Οστών

Αφηρημένο

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η ενισχυμένη διεγερσιμότητα των γαγγλίων της ραχιαίας ρίζας (DRG) νευρώνες συμβάλλει στην ανάπτυξη του πόνου από καρκίνο των οστών, η οποία μειώνει σημαντικά την ποιότητα ζωής των ασθενών με καρκίνο. Nav1.8, ένα (ΤΤΧ-R) κανάλι νατρίου τετροδοτοξίνη ανθεκτικό, συμβάλλει περισσότερο από την τρέχουσα νατρίου στηρίζεται η δράση δυναμικό ανοδικής πορείας και ευθύνεται για το μεγαλύτερο μέρος του ρεύματος σε μεταγενέστερο αιχμές σε ένα τρένο. Υποθέτουμε ότι το κανάλι νατρίου Nav1.8 είναι ένας πιθανός υποψήφιος υπεύθυνη για την ενισχυμένη διεγερσιμότητα των νευρώνων DRG σε αρουραίους με πόνο από καρκίνο των οστών. Εδώ, με τη χρήση ηλεκτροφυσιολογίας, κηλίδα Western και δοκιμασίες συμπεριφοράς, θα τεκμηριωμένο ότι η πυκνότητα ρεύματος των διαύλων νατρίου ΤΤΧ-R, ειδικά το κανάλι Nav1.8, αυξήθηκε σημαντικά σε νευρώνες DRG των αρουραίων με καρκίνο που προκαλείται από πόνο στα οστά. Η αύξηση αυτή μπορεί να οφείλεται σε αυξημένη έκφραση του Nav1.8 επί της μεμβράνης του DRG νευρώνες. Accordantly, αποκλεισμός των διαύλων νατρίου Nav1.8 με επιλεκτική blocker Α-803467 του μετριαστεί σημαντικά τον καρκίνο που προκαλείται από μηχανική αλλοδυνία και θερμικής υπεραλγησίας σε αρουραίους. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η λειτουργική ρύθμιση προς τα άνω των καναλιών Nav1.8 στη μεμβράνη των νευρώνων DRG συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου που προκαλείται από πόνο στα οστά

Παράθεση:. Liu XD, Yang JJ, Fang D, Cai J , Wan Υ, Xing GG (2014) Λειτουργική η αναβάθμιση των καναλιών Nav1.8 νατρίου στη μεμβράνη των γαγγλίων της ραχιαίας ρίζας νευρώνες συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου του πόνου που προκαλείται οστών. PLoS ONE 9 (12): e114623. doi: 10.1371 /journal.pone.0114623

Επιμέλεια: Ιωσήφ Charles Glorioso, Πανεπιστήμιο του Πίτσμπουργκ της Ιατρικής Σχολής, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 του Αυγούστου του 2014? Αποδεκτές: 11, Νοεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 11η Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η παρούσα εργασία χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81371237, 31171063,81072951), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών του Πεκίνου (7.112.079), η ειδική Ίδρυμα για το επάγγελμά κοινωφελή πρόγραμμα επιστημονικής έρευνας από το Υπουργείο Υγείας της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας (201302013-01) και το «973» πρόγραμμα του Υπουργείου Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (2013CB531905). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πόνου από καρκίνο των οστών που προκύπτουν από πρωτογενείς όγκους ή όγκους που μετάσταση στα οστά είναι μία από τις πιο σοβαρές και δυσεπίλυτο τύπων πόνου από καρκίνο, η οποία μειώνει την ποιότητα της ζωής των ασθενών [1]. Οι μηχανισμοί που διέπουν την ανάπτυξη του πόνου από καρκίνο των οστών παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

Πρόσφατα, εμείς και οι άλλοι έχουν διαπιστώσει ότι η θερμική υπεραλγησία και μηχανική υπερευαισθησία σε μοντέλα ποντικών του πόνου από καρκίνο των οστών σχετίζονται με αυξημένη διεγερσιμότητα των πρωτογενών αλγαισθητικών νευρώνων DRG [ ,,,0],2], [3]. Οι απαντήσεις των αλγοϋποδοχέων σε επιβλαβή ερεθίσματα που κωδικοποιείται από δυναμικά δράσης των οποίων γένεση και εξάπλωση εξαρτώνται από την τάση διαύλων νατρίου. Έτσι, έχουν παρεκκλίνοντα πρότυπα έκφρασης αυτών των καναλιών και κληρονομικών channelopathies νάτριο έχουν συνδεθεί με νευροπαθητικού και φλεγμονώδους άλγους [4]. νευρώνες ενηλίκων DRG μπορεί να εκφράσει τόσο τετροδοτοξίνη-ευαίσθητα (ΤΤΧ-S) και τετροδοτοξίνη ανθεκτικά (ΤΤΧ-R) κανάλια νατρίου. Μεταξύ των τελευταίων, ο δίαυλος νατρίου ΤΤΧ R Nav1.8 εκφράζεται ειδικά επί αισθητηρίων νευρώνων [5], [6]. Ως εκ τούτου, Nav1.8 είναι ένα από τα πιο ελκυστικούς στόχους για την ανάπτυξη νέων φαρμακευτικών παραγόντων για τη θεραπεία του πόνου.

Nav1.8 παράγει μια αργή-απενεργοποίησης, ταχείας επαναπλήρωσης ρεύμα νατρίου ΤΤΧ-R με αποπολωθέντα ενεργοποίηση και απενεργοποίηση της τάσης-εξάρτηση [6], [7]. Nav1.8 συνεισφέρει το μεγαλύτερο μέρος του ρεύματος νατρίου που διέπουν τη δράση δυναμικό ανοδικής πορείας στους νευρώνες που εκφράζει το κανάλι [8], [9]. Οι βιοφυσικές ιδιότητες του Nav1.8, κρίσιμο ρόλο της στην επαναλαμβανόμενη πυροδότηση, και η παρουσία του σε ελεύθερες νευρικές απολήξεις, όπου αρχίζει η σηματοδότηση του πόνου, δείχνουν ότι Nav1.8 μπορεί να επηρεάσει σημαντικά αλγοϋποδοχέων ευερεθιστότητα, συμβάλλοντας έτσι στον πόνο. Ο ρόλος της Nav1.8 στην νευροπαθητικού και φλεγμονώδους άλγους είναι καλά επανεξετάζεται από Dib-Hajj et al. [4]. Ωστόσο, αν Nav1.8 συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου που προκαλείται από πόνο στα οστά είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Πρόσφατα, Qiu και συνεργάτες [10] παρατήρησαν αυξημένη έκφραση του Nav1.8 εντός DRG σε ένα μοντέλο αρουραίου Walker 256 καρκινικών κυττάρων του πόνου που προκαλείται από τον καρκίνο των οστών, γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή εμπλοκή του Nav1.8 στην ανάπτυξη των οστών του καρκίνου που προκαλείται πόνος. Σε αυτή τη μελέτη, με τη χρήση ηλεκτροφυσιολογίας, κηλίδα Western και φαρμακολογικές μεθόδους συμπεριφοράς, παρέχουμε αποδεικτικά στοιχεία που δείχνουν ότι η λειτουργική ρύθμιση προς τα άνω των καναλιών Nav1.8 επί της μεμβράνης του DRG νευρώνες συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου που προκαλείται από πόνο στα οστά.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα

το ενήλικο θηλυκό Sprague-Dawley βάρους 180-220 g κατά την έναρξη των πειραμάτων που παρέχονται από το Τμήμα Πειραματικής ζώων Επιστημών, Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας. Οι αρουραίοι στεγάστηκαν σε ξεχωριστούς κλωβούς με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Η θερμοκρασία δωματίου διατηρήθηκε στους 24 ± 1 ° C υπό κύκλο φωτός /σκότους φυσικό φως. Όλες οι διαδικασίες πειραματόζωα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Διεθνούς Ένωσης για τη Μελέτη του Πόνου [11] και εγκρίθηκαν από την επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου του Πεκίνου.

Εμβολιασμός των καρκινικών κυττάρων

κύτταρα καρκινώματος μαστικού αδένα

MRMT-1 αρουραίου καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει RPMI 1640 (Hyclone, USA) και 10% ορό εμβρύου μόσχου. Κύτταρα απελευθερώθηκαν από το πλαστικό με σύντομη έκθεση σε 0.25% (βάρος /όγκο) θρυψίνη (Gibco, USA), και στη συνέχεια παρασκευάζονται για ένεση ως ακολούθως: τα κύτταρα κατ ‘αρχάς συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση 10 ml μέσου για 3 λεπτά στις 1000 rpm . Το προκύπτον σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 1 ml αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) και τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αραιώθηκαν για να επιτευχθεί η τελική συγκέντρωση για την ένεση και διατηρούνται σε πάγο μέχρι εγχέονται σε ζώα. Ένα μοντέλο αρουραίου του πόνου από καρκίνο των οστών ιδρύθηκε από intratibial ένεση συγγενικών MRMT-1 κύτταρα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Εν συντομία, μετά από αναισθησία με ένυδρη χλωράλη (0,3 g /kg, ε.π.), ο αρουραίος αφήνεται κνήμης προσεκτικά εκτεθεί, και μια βελόνα 23-gauge εισήχθη εντός του ενδομυελικού σωλήνα του οστού. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με ένα μακρύ λεπτό αμβλεία βελόνα που συνδέεται με ένα 10-μΙ σύριγγα Hamilton που περιέχει το μέσο που θα εγχυθεί. Ένας όγκος των καρκινικών κυττάρων μαστικού αδένα MRMT-1 αρουραίου 4 μΐ (4 × 10

4) ή όχημα (PBS) εγχύθηκε μέσα στην κοιλότητα κνημιαίο οστό. Μετά την ένεση η περιοχή σφραγίστηκε με οστό κερί, και η πληγή είχε κλείσει οριστικά. Κανένα από τα ζώα έδειξαν σημάδια κινητικής δυσλειτουργίας μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου.

ολόκληρου κυττάρου εμπλάστρου εγγραφή σφιγκτήρας

Οι νευρώνες που απομονώθηκαν από L4 και L5 DRG ενήλικων αρουραίων χρησιμοποιώντας μεθόδους όπως περιγράφεται στο μας προηγούμενες μελέτες [3], [13]. Εν συντομία, προσφάτως τεμαχίζεται γάγγλια κιμά και πλύθηκαν σε ψυχρό, οξυγονωμένο Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM? Sigma), και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε κολλαγενάση (3 mg /ml, τύπος ΙΑ, Sigma) θεραπεία για 45 λεπτά, ακολουθούμενη από θρυψίνη (2 mg /ml, Type II-S, Sigma) για 15 λεπτά στους 37 ° C. Η ενζυματική αντίδραση σταμάτησε με έκπλυση των κυττάρων με ϋΜΕΜ που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, και τα υπόλοιπα κομμάτια του γάγγλια ήπια κονιορτοποιήθηκε με τη χρήση ενός φωτιά στιλβωμένο γυαλί πιπέττα Pasteur και διέρχεται μέσα από ένα σουρωτήρι κύτταρο 40 μm. Το εναιώρημα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 800 rpm για 3 λεπτά, και το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε φρέσκο ​​ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Τα διαχωρισμένα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πολυ-ϋ-λυσίνη (0,1 mg /ml, Sigma) κατεργασμένα γυάλινες καλυπτρίδες περιέχεται εντός 4 φρεάτων στείρες πλάκες καλλιέργειας ιστών και διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C για 2 έως 3 ώρες πριν την εγγραφή.

ολόκληρου κυττάρου patch clamp καταγραφές από οξεία διαχωριστεί νευρώνες DRG πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός EPC-10 ενισχυτή και λογισμικό Patchmaster (ΗΕΚΑ, Freiburg, Γερμανία). πιπέτες Patch τραβήχτηκαν από βοριοπυριτικό γυαλί τριχοειδή με αντίσταση άκρο 5 έως 8 ΜΩ όταν γεμίζεται με εσωτερικό διάλυμα που περιέχει τα ακόλουθα (σε mM): 135 CsF, 10 NaCI, 10 HEPES, 5 EGTA και 2 Na

2ATP. Το ρΗ ρυθμίστηκε στο 7.3 χρησιμοποιώντας CsOH. Το εξωτερικό διάλυμα περιείχε τα ακόλουθα (σε mM): 30 NaCl, 20 TEA-Cl, 90 χολίνης-Cl, 3 KCI, 1 CaCl

2, 1 MgCl

2, 10 HEPES, 10 γλυκόζη και 0,1 ΟϋΟ

2. Το ρΗ ρυθμίστηκε στο 7.3 χρησιμοποιώντας Tris-base. ρεύματα μεμβράνης μετρήθηκαν με πιπέτα και χωρητικότητα μεμβράνη ακύρωση, διηθείται σε 2 kHz και ψηφιοποιήθηκαν στα 10 kHz.

Σύμφωνα με λειτουργία εγγραφής τάσης-clamp, τα κύτταρα συσφίγγονται στους -70 mV, και αντίσταση σειράς αντισταθμίστηκε σε 70 % -90%. Η χωρητικότητα μεμβράνη αποκτήθηκε από τον ενισχυτή από το λογισμικό Patchmaster για τον προσδιορισμό του μεγέθους των κυττάρων και τον υπολογισμό της πυκνότητας ρεύματος. Όλες οι εγγραφές διεξήχθησαν σε μικρής και μεσαίας διαμέτρου (20-35 μm) νευρώνες DRG, η οποία είναι γνωστό ότι εκφράζουν τόσο ΤΤΧ-S και τα ρεύματα ΤΤΧ-Κ νάτριο [14], [15]. ΤΤΧ-R ρεύματα προκλήθηκαν από ένα δυναμικό κράτησης -120 mV στους παλμούς δοκιμής που κυμαίνονται από -80 έως +45 mV σε βήματα των 5 mV σε συχνότητα 0,2 Hz παρουσία ΤΤΧ (300 ηΜ) για να δεσμεύσουν το σύνολο ΤΤΧ -S κανάλια. Ένα ρεύμα νατρίου Nav1.8 μεσολάβηση προκλήθηκε με ένα πρωτόκολλο τάσης-clamp που χρησιμοποιείται από Rush και Waxman [16] και Berta et al. [17] με την παρουσία 300 ηΜ ΤΤΧ. Δοκιμή παλμούς που κυμαίνονται από -80 έως +40 mV σε βήματα των 5 mV σε συχνότητα 0,2 Hz, προηγήθηκε από ένα στάδιο προ-παλμού 500 ms στους -40 mV, προς απενεργοποίηση ΤΤΧ-R Nav1.9 ρεύμα μεσολάβηση. Η μέγιστη κορυφή ρεύματος σε διάφορες τάσεις χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση πυκνότητας ρεύματος. Οι κανονικοποιημένες καμπύλες ενεργοποίησης (Ι /Ι

0) είχαν τοποθετηθεί χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση κατανομή Boltzmann: I /I

0 = 1-1 /{1 + exp [(V

1/2-V

m) /k]}, όπου I

0 είναι η μέγιστη κορυφή ρεύματος σε διάφορες τάσεις δοκιμής, V

m είναι το δυναμικό δοκιμασίας, V

1/2 είναι το δυναμικό μεμβράνης σε ημι-μέγιστη Ι, και k είναι ο παράγοντας κλίσης. Η τάση που εξαρτάται από απενεργοποίησης σταθερής κατάστασης εκτιμήθηκε με μέτρηση της κορυφής του ρεύματος που προκαλείται από ένα παλμό δοκιμής 100 ms έως -10 mV μετά από ένα προ-παλμού 500 ms σε πιθανούς στο εύρος από -80 έως +10 mV με ένα 20-s περίοδο μεταξύ παλμών. Οι κανονικοποιημένες καμπύλες αδρανοποίηση (Ι /Ι

0) είχαν τοποθετηθεί χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση κατανομή Boltzmann: I /I

0 = 1 /{1 + exp [(V

1/2-V

m) /k]}, όπου I

0 είναι το ρεύμα κορυφής του νατρίου σε ελεγχθεί παλμό που μετράται από το πιο αρνητικό δυναμικό παλμό της προετοιμασίας, V

m είναι το δυναμικό παλμό της προετοιμασίας, V

1/2 είναι η δυναμικό της μεμβράνης κατά το ήμισυ της μεγίστης Ι, και k είναι ο παράγοντας κλίσης. Ανάλυση δεδομένων και τοποθέτηση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Origin 8.5 (OriginLab Corporation, Northampton, ΜΑ).

κηλίδος Western

Οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν βαθιά με ένυδρη χλωράλη 10% (0,3 g /kg, ίρ) και στη συνέχεια τα DRGs L4 και L5 απομακρύνθηκαν και αμέσως ομογενοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται στην προηγούμενη έκθεση μας [18] για την ολική εκχύλιση πρωτεΐνης και ανιχνεύσεως. Για κυτοσόλιο ή μεμβράνη εκχύλιση πρωτεΐνης και διαχωρισμό, DRGs ιστοί αποκόπηκαν και λύθηκαν με ομογενοποίηση με Nucl-Cyto-Mem κιτ παρασκευάσματος (Applygen, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και στη συνέχεια αναλύθηκαν με χρήση μεθόδων που περιγράφονται από Black et al. [19]. Δέκα μικρογραμμάρια συνολικής πρωτεΐνης αναμίχθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης 4 × και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Μετά από αποκλεισμό με 5% άπαχο γάλα σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween (TBST, 20 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl και 0.05% Tween-20) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, οι μεμβράνες PVDF επωάστηκαν με οι ακόλουθες πρωτογενή αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα: αντι-αρουραίου Nav1.8 αντίσωμα κουνελιού (1:1000, Alomone Labs), αντι-β-ακτίνης ποντικού (1:3000, Santa Cruz Biotechnology), ή υποδοχέα τρανσφερίνης ποντικού αντι-αρουραίου (ΕΟΑ) αντίσωμα (1:2000, Invitrogen). Οι κηλίδες πλύθηκαν σε TBST και μετά επωάζονται σε αντι-κουνελιού /δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας κατσίκας ποντικού IgG (1:2000, Santa Cruz Biotechnology). Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας ένα κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας ανίχνευσης (Pierce) και ακολούθησε αυτοραδιογραφία χρησιμοποιώντας Hyperfilm ΜΡ (Santa Cruz Biotechnology). Οι κηλίδες σαρώθηκαν με ένα σαρωτή κανόνι (Cannon, Inc., Japan), και οι πυκνότητες ζώνη ανιχνεύθηκαν με ένα λογισμικό Ποσότητα (Bio-Rad, USA). Τα δεδομένα από πέντε αρουραίοι χρησιμοποιήθηκαν για στατιστική ανάλυση.

Εμφύτευση ενδορραχιαίας καθετήρα και την έγχυση φαρμάκων

Για φαρμακολογικές αποκλεισμό των διαύλων Nav1.8, καθετήρες εμφυτεύθηκαν ταυτόχρονα με MRMT- 1 κύτταρα όγκου ή PBS εμβολιασμό. Σύμφωνα με ένυδρη χλωράλη (0,3 g /kg, ε.π.) αναισθησία, η εμφύτευση της ενδορραχιαίας κάνουλας διεξήχθη όπως περιγράφεται στο προηγούμενη μελέτη μας [20]. Εν συντομία, ένας καθετήρας πολυαιθυλενίου ΡΕ-10 εμφυτεύθηκε μεταξύ του L5 και L6 σπονδύλων για να φτάσει τη διεύρυνση ξυλεία του νωτιαίου μυελού. Το εξωτερικό μέρος του καθετήρα συνδέθηκε και στερεώνεται πάνω στο δέρμα κατά το κλείσιμο του τραύματος. Όλες οι χειρουργικές διαδικασίες εκτελέστηκαν υπό στείρες συνθήκες. Οι αρουραίοι που εμφανίζουν νευρολογικά ελλείμματα μετά αποκλείστηκαν ο εμφύτευση καθετήρα.

Για να εξεταστούν οι συνέπειές της φαρμακολογικής αποκλεισμός της Nav1.8 με εκλεκτικό ανταγωνιστή Α-803467 (TOCRIS, UK) σε αρουραίους καρκίνο των οστών, Α-803 467 (50, 100 και 150 nmol) ή του φορέα της (1% DMSO) ενδορραχιαίως παραδοθεί MRMT-1 ποντίκια την ημέρα 14 μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων όταν εμφανιστεί υπερευαισθησία πόνου. Ως έλεγχος, υψηλή δόση της Α-803467 (150 nmol) ή του φορέα της (1% DMSO) επίσης ενδορραχιαίως χορηγείται σε PBS εμβολιασμένα ζώα ψευδο την ημέρα 14 μετά τον εμβολιασμό PBS. Drug ή όχημα εγχύθηκε εντός της θήκης μέσω του εμφυτευμένου καθετήρα σε μια 10-μΙ όγκος του διαλύματος ακολουθούμενο από 10 μΐ φυσιολογικού ορού (NS) για την έκπλυση. Κάθε ένεση διήρκεσε τουλάχιστον 5 λεπτά. Μετά την ένεση, η βελόνα παραμένει in situ για 2 λεπτά προτού αποσυρθεί. Τόσο συμπεριφορές πόνου και κινητική λειτουργία των ζώων αξιολογήθηκαν στις 15, 30, 60, 90 και 120 λεπτά μετά την εφαρμογή του φαρμάκου.

Αξιολόγηση της μηχανικής αλλοδυνίας

μηχανική αλλοδυνία, ως συμπεριφορική σημάδι της οστικής πόνο καρκίνου, αξιολογήθηκε με μέτρηση του 50% κατώφλι απόσυρσης του ποδιού (PWT), όπως περιγράφεται στις προηγούμενες εκθέσεις μας [3], [21]. Το PWT 50% σε απόκριση σε μια σειρά νοη Frey νημάτια (Stoelting, Wood Dale, IL, USA) προσδιορίστηκε με τη μέθοδο πάνω και κάτω [22]. Οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν σε ένα πάτωμα μεταλλικού πλέγματος που καλύπτεται με ένα ανεστραμμένο διάφανο πλαστικό κλωβό (18 χ 8 χ 8 cm) και αφέθηκε μια 20-λεπτών περίοδος εγκλιματισμού. Οκτώ von Frey νημάτια με περίπου ίσο λογαριθμική οριακό (0,224) κάμψη δυνάμεις επιλέχθηκαν (0.41, 0.70, 1.20, 2.00, 3.63, 5.50, 8.50, και 15.10 g). Κάθε δοκιμή ξεκίνησε με μια δύναμη νοη Frey 2,00 g παραδίδεται κάθετα προς την πελματική επιφάνεια του αριστερού πίσω ποδιού για περίπου 2-3 ​​δευτερόλεπτα. Μια απότομη απόσυρση του ποδιού κατά τη διέγερση ή αμέσως μετά την απομάκρυνση της τρίχας καταγράφηκε ως θετική απόκριση. Όποτε υπήρχε θετική ή αρνητική απάντηση, το επόμενο ασθενέστερο ή ισχυρότερο νήμα εφαρμόστηκε, αντίστοιχα. Αυτή η διαδικασία έγινε έως ότου παρατηρηθεί έξι ερεθίσματα μετά την πρώτη αλλαγή σε απάντηση. Το PWT 50% υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: 50% PWT = 10

(Χ

f

+ Κδ), όπου το Χ

f είναι η αξία του τελικού νημάτιο νοη Frey που χρησιμοποιήθηκε (σε μονάδες log), k είναι μια τιμή που μετράται από το πρότυπο θετικών /αρνητικών απαντήσεων και δ = 0.224, το οποίο είναι το μέσο διάστημα (σε μονάδες log) μεταξύ των νημάτων νοη Frey [23]. Εάν ένα ζώο ανταποκρίθηκε στο χαμηλότερο von Frey νήμα, μια τιμή των 0,25 g ανατέθηκε. Αν ένα ζώο δεν ανταποκρίνεται στην υψηλότερη von Frey νημάτιο, η αξία καταγράφεται ως 15,0 g. συνεδρίες Δοκιμές εκτελέσθηκαν σε 0, 15, 30, 60, 90 και 120 λεπτά μετά την έγχυση του φαρμάκου.

Αξιολόγηση της θερμικής υπεραλγησίας

Θερμική υπεραλγησία του πίσω ποδιού ελέγχθηκε όπως περιγράφεται από τα προηγούμενα μας έκθεση [20]. Οι αρουραίοι αφέθηκαν να εγκλιματιστούν για ένα ελάχιστο 30 λεπτών εντός ακρυλικό περιβλήματα σε μια σαφή γυάλινη πλάκα διατηρήθηκε στους 30 ° C. Ένα ακτινοβόλο πηγή θερμότητας εστιάστηκε πάνω στην πελματική επιφάνεια του πίσω ποδιού. Μετρήσεις της απομάκρυνσης του ποδιού λανθάνουσα (PWL) λήφθηκαν από ένα χρονόμετρο που ξεκίνησε από την ενεργοποίηση της πηγής θερμότητας και σταμάτησε όταν απόσυρση του πέλματος ανιχνεύθηκε με ένα φωτοανιχνευτή. Ένας μέγιστος χρόνος αποκοπής των 30 s χρησιμοποιήθηκε για την αποφυγή περιττών βλάβη των ιστών. Τρεις μετρήσεις PWL πάρθηκαν για κάθε οπίσθιο πέλμα και ελήφθη ο μέσος όρος ως το αποτέλεσμα του κάθε συνόδου δοκιμής. Το πίσω πόδι δοκιμάστηκε εναλλάξ με διαστήματα μεγαλύτερα από 5 λεπτά μεταξύ των διαδοχικών δοκιμών.

Αξιολόγηση της λειτουργίας του κινητικού

δοκιμή επικλινής-πλάκα διεξήχθη για την αξιολόγηση της λειτουργίας του κινητικού συστήματος, για ποντίκια έλαβαν A-803467 (150 nmol). Ο αρουραίος τοποθετήθηκε εγκάρσια προς τον επιμήκη άξονα του μια κεκλιμένη πλάκα. Η αρχική γωνία της κεκλιμένης πλάκας ήταν 50 °. Η γωνία στη συνέχεια ρυθμίστηκε σε βήματα των 5 μοιρών. Η μέγιστη γωνία της πλάκας κατά την οποία ο αρουραίος διατήρησε τη θέση του σώματος της για 5 s χωρίς να πέσει προσδιορίστηκε σύμφωνα με την μέθοδο που αναφέρθηκε προηγουμένως [24].

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με GraphPad Prism 5.0 πακέτο (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από του Dunnett πολλαπλής σύγκρισης τεστ ή αμφίδρομη ANOVA ακολουθούμενο από το hoc post-test Bonferroni χρησιμοποιήθηκε για πολλαπλές συγκρίσεις. Οι διαφορές με την P & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Αύξηση σε τρέχουσες νατρίου TTX-R σε DRG νευρώνες των αρουραίων με τον πόνο του καρκίνου των οστών

Για να διερευνήσουν κατά πόσον TTX- R διαύλων νατρίου συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου που προκαλείται από πόνο στα οστά, μετρήσαμε πρώτα ΤΤΧ-R ρευμάτων νατρίου που καταγράφονται σε οξεία απομονωθεί νευρώνες DRG σε ένα μοντέλο αρουραίου του πόνου από καρκίνο των οστών, με την προσθήκη ΤΤΧ (300 ηΜ) στο διάλυμα του λουτρού για να εμποδίσει όλα τα ευαίσθητα σε ΤΤΧ διαύλων [25]. Το πρωτόκολλο τάση που χρησιμοποιήσαμε φαίνεται στο Σχ. 1Α. Βρήκαμε ότι η πυκνότητα του ρεύματος νατρίου ΤΤΧ-R αυξήθηκε σταδιακά μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Την ημέρα 7 μετά τον εμβολιασμό, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην πυκνότητα του ρεύματος νατρίου ΤΤΧ-Κ μεταξύ των νευρώνων από αρουραίους υπό αγωγή με κύτταρα MRMT-1 όγκου (96,67 ± 8,2 ρΑ /pF, n = 14) και εκείνων που προέρχονται από αρουραίους υπό αγωγή με PBS (97,08 ± 5,8 ρΑ /pF, n = 15) (Ρ & gt? 0,05, αμφίδρομη ANOVA, Σχήματα 1 C, D και G)., η οποία είναι συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα μας συμπεριφοράς που δείχνει δεν υπήρχε μηχανικές ή θερμικές υπερευαισθησίας του πόνου στο ότι χρόνο [3]. Ωστόσο, την ημέρα 14 μετά τον εμβολιασμό, η πυκνότητα του ρεύματος νατρίου ΤΤΧ-R αυξήθηκε σημαντικά σε MRMT-1-αγωγή αρουραίους (181,34 ± 17,2 ρΑ /pF, n = 19) σε σύγκριση με PBS-αγωγή αρουραίους (100,83 ± 14,7 pA /pF , n = 15) (Ρ & lt? 0.001, αμφίδρομη ANOVA, Σχήματα 1Ε έως G).. Αντιπροσωπευτικά ίχνη ρεύματος νατρίου ΤΤΧ-R σε αφελή, αγωγή με PBS και MRMT-1-αγωγή αρουραίους, καταγράφηκαν σε νευρώνες DRG σε 7 και 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων ή PBS φαίνεται στα Σχ. 1Β F.

(Α): πρωτόκολλο τάση που χρησιμοποιείται για την καταγραφή ΤΤΧ-R ρεύμα νατρίου με 300 ηΜ ΤΤΧ στο διάλυμα του λουτρού. (B έως F): Αντιπροσωπευτικά ίχνη ρεύματος νατρίου ΤΤΧ-R σε αφελή (Β), με αγωγή με PBS (C και Ε) και MRMT-1-αγωγή αρουραίους (D και F), καταγράφηκαν σε νευρώνες DRG σε 7 (C και D) και 14 (Ε και F) ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων ή PBS. (G): Στατιστική ανάλυση της πυκνότητας του ρεύματος κορυφής. Σημειώστε ότι η πυκνότητα του ρεύματος νατρίου ΤΤΧ-R είναι σημαντικά αυξημένη στους νευρώνες DRG των αρουραίων καρκίνο των οστών.

***

P

& lt?. 0.001, σε σύγκριση με την ομάδα PBS, αμφίδρομη ANOVA, n = 19 (MRMT-1) και 15 (PBS)

Η

αύξηση των Nav1.8 ρεύματος νατρίου σε DRG νευρώνες των αρουραίων με τον πόνο του καρκίνου των οστών

Για να απομονώσετε Nav1.8 τρέχουσα νατρίου από συνολικό ρεύμα νατρίου TTX-R, χρησιμοποιήσαμε ένα άλλο πρωτόκολλο τάσης με 500 ms προ-παλμού στους -40 mV για την αδρανοποίηση του καναλιού Nav1.9 όπως περιγράφεται στην προηγούμενη έκθεση [17] (Εικ. 2G). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η τρέχουσα η πυκνότητα του Nav1.8 μεσολάβηση νάτριο 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό αυξήθηκε σημαντικά σε MRMT-1-αγωγή αρουραίους (136,11 ± 10,4 ρΑ /pF, n = 17) σε σύγκριση με αγωγή με PBS αρουραίους (74,09 ± 10,0 pA /pF, n = 16) (Ρ & lt? 0.001, αμφίδρομη ANOVA, Σχήματα 2D έως F).. Παρόμοια με την πυκνότητα του ρεύματος νατρίου ΤΤΧ-R, η πυκνότητα ρεύματος Nav1.8 μεσολάβηση παρέμεινε αμετάβλητη την ημέρα 7 μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων (Ρ & gt? 0,05, έναντι PBS, αμφίδρομη ΑΝΟνΑ, η = 11 MRMT- 1 και 12 PBS, Σχ. 2Β, C και F). Για να διερευνήσουν κατά πόσον οι εγγενείς ιδιότητες των Nav1.8 καναλιών νατρίου άλλαξαν μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων, εξετάσαμε τόσο τις καμπύλες ενεργοποίηση και απενεργοποίηση της Nav1.8 μεσολάβηση ρεύματα νατρίου σε αφελείς, PBS-θεραπεία και MRMT-1-αντιμετωπίζονται αρουραίους . Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Η και Ι, δεν παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή παρατηρήθηκε είτε στην ενεργοποίηση (Σχ. 2Η), ή την απενεργοποίηση (Σχ. 2Θ) καμπύλες μεταξύ των τριών ομάδων, υποδεικνύοντας ότι οι εγγενείς ιδιότητες του διαύλου νατρίου Nav1.8 παρέμεινε αμετάβλητη μετά τον εμβολιασμό του όγκου κύτταρα. Αντιπροσωπευτικά ίχνη Nav1.8 μεσολάβηση ρεύμα νατρίου σε αφελή, PBS-και MRMT-1-αγωγή αρουραίους, καταγράφηκαν σε νευρώνες DRG σε 7 και 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων ή PBS φαίνεται στα Σχ. 2Α έως Ε

(Α έως Ε): Εκπρόσωπος ίχνη Nav1.8 μεσολάβηση ρεύματος νατρίου σε αφελείς (Α), με PBS (Β και D) και MRMT-1-αγωγή (C και Ε) αρουραίους, καταγράφηκαν σε DRG νευρώνες στις ημέρες 7 (Β και C) και 14 (D και Ε) μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων ή PBS. (F): Στατιστική ανάλυση της πυκνότητας του ρεύματος κορυφής. Σημειώστε ότι η πυκνότητα του Nav1.8 μεσολάβηση ρεύμα νατρίου αυξάνεται σημαντικά στους νευρώνες DRG των αρουραίων καρκίνο των οστών.

***

P

& lt? 0.001, σε σύγκριση με την ομάδα PBS, αμφίδρομη ANOVA, n = 17 (MRMT-1) και 16 (PBS). (G): πρωτόκολλο τάση που χρησιμοποιείται για την καταγραφή Nav1.8 μεσολάβηση ρεύματα νατρίου με 300 ηΜ ΤΤΧ στο διάλυμα του λουτρού. Των 500 ms προ-παλμού στους -40 mV χρησιμοποιήθηκε για την αδρανοποίηση Nav1.9 διαύλους νατρίου. (Η και Ι): Καμπύλες ενεργοποίηση και απενεργοποίηση του Nav1.8 μεσολάβηση ρεύμα νατρίου σε αφελή, αγωγή με PBS και MRMT-1-αγωγή αρουραίους στις 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων ή PBS. Σημειώστε ότι δεν υπάρχει σημαντική μεταβολή παρατηρείται είτε στην ενεργοποίηση (H) ή επί των αδρανοποίησης (Ι) καμπύλες μεταξύ των τριών ομάδων. καμπύλες ενεργοποίησης προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για την καταγραφή των Nav1.8 ρεύμα νατρίου. Να σημειωθεί ότι οι καμπύλες σε Αφελής και PBS ομάδες επικαλύπτονται σχεδόν ολοκληρωτικά. Οι καμπύλες αδρανοποίησης προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο που περιγράφεται στις μεθόδους.

Η

Αύξηση έκφραση μεμβράνης του Nav1.8 πρωτεΐνης στο DRG των αρουραίων με πόνο από καρκίνο των οστών

Επιπλέον, εξετάσαμε έκφραση της Nav1.8 πρωτεΐνης στο DRG των αρουραίων με καρκίνο που προκαλείται από τον πόνο των οστών, ειδικότερα, τα κανάλια επί της κυτταρικής μεμβράνης, οι οποίες αντιπροσωπεύουν λειτουργικούς διαύλους. Χρησιμοποιώντας δοκιμασία κηλίδος Western, βρήκαμε ότι η έκφραση της συνολικής πρωτεΐνης Nav1.8 σε ομόπλευρη L4 και L5 DRGs παρέμεινε αμετάβλητη από την ημέρα 7 έως την ημέρα 14 σε MRMT-1-αγωγή αρουραίους σε σύγκριση με αγωγή με PBS αρουραίους (Ρ & gt? 0,05, δίκυκλα τρόπος ANOVA, n = 4 /ομάδα, Σχ. 3Α). Αυτό ήταν απροσδόκητο, καθώς πειράματα ηλεκτροφυσιολογίας αποκάλυψε μια αυξημένη πυκνότητα ρεύματος Nav1.8 σε MRMT-1-αγωγή αρουραίους (βλέπε Σχ. 2). Υποθέτουμε ότι μια τέτοια αύξηση του Nav1.8 ρεύμα νατρίου είναι πιθανόν να οφείλεται σε αυξημένη έκφραση του Nav1.8 στην κυτταρική μεμβράνη επειδή οι εγγενείς ιδιότητες του διαύλου νατρίου Nav1.8 παρέμεινε αμετάβλητη μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων (βλέπε Εικ. 2Η και ΕΓΏ). Για να διευκρινιστεί αυτή η υπόθεση, ανιχνεύσαμε περαιτέρω την έκφραση μεμβράνης του Nav1.8 χρησιμοποιώντας μια μέθοδο φυγοκέντρησης υψηλής ταχύτητας για την απομόνωση του κλάσματος μεμβράνης από κύτταρα DRG, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη μελέτη [19]. Όπως ήταν αναμενόμενο, 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων, η πυκνότητα ζώνη Nav1.8 πρωτεΐνη που εκφράζεται στην κυτταρική μεμβράνη αυξήθηκε σημαντικά σε MRMT-1-αγωγή αρουραίους (1,45 ± 0,06, η = 6) σε σύγκριση με PBS-αγωγή αρουραίους ( 0,87 ± 0,07, η = 6) (Ρ & lt? 0.001, αμφίδρομη ANOVA, Σχήμα 3Β).. Εν τω μεταξύ, η πυκνότητα ζώνη του Nav1.8 πρωτεΐνης που βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα μειώθηκε σημαντικά σε MRMT-1-αγωγή αρουραίους (0,57 ± 0,04, η = 3) σε σύγκριση με αγωγή με PBS αρουραίοι (1,09 ± 0,02, η = 3) (Ρ & lt? . 0.001, αμφίδρομη ANOVA, Σχ 3C)

(Α):. Σύνολο Nav1.8 πρωτεΐνη. Άνω: εκπρόσωπος των ζωνών κηλίδας Western? Κάτω: στατιστική ανάλυση των Nav1.8 συνολική έκφραση της πρωτεΐνης. Καμία σημαντική διαφορά παρατηρείται στην έκφραση της συνολικής πρωτεΐνης Nav1.8 μεταξύ των τριών ομάδων.

P

& gt? 0,05, αμφίδρομη ANOVA, n = 4 /ομάδα. (Β): πρωτεΐνη Nav1.8 μεμβράνης. Άνω: εκπρόσωπος των ζωνών κηλίδας Western. υποδοχέα τρανσφερίνης (TfR) χρησιμοποιείται ως εσωτερικός έλεγχος. Κάτω: στατιστική ανάλυση των Nav1.8 έκφραση της πρωτεΐνης μεμβράνης. Σημειώστε ότι η έκφραση του Nav1.8 στην κυτταρική μεμβράνη αυξάνεται σημαντικά στους νευρώνες DRG των MRMT-1-αγωγή αρουραίους σε σύγκριση με αγωγή με PBS αρουραίους.

***

P

& lt? 0.001, αμφίδρομη ANOVA, n = 6 /ομάδα. (C): Nav1.8 πρωτεΐνη στο κυτταρόπλασμα. Σημειώστε ότι η έκφραση του Nav1.8 στο κυτταρόπλασμα μειώνεται σημαντικά στους νευρώνες DRG των MRMT-1-αγωγή αρουραίους σε σύγκριση με αγωγή με PBS αρουραίους.

***

P

& lt?. 0.001, αμφίδρομη ANOVA, n = 3 /ομάδα

Η

Α-803467 ανακουφίζει τη μηχανική αλλοδυνία και η θερμική υπεραλγησία του καρκίνου των οστών αρουραίους

Τέλος, διερευνήσαμε αν A-803467, ένας εκλεκτικός αναστολέας της Nav1.8 [26] θα μπορούσε να ανακουφίσει τον καρκίνο που προκαλείται από τον πόνο των οστών σε αρουραίους. Δοκιμάσαμε PWT και PWL την ημέρα 14 μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων ή PBS ως τη γραμμή βάσης. Στη συνέχεια, A-803467 ή όχημα ϋΜδΟ ενδορραχιαίως παραδοθεί MRMT-1 εμβολιάστηκαν αρουραίους πόνος καρκίνου, καθώς και PBS ενοφθαλμίστηκαν αρουραίους επίφαση, και τόσο η PWT και PWL μετρήθηκαν σε 15, 30, 60, 90 και 120 λεπτά μετά την εφαρμογή του φαρμάκου. Η δοσολογία και η έγχυση της ρίζας του Α-803467 ήταν σύμφωνα με μια προηγούμενη έκθεση δείχνει ότι η ενδοραχιαία χορήγηση Α-803467 (50-150 nmol) μειώνει τόσο προκλητών και αυθόρμητες απορρίψεις μεγάλο δυναμικό εύρος (WDR) νευρώνες στο νωτιαίο ραχιαίο κέρας [27 ]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, ενδοραχιαία χορήγηση Α-803467 (τόσο σε 100 και 150 nmol) θα μπορούσε σε περίοπτη θέση την αποκατάσταση του καρκίνου που προκαλείται από μείωση των οστών τόσο PWT (P & lt? 0,05 έως 0,001, έναντι του οχήματος /αρουραίους καρκίνο ομάδα, αμφίδρομη ANOVA, n = 7-8 /ομάδα, Σχήμα 4Α) και PWL (Ρ & lt?. 0,05 μέχρι 0.001, η vs. /καρκίνος αρουραίους ομάδα οχήματος, αμφίδρομη ΑΝΟνΑ, η = 6-9 /ομάδα, Σχήμα 4Β) αρουραίων καρκίνου.. Αντίθετα, ακόμη και μια υψηλή δόση της Α-803467 (150 nmol) δεν είχε σημαντική επίδραση στην PWL και PWT του PBS ενοφθαλμίστηκαν αρουραίων ψευδό (Ρ & gt? 0,05, έναντι οχήματος /αρουραίοι ψευδο ομάδα, αμφίδρομη ΑΝΟνΑ, η = 6 /ομάδα, τα Σχ. 4Α και Β). Να αποκλεισθεί κάθε πιθανή δυσλειτουργία του κινητήρα που προκαλούνται από την A-803467, εξετάσαμε επίσης επίδραση του Α-803 467 (σε μέγιστη δόση των 150 nmol) σχετικά με την κινητική λειτουργία των αρουραίων χρησιμοποιώντας τεστ κεκλιμένου πλάκα. Όπως προσδοκία μας, καμία σημαντική κινητική δυσλειτουργία παρατηρήθηκε σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο μετά την έγχυση του φαρμάκου (ρ & gt? 0,05, μονόδρομη ANOVA, η = 7 /ομάδα, Σχήμα 4C.). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της Nav1.8 από Α-803467 μπορεί να σώσει την προκαλούμενη από όγκο μηχανική αλλοδυνία και θερμικής υπεραλγησίας σε αρουραίους καρκίνο των οστών

(Α, Β):. Επιπτώσεις της Α-803467 (στους 50 , 100 και 150 nmol) επί μηχανική (Α) και θερμικό (Β) πόνος συμπεριφορές σε αρουραίους αξιολογήθηκε την ημέρα 14 μετά τον εμβολιασμό του MRMT-1 κύτταρα όγκου ή PBS. Σημειώστε ότι Α-803467 αποκαθιστά εντυπωσιακά τον όγκο των κυττάρων που προκαλείται από τη μείωση του PWT και PWL σε αρουραίους μοντέλο καρκίνο, αλλά δεν έχει σημαντική επίδραση στην PWL και PWT σε PBS που εμβολιάστηκαν αρουραίους επίφαση.

* /#

P

& lt? 0,05,

** /##

P

& lt? 0,01,

***

P

& lt ? 0.001, σε σύγκριση με όχημα /καρκίνο (MRMT-1) ομάδα αρουραίων, αμφίδρομη ΑΝΟνΑ, η = 6-9 /ομάδα. (Γ): δοκιμή κεκλιμένου πλάκα. Σημειώστε ότι ενδοραχιαία χορήγηση του Α-803467 στη μέγιστη δόση των 150 nmol δεν έχει σημαντική επίδραση στην κινητική λειτουργία των αρουραίων.

P

& gt? 0.05, μονόδρομη ANOVA, n = 7 /ομάδα

Η

Συζήτηση

Λειτουργική ρύθμιση προς τα άνω του Nav1.8 διαύλων νατρίου σε DRG νευρώνες. αρουραίους με τον πόνο του καρκίνου των οστών

Σύμφωνα με τα προηγούμενα ευρήματα ότι η έκφραση του Nav1.8 mRNA και η πρωτεΐνη είναι αυξημένη κατά οσφυϊκή 4-5 DRG σε ένα ζωικό μοντέλο του πόνου από καρκίνο των οστών [10], παρούσα μελέτη μας παρέχει πρόσθετες άμεση απόδειξη καταδεικνύοντας μια λειτουργική ρύθμιση προς τα πάνω του τασεοελεγχόμενων υποτύπου διαύλου νατρίου Nav1.8 επί της μεμβράνης του DRG νευρώνες σε ένα καρκίνο αρουραίου μοντέλο πόνου, η οποία έχει αποδειχθεί ότι απαιτείται για την ανάπτυξη του καρκίνου που προκαλείται από πόνο στα οστά.

Βιοφυσικής και φαρμακολογικές μελέτες έχουν προσδιορίσει ότι τέσσερις περιφερειακές ειδικών διαύλων νατρίου, συμπεριλαμβανομένης της TTX-S κανάλια Nav1.3 και NaV1.7 και την TTX-R κανάλια NaV1.8 και NaV1.9 εκφράζονται κατά προτίμηση σε πρωτογενείς αισθητικές νευρώνες DRG και το παιχνίδι σημαντικούς ρόλους στην παθοφυσιολογία διαφόρων συνδρόμων πόνου [18], [28], [29]. Μεταξύ αυτών, το κανάλι νάτριο Nav1.8 έχει αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητο για πολλούς τύπους χρονίων φλεγμονωδών και νευροπαθητικού πόνου [26], [30], [31]. Ωστόσο, ο ρόλος του Nav1.8 διαύλου νατρίου στην παθογένεση του πόνου από καρκίνο των οστών είναι ακόμη άγνωστος. Αν και Qiu et al. [10] παρατήρησαν αυξημένη έκφραση του Nav1.8 εντός DRG σε ένα μοντέλο αρουραίου του πόνου από καρκίνο των οστών, δεν σίγουρα καταλήξει σε συμπέρασμα κατά πόσον ή όχι η αυξημένη διαύλου νατρίου Nav1.8 συμβάλλει στον καρκίνο που προκαλείται από πόνο στα οστά. Σε μια άλλη μελέτη, Miao και συνεργάτες [32] ανέφεραν μία σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Nav1.8 στο DRG σε ένα μοντέλο πόνου από καρκίνο αρουραίου. Παρ ‘όλα αυτά, χρησιμοποιώντας antisense ολιγοδεοξυνουκλεοτίδια (ODNs) έναντι Nav1.8, διαπίστωσαν ότι knock-down της έκφρασης Nav1.8 σε νευρώνες DRG θα μπορούσε να μετριάσει καθοριστεί συμπεριφορές πόνου από καρκίνο σε αρουραίους που φέρουν όγκο, υποδηλώνοντας ένα πιθανό ρόλο του Nav1.8 στην ανάπτυξη και συντήρηση του πόνου από καρκίνο των οστών. Ασυνέπεια, μια πρόσφατη μελέτη, χρησιμοποιώντας όρους ποντίκια knock-out έχει δείξει ότι ούτε Nav1.7 ή Nav1.8 απαιτείται για τον καρκίνο που προκαλείται από τον πόνο των οστών [33]. Στην τρέχουσα μελέτη μας, παρουσιάζουμε ηλεκτροφυσιολογικές και βιοχημικές ενδείξεις που δείχνουν ότι η πυκνότητα των Nav1.8 μεσολάβηση ρεύμα νατρίου αυξάνεται σημαντικά στους νευρώνες DRG των αρουραίων με πόνο από καρκίνο των οστών και ότι αυτή η αύξηση οφείλεται πιθανώς σε μια αυξημένη έκφραση του λειτουργικού NAV1 0.8 δίαυλοι νατρίου στην κυτταρική μεμβράνη αντί των μεταβολών στις εγγενείς ιδιότητες ή ολικής πρωτεΐνης έκφραση των καναλιών, επειδή αυτό, μαζί με την αυξημένη πυκνότητα των δύο ΤΤΧ R- και Nav1.8 μεσολάβηση ρευμάτων νατρίου, η έκφραση της πρωτεΐνης μεμβράνης