Αφηρημένο

Ιστορικό

ο καρκίνος του δέρματος είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο. Η επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) και η απόκτηση καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) -όπως ιδιότητες αναδειχθεί ως κρίσιμης σημασίας βήματα για την μετάσταση των ανθρώπινων καρκίνων του δέρματος. Καφεϊκό οξύ (CAA) ασκεί αντικαρκινική δράση. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της ΥΠΑ για το μεταναστευτικό ικανότητα και στα ΚΕΠ-όπως ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων του δέρματος, και οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν αυτό δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

Μέθοδοι

Κακοήθη HaCaT κύτταρα αντιμετωπίζονται από ΥΠΑ. δοκιμασία φρεατίων πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί ότι η ΥΠΑ εξασθενεί τη μεταναστευτική ικανότητα? δοκιμασία σχηματισμού σφαιροειδές διεξήχθη για να επιβεβαιώσει ότι η ΥΠΑ μείωσε το ΚΕΠ που μοιάζει με φαινότυπο? Επεξεργασμένα κακοήθη κύτταρα HaCaT μοριακώς χαρακτηρίζονται από RT-PCR, κηλίδες Western, στύπωμα Νοτιοδυτική, και ανοσοκαταβύθιση.

Αποτελέσματα

CAA αγωγή κακοήθων ανθρώπινων κερατινοκυττάρων (HaCaT κακοήθη κύτταρα), η αναστολή της παρατηρήθηκαν μεταναστευτικά ικανότητα και ΚΕΠ φαινότυπο. CAA up-ρύθμιση της φωσφορυλίωσης της p38, και κάτω-ρυθμιζόμενες την ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα κΒ (NF-κΒ) /σαλιγκάρι οδό σήματος. Πράγματι, ρ38 μείωσε την δραστικότητα δέσμευσης DNA του ΝΡ-κΒ στον προαγωγέα του

σαλιγκάρι

γονίδιο, το οποίο είχε ως αποτέλεσμα την μεταγραφική αδρανοποίηση των

σαλιγκάρι

. Απόφραξη της p38 εξασθενημένο της ΥΠΑ που προκαλείται από την αναστολή των μεταναστευτικών ικανότητα και ΚΕΠ, όπως φαινότυπο σε κακοήθη κύτταρα HaCaT.

Συμπεράσματα

ΥΠΑ εξασθενεί τα μεταναστευτικά ικανότητα και ΚΕΠ-όπως ιδιότητες των κακοήθων ανθρώπινων κερατινοκυττάρων, στην οποία, ρ38 κάτω ρύθμιση της οδού σήματος /σαλιγκάρι NF-κΒ εμπλέκεται

Παράθεση:. Yang Υ, Li Υ, Wang Κ, Wang Υ, Γιν W, Li L (2013) ρ38 /NF-κΒ /σαλιγκάρι Διαδρομή εμπλέκεται σε καφεϊκό οξύ-Induced Αναστολή καρκινικά βλαστικά κύτταρα-Like Properties και μεταναστευτικών Χωρητικότητα σε κακοήθη Ανθρωπίνων κερατινοκυττάρων. PLoS ONE 8 (3): e58915. doi: 10.1371 /journal.pone.0058915

Επιμέλεια: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Οκτ 2012? Αποδεκτές: 8η Φεβρουαρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Μαρτίου 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις Φυσικών Επιστημών Ιδρύματα της Κίνας (81072338) και ένα έργο που χρηματοδοτήθηκε από την Προτεραιότητα Ακαδημαϊκό Πρόγραμμα Ανάπτυξης των Jiangsu Ιδρυμάτων Ανώτατης Εκπαίδευσης (2010). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του δέρματος είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Για τις δύο τελευταίες δεκαετίες, η θνησιμότητα του καρκίνου του δέρματος είναι σταθερή, εν μέρει λόγω της μεταστατικής νόσου [3]. Θεραπευτικές επιλογές για τον μεταστατικό καρκίνο του δέρματος συνεχίζουν να εξελίσσονται σε πολλά σύνορα. Δακαρβαζίνη, σήμερα η μόνη αμερικανική Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) ενέκρινε τη χημειοθεραπεία για τη θεραπεία του μεταστατικού ασθένεια, μέχρι σήμερα είχε σαν αποτέλεσμα μικρή ή καθόλου επίδραση στην επιβίωση, ακόμη και όταν αξιολογούνται σε συνδυασμό με θεραπευτικά με διάφορους μηχανισμούς δράσης [4]. Novel χημειοθεραπευτικούς παράγοντες για την θεραπεία των ασθενών με καρκίνο του διαδίδονται κακοήθη δέρματος χρειάζονται επειγόντως.

Φυσικά απαντώμενες παράγωγα υδροξυκινναμωμικού οξέως αναφερθεί ότι έχει αντικαρκινικές, αντιφλεγμονώδεις, αντιοξειδωτικές ιδιότητες και [5], [6]. φυσική τους προέλευση και πανταχού παρούσα εμφάνιση ώθησαν έντονο ενδιαφέρον για τη χρήση τους ως αντικαρκινικών παραγόντων. Caffeic οξύ (3, 4-διϋδροξυκινναμωμικό οξύ, CAA) είναι το κύριο διαιτητικό υδροξυκινναμωμικού οξέως. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η ΥΠΑ ασκεί αντικαρκινικές επιδράσεις [7]? CAA ασκεί προστατευτική δράση έναντι UVB επαγόμενη βλάβες του δέρματος καταστέλλοντας την ενεργοποίηση της ιντερλευκίνης-10 και ενεργοποιείται από μιτογόνο κινασών πρωτεΐνης (MAPKs) σε δέρμα ποντικού [8]? Περαιτέρω, CAA αναστέλλει τη δράση της Fyn κινάσης (ένας μεσολαβητής κλειδί που απαιτείται για την UVB επαγόμενη καρκίνου του δέρματος), η οποία μπορεί να εμπλέκεται στην καταστολή της καρκινογένεσης του δέρματος [9]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της CAA στο μεταστατικό ικανότητα του καρκίνου του δέρματος, και οι μοριακοί μηχανισμοί υποκείμενες σε, δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

Ο επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) είναι μια εξελικτική διαδικασία με την οποία τα επιθηλιακά κύτταρα μετατρέπονται για μεσεγχυματικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, αναδιαμόρφωση των ιστών, και την επούλωση τραυμάτων [10]. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, τα επιθηλιακά κύτταρα αποκτούν ιδιότητες μεσεγχυματικών κυττάρων, και δείχνουν την μειωμένη διακυτταρική προσκόλληση και την αυξημένη εισβολή [11]. Η ενεργοποίηση του προγράμματος ΕΜΤ έχει ενοχοποιηθεί ως ένα σημαντικό βήμα στην μετάσταση πολλών ανθρώπινων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του δέρματος [10], [12].

Μια ιδέα που προτάθηκε πρόσφατα για να εξηγήσουν τα χαρακτηριστικά των νεοπλασματικών ιστών είναι η ύπαρξη της αυτο-ανανέωσης, βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν στους όγκους, οι οποίες έχουν ονομαστεί «καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) [13]. Οι CSCs έχουν ταυτοποιηθεί σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του δέρματος, του μαστού, του ήπατος, των πνευμόνων, και ούτω καθεξής [1], [12], [14], [15]. Μέσα σε έναν όγκο, ΚΕΠ, τα οποία αποτελούν ένα μικρό μέρος των νεοπλασματικών κυττάρων, ορίζονται από την ικανότητά τους να παράγουν νέους όγκους. Για το λόγο αυτό, έχουν επίσης ονομαστεί «καρκινικά κύτταρα έναρξη [13]. Μια σχέση μεταξύ του EMT και ΚΕΠ έχει παρατηρηθεί, ότι κατά τη διάρκεια της διαδικασίας EMT, επιθηλιακά κύτταρα αποκτούν βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με τα χαρακτηριστικά και ότι ΚΕΠ παρουσιάζουν εμφάνιση μεσεγχυματικά-όπως [16]. Αυτή η σύνδεση μεταξύ της διαδικασίας EMT και την επαγωγή της ΚΕΠ μπορεί να εξηγήσει γιατί το πρόγραμμα EMT προκαλεί την έναρξη και την εξέλιξη του όγκου.

Εδώ, βρήκαμε ότι ΥΠΑ εξασθενημένο τα μεταναστευτικά ικανότητα και ΚΕΠ, όπως ακίνητα σε κακοήθη ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (κακοήθη κύτταρα HaCaT). CAA βελτίωσε τη φωσφορυλίωση του p38, το οποίο μπλοκάρει την ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα κΒ (NF-κΒ) /σαλιγκάρι οδό σήματος. Αναστολή της ρ38 καταργηθεί η ΥΠΑ που προκαλείται από την αναστολή των μεταναστευτικών ικανότητα και ΚΕΠ, όπως φαινότυπο σε κακοήθη κύτταρα HaCaT.

Αποτελέσματα

ΥΠΑ εξασθενεί τη μεταναστευτική ικανότητα των κακοήθων κυττάρων HaCaT

για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων της CAA στο μεταναστευτικό δυναμικό των κακοήθων κυττάρων HaCaT, transwell δοκιμασία διεξήχθη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, τα κακοήθη κύτταρα HaCaT εμφανίζονται υψηλές μεταναστευτικές ικανότητα? Αντιθέτως, CAA εξασθενημένο της μεταναστευτικής ικανότητας των κακοήθων HaCaT κυττάρων σε ένα κάνει-εξαρτώμενο τρόπο. Από 100,0 μΜ της ΥΠΑ μείωσε τη μεταναστευτική ικανότητα των κακοήθων κυττάρων HaCaT αποτελεσματικά, και δεδομένου ότι δεν είχε καμία ανιχνεύσιμη κυτταροτοξικότητα (Εικόνα S1), επιλέξαμε αυτή τη συγκέντρωση για περαιτέρω έρευνα.

Κακοήθη HaCaT κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0,0, 50,0 ή 100,0 μΜ CAA επί 48 ώρες, αντίστοιχα. (Α) ανάλυση Transwell αναλύσεις της μεταναστευτικής ικανότητας των κακοήθων κυττάρων HaCaT, bar = 125 μm? (Β) Ποσοτικοποίηση των Transwell προσδιορισμού κυτταρικής μετανάστευσης. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μετανάστευσαν αριθμούς κυττάρων ανά οπτικό πεδίο (μέση ± SD, η = 5). **

σ

& lt? 0.01 σε σύγκριση με 0,0 μΜ κακοήθων ομάδα HaCaT κύτταρα CAA-θεραπεία.

Η

CAA προκαλεί μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβασης (ΚΟΑ) σε κακοήθη κύτταρα HaCaT

Για τα κακοήθη κύτταρα HaCaT, αλλοίωση από επιθηλιακά να ατρακτοειδόμορφα μεσεγχυματικών μορφολογία είναι μια εκδήλωση [17]. Από EMT επιτρέπει κύτταρο να κυκλοφορούν και να εισβάλουν [18], που προσδιορίζεται στη συνέχεια τα αποτελέσματα της ΥΠΑ για τη διαδικασία EMT σε κακοήθη κύτταρα HaCaT. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, τα κακοήθη κύτταρα HaCaT επέδειξαν παρόμοια με ινοβλάστη εμφάνιση μεσεγχυματικών? Ωστόσο, μετά από αυτά τα κύτταρα εκτέθηκαν σε CAA για 48 ώρες, έδειξαν μια επιθηλιακή μορφολογία που μοιάζει. Η αναστολή της κυτταρικής ικανότητας κόλλας συνδέεται με EMT έναρξη [18]. Εδώ, αναλύσεις προσκόλλησης έδειξε ότι CAA βελτίωσε τη συγκολλητική ικανότητα των κακοήθων κυττάρων HaCaT (Σχήμα 2Β). Στη συνέχεια, τα αποτελέσματα της CAA στην έκφραση του ΕΜΤ /κόλλας δείκτες:, προσδιορίστηκαν Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, και βιμεντίνη. Μετά κακοήθη HaCaT κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΥΠΑ για 48 ώρες, το επίπεδο Ε-καδερίνης ήταν αυξημένη, σε αντίθεση, Ν-cadherin και τα επίπεδα βιμεντίνης μειώθηκαν (Σχήμα 2C). Ως εκ τούτου, και οι δύο μορφολογικές και μοριακές μεταβολές αποδείξει ότι, με την έκθεση σε CAA, κακοήθη HaCaT κύτταρα υφίστανται μια ΚΟΑ.

Κακοήθη HaCaT κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,0 ή 100.0 μΜ CAA επί 48 ώρες, αντίστοιχα. (Α) Μορφολογικά εικόνες των κακοήθων κυττάρων HaCaT (μπάρες: συμπαγής γραμμή = 500 μm και διακεκομμένη γραμμή = 125 μm)? (Β) Ποσοτικοποίηση δοκιμασία προσκόλλησης, όπως περιγράφεται στην ενότητα

Υλικά και Μέθοδοι

. Χρησιμοποιήσαμε τις αναλογίες προσκόλληση των μη επεξεργασμένων κακοήθη κύτταρα HaCaT να προσδιοριστεί το επίπεδο 100%? (Γ) αναλύσεις Western blot Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, και τα επίπεδα βιμεντίνη. Οι κηλίδες κανονικοποιήθηκαν με τη χρήση GAPDH για τη διόρθωση για τις διαφορές στη φόρτωση των πρωτεϊνών. **

σ

& lt? 0.01 σε σύγκριση με 0,0 μΜ κακοήθων ομάδα HaCaT κύτταρα CAA-θεραπεία.

Η

ΥΠΑ μειώνει τα ΚΕΠ-όπως ιδιότητες των κακοήθων κυττάρων HaCaT

Πρόκληση EMT έχει συσχετισθεί με την απόκτηση της βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με τα χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένης της έκφρασης των εν λόγω δεικτών βλαστικών κυττάρων-επιφάνειας, μη προσκολλημένα ανάπτυξη, και αλλαγές στην έκφραση των γλυκοπρωτεϊνών κυτταρικής επιφάνειας [16]. CD34 και Κ5 είναι δείκτες κυτταρικής επιφάνειας των βλαστικών κυττάρων του δέρματος [19], [20]. Στην παρούσα μελέτη μας, κακοήθη HaCaT κύτταρα έδειξαν αυξημένη έκφραση του

CD34

και

Κ5

mRNAs? Ωστόσο, μετά την αγωγή των κακοηθών HaCaT κυττάρων με ΠΑΟ για 48 ώρες, μια μειωμένη έκφραση τέτοιων mRNAs παρατηρήθηκε (Σχήμα 3Α). Σχηματισμός σφαιροειδή καταδεικνύει την ικανότητα των κυττάρων για αυτο-ανανέωση και για την έναρξη των όγκων, τα οποία είναι χαρακτηριστικά των καρκινικών βλαστοκυττάρων (ΚΕΠ) [21]. Στη συνέχεια καθορίζονται οι επιδράσεις της CAA επί του σχηματισμού σφαιριδίων σε κακοήθη κύτταρα HaCaT. Σε μη προσκολλημένα πιάτα, κακοήθη HaCaT κύτταρα που σχηματίζονται ελεύθερης διακύμανσης, βιώσιμη σφαίρες? Ωστόσο, μετά την αγωγή των κακοηθών HaCaT κυττάρων με ΠΑΟ για 48 ώρες, όπως το φαινόμενο εξαφανίστηκε (Σχήμα 3Β και 3C). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι CAA μειώνει τις ΚΕΠ-όπως ιδιότητες των κακοηθών κυττάρων HaCaT.

Κακοήθη HaCaT κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,0 ή 100.0 μΜ CAA επί 48 ώρες, αντίστοιχα. (Α) RT-PCR αναλύσεις

Κ5

και

CD34

επίπεδα mRNA. Συγκροτήματα κανονικοποιήθηκαν με τη χρήση GAPDH για τη διόρθωση για τις διαφορές στη φόρτωση των cDNA? (Β) Ελεύθερη διακύμανση, βιώσιμη σφαίρες σχηματίζονται από κακοήθη κύτταρα HaCaT (bar = 125 μm)? (Γ) Σφαίρα ποσοτικοποίηση (μέση ± SD, η = 3). **

σ

& lt? 0.01 σε σύγκριση με 0,0 μΜ κακοήθων ομάδα HaCaT κύτταρα CAA-θεραπεία.

Η

ΥΠΑ αναστέλλει την ενεργοποίηση του μονοπατιού σήματος /σαλιγκάρι NF-κΒ από p38

σαλιγκάρι, ένα δάχτυλο του ψευδαργύρου μεταγραφικού παράγοντα , λειτουργεί ως ρυθμιστής για να καταστείλει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης και να βοηθήσει την διαφυγή των καρκινικών κυττάρων από τον κυτταρικό θάνατο κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ [22]. ΝΡ-κΒ, ένας μεσολαβητής κλειδί που εμπλέκονται στην κακοήθη μετασχηματισμό των κυττάρων HaCaT [17], ρυθμίζει ανοδικά σαλιγκάρι έκφραση και επάγει ΕΜΤ [23], [24]. Υποθέσαμε ότι η NF-κΒ σηματοδοτικό μονοπάτι /σαλιγκάρι μπορεί να εμπλέκεται στην ΥΠΑ που προκαλείται από την αναστολή των ΚΕΠ-όπως ιδιότητες και τα μεταναστευτικά ικανότητα σε κακοήθη κύτταρα HaCaT. Εδώ, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, CAA μείωσε την έκφραση της φωσφο-ΚεΙΑ (υποδεικνύοντας την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ) και σαλιγκάρι, που πρότεινε ότι CAA μπλοκάρει την ενεργοποίηση του μονοπατιού σήματος /σαλιγκάρι ΝΡ-κΒ.

(Α) Κακοήθη HaCaT κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,0 ή 100.0 μΜ CAA για 24 ώρες, αντίστοιχα. αναλύσεις Western blot σαλιγκάρι, ρ-ρ38, και τα επίπεδα ρ-ΚεΙΑ. Οι κηλίδες κανονικοποιήθηκαν με τη χρήση GAPDH για τη διόρθωση για τις διαφορές στη φόρτωση των πρωτεϊνών? (Β) Μετά από κακοήθη HaCaT κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10,0 μΜ SB203580 (αναστολέας ρ38) για 6 ώρες, εκτέθηκαν σε 0,0 ή 100.0 μΜ CAA για 24 ώρες, αντίστοιχα. (Β, κορυφή) Κύτταρα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ανοσοκατακρήμνιση με ΝΡ-κΒ /ΚεΙΑ αντίσωμα, και τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε Νοτιοδυτική κηλίδες για τον προσδιορισμό της δέσμευσης του ΝΡ-κΒ σε αλληλουχίες DNA του

σαλιγκάρι

προαγωγό (5 ‘ –

ΤΑΑ

–

GGG-AGT-ΤΟΟ-CGG

-3 ‘)? (Β, κάτω) τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε στύπωμα Western για να προσδιοριστεί το επίπεδο ΚεΙΑ, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τη διόρθωση για τις διαφορές στα φόρτωση των ανοσοκαταβύθισης? (Γ) τα κακοήθη κύτταρα HaCaT υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο (Β), RT-PCR (επάνω) και στύπωμα Western (κάτω μέρος) των αναλύσεων σαλιγκάρι mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Οι κηλίδες /ζώνες ομαλοποιήθηκαν με τη χρήση του GAPDH να διορθώσει τις διαφορές στη φόρτωση των πρωτεϊνών /cDNA.

Η

Για να καθοριστεί περαιτέρω το ρυθμιστή ανάντη του NF-κΒ /σαλιγκάρι στην ΥΠΑ θεραπεία κακοήθων κυττάρων HaCaT , διερευνήσαμε την ενεργοποίηση της ρ38 (ένας αναστολέας του ΝΡ-κΒ και EMT [25]). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, CAA βελτίωσε τη φωσφορυλίωση της ρ38 (που υποδεικνύει την ενεργοποίηση του p38). Με βάση αυτά τα δεδομένα, υποθέσαμε ότι σε κακοήθη κύτταρα HaCaT, CAA μπλοκάρει το σήμα /σαλιγκάρι μονοπατιού NF-κΒ από την p38.

Στη συνέχεια χρησιμοποιείται ανοσοκατακρήμνιση και δοκιμασία κηλίδος Νοτιοδυτική να επιβεβαιώσουν την υπόθεσή μας. SB203580 είναι ένας ειδικός αναστολέας της p38, και χρησιμοποιήσαμε 10,0 μΜ SB203580 να εμποδίσει την ΥΠΑ επαγόμενη ενεργοποίηση της ρ38 (Εικόνα S2). Μετά κακοήθη HaCaT κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10,0 μΜ SB203580 για 6 ώρες, εκτέθηκαν σε 0,0 ή 100.0 μΜ CAA για 24 ώρες, αντίστοιχα. ΚεΙΑ ανοσοκαταβυθίστηκε με ειδικό αντίσωμα του, και τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε Νοτιοδυτική στυπώματα χρησιμοποιώντας το βιοτίνη σημασμένο ανιχνευτή «

gggagttggc

» (Εικόνα S3) για τον προσδιορισμό της δέσμευσης του ΝΡ-κΒ σε αλληλουχίες DNA του

σαλιγκάρι

υποκινητή. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, CAA μείωσε την πρόσδεση του NF-κΒ στο

σαλιγκάρι

προαγωγού σε κακοήθη κύτταρα HaCaT? Ωστόσο, η αναστολή της ρ38 καταργηθεί αυτό το αποτέλεσμα. Περαιτέρω, απόφραξη της p38 εξασθένισε την ΥΠΑ μεσολάβηση μειωμένη έκφραση των σαλιγκαριών mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι, σε κακοήθη HaCaT κύτταρα που εκτίθενται σε CAA, ρ38 μειώνουν την δραστικότητα δέσμευσης DNA του ΝΡ-κΒ σε

σαλιγκάρι

προαγωγού, η οποία οδηγεί στη μεταγραφική ρύθμιση προς τα κάτω του σαλιγκαριού.

p38 εμπλέκεται στην ΥΠΑ που προκαλείται ΚΟΑ των κακοήθων κυττάρων HaCaT

στη συνέχεια καθορίζονται οι λειτουργίες του p38 σε CAA-μεσολάβηση ΚΟΑ σε κακοήθη κύτταρα HaCaT. Μετά κακοήθη HaCaT κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10,0 μΜ SB203580 για 6 ώρες, εκτέθηκαν σε 0,0 ή 100.0 μΜ CAA επί 48 ώρες, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5. Σε κακοήθη κύτταρα HaCaT CAA-κατεργασία, το επίπεδο Ε-καδερίνης ήταν αυξημένη, αλλά Ν-καδερίνης και βιμεντίνης επίπεδα μειώθηκαν (Σχήμα 5Α)? κυτταρικό συγκολλητική ικανότητα ήταν βελτιωμένη (Σχήμα 5Β)? και τα κύτταρα απέκτησε επιθηλιακά-όπως μορφολογία (Σχήμα 5C). Ωστόσο, η αναστολή της ρ38 κατήργησε το φαινόμενο προκαλείται από την παραπάνω CAA (Σχήμα 5Α, 5Β και 5C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρ38 εμπλέκεται στην CAA που προκαλείται ΚΟΑ των κακοήθων κυττάρων HaCaT.

Μετά από κακοήθη κύτταρα HaCaT προεπεξεργασία με SB203580 (αναστολέας της p38) για 6 ώρες, που εκτέθηκαν σε 0,0 ή 100.0 μΜ της ΥΠΑ επί 48 ώρες, αντίστοιχα. (Α) αναλύσεις Western blot Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, και τα επίπεδα βιμεντίνη. Οι κηλίδες κανονικοποιήθηκαν με τη χρήση GAPDH για τη διόρθωση για τις διαφορές στη φόρτωση των πρωτεϊνών? (Β) Ποσοτικοποίηση δοκιμασία προσκόλλησης, όπως περιγράφεται στην ενότητα

Υλικά και Μέθοδοι

. Χρησιμοποιήσαμε τις αναλογίες προσκόλληση των μη επεξεργασμένων κακοήθη κύτταρα HaCaT να προσδιοριστεί το επίπεδο 100%? (C) Μορφολογικά εικόνες των κακοήθων κυττάρων HaCaT (μπάρες: συμπαγής γραμμή = 500 μm και διακεκομμένη γραμμή = 125 μm). **

σ

& lt? 0.01 σε σύγκριση με (CAA + SB203580) επεξεργασμένων με κακοήθη ομάδα HaCaT κύτταρα.

Η

P38 εμπλέκεται σε CAA που προκαλείται από την αναστολή των ΚΕΠ-όπως ιδιότητες σε κακοήθη κύτταρα HaCaT

Επιπλέον, έχουμε καθορίζονται οι συνέπειες της p38 στην ΥΠΑ που προκαλείται από την αναστολή των ΚΕΠ-όπως ιδιότητες σε κακοήθη κύτταρα HaCaT. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται ανωτέρω. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, CAA εξασθένησε την έκφραση του

CD34

και

Κ5

mRNAs (Σχήμα 6Α), και μείωσε το σχηματισμό σφαιριδίων (Σχήμα 6Β και 6C). Ωστόσο, η αναστολή της ρ38 κατήργησε το φαινόμενο προκαλείται από την παραπάνω CAA (Σχήμα 6Α, 6Β, και 6C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρ38 εμπλέκεται στην CAA-επαγόμενη αναστολή της ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες σε κακοήθη κύτταρα HaCaT.

Μετά την κακοήθη HaCaT κύτταρα προκατεργάστηκαν με SB203580 για 6 ώρες, εκτέθηκαν σε 0,0 ή 100.0 μΜ CAA επί 48 ώρες, αντίστοιχα. (Α) RT-PCR αναλύσεις

Κ5

και

CD34

επίπεδα mRNA. Συγκροτήματα κανονικοποιήθηκαν με τη χρήση GAPDH για τη διόρθωση για τις διαφορές στη φόρτωση των cDNA? (Β) Ελεύθερη διακύμανση, βιώσιμη σφαίρες σχηματίζονται από κακοήθη κύτταρα HaCaT (bar = 125 μm)? (Γ) Σφαίρα ποσοτικοποίηση (μέση ± SD, η = 3). **

σ

& lt? 0.01 σε σύγκριση με (CAA + SB203580) επεξεργασμένων με κακοήθη ομάδα HaCaT κύτταρα.

Η

ΥΠΑ εξασθενεί τη μεταναστευτική ικανότητα των κακοήθων κυττάρων HaCaT από p38

Τέλος, προσδιορίσαμε αν ΥΠΑ μειωθεί το μεταναστευτικό ικανότητα των κακοήθων κυττάρων HaCaT μέσω p38. Κακοήθη HaCaT κύτταρα εκτέθηκαν σε CAA (0,0 ή 100.0 μΜ) παρουσία ή απουσία SB203580 όπως περιγράφεται στην Εικόνα 6, και το μεταναστευτικό δυναμικό των κακοήθων HaCaT κυττάρων προσδιορίστηκε με Transwell δοκιμασίας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, CAA εξασθενημένο της μεταναστευτικής ικανότητας των κακοήθων κυττάρων HaCaT? Ωστόσο, η αναστολή της ρ38 καταργηθεί αυτό το φαινόμενο. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ρ38 εμπλέκεται στην CAA-επαγόμενη αναστολή των μεταναστευτικών ικανότητας σε κακοήθη κύτταρα HaCaT.

Μετά την κακοήθη HaCaT κύτταρα προκατεργάστηκαν με SB203580 για 6 ώρες, εκτέθηκαν σε 0,0 ή 100.0 μΜ CAA για 48 h, αντίστοιχα. (Α) ανάλυση Transwell αναλύσεις της μεταναστευτικής ικανότητας των κακοήθων κυττάρων HaCaT, bar = 125 μm? (Β) Ποσοτικοποίηση των Transwell προσδιορισμού κυτταρικής μετανάστευσης. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μετανάστευσαν αριθμούς κυττάρων ανά οπτικό πεδίο (μέση ± SD, η = 5). **

σ

& lt? 0.01 σε σύγκριση με (CAA + SB203580) επεξεργασμένων με κακοήθη ομάδα HaCaT κύτταρα.

Η

Συζήτηση

CAA είναι ένας από τους κύριους μεταβολίτες που παράγονται από την υδρόλυση του χλωρογενικό οξύ, μια σημαντική φαινολική φυτοχημικές σε διάφορα τρόφιμα, συμπεριλαμβανομένου του καφέ [8]. Επειδή ένα μεγάλο μέρος των χλωρογενικό οξύ απορροφάται στο μεταβολίζεται μορφή, σημαντική προσοχή έχει επικεντρωθεί στις βιολογικές επιδράσεις των μεταβολιτών όπως CAA, προκειμένου να αξιολογηθούν οι πιθανοί

in vivo

επίδραση διαιτών χλωρογενικό οξύ που περιέχει-[9 ]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι ΥΠΑ έχει τη δυνατότητα να αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του δέρματος, για παράδειγμα, CAA αναστέλλει προαγωγή όγκων του δέρματος που προκαλείται από 12-Ο-δεκατετρανοϋλοφορβόλης-13-οξικό σε δέρμα ποντικού [26]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της CAA στο μεταναστευτικό ικανότητα των κακοήθων κυττάρων του δέρματος, και των μοριακών μηχανισμών που διέπουν σε, παραμένουν ασαφείς. Εδώ βρήκαμε ότι CAA εξασθενημένο τη μεταναστευτική ικανότητα και ΚΕΠ-όπως ιδιότητες των κακοήθων ανθρώπινων κερατινοκυττάρων, στην οποία, ρ38 κάτω ρύθμιση της οδού σήματος /σαλιγκάρι NF-κΒ συμμετείχε.

EMT αναφέρεται σε ένα πρόγραμμα κατά την κανονική εμβρυϊκή ανάπτυξη που χαρακτηρίζει μια απώλεια των επιθηλιακών ιδιότητες, όπως προσκόλληση κυττάρου και έκφραση της επιθηλιακής δείκτη, Ε-καδερίνης, και την απόκτηση των ιδιοτήτων μεσεγχυματικών, όπως αυξημένη κινητικότητα κυττάρων και έκφραση του δείκτη μεσεγχυματικών, Ν-cadherin και βιμεντίνης [ ,,,0],10]. EMT θεωρείται ως ένα σημαντικό βήμα για την εισβολή και μετάσταση όγκου [27]. Εδώ βρήκαμε ότι, μετά την έκθεση των κακοήθων κυττάρων HaCaT να CAA για 48 ώρες, έδειξαν μια επιθηλιακή μορφολογία παρόμοια και βελτιωμένη ικανότητα συγκολλητικό. Περαιτέρω, υπήρχαν αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης (ένα επιθηλιακό δείκτη), και μειωμένη έκφραση του Ν-καντερίνης και βιμεντίνης (δείκτες μεσεγχυματικά). Τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν ότι, με την έκθεση για την ΥΠΑ, κακοήθη HaCaT κύτταρα υφίστανται μια ΚΟΑ.

Απόκτηση ΚΕΠ-όπως ιδιότητες αναδειχθεί ως ένα κρίσιμο βήμα στην εξέλιξη του καρκίνου [28]. Πολλά γονίδια που εκφράζονται σε ΚΕΠ του δέρματος, συμπεριλαμβανομένης

CD34

,

Κ5

, και ούτω καθεξής [19], [20]. Στο δέρμα,

CD34

εκφράζεται ειδικά στο ΠΚ κερατινοκυττάρων, και

CD34

έκφραση είναι το κλειδί για την καρκινογένεση του δέρματος [19]?

K5

είναι ένας δείκτης των μη διαφοροποιημένων ΠΚ δέρματος ή ΚΕΠ [20]. Στην παρούσα μελέτη μας, εκφράσεις του

CD34

και

Κ5

mRNA ήταν σημαντικά μειωμένη στα κακοήθη κύτταρα HaCaT CAA-θεραπεία. ΠΚ και ΚΕΠ μοιράζονται μια ποικιλία ιδιοτήτων, συμπεριλαμβανομένης selfrenewal, αν και τυπικά απορρυθμιστεί στην ογκογένεση. Πολλοί καλλιεργημένα SC ή CSC γραμμές σχηματίζουν ελεύθερης διακύμανσης σφαιρικά σμήνη των βιώσιμων κυττάρων που περιέχουν μια υπεροχή της ΥΠ.Ε.Ε. ή ΚΕΠ [21], [29]. Στην παρούσα μελέτη, CAA-θεραπεία κακοήθων HaCaT κύτταρα εμφάνισαν εξασθενημένη ικανότητα σχηματισμού σφαίρες. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα κακοήθη HaCaT κυττάρων που χάνονται ΚΕΠ-όπως χαρακτηριστικά με έκθεση σε CAA.

σαλιγκάρι, ένα δάκτυλο ψευδαργύρου μεταγραφικός παράγοντας, λειτουργεί ως ρυθμιστής για να καταστείλει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης και να βοηθήσει την διαφυγή των κυττάρων του όγκου από τον κυτταρικό θάνατο κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ [22], [30]. Σαλιγκάρι εκφράζεται συχνά σε πολλούς τύπους κυττάρων όγκου στα οποία μειώνεται η έκφραση Ε-καδερίνης. Επιπλέον, αυτή η αντίστροφη σχέση της σαλιγκάρι και Ε-καδερίνης ήταν συχνά παρατηρήθηκε στις επεμβατικές τύπους όγκων [31]. Μεταγενέστερες μελέτες επιβεβαίωσαν έναν κατασταλτικό αποτέλεσμα σαλιγκάρι σε

Ε-καδερίνης

υποκινητή μέσω μιας ειδικής σύνδεσης στις τρεις E-κουτιά

(cacctg)

στην περιοχή προαγωγού σε -178 έως +92 του

E-cadherin

γονίδιο [31]. Επιπλέον, σαλιγκάρι, επίσης, έχει συνδεθεί με την απόκτηση της CSC-όπως χαρακτηριστικά [22]. Εδώ σε κακοήθη κύτταρα HaCaT CAA-θεραπεία, παρατηρήθηκε μειωμένη έκφραση των σαλιγκαριών.

Για να καθοριστεί περαιτέρω το ρυθμιστή ανάντη των σαλιγκαριών σε κακοήθη κύτταρα HaCaT αντιμετωπίζονται ΥΠΑ, ερευνήσαμε την ενεργοποίηση του NF-κΒ. ΝΡ-κΒ πιστεύεται να κινήσει και να επιταχύνει την ογκογένεση, και κυτταρικό μετασχηματισμό μπλοκ αναστολή της επαγόμενης από προαγωγούς όγκου [16], [23]? ΝΡ-κΒ επάγει μορφολογικές αλλαγές, κυτταρική μετανάστευση, σαλιγκάρι ενεργοποίηση και καταστολή της παραγωγής Ε-καδερίνης [24], [32]. NF-κΒ προσδένεται σε

σαλιγκάρι

υποκινητή και μεταγραφικό απορυθμίζει σαλιγκάρι έκφρασης [23]. Εδώ, σε κακοήθη κύτταρα HaCaT CAA-αγωγή, παρατηρήθηκε μειωμένη έκφραση του ρ-ΚεΙΑ. Περαιτέρω, CAA ρυθμισμένα προς τα κάτω την δραστικότητα δέσμευσης DNA του ΝΡ-κΒ σε

σαλιγκάρι

προαγωγού, η οποία είχε ως αποτέλεσμα την μεταγραφική αναστολή της χελώνας. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΠΑΟ προκαλεί αδρανοποίηση της οδού σήματος /σαλιγκάρι ΝΡ-κΒ.

Τα ΜΑΡΚ μετάγουν σήματα τα οποία οδηγούν σε ποικίλες κυτταρικές αποκρίσεις όπως κυτταρική αύξηση, διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό, απόπτωση, και αποκρίσεις στρες σε περιβαλλοντικές ερεθίσματα [33]. Το εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης 1/2 (ERK1 /2) οδός μετατρέπει τυπικά σήματα αυξητικού παράγοντα που οδηγούν σε κυτταρική διαφοροποίηση ή τον πολλαπλασιασμό, ενώ οι κυτοκίνες και σήματα στρες ενεργοποιούν τα c-Jun Ν-τερματικό κινάσες (JNKs) και μονοπατιών της p38 MAPK, με αποτέλεσμα στις απαντήσεις του στρες, διακοπή αύξησης ή απόπτωση [34]. Πέραν του ότι είναι ένας κεντρικός μεσολαβητής της φλεγμονώδους και στρες απόκριση, ρ38 παίζει ένα σημαντικό ρόλο σε μη φλεγμονώδεις διεργασίες όπως η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την διαφοροποίηση των κυττάρων [35]. Μόλις ενεργοποιηθεί, ρ38 φωσφορυλιώνει ένα ευρύ φάσμα υποστρωμάτων στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα, ρυθμίζοντας έτσι την έκφραση του γονιδίου, του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό πόλωση. Μελέτες σε ρόλους των οικογενειών ΜΑΡΚ στη γένεση του EMT έχουν αντικρουόμενα αποτελέσματα, λόγω της ανομοιογένειας των κυτταρικών μοντέλων και τις διάφορες πειραματικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται [25], [36]. Προηγούμενη μελέτη αποδεικνύει ότι η ρ38 προάγει έκφραση Ε-καδερίνης με καταστολή ΤΘΡ-β-ενεργοποιημένη κινάση 1 (TAK1) -NF-κΒ σηματοδότηση [25]. Εδώ, σε κακοήθη κύτταρα HaCaT CAA-αγωγή, ρ38 μειώνει τη δραστικότητα δέσμευσης DNA του ΝΡ-κΒ σε

σαλιγκάρι

προαγωγού, η οποία οδηγεί στη μεταγραφική ρύθμιση προς τα κάτω του σαλιγκαριού. Το p38 /NF-κΒ /Σαλιγκάρι μονοπάτι εμπλέκεται σε CAA που προκαλείται από την αναστολή των ΚΕΠ-όπως ιδιότητες και τα μεταναστευτικά ικανότητα σε κακοήθη ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (Εικόνα 8).

Σε κακοήθη HaCaT κύτταρα που εκτίθενται σε ΥΠΑ, ρ38 μειώνεται η DNA-δεσμευτική δραστικότητα του ΝΡ-κΒ στο

σαλιγκάρι

προαγωγού, η οποία οδηγεί στη μεταγραφική ρύθμιση προς τα κάτω του σαλιγκαριού. Όπως μοριακή διαδικασία προκαλεί την αναστολή των ΚΕΠ-όπως ιδιότητες και τα μεταναστευτικά ικανότητα των κακοήθων κυττάρων HaCaT.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

Το κακόηθες μεταμορφωθεί κύτταρα HaCaT αναπτύχθηκαν προηγουμένως από το εργαστήριο μας [17]. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C σε μέσο RPMI-1640 (Life Technologies /Gibco, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Life Technologies /GIBCO), 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Life Technologies /Gibco, Gaithersburg, MD). Ο αναστολέας ρ38, SB203580 αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικού βαθμού ή ανώτερου βαθμού διαθέσιμα.

Transwell δοκιμασία

δοκιμασία Transwell διεξήχθη με χρήση του αυξητικού παράγοντα-μειωμένων επικαλυμμένα με Matrigel (μέγεθος πόρων 8 μm, BD, Franklin Lakes, NJ) φίλτρα σε πλάκες 24 φρεατίων. Εν συντομία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν πάνω στον ανώτερο θάλαμο των transwells (3 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) στα συμπληρώματα-free 1640. Οι κάτω θάλαμοι των transwells πληρώθηκαν με το μέσο 1640 που περιέχει 100 ng /ml του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF, R &? D Systems). Οι θάλαμοι επωάζονται εις 37 ° C με 5% CO

2 για 24 ώρες. Στο τέλος της επώασης, τα κύτταρα επί της άνω επιφάνειας του φίλτρου απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μάκτρο βάμβακος. Τα κύτταρα που μεταναστεύουν μέσω του φίλτρου προς την κατώτερη επιφάνεια μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες για 5 λεπτά. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν είδαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Olympus, Tokyo, Japan), και υπολογίζονται σε πέντε τυχαία επιλεγμένους τομείς.

Προσκόλληση δοκιμασία

Ένα σύνολο από 1 × 10

4 κύτταρα επεξεργασμένα σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων για 24 ώρες, ακολουθούμενη από πλύση σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) δύο φορές και για τον καθορισμό με 70% αιθανόλη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα υπόλοιπα προσκολλητικά κύτταρα αξιολογήθηκαν από WST-8 υδρόλυση χρησιμοποιώντας Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Inc.). Εν συντομία, αφού τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS, επωάστηκαν με 20.0 μΙ CCK-8 διάλυμα επί 4 ώρες. Η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε με μια συσκευή ανάγνωσης πλακών πολλαπλών φρεατίων (Model 680, Bio-Rad, USA). Οι αναλογίες των μη κατεργασμένων κυττάρων ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί το επίπεδο 100%.

κηλίδες Western

Τα κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου με δωδεκυλοθειϊκό νάτριο και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο ( Millipore, Billerica, ΜΑ, USA)? τα ανοσοσύμπλοκα ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Cell Signaling Technology). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, βιμεντίνη, σαλιγκάρι, ρ38, ρ-p38 (Thr180 /Tyr182), ΚεΙΑ, ρ-ΚεΙΑ (Ser536, Cell Signaling Technology)? Γλυκεραλδεΰδη 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH, Sigma, St. Louis, ΜΟ). Οι κηλίδες κανονικοποιήθηκαν με τη χρήση GAPDH για τη διόρθωση για τις διαφορές στη φόρτωση των πρωτεϊνών.

ανάστροφης τρανσκριπτάσης αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Ολικό RNA (2 μα) μεταγράφηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας ΑΜν ανάστροφης μεταγραφάσης (Promega, Madison, WI, USA). Αστάρια για το

CD34

(προς τα εμπρός, 5′-TTGGGCATCACTGGCTATTT-3 ‘? Αντίστροφη, 5′-GGAAGGGTTGGGCGTAAGA-3’),

Κ5

(προς τα εμπρός, 5′-GAGCAGGGCACCAAGAC-3 ‘? Αντίστροφη , 5’-CTCCGCATCAAAGAACATC-3 ‘), και

σαλιγκάρι

(προς τα εμπρός, 5′-TTCTCCCGAATGTCCCT -3′? αντίστροφη, 5′-TCAGCCTTTGTCCTGTAGC -3 ‘) χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση PCR. Η αντίδραση PCR αξιολογήθηκε με τον έλεγχο των προϊόντων PCR σε 2% w /v πηκτές αγαρόζης. Συγκροτήματα ομαλοποιήθηκαν με τη χρήση του GAPDH να διορθώσει τις διαφορές στη φόρτωση των cDNA

σχηματισμό σφαιροειδές

Σε μη προσκολλημένα πιάτα (Costar, ΗΠΑ), κύτταρα (1 × 10

4) ήταν αιωρούνται σε καθορισμένη, ελεύθερο ορού μέσο αποτελούμενο από DMEM /F-12 (Gibco), 10 ng /ml ανθρώπινο ανασυνδυασμένο βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (bFGF, Ε & amp? D Systems, USA), και 10 ng /ml EGF. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 10 ημέρες και τροφοδοτείται κάθε 48 ώρες. Σύνολο σφαίρες μετά μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο (Olympus).

Ανοσοκαταβύθιση

Τα κύτταρα εκχυλίζονται για 30 λεπτά με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Μετά από φυγοκέντρηση των παρασκευασμάτων, τα υπερκείμενα επωάσθηκαν με αντισώματα ΚεΙΑ και μετέπειτα με μία χάντρες + G Sepharose (Sigma) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές, επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος δωδεκυλοθειικό νάτριο, και βρασμένο για να απομακρυνθεί πρωτεΐνης από τα σφαιρίδια. Τα ανοσοϊζήματα αναλύθηκαν με στυπώματα Νοτιοδυτική με βιοτίνη σημασμένο ανιχνευτή (5 ‘-

ΤΑΑ

–

GGG-AGT-TGG-CGG

-3′)., Ή με κηλίδες Western

Νοτιοδυτική δοκιμασίες

Νοτιοδυτική αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, τα ανοσοϊζήματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Millipore). Μετά τη μεταφορά, τα φίλτρα υβριδοποιήθηκαν για 2 ώρες στους 20 ° C με ρυθμιστικό σύνδεσης που περιέχει 40 ng του επισημασμένου με βιοτίνη ανιχνευτή (

σαλιγκάρι

υποκινητή: 5 ‘-

ΤΑΑ

–

GGG-AGT-ΤΟΟ-CGG

-3 ‘). Οι θέσεις των τελικών βιοτίνη επισημασμένα ολιγονουκλεοτίδια ανιχνεύθηκαν με χημειοφωταύγειας αντίδραση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Pierce, USA) και έγινε ορατό με αυτοραδιογραφία.

Στατιστική ανάλυση

προκύπτουσες τιμές παρουσιάστηκαν ως ο σημαίνει ± SD. Του Dunnett

t

δοκιμής και μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών ομάδων. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με την δοκιμή Fisher.

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1..

Επιδράσεις της ΥΠΑ για τη βιωσιμότητα των κακοήθων κυττάρων HaCaT. Αφού τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 0,0, 50,0, 100,0, 200,0 ή μΜ CAA για 24 και 48 ώρες, αντίστοιχα, βιωσιμότητες τους μετρήθηκαν με τη χρήση ενός κιτ μέτρησης κυττάρων-8 δοκιμασίας. Οι σχετικές αναλογίες της βιωσιμότητας των κυττάρων προσδιορίστηκαν με σύγκριση της ανάπτυξης των κυττάρων που εκτέθηκαν σε καμία CAA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0058915.s001

(TIF)

Εικόνα S2.

Επιδράσεις της SB203580 επί του κυττάρου βιωσιμότητα και τη φωσφορυλίωση της ρ38. (Α) Τα αποτελέσματα του SB203580 στην βιωσιμότητα των κακοήθων κυττάρων HaCaT. Αφού τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 0,0, 5,0, 10,0, 20,0, 40,0 ή μΜ SB203580 για 24 ώρες, βιωσιμότητες τους μετρήθηκαν με τη χρήση ενός κιτ μέτρησης κυττάρων-8 δοκιμασίας. Οι σχετικές αναλογίες της κυτταρικής βιωσιμότητας χαράχθηκαν με μη επεξεργασμένα κύτταρα προσδιορισμό του επιπέδου δραστικότητας 100%. (Β) SB203580 μπλοκάρει την CAA-επαγόμενη φωσφορυλίωση της p38. (

gggynrrrcc

).

doi:10.1371/journal.pone.0058915.s003

(TIF)

Acknowledgments

The