Αφηρημένο

ουρσολικό οξύ (UA), ένα φυσικό πεντακυκλικόν τριτερπενοειδείς καρβοξυλικό οξύ διανέμεται σε ιατρικά βότανα, ασκεί αντικαρκινική δράση και αναδύεται ως μια πολλά υποσχόμενη ένωση για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου, αλλά οι μηχανισμοί τους ειδικούς φόρους κατανάλωσης της δράσης καρκινικά κύτταρα κόλου παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Εδώ, εντοπίσαμε τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους UA ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση που επάγεται στο ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου SW480 και LoVo κυττάρων. Η θεραπεία με UA οδήγησε σε σημαντικές αναστολές της βιωσιμότητας των κυττάρων και το σχηματισμό του κλώνου και αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων και εξάπλωση. UA κατέστειλε επίσης κόλου μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων με αναστολή ΜΜΡ9 και προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης Cdh1. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι UA ανέστειλε την φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Akt και ERK. Η προεπεξεργασία με έναν αναστολέα Akt ή ERK-ειδική κατήργησε σημαντικά την αναστολή πολλαπλασιασμού από UA. UA επίσης σημαντικά ανέστειλε κύτταρο καρκίνου του παχέος εντέρου έκφραση COX-2 και την παραγωγή PGE2. Η προεπεξεργασία με έναν αναστολέα της COX-2 (σελεκοξίμπη) κατήργησε την UA-επαγόμενο πολλαπλασιασμό κυττάρων. Επιπλέον, βρήκαμε ότι UA προωθηθούν αποτελεσματικά NF-κΒ και ρ300 μετατόπιση από πυρήνες κυττάρων προς κυτταρόπλασμα, και εξασθένησε την p300 μεσολάβηση ακετυλίωση του NF-κΒ και CREB2. Η προεπεξεργασία με έναν αναστολέα p300 (ροσκοβιτίνη) κατήργησε την UA-επαγόμενο πολλαπλασιασμό κυττάρων, η οποία αναστρέφεται με p300 υπερέκφραση. Επιπλέον, UA επάγεται θεραπεία καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρου απόπτωση, αύξησε την διάσπαση της PARP, κασπάσης-3 και 9, και trigged την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από μιτοχονδριακές διάστημα μεταξύ της μεμβράνης σε κυτοσόλιο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι UA αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μέσω της ταυτόχρονης διαμόρφωσης των οδών πολλαπλών σηματοδότησης όπως ΜΜΡ9 /Cdh1, Akt /ERK, COX-2 /PGE2, p300 /ΝΡ-κΒ /CREB2, και κυτόχρωμα c /μονοπάτια της κασπάσης

Παράθεση:. Wang J, Liu L, Qiu Η Ζανγκ Χ, Guo W, Chen W, et al. (2013) ουρσολικό οξύ Στοχεύει ταυτόχρονα πολλαπλές οδούς σηματοδότησης να καταστείλουν τον πολλαπλασιασμό και επάγει απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (5): e63872. doi: 10.1371 /journal.pone.0063872

Επιμέλεια: Chunhong Yan, Albany Medical College, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Ιανουαρίου 2013? Αποδεκτές: 10η του Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: May 30, 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα κονδύλια από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81071687, 81272195), το κράτος «863 Πρόγραμμα» της Κίνας (SS2012AA020403), το Ίδρυμα διδακτορικά προγράμματα του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (20110171110077), και το Χημείο του κράτους Κλειδί Ογκολογίας στη Νότια Κίνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει την υπαγωγή (ες) του Wenlin Huang στο «Guangzhou Double Bioproduct Inc «. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

παχέος εντέρου και του καρκίνου του ορθού (του παχέος εντέρου, CRC), η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο , έχει γίνει μία από τις κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο [1]. Χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία είναι οι βασικοί και κοινές θεραπείες για καρκίνο του παχέος εντέρου. Αν και η χημειοθεραπεία είναι ανοσοενισχυτικό σε χειρουργική επέμβαση, ο ρυθμός σκλήρυνσης του ορθοκολικού καρκίνου εξακολουθούσε να μην είναι ιδανική, ειδικά για τους ασθενείς μεταγενέστερο στάδιο. Η μετάσταση και υποτροπής μετά τη χειρουργική επέμβαση ή την παραγόμενη αντίσταση χημειοθεραπεία συνήθως οδηγεί στο τελικό θάνατο. Έτσι, η συμπληρωματική και εναλλακτική θεραπευτική στρατηγική έχει καταστεί αναγκαίο να βελτιωθεί το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου. Κινεζική βοτανική ιατρική γίνεται όλο και πιο δημοφιλής στον καρκίνο θεραπείες σε συνδυασμό με τη συμβατική θεραπεία λόγω της φυσικής προέλευσης του, χαμηλή τοξικότητα και την αποτελεσματικότητα για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου [2].

ουρσολικό οξύ (UA) , ένα φυσικό πεντακυκλική τριτερπενοειδείς καρβοξυλικό οξύ εκχυλίζεται από την ιατρική βότανα και βρώσιμα φυτά, εξασκεί ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της ηπατοπροστατευτικά [3], αντι-βακτηριακή [4], αντι-ιική [5], και αντι-φλεγμονώδη [6]. Επιπλέον, έχει εμπλακεί στην πρόληψη και την προστασία κατά των καρκίνων [7]. αντι-νεοπλασματική δράση του αποδίδεται στην ικανότητά του να εμποδίζει την ογκογένεση [8], αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, και να προκαλέσουν καρκίνο κυττάρου απόπτωση [6], [9]. Οι οδοί σηματοδότησης εμπλέκονται σε δραστηριότητα UA θα μπορούσε να είναι διαφορετική σε διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές, και τα μονοπάτια σηματοδότησης μερική μπορούσαν να ρυθμίζονται ταυτόχρονα ή διαδοχικά και synergized να συμβάλλουν στην θεραπεία UA. Ωστόσο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην UA αναστολή του πολλαπλασιασμού και την επαγωγή απόπτωσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου δεν ήταν ακόμα αρκετά σαφής.

Το ένζυμο κυκλοοξυγενάση-2 (COX-2), υπεύθυνο για την κατάλυση της μετατροπής του αραχιδονικού οξύ σε προσταγλανδίνες και θρομβοξάνη Α

2, είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε πολλαπλές παθοφυσιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της fl ammation και ογκογένεση [10], [11]. COX-2 είναι μη ανιχνεύσιμο στους περισσότερους φυσιολογικούς ιστούς, αλλά είναι συνήθως υπερεκφράζεται σε πολλούς προ-κακοήθη, κακοήθη και μεταστατικά ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου καρκίνου του παχέος εντέρου, με κατάντη προσταγλανδίνη προϊόν του Ε2 (PGE2). Η αυξανόμενη αποδεικτικά στοιχεία δείχνουν τους βασικούς ρόλους των COX-2 στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου είναι μέσω της συμμετοχής στην έναρξη του όγκου, προωθώντας τη συντήρηση και την εξέλιξη του όγκου, και την ενθάρρυνση του όγκου μεταστατική εξάπλωση [12], [13]. Η εκλεκτική αναστολή της δράσης της COX-2 αντιστρέφει την καρκινογένεση του παχέος εντέρου και του καρκίνου έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση, και αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση [14], [15]. Ορισμένοι από τους αναστολείς της έχουν ακόμη αποδειχθεί ότι είναι δυνητικά ελκυστική χημειοθεραπευτικά φάρμακα στην αγωγή του καρκίνου του παχέος εντέρου σε συνδυασμό με άλλα κοινά χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [16], [17]. έκφραση COX-2 είναι στενά ρυθμίζεται στο επίπεδο της μεταγραφής μέσω της δέσμευσης του διαενεργοποιητών όπως ΝΡ-κΒ, CREB2 και συν-ενεργοποιητών όπως P300 στις αντίστοιχες θέσεις που βρίσκονται σε υποκινητή του [18] – [21]. Ωστόσο, αν UA παίζει αντικαρκινική δράση της μέσω κανονισμών της COX-2, NF-κΒ και σηματοδότηση P300 εξακολουθεί να είναι ελάχιστα κατανοητή σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου, και οι σχετικές οδοί υποκείμενες σηματοδότησης παραμένουν ασαφείς.

Εδώ, αξιολογήσαμε την επίδραση της UA επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, τη μετανάστευση, και την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα κόλου και αναλύθηκαν ρύθμιση του σχετικά με τις βασικές πρωτεΐνες ορισμένων οδών σηματοδότησης που εμπλέκονται σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την απόπτωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν τα αντι-πολλαπλασιασμό, αντι-μετανάστευσης και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα της UA σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου είχαν τη μεσολάβηση ταυτόχρονη διαμόρφωση πολλαπλών οδών σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου ΜΜΡ9 /Cdh1, Akt /ERK, COX-2 /PGE2, p300 /NF -κB /CREB2 και κυτόχρωμα c /κασπάσης-εξαρτώμενη μονοπάτια. Η μελέτη μας δεν είναι μόνο αποκαλύπτει τις υποκείμενες μοριακών μηχανισμών δράσης UA σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, αλλά προτείνει επίσης τις μεγάλες δυνατότητες της UA στην ανθρώπινη παχέος πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου.

Αποτελέσματα

UA Σαθεροποιημένο τηλέφωνα ο πολλαπλασιασμός και ο κλώνος Σχηματισμός και Induced κυττάρων Μορφολογία Αλλαγή

πρώτα αναλύθηκαν ποσοτικά την επίδραση της UA στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία σε κύτταρα SW480 και LoVo με δοκιμασία ΜΤΤ. Η θεραπεία με UA στη δόση των 10 μΜ έως 60 μΜ ανέστειλε σημαντικά κυτταρικής βιωσιμότητας σε μια συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο, με αποτέλεσμα την κατά 20% σε μια αναστολή 83% σε κύτταρα SW480 και αναστολή 5% έως 55% στα κύτταρα LoVo, αντίστοιχα ( Σχ. 1Α). Προσδιορίσαμε επίσης τα αποτελέσματα της UA επί των κυττάρων του όγκου κλωνογονικότητας. UA επίσης σημαντικά ανέστειλε το σχηματισμό του κλώνου με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1Β), με αποτέλεσμα τη σημαντική αναστολή της αναλογίας σχηματισμού κλώνου και στις δύο κύτταρα SW480 και LoVo (Εικ. 1 C).

ανθρώπινου κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου SW480 και LoVo και φυσιολογικές κυτταρικές σειρές CCD841 και LO2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με UA στις ενδεικνυόμενες δόσεις. Στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ (Α, Ε), και ο όγκος των κυττάρων που προκαλείται από τον σχηματισμό κλώνος αναλύθηκε (Β, C). Οι αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία, εξάπλωση και διόγκωση σε κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς UA (10 μΜ και 20 μΜ) για 48 ώρες παρατηρήθηκαν και τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο εφοδιασμένο με ψηφιακή κάμερα (D). Η αναλογία σχηματισμός βιωσιμότητα τοις εκατό των κυττάρων ή στον κλώνο σε κάθε ομάδα αγωγής υπολογίστηκε σε σχέση με κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με DMSO ελέγχου του οχήματος. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. *,

P

& lt?. 0.05, σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες θεραπείας και ομάδες ελέγχου DMSO

Η

επόμενο αναλύονται οι UA-μεσολάβηση αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων και την εξάπλωση των κυττάρων SW480 και LoVo . Η επεξεργασία των κυττάρων με DMSO, ένας μάρτυρας του φορέα, που σχηματίζεται ένα στρώμα κυττάρων, και παρατηρήθηκαν περισσότερο εξαπλώνεται, filopodia και διόγκωση. Αντίθετα, η θεραπεία UA προκάλεσε σημαντική μείωση του κυττάρου-προς-κύτταρο επαφή, και είχαν χαμηλότερο εξαπλώνεται με λιγότερες σχηματισμό filopodia σε δύο κύτταρα SW480 και LoVo, και επαγόμενη διόγκωση της μεμβράνης σε κύτταρο σε επεξεργασία με UA (Εικ. 1ϋ).

Αξιολογήσαμε επίσης την επίδραση της UA στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ανθρώπινες φυσιολογικές κυτταρικές σειρές CCD841 και LO2. Η θεραπεία με UA στις δόσεις ≤20 μΜ δεν ανέστειλαν την κυτταρική βιωσιμότητα σε αμφότερες τις φυσιολογικές κυτταρικές σειρές, καταδεικνύοντας τη δυνατότητα εξειδίκευση της UA στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου στην δόση ≤20 μΜ.

UA Targeted MMP9 /Cdh1 Σηματοδοσίας να αναστέλλουν τις κυτταρικές μετανάστευση

Εξετάσαμε δίπλα το αποτέλεσμα της UA για τη μετανάστευση των κυττάρων με τη χρησιμοποίηση ενός προσδιορισμού μηδέν. Σε συμφωνία με τα δεδομένα από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η αναστολή κλωνογονικότητας, η θεραπεία με UA στα 5 μΜ ανέστειλαν αποτελεσματικά την κυτταρική μετανάστευση τόσο SW480 και κύτταρα LoVo (Εικ. 2Α). Το μέρος του χάσματος ή τραυματίζοντας χώρος μεταξύ των κυττάρων στρώματα μετά την πραγματοποίηση μια γρατσουνιά είχε καταληφθεί πλήρως από τα κύτταρα που μεταναστεύουν μετά από 56 ώρες. Αντίθετα, ο κενός χώρος των κυττάρων δεν καταλαμβάνεται από τους μεταναστεύουν κύτταρα κατεργασμένα με UA (Εικ. 2Α).

(Α), η μετανάστευση των κυττάρων αναλύθηκε με μία ανίχνευση μηδέν. SW480 και LoVo κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρη συρροή. Οι κυτταρικές μονοστοιβάδες τραυματίστηκαν με ένα στείρο ρύγχος πιπέτας, και πλύθηκαν με μέσο για να απομακρυνθεί αποσπασμένα κύτταρα από τις πλάκες. Τα κύτταρα αφέθηκαν είτε άνευ αγωγής ή υπέστησαν αγωγή με υποδεικνυόμενες δόσεις UA. Μετά από 56 ώρες, το χάσμα πληγή παρατηρήθηκε και τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν. (Β, C), SW480 κύτταρα επεξεργάστηκαν με UA στις ενδεικνυόμενες δόσεις. Σε 56 ώρες μετά την αγωγή, η έκφραση της ΜΜΡ9 (Β) ή Cdh1 (C) αναλύθηκε ποσοτικά με ανάλυση σε πραγματικό χρόνο qPCR. *,

P

& lt?. 0.05, σημαντικές διαφορές μεταξύ των UA-αγωγή ομάδες και τις ομάδες DMSO-αγωγή

Η

MMP9 και Cdh1 αποτελούν δύο βασικά μόρια που εμπλέκονται στην εισβολή των κυττάρων και σχετίζονται με τη μετανάστευση οδού σηματοδότησης [22], [23]. Εμείς επόμενη αναλύθηκε ποσοτικά τις επιδράσεις της UA στην έκφραση της ΜΜΡ9 και Cdh1 από ένα πραγματικό χρόνο ανάλυση qPCR σε κύτταρα SW480. Όπως ήταν αναμενόμενο, UA στα 20 μΜ και 40 μΜ κατέστειλε σημαντικά το επίπεδο mRNA του γονιδίου ΜΜΡ9 (σχ. 2Β), ενώ η αγωγή UA οδήγησε σε σημαντική αύξηση στην έκφραση του mRNA Cdh1 (Σχ. 2C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι UA παίζει σημαντικό ρόλο στην καταστολή της μετανάστευσης και της εισβολής μέσω της διαφοροποίησης των ΜΜΡ9 και Cdh1 σηματοδότησης.

UA αδρανοποιημένα Akt και ERK Σηματοδοσίας να αναστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό

Η PI3K /Akt και ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης παίζουν κρίσιμους ρόλους στον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και ογκογένεση. Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον UA είναι ικανό ρύθμισης της ΡΙ3Κ /Akt και ΜΑΡΚ σηματοδότηση οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, εξετάσαμε τις επιδράσεις της UA στην φωσφορυλίωση των μορίων σηματοδότησης σε αυτές τις δύο οδούς στα κύτταρα SW480 με ανάλυση κηλίδας Western. Η θεραπεία με UA στα 20 μΜ ανέστειλε σημαντικά την έκφραση του φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη Akt και mTOR, αλλά αυξήθηκαν φωσφορυλιωμένη έκφραση ΡΤΕΝ (Σχ. 3Α). Διαπιστώσαμε επίσης μία σημαντική μείωση των φωσφορυλιωμένων ERK πρωτεΐνες με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 3Β). Τα επίπεδα της συνολικής πρωτεΐνης έκφραση του Akt, mTOR, ΡΤΕΝ (Εικ. 3Α) και ERK (Εικ. 3Β) δεν μεταβλήθηκαν.

(Α, Β), SW480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με UA στο 20μΜ ή 40 μΜ για 48 ώρες. Η έκφραση του φωσφορυλιωμένου ή ολική ΡΙ3Κ, Akt, mTOR, ΡΤΕΝ, JNK, πρωτεΐνες ERK1 /2 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τη φόρτωση του δείγματος. (C, D), SW480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα ΡΙ3Κ /Akt-εκλεκτικός αναστολέας LY294002 (LY, 5 μΜ) (C) ή με ένα ΕΚΚ-εκλεκτικός αναστολέας U0126 (20 μΜ) (D) για 4 ώρες, και στη συνέχεια κατεργάζεται με UA στα 20 μΜ. Στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων τοις εκατό σε κάθε ομάδα αγωγής υπολογίστηκε σε σχέση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με το DMSO έλεγχο οχήματος. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. *,

P

& lt? 0,05, σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες θεραπείας και ομάδες ελέγχου

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η συμμετοχή των σηματοδοτικών μονοπατιών Akt και ERK στην UA-μεσολάβηση αναστολή της. τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αναλύσαμε την επόμενη τα αποτελέσματα του αναστολέα Akt ή ERK-επιλεκτικό για UA μεσολάβηση αναστολή πολλαπλασιασμού σε κύτταρα SW480. Προκατεργασία των κυττάρων με αναστολέα ΡΙ3Κ /Akt LY294002 (LY) σε 5 μΜ (Σχ. 3C) ή ERK Αναστολέας U0126 στα 20 μΜ (Σχ. 3D) ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και ένα συνδυασμό UA (20 μΜ) με Αυτοί οι αναστολείς αυξήθηκε ελαφρώς η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχ. 3C και 3D). Ωστόσο, η προσθήκη UA δεν μεταβλήθηκε σημαντικά την αναστολή του πολλαπλασιασμού στα κύτταρα SW480 προεπεξεργασία με αναστολέα Akt LY (Σχ. 3C) ή ERK αναστολέα U0126 (Σχ. 3D), επιβεβαιώνοντας το ρόλο του UA στη ρύθμιση της σηματοδότησης Akt και ERK.

UA Targeted COX-2 και PGE2 σηματοδοσίας να αναστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό

έκφραση COX-2 έχει δειχθεί ότι ρυθμίζει προς τα πάνω την EGFR, ΡΙ3Κ /Akt και ERK σηματοδότηση, έτσι επάγει πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, η μετανάστευση και εισβολή [24], [25]. Για να προσδιοριστεί αν η UA-διαμεσολαβούμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων διαμεσολαβείται μέσω της διαφοροποίησης της σηματοδότησης COX-2 σε καρκινικά κύτταρα κόλου, αξιολογήσαμε την επίδραση της UA στην έκφραση COX-2 σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA με κηλίδα Western και RT-PCR. Η θεραπεία με UA στις δόσεις των 20 μΜ και 40 μΜ ανέστειλε δραματικά την έκφραση της COX-2 πρωτεΐνης (Εικ. 4Α) και mRNA (σχ. 4Β) σε κύτταρα SW480 και LoVo. Η ποσοτική ανάλυση πυκνομετρίας έδειξε επίσης ότι UA στα 20 μΜ και 40 μΜ κατέστειλε σημαντικά την COX-2 mRNA σε δύο κύτταρα SW480 και LoVo (Εικ. 4C).

(Α-Δ), SW480 και LoVo κύτταρα κατεργάστηκαν με UA για 48 ώρες. Η έκφραση της πρωτεΐνης COX-2 (Α) και mRNA (Β) αναλύθηκαν με κηλίδωση Western και RT-PCR, αντίστοιχα. Οι πυκνότητες του COX-2 mRNA και η αναλογία COX-2 /GAPDH ποσοτικά αναλύθηκαν (C). Η παραγωγή της PGE2 ανιχνεύθηκε με ανάλυση ELSIA (D). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχοι για τη φόρτωση του δείγματος. (Ε), SW480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα COX-2 εκλεκτικού αναστολέα σελεκοξίμπη (CB, 20 μΜ) για 4 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με UA στα 20 μΜ. Στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. *,

P

& lt?. 0.05, σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες θεραπείας και ομάδες ελέγχου

Η

PGE2 είναι μεταγενέστερος προϊόν της COX-2, και συντίθεται μέσω της κυκλοοξυγενάσης και προσταγλανδίνης συνθάσης μονοπάτια. Εμείς επεξεργασμένα κύτταρα SW480 και LoVo με UA στα 20 μΜ και προσδιορίστηκε η επίδραση της UA στην παραγωγή PGE2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία UA μείωσε σημαντικά την παραγωγή της PGE2 και στα δύο κύτταρα (Σχ. 4D).

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι το UA-μεσολαβούμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων είναι μέσω της ρύθμισης της COX-2 σηματοδότηση σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, εμείς προκατεργασμένο SW480 κυττάρων με σελεκοξίμπη (CB, 10 μΜ), ένα COX-2 εκλεκτικού αναστολέα, και δοκιμάστηκε η επίδραση της UA στην celecoxib μεσολάβηση αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Ε, προ-θεραπεία με celecoxib (CB) σημαντικά ανέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα, ενώ UA στα 20 μΜ δεν μετέβαλε σημαντικά την αναστολή που προκαλείται από celecoxib. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων κόλου από UA μπορεί να επίσης μερικώς διαμεσολαβούνται από την αναστολή της σηματοδότησης της COX-2.

UA Induced μετατόπιση του ΝΡ-κΒ και ρ300 από πυρήνες κυττάρων προς κυτταρόπλασμα

Η έκφραση της COX-2 ρυθμίζεται από την μετατόπιση και την αλληλεπίδραση του τρανσενεργοποιητή NF-κΒ και συνενεργοποιητή p300 σε κύτταρο όγκου πυρήνες. Εμείς επόμενη εκτελείται δοκιμασία ανοσοφθορισμού για να αξιολογηθεί η επίδραση της UA επί πυρηνικό εντοπισμό και την αλληλεπίδραση του NF-κΒ και ρ300 σε καρκίνο του παχέος εντέρου SW480 και LoVo κυττάρων. Διαπιστώσαμε τη συστατική μετατόπιση του p50 και p65 NF-κΒ και P300 σε πυρήνες κυττάρων (Εικ. 5Α και 5Β) και την συν-εντοπισμό του p65 με Ρ50 (Εικ. 5Α) ή p300 (Εικ. 5Β) και στα δύο SW480 και LoVo κύτταρα. Η θεραπεία με UA στα 20 μΜ και 40 μΜ επαγόμενη μετατόπιση του ΝΡ-κΒ (Εικ. 5Α) και p300 (Εικ. 5Β) από πυρήνες κυττάρων προς κυτταρόπλασμα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι UA στόχο το NF-κΒ και σηματοδότηση p300 προωθώντας μετατόπιση τους από πυρήνες κυττάρων προς κυτταρόπλασμα σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

Ανθρώπινο SW480 και LoVo κύτταρα αναπτύσσονται σε πλάκες θαλάμου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με UA. Στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία, η υπο-κυτταρική εντόπιση του p50, p65 και p300 και συν-εντοπισμό του p65 με Ρ50 (Α) ή P300 (Β) εξετάστηκαν με συνεστιακή ανάλυση μικροσκόπιο με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο. Περισσότεροι από 100 κύτταρα επιθεωρούνται ανά πείραμα, και παρουσιάστηκαν τα κύτταρα με χαρακτηριστική μορφολογία.

Η

UA Στοχευμένες Σηματοδότησης P300 για να Αναστέλλουν NF-κΒ /CREB-2 ακετυλίωση και κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Η p300 μεσολάβηση ακετυλίωση διαενεργοποιητών και δέσμευσης τους με το γονίδιο της COX-2 προάγουν παίξει κρίσιμο ρόλο στην έκφραση της COX-2. Στην συνέχεια προσδιορίσαμε την επίδραση της UA επί p300 μεσολάβηση ακετυλίωση διαενεργοποιητών NF-κΒ και CREB2 στο παχύ έντερο κύτταρα του καρκίνου SW480. Η θεραπεία με UA στα 20 μΜ στα SW480 κύτταρα p300-επιμολυσμένα ανέστειλαν αξιοσημείωτα την ακετυλιωμένη επίπεδα ρ50 /ρ65 και πρωτεϊνών CREB-2 (Εικ. 6Α), ενώ η έκφραση αυτών των πρωτεϊνών δεν άλλαξε (Σχ. 6Β).

(Α, Β), SW480 κύτταρα επιμολύνθηκαν με FLAG-P300 για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με UA για 48 ώρες. Τα πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και ρ50, ρ65 και CREB2 ανοσοκαταβυθίστηκαν με μια ακετυλο-λυσίνη αντίσωμα. Τα ακετυλιωμένα πρωτεΐνες (Α) και η έκφραση της πρωτεΐνης (Β) του ρ50, ρ65 ή CREB2 αναλύθηκαν με κηλίδα Western. (C, D), SW480 κύτταρα προκατεργάστηκαν με p300-εκλεκτικός αναστολέας ροσκοβιτίνης (ROSC, 20 μΜ) (C), ή διαμολυσμένα με φορέα που εκφράζει p300-(D) για 8 ώρες, και στη συνέχεια κατεργάζεται με UA. Σε 40 ώρες μετά την αγωγή, η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε. Κενό φορέα (EV) χρησιμοποιήθηκε έλεγχος επιμόλυνσης. Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση ± SD τριών πειραμάτων. *,

P

& lt?. 0.05, σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες θεραπείας και ομάδες ελέγχου

Η

Για να επαληθεύσετε το ρόλο της UA στη ρύθμιση της σηματοδότησης P300 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, έχουμε προ-θεραπεία με ροσκοβιτίνη, ένας αναστολέας της p300 (Εικ. 6C), ή διαμολυσμένα με φορέα που εκφράζει ρ300 σε κύτταρα SW480 (Εικ. 6D), και τα αποτελέσματα της UA επί αναλύθηκαν ροσκοβιτίνη ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ρ300 μεσολάβηση. Η επεξεργασία των κυττάρων με ροσκοβιτίνη (ROSC, 20 μΜ) ανέστειλε σημαντικά κυτταρική βιωσιμότητα, ενώ UA στα 20 μΜ δεν άλλαξε σημαντικά την ροσκοβιτίνη μεσολάβηση αναστολής (Σχ. 6C). Αντίθετα, p300 υπερέκφραση αντιστραφεί σημαντικά την UA-παρεμπόδιση που προκαλείται σε κύτταρα SW480 σε σύγκριση με επιμόλυνση με ένα άδειο φορέα (EV) (Εικ. 6D). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι P300 είναι ένας σημαντικός στόχος της UA και ότι η UA-επαγόμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων διαμεσολαβείται, τουλάχιστον εν μέρει μέσω της οδού σηματοδότησης p300 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

UA Targeted κυτοχρώματος c /κασπάσης Σηματοδοσίας για την επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης

επίσης εξετάσαμε την επίδραση της UA στην κυτταρική απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου με προσδιορισμό FACS χρώση με βάση αννεξίνης-ν στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία. Η επεξεργασία των κυττάρων με UA στα 20 μΜ και 40 μΜ οδήγησε σε μια επαγωγή δοσο-εξαρτώμενη των θετικών αποπτωτικών κυττάρων (Εικ. 7Α), οδηγώντας σε επαγωγή 6,3% έως 14,2% στα κύτταρα SW480 και 2,8% για επαγωγή 53,4% σε LoVo κύτταρα (Σχ. 7Β). Η ενεργοποίηση των κασπασών είναι ένα σημαντικό γεγονός στην κατάντη αποπτωτική παθολογική οδό. Στην συνέχεια προσδιορίσαμε αν απόπτωση που επάγεται από UA σχετίζεται με την αυξημένη ενεργοποίηση του μονοπατιού κασπάσης σε SW480 κύτταρα. Οι επιδράσεις της UA στην έκφραση των διασπασμένων πρωτεϊνών από τις τρεις βασικές πρωτεΐνες απόπτωση που σχετίζονται με: PARP, κασπάσης-3 και κασπάσης-9, ανιχνεύθηκαν στις 48 ώρες μετά την κατεργασία με ανάλυση κηλίδος Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7C, η θεραπεία με UA στα 20 μΜ και 40 μΜ είχε ως αποτέλεσμα μια αξιοσημείωτη αύξηση της διασπασμένης ΡΑΚΡ, κασπάσης-3 και κασπάσης-9 πρωτεΐνες, γεγονός που υποδηλώνει ότι UA μπορεί να λειτουργεί ως ένα σημαντικό και ειδικό διαμεσολαβητή για να διευκολύνει την ενεργοποίηση των καταρρακτών κασπάσης.

SW480 και LoVo κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με UA (20 μΜ και 40 μΜ). Στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία, η απόπτωση προσδιορίστηκε με AnnexinV-FITC ανάλυση χρώσης με βάση FACS (Α, Β). Τα επίπεδα των διασπασμένων κασπάσης-3, κασπάσης-9 και ΡΑΚΡ πρωτεϊνών σε κύτταρα SW480, αναλύθηκαν με κηλίδα Western (C). Η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c (Cyto-γ) από το ενδο-μιτοχονδριακή χώρος μέσα στο κυτοσόλιο προσδιορίστηκε με ανάλυση απεικόνισης ανοσοφθορισμού (D). κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν με p300 siRNA επί 24 ώρες και ακολούθησε η κατεργασία με UA (20 μΜ). Στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία, η απόπτωση προσδιορίστηκε με ανάλυση FACS (Ε). Η απόπτωση αντιπροσωπεύονται από σχετικά ποσοστά των αποπτωτικών κυττάρων έναντι ότι σε κύτταρα DMSO-θεραπεία. *,

P

& lt?. 0.05, σημαντικές διαφορές μεταξύ των UA-αγωγή ομάδες και τις ομάδες ελέγχου

Η

Το κυτόχρωμα c (Cyto-γ) είναι η ανάντη μόριο του caspase- εξαρτώμενη από μονοπάτι απόπτωσης. Είμαστε δίπλα πραγματοποιήθηκε ανάλυση απεικόνισης ανοσοφθορισμού (IFI) για την παρακολούθηση των αλλαγών στην υποκυτταρική εντόπιση του Cyto-c στα UA-θεραπεία SW480 και LoVo κύτταρα για να προσδιοριστεί αν UA θα μπορούσε να προκαλέσει την απελευθέρωση Cyto-c. Η θεραπεία με UA (20 μΜ) προώθησε αποτελεσματικά την απελευθέρωση της Cyto-γ από την ενδο-μιτοχονδριακή χώρο μέσα στο κυτταρόπλασμα (Σχ. 7D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι UA συντονισμένη απελευθέρωση Cyto-γ από το χώρο μεταξύ των μιτοχονδριακής μεμβράνης και διευκόλυνε την κατάντη ενεργοποίηση της κασπάσης στο κυτταρόπλασμα.

Επίσης εξετάσαμε την επίδραση της αναστολής του Ρ300 στην απόπτωση που επάγεται από UA. Τα κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν με ένα Ρ300 ειδικό siRNA (si-P300) και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με UA (20 μΜ), και το αποτέλεσμα της αναστολής της ρ300 επί UA-απόπτωση αναλύθηκαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι knockdown έκφρασης ρ300 με SI-P300 ενισχυμένη σημαντικά την επαγωγή απόπτωσης που διαμεσολαβείται από UA (Εικ. 7Ε), επιβεβαιώνοντας το ρόλο της σηματοδότησης ρ300 στη ρύθμιση UA-επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε την απόκριση των καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου κόλου σε θεραπεία UA. UA ανέστειλε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την απόπτωση που επάγεται με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Δείξαμε ότι UA επαγόμενη απελευθέρωση κυτοχρώματος c, έτσι προκαλείται ενεργοποίηση της κασπάσης και απόπτωση. UA ρυθμίζεται επίσης την έκφραση ΜΜΡ9 και Cdh1 γονιδίων και ανέστειλαν την φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Akt και ERK, που οδηγεί σε αδρανοποίηση της κυτταρικής μετανάστευσης και μονοπάτια σηματοδότησης του πολλαπλασιασμού που σχετίζονται. Η μελέτη μας έδειξε επίσης ότι UA κατέστειλε COX-2 έκφρασης και παραγωγή PGE2. Επιπλέον, δείξαμε ότι η UA-διαμεσολαβούμενη καταστολή του COX-2 έκφρασης και κύτταρο πολλαπλασιασμός μεσολαβείται από την ταυτόχρονη διαμόρφωση των p300, ΝΡ-κΒ, και CREB2 σηματοδότηση. UA ανέστειλε p300 μεσολάβηση ακετυλίωση του NF-κΒ και CREB2, και προωθείται επίσης μετατόπιση της ρ65 ΝΡ-κΒ και ρ300 από πυρήνες κυττάρων προς κυτταρόπλασμα. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση που έδειξε ότι UA στοχεύει ταυτόχρονα τις οδούς πολλαπλών σηματοδότησης να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό κυττάρων καρκίνου κόλου και επάγουν την απόπτωση

UA έχει εντατικά μελετηθεί στο παρελθόν.? κυρίως ως ένωση κατά του καρκίνου και για την καρδιαγγειακή προστατευτικές ιδιότητες του. Η διαμάχη των εκθέσεων υποδηλώνει αντι-αγγειογενετική και κυτταροτοξικά αποτελέσματα UA στη μία πλευρά και των καρδιαγγειακών και ενδοθηλιακών προστατευτικές επιδράσεις στην άλλη πλευρά. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν επαρκή στοιχεία για να προτείνουμε ένα ιδανικό ανθρώπινη δόση. Μελέτες σε ζώα δείχνουν χρήση οφέλους μεταξύ 0,05-0,2% της διατροφής αρουραίου ως UA. Υποθέτοντας ένα εύρος 10-40 mg /kg σωματικού βάρους, τα οφέλη σε μελέτες σε αρουραίους που σχετίζεται με UA είναι περίπου ίση με μια ανθρώπινη δόση των 1.6 – 6.4 mg /kg σωματικού βάρους (110-440 mg για ένα άτομο 150 λίβρες).

Οι παρενέργειες της UA από περιλαμβάνουν κυρίως δύο πτυχές: την ανδρική γονιμότητα και βλάβες στο DNA. Προηγούμενη μελέτη αποκάλυψε ότι UA έχει τη δυνατότητα της αναστολής της κινητικότητας του σπέρματος και μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα τοπικό κολπικό αντισυλληπτικό [24], [25]. Ειδικότερα, προκαλεί σπάσιμο των γεφυρών μεταξύ των κυττάρων που πρόκειται σύντομα να είναι το σπέρμα, και τα κατεστραμμένα κύτταρα, στη συνέχεια, για να σχηματίσουν συλλογή symplasts σε σπερματικών σωληναρίων που σχετίζονται με την ανδρική υπογονιμότητα. UA ως αντι-αγγειογένεσης, αντι-καρκίνου και τοπικά εφαρμόζεται καρδιαγγειακών φαρμάκων μπορεί να είναι χρήσιμη. Ωστόσο, η επιζήμια δράση του DNA της UA μπορεί επίσης να αποτελεί ένα σοβαρό πρόβλημα. UA ήταν σε θέση να επάγει κυτταρικό θάνατο σε ενδοθηλιακά κύτταρα όταν η συγκέντρωση υπερβεί το 12,5 μΜ [26].

Η έκφραση της COX-2 παίζει ένα ρόλο κλειδί σε ανθρώπινους καρκίνους. έκφραση COX-2 και την παραγωγή της PGE2 έχουν αποδειχθεί ότι ρυθμίζουν προς τα πάνω το ΡΙ3Κ /Akt και ERK σηματοδότηση, έτσι επαγόμενη αγγειογένεση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή [27], [28]. αναστολή της COX-2 μπορεί να οδηγήσει σε καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και την απόπτωση και επάγει επιθηλιακή-μεσεγχυματικά μετάβαση [29] – [32]. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο η COX-2 εκφράζεται έντονα στην ογκογένεση δεν είναι πλήρως κατανοητός. COX-2 μεταγραφική ρύθμιση έχει χαρακτηριστεί εκτενώς [33] – [35]. P300 έχει αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη για την έκφραση της COX-2 και ασκεί μια συνολική επίδραση επί της COX-2 δομής της χρωματίνης υποκινητή για ενίσχυση της δέσμευσης του διαενεργοποιητών [20], [21]. P300 εκφράζεται σε αφθονία σε καρκινικά κύτταρα και p300 υπερέκφραση αυξάνει COX-2 μεταγραφικής ενεργοποίησης [36], [37]. Χρησιμεύει ως συνενεργοποιητή μεταγραφής για να γεφυρώσει τα διενεργοποιητές υποκινητή δεσμευμένο με μεταγραφικών παραγόντων στον μηχανισμό μεταγραφής [20], [21]. P300 HAT ακετυλιώνει ιστόνες ανοίγοντας έτσι την δομή της χρωματίνης και την αύξηση της πρόσβασης των στοιχείων ενισχυτή για διαενεργοποιητών. P300 ΗΑΤ είναι επίσης ικανό να ακετυλιώσεως διαενεργοποιητών όπως ΝΡ-κΒ, με τον τρόπο αυτό αυξάνουν σύνδεση τρανσενεργοποιητή [21]. Σε συμφωνία με τις προηγούμενες εκθέσεις, παρούσα μελέτη μας έδειξε επίσης ότι p300 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση του NF-κΒ και CREB2 ακετυλίωση και κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. UA στόχοι P300 σηματοδότησης για την αναστολή ακετυλίωση της NF-κΒ και CREB2, έτσι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Έχει δειχθεί ότι p300 ΗΑΤ ρυθμίζεται από φωσφορυλίωση ρ300 ή ακετυλίωση [38]. Είναι πιθανό ότι UA καταστέλλει φωσφορυλίωση ρ300, ρ300 μεταβάλλει ΗΑΤ διάπλασης και καταλυτική δραστικότητα, και αναστέλλει τη μετα-μεταφραστική τροποποίηση του p300 ΗΑΤ, εμποδίζοντας έτσι τη δραστηριότητα ΗΑΤ σε καρκινικά κύτταρα κόλου. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο UA αναστέλλει τη σηματοδότηση P300.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι UA επάγει την απόπτωση σε καρκίνους του ανθρώπου [39]. Ωστόσο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί και τα μονοπάτια σηματοδότησης με τα οποία UA επάγει απόπτωση παραμένουν ασαφείς. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η επαγωγή της απόπτωσης από UA είναι κυρίως μέσω UA διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-εξαρτώμενο μονοπάτι αποπτωτικά. Η επεξεργασία των κυττάρων με UA προκάλεσε την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c (Cyto-c) προς την κυτοσόλη, και στη συνέχεια διεγείρονται την ενεργοποίηση των κασπασών, έτσι απόπτωση.

Βρήκαμε επίσης ότι UA στοχευμένες το Akt και ERK-εξαρτώμενη μονοπάτια σηματοδότησης να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Το φωσφορυλιωμένο Akt και ERK είναι οι μεσολαβητές του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την επιβίωση και η κλινική ανταπόκριση στη τυροσίνης αναστολείς κινάσης (ΤΚΙ), και μια μείωση στη φωσφορυλιωμένη Akt και ERK έκφραση είναι ένα σημαντικό γεγονός στην ευαισθητοποίηση των κυττάρων όγκου σε θεραπεία ΤΚΙ. UA ανέστειλε την φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Akt και ERK, με αποτέλεσμα την απενεργοποίηση του κυτταρικής ανάπτυξης και επιβίωσης σχετίζονται Akt μονοπάτι σηματοδότησης /ERK. Τα ευρήματά μας έχουν σημαντικές επιπτώσεις στην εξερεύνηση νέων θεραπευτικών στρατηγικών για τον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Εν ολίγοις, έχουμε αποδείξει ότι UA ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση και την επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου με ταυτόχρονη ρύθμιση της MMP9 /Cdh1, Akt /ERK , μονοπάτια σηματοδότησης COX-2 /PGE2, p300 /ΝΡ-κΒ /CREB2, και κυτόχρωμα c /κασπάσης-εξαρτώμενο (Σχ. 8). Τα ευρήματά μας παρέχουν νέες γνώσεις για τους μοριακούς μηχανισμούς UA-μεσολαβούμενη επαγωγή αναστολή πολλαπλασιασμού και απόπτωσης και υποδηλώνουν ότι UA μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη παράγοντα για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου του ανθρώπου.

UA ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση και επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου με ταυτόχρονη ρύθμιση της ΜΜΡ9 /Cdh1, Akt /ERK, COX-2 /PGE2, p300 /ΝΡ-κΒ /CREB2, και κυτόχρωμα c /μονοπάτια σηματοδότησης κασπάσης-εξαρτώμενη.

η

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια and Chemicals

Ανθρώπινο κόλον καρκινικές κυτταρικές γραμμές (SW480, LoVo) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 μέσα συμπληρωμένα με 10% ορό εμβρύου μόσχου απενεργοποιημένο με θέρμανση, 100 μg /ml πενικιλλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και διατηρήθηκαν μέσα σε έναν επωαστήρα με υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2 στους 37 ° C . Σε όλα τα πειράματα, τα κύτταρα με 60% συρροή δοκιμάστηκαν. Ουρσολικό οξύ (UA), σελεκοξίμπη και ροσκοβιτίνη αγοράστηκαν από (Sigma (St. Louis, ΜΟ). Ένα διάλυμα 100 mM του φαρμάκου παρασκευάστηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), αποθηκεύονται ως μικρές ποσότητες στους -20 ° C και στη συνέχεια αραιώνεται ως απαιτούνται σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας.

βιωσιμότητας κυττάρων δοκιμασία

η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ (Roche Διάγνωση, Indianapolis, ΙΝ). Συνοπτικά, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων (3000 κύτταρα /φρεάτιο) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με UA σε διάφορες δόσεις. στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε.

Colonogenic Δοκιμασία

Cells επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων υποβλήθηκαν σε αγωγή με UA. μετά από 24 ώρες , τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επεξεργασία με θρυψίνη. στη συνέχεια, τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 100 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων, και διασκορπίζεται ομοιόμορφα με ελαφρώς ανακίνηση τα πιάτα και επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO2 για 21 ημέρες. Το μέσο ήταν