Αφηρημένο

ιδρυτική ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt οδηγεί στο σχηματισμό αδενώματος, ένα υποχρεωτικό βήμα για τον καρκίνο του εντέρου. Εν όψει της καθιερωμένης ρόλο της Wnt στη ρύθμιση βλαστική ικανότητα, επιχειρήσαμε την απομόνωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ) από το

Αρο

– και

Αρο

/

KRAS

μεταλλαγμένου εντερική όγκων. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η ΚΕΠ είναι παρόντες στο

Αρο

/

KRAS

όγκων, φαίνεται να είναι πολύ σπάνιες ( Είναι καρκινικά κύτταρα με τις ιδιότητες των βλαστικών όπως ήδη παρόντες στις αρχές, καλοήθεις αλλοιώσεις όπως αδενώματα; Εδώ, πήραμε πλεονέκτημα του

Αρο

1638N /+ και

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G μοντέλα ποντικών για εντερική ογκογένεση να εντοπιστούν μελλοντικά υποπληθυσμών των καρκινικών βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν και να χαρακτηρίσει τους σε σχέση με πολυδυναμικότητα τους, αυτο-ανανέωση, προφίλ έκφρασης του γονιδιώματος-ευρεία, και η δραστηριότητα σηματοδότησης /β-κατενίνης Wnt.

Αποτελέσματα

όγκου-έναρξη κύτταρα είναι παρόντα στο

Αρο

1638N /+ /KRAS

V12G

, αλλά είναι πολύ σπάνια σε

Αρο

1638N /+

Εντερική Όγκοι

το

Αρο

μοντέλο 1638N /+ ποντίκι αναπτύσσεται κατά μέσο όρο 4-5 καλοήθεις όγκους άνω GI (αδενώματα) στην C57Bl /6J γενετικό υπόβαθρο [10], [11]. Αυτές οι βλάβες μόνο σπάνια (και με όψιμη έναρξη) να εξελιχθεί σε αδενοκαρκινώματα, όπως φαίνεται και από την έλλειψη αυθόρμητης σωματικές μεταλλάξεις που συμβαίνουν στο

Kras

και

TP53

γονίδια [12]. Για να εκτιμηθεί η παρουσία των καρκινικών κυττάρων, την κίνηση στα αδενώματα

Αρο

1638N /+, δηλαδή κύτταρα ικανά να ανακεφαλαιώνει την κύρια βλάβη όταν μεταμοσχεύονται σε ένα ζώο δέκτη, εντερική όγκοι συλλέχθηκαν από

Αρο

1638N /+ ζώα και διαχωρίστηκαν μηχανικά και ενζυμικά σε εναιωρήματα μονών κυττάρων και εξαντλημένα από ενδοθηλιακά και αιμοποιητικά κύτταρα (Lin

+) με ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων (FACS). Στη συνέχεια, οι διαφορετικές πολλαπλότητες του προκύπτοντος Lin

– πληθυσμός χύδην κύτταρα όγκου μεταμοσχεύτηκαν υποδορίως σε NOD-SCID ζώα. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, δεν ανάπτυξη του όγκου παρατηρήθηκε ακόμη και κατά την ένεση του όσο 0.5-1.0 * 10

6 Lin

-. Κύτταρα και 6 μήνες μετά τη μεταμόσχευση

Η

Στη συνέχεια, επαναλάβαμε τη δοκιμασία μεταμόσχευση με χύμα Lin

– τα καρκινικά κύτταρα από το

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G εντερική όγκους. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η πλειοψηφία των εντερικών όγκων που βρέθηκαν σε αυτές ένωση ζώα της ίδιας αμιγές C57B6 /J γενετικό υπόβαθρο είναι τοπικά επεμβατικές αδενοκαρκινώματα [14]. Σε έντονη αντίθεση με τον Lin

– κυττάρων από

Αρο

/+ αδενώματα 1638N, η ανάπτυξη του όγκου παρατηρήθηκε σε 23 από τις 33 ενέσεις με 10

5

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G Lin

– κύτταρα και, αν και σε μικρότερη συχνότητα (3 από 48 μεταμοσχεύσεις), ακόμη και με τόσο χαμηλά όσο 1500 κύτταρα (Πίνακας 1). Περιορίζοντας την ανάλυση αραίωσης (L-Calc ™) τη συχνότητα των καρκινικών κυττάρων, την έναρξη της Λιν

– πληθυσμός από

Αρο

1638N /+ /

KRAS

εντερικών όγκων V12G εκτιμήθηκε ως 1 στα 72.838 (95% CI των 109.467 έως 48.465). Όσο για το

Αρο

1638N /+ αδενώματα, τα καρκινικά κύτταρα-κίνηση είναι πιθανό να είναι παρόντες, αν όχι καθόλου, σε σημαντικά χαμηλότερες συχνότητες (& lt? 10

-6). Ως εκ τούτου, η παρουσία των καρκινικών κυττάρων, την κίνηση, όπως ορίζεται από δοκιμασίες μεταμόσχευση, φαίνεται να περιορίζεται στους όγκους από το

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G ποντίκια σε σύγκριση με εκείνες από το

Αρο

μοντέλο 1638N /+ ποντίκι.

Ο Lin-CD24

hiCD29

+ υποπληθυσμός από

Αρο

1638N /+ /KRAS

V12G

Εντερική όγκοι περιλαμβάνουν όγκου-έναρξη και την αυτο-ανανέωση ΚΕΠ

για να προοπτικά εμπλουτίσει και τελικά να απομονωθούν τα καρκινικά κύτταρα-κίνηση από τον κύριο όγκο Lin

– πληθυσμός

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G όγκους, δοκιμάσαμε για πρώτη φορά μια ομάδα που είχε καθοριστεί προηγουμένως (καρκίνος) βλαστικών κυττάρων δείκτες συμπεριλαμβανομένων των CD24, CD29 (β1 ιντεγκρίνης), CD44, CD97, και L1CAM από FACSorting και μεταφύτευση σε NOD-SCID ποντίκια. Σε αντίθεση με τα CD44, L1CAM, και CD97 (Πίνακας S1), η μεταμόσχευση του Λιν

-CD24

+ CD29

+ κύτταρα αποκάλυψε μια μικρή αλλά σημαντική εμπλουτισμό σε καρκινικά κύτταρα-κίνηση (εκτιμώμενη συχνότητα 1 στα 56.463 , με CI των 399.211-7986) (Πίνακας 2). Δεδομένου ότι η Λιν

-CD24

+ CD29

+ πληθυσμού αντιπροσωπεύει ένα σχετικά μεγάλο ποσοστό των χύμα κυττάρων (-80%? Τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), που στη συνέχεια ορίζεται περαιτέρω τρεις επιπλέον πύλες FACS με βάση τη σχετική έκφραση του αντιγόνου επιφανείας CD24 κυττάρων (CD24

hi, CD24

med, και CD24

χαμηλή) (Σχήμα 1α). Από 30 πρωτοβάθμια

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G όγκων αναλύθηκαν με FACS, το μέσο μέγεθος (που εκφράζεται σε ποσοστό του χύμα Λιν

– κλάσμα ) κάθε CD24 /CD29 ταξινομημένο υποπληθυσμό προσδιορίστηκε: CD24

-CD29

-, 3,4% (SD 2.6)? CD24

-CD29

+, 7,8% (SD 4,7)? CD24

+ CD29

-, 4,4% (SD 3.4)? CD24

loCD29

+ (P1), 7,9% (SD 2,5)? CD24

medCD29

+ (Ρ2), 52,9% (SD 7,4)? CD24

hiCD29

+ (P3), 10,0% (SD 4.7). Παρακαλείστε να σημειώσετε ότι τα ποσοστά αυτά δεν προσθέτουν στο 100%, απλώς λόγω της σκόπιμης αποκλεισμό των κυττάρων που βρίσκονται στους διαχωρισμούς μεταξύ των πυλών διαλογής (βλέπε Εικόνα 1α).

α. Μεγάλες πίνακα: dot οικόπεδο αντιπροσωπευτική του ρυθμού χρώσης λήφθηκε με χρώση με αντι-CD24 ΑΡΟ-συζευγμένο αντι-CD29 ΡΕ-συζευγμένα αντισώματα. Lineage θετικά κύτταρα (Lin

+) αποκλείστηκαν (οριοθετημένα έξω) με χρώση με βιοτινυλιωμένα αντισώματα έναντι δείκτες γενεαλογίας και Στρεπταβιδίνη-PerCPCy5.5. P1 (Lin

-CD24

lowCD29

+), P2 (Lin

-CD24

medCD29

+), και P3 (Lin

-CD24

hiCD29

+) οι πληθυσμοί που αναφέρονται στο οικόπεδο. Μικρά φύλλα: dot οικόπεδα εκπρόσωπος των κυττάρων χρωματίζονται με ισοτυπικό αντισώματα ελέγχου (αριστερά), χειριστήριο αντιστάθμισης χρωματίστηκαν μόνο με αντισώματα αντι-CD24 APC (μέση), χειριστήριο αντιστάθμισης χρωματίστηκαν μόνο με αντισώματα αντι CD29-ΡΕ (δεξιά). σι. FACS ανάλυση του προτύπου CD24 /CD29 των όγκων που λαμβάνονται με αύξοντα μεταμόσχευση Ρ3 κύτταρα αναστολές από

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G εντερική όγκους. Αριστερά: πρωτογενή μεταμόσχευση. Δεξιά: δευτεροβάθμια μεταμόσχευση. ντο. Ανάλυση ανοσοϊστοχημείας των όγκων που λαμβάνονται από 3 γύρους σειριακό μεταμόσχευση των κυττάρων P3 αναστολές από

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G εντερική όγκους.

Η

Η συχνότητα των ογκογενή κύτταρα εντός του Ρ1, Ρ2 και Ρ3 υποπληθυσμών προσδιορίστηκε με μεταμόσχευση 1500 κύτταρα καθένα σε NOD-SCID ποντικούς. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ενώ σε αυτή την πολλαπλότητα CD24

medCD29

+ και CD24

loCD29

+ κύτταρα επανειλημμένα αποτύχει να σχηματίσουν όγκους (1 μόνο αύξηση από 56 μεταμοσχεύσεις), η Λιν

-CD24

hiCD29

+ υποπληθυσμό βρέθηκε να περικλείει ένα σημαντικό εμπλουτισμό σε ογκογόνα κύτταρα (13/28? Πίνακας 2). Ως εκ τούτου, αν και σε αυτή την περίπτωση δεν θα μπορούσαμε να εκτελέσει ανάλυση περιοριστικής αραίωσης από την L-Calc ™ (από σταθερό πολλαπλότητα των κυττάρων που χρησιμοποιούνται) η Λιν

-CD24

hiCD29

+ υποπληθυσμό όγκου φαίνεται να χαρακτηρίζεται από μια σημαντική σε σχέση εμπλουτισμό περίπου. 20-25 φορές σε σύγκριση με το συνολικό Lin

– χύμα κύτταρα (1 CSC από -3000 καρκινικών κυττάρων έναντι 1 στις 72.838)

Ο ορισμός του καρκίνου βλαστικών κυττάρων δεν μπορεί να βασίζεται αποκλειστικά στην ικανότητά τους. να σχηματίζουν όγκους όταν μεταμοσχεύονται σε χαμηλή πολλαπλότητα σε ανοσο-ανίκανους ποντικούς. Εξίσου σημαντικά χαρακτηριστικά των ΚΕΠ είναι μοναδική ικανότητά τους να αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση σε καύσιμα και ανακεφαλαιώσω την ετερογενή σύνθεση του πρωτογενούς όγκου που προέρχονται από. Προκειμένου να καθοριστεί αν τα καρκινικά κύτταρα-κίνηση που περιλαμβάνονται στην Lin

-CD24

hiCD29

+ πληθυσμού είναι επίσης σε θέση να αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης, πραγματοποιήσαμε σειριακό πειράματα μεταμοσχεύσεις. Κατ ‘αρχάς, 1500 Lin

-CD24

hiCD29

+ κύτταρα απομονώθηκαν από το

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G πρωτογενείς όγκους και εντερική μεταμοσχεύθηκαν σε ποντικούς δέκτες NOD-SCID. Όπως αναμενόταν από προηγούμενα αποτελέσματα μας, αυτή η αρχική δοκιμασία προκάλεσε υποδόριων όγκων μέσα σε 8 έως 10 εβδομάδες. Οι όγκοι που προκύπτουν στη συνέχεια αποκόπηκαν από τις NOD-SCID ζώα παραλήπτη και χρησιμοποιούνται για τις δύο FACS και ιστολογική ανάλυση. Όσο για FACS, οι όγκοι διαχωρίστηκαν σε εναιωρήματα απλού κυττάρου και αναλύθηκαν, ταξινομημένα και μεταμοσχεύονται ανάλογα με τα επίπεδα CD24 και CD29 έκφραση τους. Δευτερογενείς όγκους που προέρχονται από Lin

-CD24

hiCD29

+ κύτταρα ανακεφαλαίωνε πλήρως τον /CD29 FACS προφίλ έκφρασης CD24 των πρωτογενών βλαβών (Εικόνα 1β και σχήμα S2). Ομοίως, κατά την μεταμόσχευση του 1500 κυττάρων από κάθε ένα από τα Lin

-CD24CD29 πληθυσμούς που λαμβάνονται από τις δευτερογενείς όγκους, μόνο ο Lin

-CD24

hiCD29

+ κύτταρα ήταν ικανά να σχηματίζουν τριτοταγή όγκων. Κατά συνέπεια, το προφίλ FACS των τριτοταγών όγκων ανακεφαλαιώνει εκείνη των πρωτογενών βλαβών (Σχήμα 1β). Αξιοσημείωτα, ανοσοϊστοχημεία (IHC) και χρώση ενζυματική αποκάλυψε μια προοδευτική αύξηση στην σχετική παρουσία των εντερικών καταγωγές διαφοροποίησης, δηλαδή Goblet (Περιοδική Acid Schiff? PAS), Paneth (λυσοζύμη) και εντερο-ενδοκρινικές (συναπτοφυσίνη) κύτταρα στα μεταμοσχευμένα εντερικό όγκους σε σύγκριση με την πρωτογενή

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G βλάβες (Σχήμα 1γ). Ωστόσο, η ανάλυση FACS των σειριακά μεταμοσχευμένων όγκων έδειξε ότι το σχετικό μέγεθος των επιμέρους CD24 υποπληθυσμών /CD29 δεν μεταβλήθηκε σημαντικά (Σχήμα S3).

Έτσι, η Λιν

-CD24

hiCD29

+ υποπληθυσμό των νεοπλασματικών κυττάρων από το

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G αδενοκαρκινώματα περιλαμβάνουν

καλόπιστους

ΚΕΠ με ογκογενή, αυτο -ανανεωτική και τις δυνατότητες διαφοροποίησης.

Lin-CD24

hiCD29

+ κύτταρα από

Αρο

1638N /+ /KRAS

V12G

Εντερική Όγκοι Εμφάνιση αυξημένη ενδοκυτταρική β κατενίνης συσσώρευση

Σας προτείνονται στο παρελθόν ότι η μειοψηφία των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου που χαρακτηρίζει τη συσσώρευση πυρηνικών β-κατενίνης και μη-τυχαία κατανεμημένες κατά μήκος της επεμβατικής μπροστά, αντιπροσωπεύουν ΚΕΠ [7]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τόσο

Αρο

1638N /+ αδενωμάτων και

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G καρκινώματα μοιράζονται την ίδια «β- κατενίνης παράδοξο »που παρατηρείται σε ανθρώπινους καρκίνους του παχέος εντέρου από το γεγονός ότι, κατά την ανάλυση IHC, μόνο μια μειοψηφία των καρκινικών κυττάρων δείχνουν συσσώρευση πυρηνικών β-κατενίνης παρά το γεγονός ότι η πλειοψηφία, αν όχι όλα, μοιράζονται τα δύο χτυπήματα στο

Αρο

locus [12], [14] (Σχήμα 2α). Για να εκτιμηθεί κατά πόσον τα ΚΕΠ εμπλουτισμένο στο Lin

-CD24

hiCD29

υποπληθυσμό καρκινικών χαρακτηρίζονται από ένα αυξημένο επίπεδο της ενδοκυτταρικής β-κατενίνης +, αναλύσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης στα διάφορα Κυτταροεπιλεγμένα υποπληθυσμών των κυττάρων του όγκου με δύο ανεξάρτητους προσδιορισμούς, δηλαδή ανοσο-χρώση και ανάλυση στυπώματος western. Ανοσο-χρώση έδειξαν ότι η πλειοψηφία των Λιν

-CD24

hiCD29

+ τα εντερικά κύτταρα του όγκου που χαρακτηρίζεται από ενδοκυτταρική συσσώρευση της β-κατενίνης σε σύγκριση με άλλες ταξινομημένα πληθυσμούς και το μεγαλύτερο μέρος (Lin

-) καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 2β). Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε επίσης σε μια πιο ποσοτικό τρόπο με ανάλυση Western πραγματοποιήθηκε με αντισώματα ειδικά για την σηματοδότηση-αρμόδια κλάσμα (δηλ αποφωσφορυλιωμένο στα κατάλοιπα Ser37 και Thr41) της πρωτεΐνης β-κατενίνης (Σχήμα 2c και το σχήμα S4).

ανοσοϊστοχημεία (α., β.) και κηλίδα western (γ.) ανάλυση της β-κατενίνης στην πρωτοβάθμια

Αρο

/+ εντερική αδενώματα (α.) και σε πληθυσμούς όγκου Κυτταροεπιλεγμένα 1638N από

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G εντερική όγκων (β. και γ.). Οι μπάρες στο c. αντιπροσωπεύει την ποσοτικοποίηση των ζωνών που ελήφθησαν με ένα αντι-δραστική β-κατενίνης Ab (αντι-ABC? κλώνος 8E7, # 05-665, Millipore) με σάρωση και ανάλυση της κηλίδος western με το σαρωτή Οδύσσεια και μετά την κανονικοποίηση με β-ακτίνη.

η

Σε γενικές γραμμές, τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν ότι η Λιν

-CD24

hiCD29

+ υποπληθυσμός από

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G όγκους, εδώ φαίνεται να εμπλουτιστεί σε ΚΕΠ, περιλαμβάνει ένα σημαντικά υψηλότερο επίπεδο της ενδοκυτταρικής και σηματοδότησης-αρμόδιες β-κατενίνης σε σύγκριση με χύμα Lin

– και άλλων υποπληθυσμών των καρκινικών κυττάρων. Η αυξημένη δραστηριότητα σηματοδότησης Wnt στα ΚΕΠ επιβεβαιώθηκε αργότερα από προφίλ έκφρασης και ανάλυση Taqman qPCR της Wnt γονίδια κατάντη στόχου (π.χ.

Lgr5

,

Axin2

,

T

, και

Ι.ΕΡ1

? βλ. κατωτέρω)

Η Εκδήλωση Υπογραφή του ΚΕΠ από

Αρο

1638N /+ /KRA

SV12G

Εντερική Όγκοι είναι διαφορετική από εκείνη της διαφοροποιημένη και Μαζική όγκου κύτταρα και περιλαμβάνει τόσο αρχέγονα και Paneth Μαρκαδόροι κυττάρων

Για την αναγνώριση μοριακές διαφορές μεταξύ στελέχους-όπως και πιο διαφοροποιημένη (χύμα) τα καρκινικά κύτταρα από το

Αρο

1638N /+ και

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G εντερική όγκους, απομονώσαμε το ολικό RNA από 10

4 Lin

-CD24

hiCD29

+ (P3), Lin

-CD24

medCD29

+ /Lin

-CD24

loCD29

+ (P1 + P2, νέα πύλη) και Lin

– ( χύμα) καρκινικά κύτταρα από 5 ατομικά ποντίκια της κάθε γονότυπο (

Αρο

1638N /+ και

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G). Σύνολο RNA δείγματα στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για να υβριδοποιηθεί μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων (Affymetrix Mouse Genome 430Α 2,0 Array) σύμφωνα με συμβατικά πρωτόκολλα.

Πρώτον, οι διάφοροι πληθυσμοί των καρκινικών κυττάρων που απομονώθηκαν από ποντικούς με διάφορους γονότυπους (

Αρο

1638N /+ και

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G) συγκρίθηκαν με ANOVA (3 τρόποι) με ένα (ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη) σετ FDR στο 0,05 για να επιλέξετε για γονιδίων με διαφορική έκφραση ≥2 φορές. Συγκεκριμένα, το Ρ3 (ΚΕΠ και από τις δύο γονότυπους) έναντι Lin

– (χύμα? Δύο γονότυποι) και P3 έναντι Ρ1 + Ρ2 συγκρίσεις ως αποτέλεσμα σημαντικές διαφορές και στον ορισμό των δύο καταλόγων διαφορικά εκφρασμένων σετ ανιχνευτή (n = 1062 [851 μη-περιττές, σχολιασμένο γονίδια] και 746 [602 μη-περιττές, σχολιασμένη γονίδια], αντίστοιχα? πίνακες S3 και S4). Με τον τρόπο αυτό, εντοπίσαμε μια λίστα 587 διαφορικά εκφρασμένων σύνολα ανιχνευτή από την τομή της Lin- εναντίον Ρ3 και Ρ1 + Ρ2 εναντίον P3. Οι εντοπίστηκαν σύνολα ανιχνευτή αντιστοιχούν σε 482 γονίδια (μη περιττή) (Πίνακας S5).

Τα προφίλ έκφρασης που λαμβάνονται από τις CSC εμπλουτισμένο υποπληθυσμών (Lin

-CD24

hiCD29

+) και των δύο γονότυπων (

Αρο

1638N /+ και

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G) διαφέρουν από εκείνες των πιο διαφοροποιημένη (Lin

-CD24

medCD29

+ /CD24

loCD29

+) και του Λιν

– χύμα υποπληθυσμών όπως σαφώς ορατή στην ιεραρχική ομαδοποίηση (HCA) και κύριο συστατικό ( PCA) ανάλυση (Σχήμα 3).

(α). Ιεραρχική ομαδοποίηση και (β.) Principal Components Analysis (PCA) (και οι δύο εφαρμόζονται σε Partek) του Lin

-CD24

hiCD29

+ (P3), Lin

-CD24

medCD29

+ /Lin

-CD24

loCD29

+ (P1 + P2, νέα πύλη) και Lin

– ( χύμα) καρκινικά κύτταρα από 5 ατομικά ποντίκια της κάθε γονότυπο (

Αρο

1638N /+ και

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G). Για καλύτερη απεικόνιση μεμονωμένα χρώματα χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ομάδα και b. ελλειψοειδή συντάχθηκαν γύρω από τους τρεις πληθυσμούς του όγκου

Η

Αξίζει να σημειωθεί ότι, η

Αρο

-. και

Αρο

/

KRAS

μεταλλαγμένου γονότυπους δεν είναι επιλυθεί από HCA και PCA, πιθανόν να οφείλεται στο σχετικά περιορισμένο αριθμό

Αρο

1638N /+ και

Αρο

1638N /+ /

KRAS

δείγματα V12G όγκου (n = 5 για κάθε ομάδα) που χρησιμοποιούνται για τη συγκριτική έκφραση προφίλ ανάλυσης, ανεπαρκείς για την ανάδειξη των δήθεν πιο λεπτές διαφορές μεταξύ καλοήθων και κακοήθων ΚΕΠ.

Στη συνέχεια, από τις παραπάνω λίστες των διαφορικά εκφρασμένων ανιχνευτές μεταξύ Ρ3 και άλλων πληθυσμών κυττάρου όγκου που επικύρωσε την έκφραση του συνολικά 35 γονίδια με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (Πίνακας S2). Η επιλογή των επικυρωμένων γονιδίων περιλαμβάνει, εκτός από την κορυφή πάνω και κάτω ρυθμιζόμενα γονίδια, επίσης πρόσθετα μέλη της κανονικής Wnt μονοπάτι μεταγωγής σήματος, και τα γονίδια είναι γνωστό ότι παίζουν ρόλους σχετικές στον καρκίνο. Συνολικά, η συντριπτική πλειοψηφία των επιλεγμένων γονιδίων (33/35) επικυρώθηκαν για διαφορική έκφραση τους με qPCR (Σχήμα S1).

ανάλυση Gene οντολογία [20] της υπογραφής τομής αποκάλυψε μια μάλλον ευρύ φάσμα κυτταρικών λειτουργίες, τις δομές και τις διαδικασίες μεταξύ των up-ρυθμιζόμενα γονίδια συμπεριλαμβανομένων εξωκυττάριας μήτρας, της κυτταρικής προσκόλλησης, ανάπτυξη οργάνων και μορφογένεση (Πίνακας S6). Ειδικότερα, η ανάλυση των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά στο CD24

hiCD29

+ κυττάρων από

Αρο

1638N /+ και

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G όγκους σε σύγκριση με χύμα και πιο διαφοροποιημένα κύτταρα του όγκου, αποκάλυψε αρκετές βιολογικές διαδικασίες που ενδέχεται να παίξουν λειτουργικούς ρόλους σε βλαστική ικανότητα καρκίνο. Πρώτον, όπως φαίνεται και από την ενδοκυτταρική συσσώρευση του δραστικού β-κατενίνης, αρκετοί στόχοι και τα μέλη του καταρράκτη σηματοδότησης Wnt εκφράζονται διαφορικά στην υπογραφή Ρ3 συμπεριλαμβανομένης

Lgr5

,

ΜΜΡ2

και

ΜΜΡ7

,

Dkk2

,

Pla2g2a

,

Prox1

,

Sox17

,

T

(brachyury),

Wif1

, και

Fzd5

. Η παρουσία του

Lgr5

μεταξύ των απορυθμίζεται γονίδια έχει ενδιαφέρον, καθώς δείχνει ότι αυτό το γνωστό δείκτη των φυσιολογικών ποδηλασίας βλαστικών κυττάρων στο έντερο ποντικού [21] μπορεί επίσης να αντιπροσωπεύουν ένα χρήσιμο δείκτη CSC στο εντερικό όγκους ποντικών ως απέδειξε πρόσφατα με την καταγωγή εντοπισμό [22]. Επίσης, ο παράγοντας μεταγραφής

Prox1

, άμεση και εξαρτώμενη από τη δόση-στόχο του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης, ρυθμίζεται αυξητικά στον πληθυσμό Ρ3.

Prox1

προηγουμένως δειχθεί ότι προάγει δυσπλασία σε κολονική αδενώματα και του παχέος εξέλιξης του καρκίνου [23]. Ωστόσο, θα μπορούσαμε να βρούμε σημαντικές διαφορές μεταξύ των

Prox1

επίπεδα έκφρασης μεταξύ

Αρο

1638N /+ και

Αρο

1638N /+ /

κύτταρα KRAS

V12G όγκου τόσο στα αρχικά δεδομένα μικροσυστοιχιών και κατόπιν qPCR επικύρωση (Σχήμα S1). Η παρατήρηση αυτή αντανακλά μια γενικότερη έλλειψη σημαντικές διαφορές μεταξύ των πληθυσμών P3 του

Αρο

1638N /+ και

Αρο

1638N /+ /

KRAS

όγκων V12G, όπως φαίνεται και από ιεραρχική ομαδοποίηση και ανάλυση PCA (Σχήμα 3α και β, αντίστοιχα). Σε προηγούμενη μελέτη μας [14], προφίλ έκφρασης των χύδην όγκων από το

Αρο

1638N /+ και

Αρο

1638N /+ /

KRAS

ποντίκια V12G επίσης δεν έλυσαν τα δύο γονότυπους. Στην πραγματικότητα, μόνο ο σχετικός αριθμός των καρκινικών κυττάρων με πυρηνική β-κατενίνης θα μπορούσε σημαντικά διάκριση μεταξύ των

Αρο

1638N /+ από

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G εντερική όγκων [14].

Εκτός από Wnt, οι πρόσθετες μονοπάτια σηματοδότησης που αντιπροσωπεύεται από τα διαφορικά ρυθμιζόμενα γονίδια, όπως φαίνεται από τη διαφορική έκφραση του

BMP7

και

Bmper

(BMP σηματοδότησης),

Fgfbp1

,

Fgfrl1

, και

Etv5

(υποδοχείς του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών, των πρωτεϊνών και των παραγόντων μεταγραφής δεσμευτική), και

IGF1

,

IGFBP1

,

ΙΟΡΒΡ5

, και

Igfbp7

(ινσουλίνη-όπως αυξητικοί παράγοντες και δεσμευτικές πρωτεΐνες).

Σε γενικές γραμμές, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα ΚΕΠ από

Αρο

– και

Αρο

/

KRAS

μεταλλαγμένου όγκοι έχουν διακριτά προφίλ έκφρασης από άλλους πληθυσμούς καρκινικών κυττάρων και χαρακτηρίζονται από αυξημένη δραστηριότητα σηματοδότησης Wnt , σε συμφωνία με ενισχυμένη επίπεδα της ενδοκυτταρικής β-κατενίνης, μαζί με άλλα pathays σηματοδότησης (BMP, IGF), και από την έκφραση του κυττάρου-ειδικών γονιδίων Paneth.

Συζήτηση

Οι μεταλλάξεις στο η

APC

ογκοκατασταλτικό γονίδιο αντιπροσωπεύουν την κύρια κίνησης και εκδήλωση περιορισμού του ρυθμού στην αλληλουχία αδένωμα-καρκίνωμα που οδηγεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου στον άνθρωπο [1]. Απώλεια

APC

λειτουργία οδηγεί στην συστατική ενεργοποίηση της κανονικής οδού σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης είναι γνωστό ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης σε ένα ευρύ φάσμα των βλαστοκυττάρων κόγχες ιστοειδική συμπεριλαμβανομένης της εντερικής κρύπτης και, κατά συνέπεια, στην έναρξη των πολλών τύπων καρκίνου [24]. Συστατική ενεργοποίηση σηματοδότησης Wnt στο εντερικό επιθήλιο ενεργοποιεί τον σχηματισμό αδενώματος και αντιπροσωπεύει ένα αναγκαίο, αν και ανεπαρκής, το βήμα για τον κακοήθη μετασχηματισμό. Σωματικές μεταλλάξεις στο

KRAS

,

BRAF

,

TP53

, και

Smad4

συνήθως αποτελούν τη βάση της περαιτέρω εξέλιξης της καλοήθους όγκου σε τοπικά διηθητικό αδενοκαρκίνωμα και μετάσταση σε θέσεις μακριά όργανο [1]. Μεταλλάξεις στο ενδογενές ποντίκι

Αρο

γονίδιο οδηγήσει επίσης στο σχηματισμό του εντέρου πολύποδα, αν και βρίσκονται κυρίως στην ανώτερη γαστρεντερική οδό. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το ποντίκι

Αρο

καθοδηγούμενου από εντερική αδενώματα δεν αυθόρμητα συσσωρεύονται

Kras

ή

TP53

σωματικές μεταλλάξεις και, ως εκ τούτου, πολύ σπάνια να εξελιχθεί σε αδενοκαρκινώματα [12].

στο εργαστήριό μας, έχουμε δημιουργήσει το

Αρο

1638N /+ μοντέλο κωδικοποίηση του ποντικιού για ένα υποπλασμένα

Αρο

μετάλλαξη με αποτέλεσμα σε λίγα (5-6) άνω αδενώματα GI , μεγαλύτερης διάρκειας επιβίωση, και αυξημένη πιθανότητα αυθόρμητης κακοήθη μετασχηματισμό αν και μόνο σε ζώα μεγαλύτερα του 1 έτους [10], [11], [12]. Σε αντίθεση, η ένωση ετερόζυγη

Αρο

1638N /+ /

KRAS

Τα ποντίκια V12G χαρακτηρίζεται από αυξημένη πολλαπλότητα των όγκων (περίπου 10 φορές) και να επιταχυνθούν κακοήθη εξέλιξη με την πλειοψηφία των αλλοιώσεις είναι τοπικά επεμβατικές αδενοκαρκινώματα [14]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ογκογόνο ενεργοποίηση του

KRAS

/

Kras

από μόνη της δεν επαρκεί για την κίνηση του εντέρου ογκογένεση [25], αν όχι με όψιμη έναρξη και μετά σωματικά αδρανοποίηση του

TP53

γονίδιο [13]. Ως εκ τούτου, οι δραματικές φαινοτυπικές διαφορές που επέφερε ογκογόνο ενεργοποίηση των

KRAS

γονιδίου σε σύνθετες

Αρο

1638N + /

KRAS

V12G αποτελέσματα /ποντίκια από την συνεργιστική δράση της στην προώθηση κανονική σηματοδότηση Wnt, όπως φαίνεται από την αύξηση της δραστηριότητας δημοσιογράφος TOP-λάμψης και του αριθμού των καρκινικών κυττάρων που προορίζονται από τη συσσώρευση των πυρηνικών β-κατενίνης [14].

η παρατηρούμενη σχετική αύξηση του ο αριθμός των

Αρο

1638N /+ /

KRAS

καρκινικά κύτταρα V12G διατεθεί από την πυρηνική β-κατενίνης είναι σημαντική ενόψει της λεγόμενης «β-κατενίνης παράδοξο «[7]: παρά το γεγονός ότι η απώλεια του

APC

λειτουργία είναι κοινή σε όλα τα κύτταρα του όγκου και αναμένεται να έχει ως αποτέλεσμα την ενδοκυτταρική και πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης, αυτό παρατηρείται μόνο σε μια μειονότητα καρκινικά κύτταρα που υποβάλλονται σε μια επιθηλιακή-προς-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) και μη-τυχαία κατανεμημένες στο μεταναστευτικό μέτωπο της μάζας του όγκου [4], [5] (βλέπε επίσης το Σχ. 2α). Η παρατήρηση αυτή οδήγησε στην υπόθεση σύμφωνα με την οποία αφιερώνει πυρηνικής β-κατενίνης stem-σαν εντερικά κύτταρα όγκου με υψηλότερες Wnt δραστικότητα σηματοδότησης ικανό αποσπώντας από τον πρωτογενή μάζα και αποτελεσματικά τη διάδοση και σπίτι στο άπω, ζωτικά όργανα [6], [19], [26].

Εδώ, προσπαθήσαμε το μελλοντικό καθαρισμό καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) από το

Αρο

1638N /+ /

KRAS

V12G εντερική όγκων. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η παρουσία των καρκινικών κυττάρων, την κίνηση, δεν θα μπορούσε να αποδειχθεί σε όγκους

Αρο

1638N /+. Σύμφωνα με τον λειτουργικό ορισμό CSC, δηλαδή την ικανότητά τους να σχηματίζουν όγκους μετά από τον περιορισμό μεταμόσχευση αραίωση σε ποντικούς-δέκτες,

καλόπιστους

ΚΕΠ είτε απουσιάζουν είτε είναι εξαιρετικά σπάνια (& gt? 10

-6) στον εντερικό βλάβες χαρακτηριστικό των ποντικών

Αρο

1638N /+.

α. σι.