύτταρα (S2 και S3 Files).

3.4. Η ακετυλίωση των μελών της οικογένειας hnRNP

Μεταξύ των στόχων ακετυλιωμένης υπήρξε μια ενδιαφέρουσα ομάδα RNA πρωτεΐνες σύνδεσης, όλοι τους μέλη της οικογένειας ετερογενών πυρηνικών ριβονουκλεοπρωτεΐνες (hnRNPs), που εμπλέκονται σε μια ποικιλία μοριακών λειτουργιών πηγαίνει από επεξεργασία του mRNA, τη μεταφορά, τη σταθερότητα ή ακόμα και μετάφραση [27]. Αναλύσαμε στις δύο κυτταρικές σειρές αν η βασική ακετυλίωση της hnRNPs εξαρτιόταν από

KRAS

κατάστασης μεταλλάξεων. Η ακετυλίωση μετρήθηκε με πειράματα ανοσοκαθίζησης με ακετύλιο (Lys) αντισωμάτων που ακολουθείται από κηλίδα western με αντισώματα που αναγνωρίζουν το συγκεκριμένο μέλος hnRNP. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α, hnRNPA1 και Α2 /Β1 βρέθηκαν να υπερακετυλιωμένων υπό συνθήκες καλλιέργειας (10% FBS) σε HAE6 σε σύγκριση με HAF1? Ωστόσο, αυτό το μοτίβο δεν ήταν τόσο σαφής σε άλλα μέλη της οικογένειας δοκιμάζονται όπως hnRNPA3 ή L. Το mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης του hnRNPs αναλύθηκαν με qPCR και κηλίδα western αντίστοιχα (Εικόνα 4Β και 4C)? η έκφραση κανένα από τα hnRNPs έδειξε μια σημαντική αλλαγή σε σύγκριση μεταξύ των διαφόρων κυτταρικών γραμμών. Ως εκ τούτου, τα διαφορετικά επίπεδα ακετυλίωσης που παρατηρείται δεν είναι αποτέλεσμα του υψηλότερου ρυθμού γονιδιακής έκφρασης ή σταθεροποίηση της πρωτεΐνης.

Α. Συνολικά εκχυλίσματα από τα δύο κυτταρικές σειρές CRC υπό βασικές συνθήκες (10% FBS) απομονώθηκαν και ανοσοκαταβυθίστηκαν με α-ακετυλ-λυσίνη αντισώματα. Το ανοσοκαταβυθισμένο δείγμα στη συνέχεια αναλύθηκε με στύπωμα Western με αντισώματα που αναγνωρίζουν το συγκεκριμένο μέλος hnRNP (αριστερό πάνελ). Οι είσοδοι του κάθε ειδικού hnRNP στις διάφορες κυτταρικές γραμμές εμφανίζονται (δεξί πάνελ). επίπεδα Β mRNA του hnRNPs αναλύθηκαν με qPCR (n = 3). Δεν στατιστική σημαντικότητα βρέθηκε. Η ανάλυση στυπώματος Western που δείχνει C. επίπεδα πρωτεΐνης των διαφόρων hnRNPs σε κύτταρα HAF1 και HAE6. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

3.5. Ακετυλίωση hnRNPA1 και L σε απάντηση προς EGF

Παρά το γεγονός ότι η ακετυλίωση της hnRNPs έχει ήδη περιγραφεί σε άλλα συστήματα κυττάρων, προς το παρόν δεν είναι γνωστό αν αυτή η ακετυλίωση αποτελεί μέρος της απάντησης EGF στα κύτταρα CRC. Θα πρέπει να είναι η περίπτωση, θα είναι σημαντικό να διαπιστωθεί αν η

KRAS

κατάστασης μεταλλάξεων θα μπορούσε να ρυθμίσει ένα διαφορικά προκαλείται από-ακετυλίωση του hnRNPs κατά ερεθίσματα ΕΤΠ. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με EGF για ένα σύντομο (20 λεπτά.) Και ένα μακρύ (2h) χρονική περίοδο (Σχήμα 5Α). Δείγματα από κάθε συνθήκη ανοσοκαταβυθίστηκαν είτε με αντι-hnRNPA1 ή αντι-hnRNPL αντισώματα. Επιλέχθηκαν αυτές οι hnRNPs δεδομένου ότι αντιπροσωπεύουν αυτές τις ισομορφή παρουσιάζει το υψηλότερο και το χαμηλότερο διαφορές ακετυλίωση κατά τη σύγκριση των κυττάρων HAF1 και HAE6. Για να καθοριστεί η αναλογία ακετυλίωση (ακετυλο-hnRNP /σύνολο hnRNP), pull-down πρωτεΐνες αναλύθηκαν περαιτέρω με κηλίδα western με ειδικά αντισώματα έναντι ακετυλο-Lys ή το αντίστοιχο hnRNP.

δύο κυτταρικές σειρές CRC αναπτύχθηκαν σε ορό -δωρεάν μέσο και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με EGF (20 ng /mL) για 20 και 120 λεπτά. A. εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από τον έλεγχο ή κύτταρα EGF-αγωγή απομονώθηκαν και ανοσοκαταβυθίστηκαν με α-hnRNPA1 (άνω πάνελ) ή hnRNPL (κάτω πίνακας) αντισώματα. Τα ανοσοκαταβυθίστηκαν δείγματα στη συνέχεια αναλύθηκαν με στύπωμα Western με αντισώματα που αναγνωρίζουν κατάλοιπα ακετυλο-λυσίνη και, είτε hnRNPA1 ή hnRNPL. Οι είσοδοι του κάθε ειδικού hnRNP στις διάφορες κυτταρικές γραμμές δείχνονται. επίπεδα Β mRNA της hnRNPA1 και hnRNPL αναλύθηκαν από qPCR τον έλεγχο και τα κύτταρα EGF-επεξεργασία 2h. Δεν στατιστική σημαντικότητα βρέθηκε (n = 3). Η ανάλυση στυπώματος Western που δείχνει C. επίπεδα πρωτεΐνης και των δύο hnRNPs σε κύτταρα HAF1 και HAE6 σε συνθήκες EGF-αγωγή ελέγχου και 2h. Η ένταση των ζωνών hnRNPs μετρήθηκε και κανονικοποιήθηκε με β-ακτίνης? γραφήματα στο κάτω πάνελ δείχνουν την ποσοτικοποίηση τόσο για hnRNPL και Α1 HAF1 (λευκές ράβδοι) και HAE6 (γκρι ράβδοι) κυτταρικές σειρές.

Η

Σύμφωνα με στέρηση ορού, τα βασικά επίπεδα ακετυλίωση των δύο hnRNPs ήταν υψηλότερα σε HAE6 ό, τι σε κύτταρα HAF1 (Σχήμα 5Α, λωρίδα 0). Ωστόσο, η ακετυλίωση των δύο, hnRNPA1 και hnRNPL στο τελικό σημείο της EGF-θεραπεία ήταν η ίδια και στις δύο κυτταρικές σειρές. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν η ακετυλίωση των δειγμάτων EGF-αγωγή συγκρίθηκε με μη επεξεργασμένους μάρτυρες, ακετυλιωμένης hnRNP επίπεδα δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά καθ ‘όλη τη χρονική πορεία της EGF-θεραπεία σε κύτταρα HAE6 (Σχήμα 5Α). Αντίθετα, EGF προκάλεσε μία δραματική ακετυλίωση των δύο hnRNPs σε HAF1 κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι η ίδια απάντηση παρατηρήθηκε μετά από αγωγή με EGF σε HCT116 γονική κυτταρική σειρά (S3 Εικ). Τέλος, mRNA και πρωτεΐνη επίπεδα από hnRNPA1 ή-L δεν προκλήθηκαν σε κάθε EGF-αγωγή κυτταρικής σειράς στα δοκιμάστηκαν χρονικά σημεία (Σχήμα 5Β και 5C? S3 Εικ). Κατά συνέπεια, EGF-προκαλούμενη ακετυλίωση παρατηρήθηκε σε HAF1 δεν μπορεί να αποδοθεί στην μεταγραφική ή μεταφραστική ρύθμιση της hnRNPs.

3.6. Ο ρόλος του

KRAS

A146T μεταλλαγή σε hnRNP ακετυλίωση

Για να μελετήσει κατά πόσον

KRAS

A146T

μετάλλαξη μπορεί να ευθύνεται για το ΕΤΠ που προκαλείται ακετυλίωση της hnRNPs, εμείς ανέστειλε ειδικά την KRAS μονοπάτι σηματοδότησης στην κυτταρική γραμμή HAF1. Ανεξάρτητα από

KRAS

μετάλλαξη A146T, κύτταρα HAF1 περιλαμβάνει επίσης ένα

PI3KCA

μετάλλαξη. Ως εκ τούτου αναλύσαμε την ακετυλίωση hnRNPs που επάγεται από EGF σε κύτταρα προκατεργάστηκαν με αναστολείς και των δύο, ΜΕΚ1 /2 (U0126) και ΡΙ3Κ (LY294002). Αναστολή της ένα ενιαίο οδού είτε ΜΕΚ1 /2 ή ΡΙ3Κ, με τη χρήση του ειδικού αναστολέα μόνη της, δεν είχε καμία επίδραση επί ακετυλίωση πρωτεΐνης (Σχήμα 6Α). Η ικανότητα των RAS να επηρεάσουν τη δραστηριότητα της PI3K και αντίστροφα έχει τεκμηριωθεί καλά [28, 29]. Πράγματι, ο αποκλεισμός της δραστικότητας ΜΕΚ1 /2 έχει δειχθεί ότι διεγείρει φωσφορυλίωση της ΑΚΤ σε κυτταρικές σειρές CRC [30]. Από την άλλη πλευρά, το κλείδωμα δράση ΡΙ3Κ έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν τα επίπεδα της pERK1 /2 σε απόκριση σε μια ποικιλία κινήτρων [28]. Σε συμφωνία με αυτό, όταν και οι δύο αναστολείς χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα, η αναστολή της RAS /PI3K σηματοδότηση μονοπατιών μπλοκάρει εντελώς το ΕΤΠ που προκαλείται από ακετυλίωση των δύο hnRNPA1 και hnRNPL (Σχήμα 6Β). Είναι ενδιαφέρον, τα βασικά επίπεδα των ακετυλιωμένων hnRNPs σε ελέγχους στέρηση ορού δεν επηρεάζονται από τους αναστολείς κινασών.

Α. κύτταρα HAF1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με EGF σε παρουσία ή απουσία αναστολέων ΜΑΡΚ (ΜΕΚ, UO0126 ή PI3KA, LY294002). Εκχυλίσματα πρωτεΐνης από κύτταρα HAF1 ανοσοκαταβυθίστηκαν με α-hnRNPA1 ή αντισώματα hnRNPL. Τα ανοσοκαταβυθίστηκαν δείγματα στη συνέχεια αναλύθηκαν με στύπωμα Western με αντισώματα που αναγνωρίζουν ακετυλο-λυσίνης και, είτε hnRNPA1 ή hnRNPL (αριστερό πάνελ). Η φωσφορυλίωση του ERK1 /2 και ΑΚΤ σε κύτταρα HAF1 εκτιμήθηκε επίσης για την επιβεβαίωση της αποτελεσματικότητας των ατομικών αναστολέων σε δόσεις που χρησιμοποιούνται (δεξί πάνελ). αναστολείς B. Τόσο ΜΑΡΚ χρησιμοποιήθηκαν ταυτόχρονα να μελετήσει τις επιπτώσεις τους στην ΕΤΠ που προκαλείται από ακετυλίωση της hnRNPs. C. Ο ρόλος της αποακετυλασών επί των βασικών επιπέδων ακετυλίωση hnRNPs μελετήθηκαν περαιτέρω σε HAF1 κύτταρα κατεργασμένα με τριχοστατίνη Α Ανοσοκαταβύθιση με hnRNPs αντισώματα και στύπωμα western έναντι ακετυλο-λυσίνη, hnRNPA1 ή L σε κύτταρα HAF1 αγωγή με EGF, TSA ή συνδυασμό και των δύο δεικνύονται.

η

τα βασικά επίπεδα του ακετυλο-hnRNPs μπορούσε να εξαρτάται από την ημιζωή του ακετυλιώσεις. Στην πραγματικότητα, η ακετυλίωση των πρωτεϊνών δεν είναι μόνο το αποτέλεσμα της δραστηριότητας της ακετυλοτρανσφεράσης επαγόμενη, αλλά και αποακετυλασών. Για να εξεταστεί ο ρόλος των αποακετυλασών επί της βασικής ακετυλίωση, ερευνήσαμε εάν ο αναστολέας αποακετυλάσης τριχοστατίνη Α (TSA) θα μπορούσε να μιμούνται την επίδραση του EGF σε HAF1 κύτταρα. Πράγματι, TSA αύξησε την ακετυλίωση των δύο hnRNPs στα ίδια επίπεδα με εκείνα στα οποία κατέληξε η EGF-θεραπεία, αν και δεν συνεργική επίδραση παρατηρήθηκε (Σχήμα 6C).

Συζήτηση

Εδώ έχουμε αποκαλύψει αρκετά πτυχές των μοριακών γεγονότων υποκείμενα καρκινογένεσης του παχέος εντέρου που θα συζητηθεί περαιτέρω. Παρέχουμε την πρώτη έκθεση που δείχνει ότι η ακετυλίωση των 36 συγκεκριμένων πρωτεϊνών εξαρτάται από

KRAS

κατάστασης μεταλλάξεων? Μεταξύ αυτών, πολλά μέλη της οικογένειας hnRNP. Επιπλέον, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ακετυλίωση hnRNP είναι μέρος του EGF-επαγώγιμη απάντηση. Δεύτερον, δείχνουμε τις μοριακές συνέπειες της αλληλόμορφου ανισορροπία από τη διαγραφή του είτε, ενός άγριου τύπου ή ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο στο

KRAS

G13D /WT

κύτταρα CRC. Διαγραφή του αλληλόμορφου άγριου τύπου (HAE6) οδηγεί, όχι μόνο για να hnRNP ακετυλίωση, αλλά και για την πιο ογκογόνο και EGF-αδιάφορα προφίλ αυτών των κυττάρων. Αντίθετα, η διαγραφή του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου (HAF1) προκαλεί μια αυθόρμητη

KRAS

A146T

μετάλλαξη στο αλληλόμορφο άγριου τύπου.

Συλλογικά παρατηρήσεις μας φαίνεται να παράλληλες τα κλινικά ευρήματα δείχνουν ότι η διακοπή του

KRAS

αλληλόμορφο αγρίου τύπου αποτελεί δυσμενή προγνωστικό παράγοντα για CRC [31]. Παραδόξως, σε HAF1 κύτταρα, μια αυθόρμητη

KRAS

σημείο A146T

μετάλλαξη βρέθηκε. Σε συμφωνία με αυτό, οι πιο πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν δυναμική

KRAS

γονοτυπικές αλλαγές σε όλη την εξέλιξη της μεταστατικής CRC [11]. Αυτή η σημειακή μετάλλαξη καθιστά επίσης μια συστατική ενεργοποίηση του KRAS [32], στο εγγύς μέλλον, θα ήταν σημαντικό να αναλυθούν πιθανές αυθόρμητες μεταλλάξεις σε οποιαδήποτε άλλη κυτταρική γραμμή CRC χρησιμοποιείται ως πειραματικό μοντέλο για τη μελέτη των μοριακών μηχανισμών της θεραπείας-αντίστασης ή νέο φάρμακο ανάπτυξης.

δοκιμές διαλογής μετάλλαξη με βάση το hotspot

KRAS

κωδικόνια 12 και 13 έχουν ως αποτέλεσμα την κακή κατάταξη της μέχρι το ένα τρίτο των ασθενών που είχαν εσφαλμένα θεωρείται ως

KRAS

άγριου τύπου και ήταν ανθεκτικά σε αντι-EGFR θεραπείες [33, 34].

Οι KRAS

μεταλλάξεις στα κωδικόνια 61 και 146 που συνδέονται σημαντικά με μικρότερη επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε σύγκριση με το αγρίου τύπου

KRAS

σε ασθενείς CRC αντιμετωπίζονται με ένα συνδυασμό cetuximab και χημειοθεραπείας [10].