Abstract

παγκρέατος και δωδεκαδάκτυλου ομοιοακολουθίας-1 (PDX-1) είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που ρυθμίζει την έκφραση της ινσουλίνης και της συντήρησης των νησιδίων στον ενήλικο πάγκρεας. πρόσφατες μελέτες μας δείχνουν ότι PDX-1 είναι ένα ογκογονίδιο για τον καρκίνο του παγκρέατος και υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να καταδείξει ότι PDX-1 είναι ένας θεραπευτικός στόχος για τα δύο ορμονικά συμπτώματα και ο όγκος του όγκου σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του παγκρέατος, ινσουλίνωμα και νησίδα νεοπλασία. Ανοσοϊστοχημεία της ανθρώπινης παγκρεατικής και νεοπλασία νησιδίων δείγματα αποκάλυψαν σημειώνονται PDX-1 υπερέκφραση, υποδηλώνοντας PDX-1 ως «drugable» στόχος μέσα σε αυτές τις ασθένειες. Για να γίνει αυτό, μία νέα πλατφόρμα τελεστή παρεμβολής RNA, διλειτουργικά shRNA

PDX-1, αναπτύχθηκε και μελετήθηκε σε κυτταρικές γραμμές ποντικού και ανθρώπου όπως επίσης και σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του παγκρέατος, ινσουλίνωμα και νησίδα νεοπλασία. Συστημική απελευθέρωση bi-shRNA

humanPDX-1 λιποσυμπλόκων οδήγησε σε σημαντική μείωση του όγκου του όγκου και βελτίωσε την επιβίωση σε ένα ανθρώπινο παγκρεατικό μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος καρκίνου. bi-shRNA

mousePDX-1 λιποσυμπλόκων εμπόδισε τον θάνατο από υπερινσουλιναιμία και υπογλυκαιμία σε ένα μοντέλο ινσουλίνωμα ποντίκι. shRNA

mousePDX-1 λιποσυμπλόκων αντιστραφεί υπερινσουλιναιμία και υπογλυκαιμία σε ανοσο-ικανά μοντέλο ποντικού της νεοπλασίας νησίδα. PDX-1 υπερεκφράζεται σε νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος και νησιδιοβλάστωσης. Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η θεραπεία PDX-1 RNAi ελέγχει ορμονική συμπτώματα και ο όγκος του όγκου σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του παγκρέατος, ινσουλίνωμα και νεοπλασία νησιδίων, ως εκ τούτου, PDX-1 είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος γι ‘αυτές τις παθήσεις του παγκρέατος

Citation.: Liu SH, Rao DD, Nemunaitis J, Senzer Ν, Zhou G, Dawson D, et al. (2012) PDX-1 είναι ένας θεραπευτικός στόχος για καρκίνο του παγκρέατος, ινσουλινώματος και Νησίδα Νεοπλασία Χρησιμοποιώντας μια νέα πλατφόρμα Παρεμβολή RNA. PLoS ONE 7 (8): e40452. doi: 10.1371 /journal.pone.0040452

Συντάκτης: John J. Rossi, Beckman Ερευνητικό Ινστιτούτο του City of Hope, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 15, 2012? Δεκτές: 7 Ιουνίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 8 Αυγούστου, 2012

Copyright: © Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση R01-DK46441 από το Εθνικό Ινστιτούτο διαβήτη και του πεπτικού και νεφρικά νοσήματα? επιχορήγηση R01-CA095731 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου? το Ίδρυμα Alkek? το Ίδρυμα Vivian L. Smith? το Ίδρυμα MD Anderson? και η γενναιοδωρία της οικογένειας Bill και Ολίβια Heintz. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι Δ Rao, Ν Senzer, Ζ Wang και Ν Templeton απασχολούνται από Gradalis, Inc. Το παρακάτω συγγραφείς είναι μέτοχοι σε Gradalis, Inc .: N. Senzer, FC Brunicardi, Δ Rao και J. Nemunaitis. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

παγκρέατος και του δωδεκαδακτύλου ομοιοκυτίου-1 (PDX -1) είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης εμβρυολογική παγκρέατος, καθώς και στην έκφραση της ινσουλίνης και συντήρηση των νησιδίων του παγκρέατος ενήλικα [1], [2], [3], [4]. PDX-1 knockout είναι θανατηφόρος σε ποντικούς και μετάλλαξης του PDX-1 οδηγεί σε ώριμα έναρξη του διαβήτη των νέων (MODY υπότυπος IV) σε ποντικούς και ανθρώπους ασθενείς [5], [6]. Επίμονη υπερέκφραση PDX-1 οδηγεί σε κυψελοειδή να πορογενές κύτταρο μεταπλασία σε ποντικούς [7]. Η υπερέκφραση του PDX-1 σε κυτταρικές σειρές έχει σαν αποτέλεσμα τον μετασχηματισμό των κυττάρων μη-που παράγουν ινσουλίνη εντός των κυττάρων που παράγουν ινσουλίνη μετά την GLP-1 ερέθισμα [8], [9], [10], [11], [12], [13 ]. PDX-1 είναι ευρέως γνωστή ως ένα ουσιαστικό ρυθμιστής πολλών παγκρεατικών ενδοκρινικών γονίδια όπως ινσουλίνη [1], [2], [3], [4], γλυκοκινάση [14], αμυλοειδές νησίδος πολυπεπτίδιο [15], [16], [17], γλυκόζη τύπος μεταφορέα 2 [GLUT2] [18], [19], παγκρεατικό πολυπεπτίδιο [20] και σωματοστατίνη [21], [22], και ως εκ τούτου έχει έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης της γλυκόζης.

πρόσφατες μελέτες μας δείχνουν ότι PDX-1 είναι ένα ογκογονίδιο [23], [24]. Είναι αξιοσημείωτα υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παγκρέατος [23], [25], [26], [27] και ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

in vitro

και

in vivo

σε ποντικούς [23]. PDX-1 υπερέκφραση σε καλοήθη και κακοήθη κύτταρα οδήγησε σε αυξημένο σχηματισμό όγκων όταν αυτά τα κύτταρα εμφυτεύονται σε ποντικούς [24]. Συστημική παράδοση της shRNA

humanPDX-1 λιποσυμπλόκων οδήγησε σε σημαντική μείωση του μεγέθους του όγκου και παρατεταμένη επιβίωση σε ένα ανθρώπινο παγκρεατικό καρκίνο μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού [23].

Η ομάδα μας έχει αναπτύξει μια νέα πλατφόρμα παρεμβολή RNA διλειτουργικές στην οποία η μετάφραση του mRNA στόχου καταστέλλεται μέσω και των δύο οδών φόρτωση RISC διάσπαση ανεξάρτητη και εξαρτώμενη διάσπαση, με αποτέλεσμα την απόκλιση Αργοναύτης ενσωμάτωση και ξεχωριστή, αλλά συντονισμένες, στοχεύουν μηχανισμοί αδρανοποίησης [28].

σε αυτή τη μελέτη, μία νέα RNAi πλατφόρμα τελεστή στόχευση PDX-1 αναπτύχθηκε και μελετήθηκε σε ανθρώπου και ποντικού κυτταρικές γραμμές, όπως επίσης και σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του παγκρέατος, ινσουλίνωμα και νησίδα νεοπλασία να προσδιοριστεί αν PDX-1 είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για τον έλεγχο και των δύο ορμονικών συμπτώματα και ο όγκος του όγκου σε αυτά τα νοσήματα του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

SCID ποντίκια στεγάστηκαν σε μια εγκατάσταση BL-4 και φροντίζονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές στο

Η Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου

εκπονήθηκε από το Ινστιτούτο του Εργαστηρίου ζώων Πόρων, της Επιτροπής για την Life Science, το Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας και της Επιτροπής των ζώων Έρευνας του Baylor College of Medicine. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Baylor College of Medicine. (Αριθμός Άδειας: AN 2404)

Ανθρώπινα δείγματα ελήφθησαν κάτω από ένα ανθρώπινο πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review ( IRB) του Baylor College of Medicine (Αριθμός άδειας: H 14054)? δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία αυστηρά σύμφωνα με τις διαδικασίες που υπαγορεύονται από το εν λόγω πρωτόκολλο. Όλα τα ανθρώπινα δείγματα του παγκρέατος νευροενδοκρινικών όγκων και νησιδιοβλάστωσης ήταν de-εντοπίστηκαν δείγματα που λαμβάνονται με συναίνεση IRB (H 14054) και ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση.

Οι κυτταρικές σειρές, οι φορείς και τα αντισώματα

Ποντίκι βTC-6 και ανθρώπινη παγκρεατική καρκινική κυτταρική γραμμή κυτταρικές σειρές PANC-1 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) και έχουν αναφερθεί προηγουμένως [29]. Ανθρώπινου παγκρεατικού δείγματα νευροενδοκρινικών όγκων και δείγματα ανθρώπινου νησιδιοβλάστωσης ευγενικά από τον Dr. David Dawson του Τμήματος Παθολογίας στο UCLA και ο Δρ Milton Finegold του Τμήματος Παθολογίας στο Νοσοκομείο του Τέξας Παιδική, αντίστοιχα. Mouse PDX-1 shRNA (shRNA

mousePDX-1) σχεδιάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Bi-λειτουργικό ποντίκι (Bi-shRNA

mousePDX-1) και την ανθρώπινη PDX-1 (Bi-shRNA

humanPDX-1) ελήφθησαν από Gradalis Inc (Dallas, ΤΧ). pRIP-mCherry_CMV-eGFP και pRIP-mCherry _CMVeGFP_H1-shRNA

mousePDX-1 υποκλωνοποιήθηκαν βασίζεται στο πατρικό φορέα RIP-mCherry-NLS-mCherry που παρέχεται από τον Dr. Michael Mancini από το Baylor College of Medicine. Κατσίκας αντι-κουνελιού αντι-ορού και αντι-ποντικού προβάτου αντι-ορό συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας αγοράστηκαν από Amersham (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL). IgG κουνελιού αντι-κατσίκας ελήφθη από τη Zymed (Zymed Laboratories, Inc. South San Francisco, CA, USA).

Επιμόλυνση και ρεπόρτερ

δοκιμασία

β TC-6 ή PANC-1 κύτταρα ήταν τοποθετήθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 10-cm σε 1 × 10

6 κύτταρα ανά δίσκο ή πλάκες 24 φρεατίων σε 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. προσδιορισμοί Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. σήματα φθορισμού παρατηρήθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού όπως περιγράφεται προηγουμένως [23] για τον προσδιορισμό των δραστηριοτήτων ρεπόρτερ

Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων.

in vitro

Η

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με MTS δοκιμασία (Promega, Madison, WI) και BrdU ενσωματώνουν δοκιμασία (χρωματομετρική) (Roche Diagnosistics GmbH, Mannherim, Γερμανία) σε 12, 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η απορρόφηση διαβάστηκε σε μία συσκευή ανάγνωσης πλάκας Multiskan ΕΧ (Thermo Electronic Corp., Franklin, ΜΑ) στα 492 nm για MTS και 500 nm για δοκιμασία BrdU και επίπεδα πολλαπλασιασμού υπολογίστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως.

κηλίδος Western αναλύσεις

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], βΤΟ-6 κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA. Είκοσι (20) μg των κυτταρολυμάτων εφαρμόστηκαν σε SDS-PAGE γέλη για ηλεκτροφόρηση. Η πρωτεΐνη μετά μεταφέρθηκε σε μεμβράνες για να επισημανθεί με διάφορα αντισώματα έναντι PDX-1, κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4, και ρ27. Ανοσοσύμπλοκα έγιναν ορατά με ενισχυμένη χημειοφωταύγειας (ECL) υπεροξειδάσης ανίχνευσης με χρένο συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα.

Ζώα και shRNA παράδοση

SCID ποντίκια στεγάστηκαν σε μια εγκατάσταση BL-4 και φροντίζονται σύμφωνα με το κατευθυντήριες γραμμές

η φροντίδα και χρήση των πειραματόζωων

εκπονήθηκε από το Ινστιτούτο του Εργαστηρίου ζώων Πόρων, της Επιτροπής για την Life Science, το Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας και της Επιτροπής των ζώων Έρευνας του Baylor College of Medicine. DNA δοσολογίες προσδιορίστηκαν με πληρούν τα κριτήρια του λιγότερο από το 10% θάνατο ποντικού μετά ένεση λιποσωματικού συγκρότημα shRNA σε τακτά SCID ποντίκια. Αρσενικά ποντίκια, ηλικίας 8- έως 10-εβδομάδων ηλικίας, εμβολιάστηκαν με 1 × 10

6 β TC-6 ή PANC-1 κύτταρα ανά ποντικό μέσω ενδοπεριτοναϊκής (ίρ) ένεση. Δύο εβδομάδες αργότερα, είτε β TC-6 ή PANC-1 ποντίκια ομαδοποιήθηκαν τυχαίως (30 ποντικοί ανά ομάδα) και τον πρώτο κύκλο shRNA

mousePDX-1 ή δι-shRNA

mousePDX-1 ή δι-shRNA

humanPDX-1, αντίστοιχα, δόθηκαν μέσω ένεσης στην ουραία φλέβα. Οι κύκλοι επαναλήφθηκαν τις ημέρες 14 και 28 για ένα σύνολο τριών ενέσεων. Το ίδιο πρωτόκολλο εφαρμόστηκε σε SSTR

1/5

– /- ποντίκια χρησιμοποιώντας 3 κύκλους 35 μg του shRNA

mousePDX-1. Οι λιποσυμπλόκων shRNA παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

Η ινσουλίνη και η γλυκόζη μετρήσεις

Την ημέρα 7, 21, 35, και 120 μετά από κάθε απελευθέρωση γονιδίου, 50 μλ δείγματα ολικού αίματος συλλέχθηκαν και περιστράφηκε για το διαχωρισμό του ορού. Τα επίπεδα της γλυκόζης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Beckman Coulter-Αναλυτή Γλυκόζης 2 (Coulter-Beckman, Fullerton, CA), και παρουσιάζονται ως μέσες ± S.E.M. σε mg /dl. Τα επίπεδα ινσουλίνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ανάλογο ινσουλίνης ποντίκι κιτ ELISA από Mercodia (Linco Research, St. Charles, ΜΟ) και παρουσιάζονται ως μέσες ± S.E.M. . Σε μg /l

Η ενδοπεριτοναϊκή δοκιμασία ανοχής γλυκόζης (IPGTT)

SSTR

1/5

– /- ποντίκια κατά τις ημέρες 7 και 150 μετά την αρχική παράδοση shRNA

mousePDX-1 ήταν νηστικοί όλη την νύχτα πριν από τη συλλογή των δειγμάτων αίματος όπως Τ

0. Ομαδοποιημένα ποντικοί στη συνέχεια δόθηκε 1,2 g γλυκόζης /kg σωματικού βάρους μέσω ΙΡ ένεσης που ακολουθείται από συλλογή δειγμάτων αίματος σε 15, 30, 60, και 120 λεπτά μετά την ένεση γλυκόζης. Τα επίπεδα της γλυκόζης και της ινσουλίνης μετρήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

νεκροψία, συλλογή ιστών, ανοσοϊστοχημεία και TUNEL δοκιμασία

Αποχαρακτηριστούν ανθρώπινα δείγματα παγκρεατικό νευροενδοκρινή όγκο και νησιδιοβλάστωσης ελήφθησαν από τον Dr. David Dawson και από Ο Δρ William Fisher για IHC. πάγκρεας Mouse, νησίδες και δείγματα ιστού του όγκου ελήφθησαν τις ημέρες 0, 7, 21, 35, και ώρα λήξης μετά από την αρχική απελευθέρωση γονιδίου. Περιτοναϊκή όγκοι μακροσκοπικά και μικροσκοπικά αξιολογήθηκε και το μεγαλύτερο (Α) και μικρότερο (Β) διάμετροι μετρούνται και καταγράφονται. Ο όγκος του όγκου (V? α περιστροφική ελλειψοειδούς) υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο: V (mm

3) = Α (mm) × B

2 (mm)

2/2. Ο συνολικός όγκος του όγκου υπολογίστηκε με την τοποθέτηση όλων των όγκων μαζί. Τα ποντίκια βαθμολογήθηκαν σύμφωνα με την παρουσία ή την απουσία του όγκου. IHC διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Αντι-PDX-1, η ινσουλίνη, PP, κυκλίνη Ε, ρ27, CDK4 ή PCNA αντισώματα εφαρμόσθηκαν σε πλακίδια με 1:100 αραίωση που ακολουθείται από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C. Τα πλακίδια επωάστηκαν με Cy3 ή ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-κουνελιού, κατσίκας, ή δευτερεύον αντίσωμα ποντικού ανάλογα με παραγωγή των πρωτογενών αντισωμάτων επί μία ώρα, και τοποθετείται με κάλυμμα ολισθαίνει. ΤΟΥΝΕΛ δοκιμασία (FragEL ™ DNA κατακερματισμός Detection Kit, Colorimetric-TdT Enzyme, Calbiochem, La Jolla, CA) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ο ρυθμός της απόπτωσης εκφράστηκε ως η αναλογία των αποπτωτικών καρκινικών κυττάρων προς τον συνολικό αριθμό των ενδοθηλιακών κυττάρων σε 10 πεδία σε μεγέθυνση χ 100.

Στατιστική Ανάλυση

Η unpaired Student του

t

-test χρησιμοποιήθηκε για στατιστικές αναλύσεις των επιπέδων της γλυκόζης, τα επίπεδα ινσουλίνης, και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με

P

& lt? 0,05 υποδεικνύοντας σημασία. Το χ

2 δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση ρυθμού. Rank-log χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση ποντικών επιβίωση. Kaplan-Meier στο SPSS 15.0 για το MS Windows χρησιμοποιήθηκε για να σχεδιάσετε καμπύλες επιβίωσης.

Αποτελέσματα

PDX-1 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινα δείγματα νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος και νησιδιοβλάστωσης, καθώς και κύτταρα ινσουλινώματος ποντικού και ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού υπερπλασία νησιδίων

PDX-1 υπερεκφράζεται σε 36 ανθρώπινα δείγματα του παγκρέατος και της νεοπλασίας νησάκι συμπεριλαμβανομένων 26 νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος (Εικ. 1α) και 10 δείγματα νησιδιοβλάστωσης (Σχ. 1β). PDX-1 επίσης υπερεκφράστηκε σε ινσουλινώματος ποντικού (TC-6 β) κύτταρα (Σχ. 1γ) και στα δύο κύτταρα νησιδίων και κυψελωτά του παγκρέατα των υποτύπων υποδοχέα σωματοστατίνης 1 και 5 ποντίκια knock-out (SSTR

1/5

– /-.) (Εικ 1ε, f, αντίστοιχα) σε σύγκριση με εκείνη των ποντικών άγριου τύπου (Σχήμα 1 d).. Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι PDX-1 είναι σημαντικά υπερεκφράζεται σε τόσο για την ανθρώπινη νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος, nesiodioblastosis και νησίδα ποντίκι νεοπλασίας, που υποδεικνύει ότι είναι ένας πιθανός στόχος για αυτές τις ασθένειες.

ανοσοχρώση με αντι PDX-1-αντισώματος καταδεικνύει υπερέκφραση της PDX-1 σε δείγματα ανθρώπινου νεοπλασία νησιδίων (26 νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος (α), 10 νησιδιοβλάστωσης δείγματα (β), βΤΟ-6 όγκους (c) και 6 δείγματα παγκρέατα από SSTR1 /5

– /- ποντίκια (e, f .) PDX-1 υπερεκφράζεται σε αμφότερες τις νησίδες (ε) και λοβιώδη κύτταρα (στ) του SSTR1 /5

– /- ποντίκια σε σύγκριση με εκείνη των ποντικών φυσικού τύπου όπου μόνο κύτταρα νησιδίων εκφράζεται PDX-1 (δ). PDX-1 θετικά υποδεικνύεται από το βέλος (χ 200).

η

Στόχευση PDX-1 με bi-shRNA

humanPDX-1 ελέγχει τον όγκο του όγκου σε έναν άνθρωπο παγκρεατικού καρκίνου ξενομοσχεύματος μοντέλο ποντικού

In vitro

μελέτες.

Δεδομένου ότι PANC-1 κύτταρα είναι ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος που υπερεκφράζουν αξιοσημείωτα PDX-1, τα κύτταρα αυτά χρησιμοποιήθηκαν τόσο για

in vitro

και

in vivo

μελέτες. bi-shRNA

humanPDX-1 επιμόλυνση των κυττάρων PANC-1 είχε σαν αποτέλεσμα να χτυπήσει κάτω των PDX-1. Αυτό συσχετίστηκε με μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κατά 58%, 40% και 38% σε σύγκριση με τους ελέγχους κενών φορέα σε 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, αντίστοιχα. Υπήρξε μεγαλύτερη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων από εκείνη που παρατηρήθηκε με shRNA

humanPDX-1 στο 0,6 ug και 1,2 μg /ml μέσου δόσεις (Σχ. 2α, 2β), αντιμετωπίζοντας το δυνητικό πλεονέκτημα της δι- shRNA

humanPDX- 1 στη θεραπεία RNAi για καρκίνους του παγκρέατος.

δοκιμασία MTS έδειξε την χρονική πορεία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων για PANC-1 (α) κύτταρα επιμολυσμένα με bi-shRNA

mousePDX-1 και bi-shRNA

humanPDX-1, αντίστοιχα. Μία σύγκριση των ποσοστών της αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μεταξύ bi-shRNA και shRNA διαμόλυνση σε διαφορετικές δόσεις παρουσιάζεται στο PANC-1 κύτταρα (β).

Η

In vivo

μελέτες.

Ένα μοντέλο ποντικού SCID PANC-1 ξενομόσχευμα έχει αναπτυχθεί και καλά μελετηθεί στο εργαστήριο μας? όταν τοποθετείται ενδοπεριτοναϊκά σε SCID ποντίκια, τα κύτταρα PANC-1 αυξήθηκε σε μεγάλους όγκους εντός δύο μηνών. Δύο εβδομάδες μετά την εμφύτευση των κυττάρων, τρεις κύκλους bi-shRNA

humanPDX-1 λιποσυμπλόκων (35 μg /ποντικό, χορηγείται ενδοφλεβίως στις ημέρες μηδέν, 14 και 28) μείωσε σημαντικά PANC-1 όγκο όγκου με λίγες μόνο ποντίκια που έχουν υπολειμματική όγκων κατά μέσο όρο 51 mm

3 σε σύγκριση με το 100% των ποντικών ελέγχου με όγκους κατά μέσο όρο 1199 mm

3 στις 90 ημέρες μετά την αγωγή (ρ & lt? 0,05? Εικ. 3α). Επιβίωση στην ομάδα θεραπείας ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι οι έλεγχοι (115 ± 9.5d vs 85 ± 1.4D, αντίστοιχα? (P = 0.001? Σχ. 3β) χωρίς σημαντική διαφορά στην επιβίωση μεταξύ κενών ποντικών φορέα-επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα ποντίκια (85 ± 9δ vs 76 ± 8δ, p = 0,981). σε εκείνα τα ποντίκια με εναπομένουσα όγκους, όγκους έκφραση PDX-1 ήταν σημαντικά μειωμένη από 95 ± 11,1% σε 12 ± 1,3% κατά τις ημέρες 0 και 90 μετά την αγωγή, αντιστοίχως (Εικ. 3c επάνω πίνακα). IHC ανάλυση του υπολειμματικού όγκων αποκάλυψε μειωμένη έκφραση των δεικτών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, πολλαπλασιαστικών κυττάρων πυρηνικό αντιγόνο (PCNA) και Κυκλίνη Ε, (από 84 ± 9,6% σε 15 ± 0,8% και από 66 ± 10,2% σε 9 ± 2,3% , αντίστοιχα?… Σχήμα 3γ 2

ου και 3

πάνελ rd), και μία αύξηση στην έκφραση Ρ53 (Σχήμα 3γ 4

ου πίνακα) Marked απόπτωση παρατηρήθηκε σε υπολειμματική όγκους κατά την ημέρα 90 μετά θεραπεία, υποδηλώνοντας τα υπολειμματικά όγκοι αποτελούνται αποπτωτικών κυττάρων που στερούνται έκφρασης PDX-1. (Σχ. πινακίου πυθμένα 3c). Είναι αξιοσημείωτο ότι τρεις κύκλους bi-shRNA

humanPDX-1 λιποσυμπλόκων δεν είχε καμία επίδραση επί συστηματικά επίπεδα γλυκόζης και ινσουλίνης , υπογραμμίζοντας τη σημασία του είδους-ειδικό σχεδιασμό του PDX-1 RNAi (Σχ. S1).

Ο όγκος του όγκου αξιολογήθηκε και συγκρίθηκε σε 90 και 120 ημέρες μετά την αρχική θεραπεία μεταξύ των ομάδων θεραπείας και ελέγχου (α). Τα ποσοστά επιβίωσης των ποντικών που έλαβαν θεραπεία και εκείνων που έλαβαν τον άδειο φορέα ελέγχου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Kaplan-Meier σε SPSS (β). Η ανοσοχρώση για διαφάνειες όγκου με PDX-1, PCNA, κυκλίνη Ε, και Ρ53 καθώς και δοκιμασία TUNEL διενεργήθηκαν και αναλύθηκαν (γ). Το θετικό για κάθε δείκτη υποδεικνύεται από το βέλος (χ 200).

Η

Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι πολλαπλούς κύκλους του συστημικού bi-shRNA

humanPDX-1 λιποσυμπλόκων ήταν καλά ανεκτή και αποτελεσματική μειωμένη ανθρώπινο παγκρεατικό καρκίνο όγκο του όγκου και παρατεταμένη επιβίωση σε ποντίκια SCID. Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι PDX-1 είναι ένας πιθανός στόχος χρησιμοποιώντας αυτό το νέο θεραπευτικό πλατφόρμα για την πιο επιθετική μορφή της παγκρεατικής νεοπλασίας.

Στόχευση PDX-1 με bi-shRNA

mousePDX-1 ελέγχει την υπερβολική έκκριση ινσουλίνης από τα κύτταρα ινσουλινώματος ποντικού και σε ένα μοντέλο ποντικού της ινσουλίνωμα

In vitro μελέτες

.

bi-shRNA

mousePDX-1 οδήγησε σε σημαντικά μεγαλύτερη νοκ ντάουν της PDX- 1 έκφραση σε TC-6 κύτταρα β σε δόσεις των 0,6 μg και 1,2 μg /ml μέσου από shRNA

mousePDX-1 και τα κενά στοιχεία ελέγχου φορέα σε δύο κηλίδα western (Σχήμα 4α?. p & lt? 0,05) και ανοσοϊστοχημεία (IHC) αναλύσεις (Εικ. πίνακας κορυφή 4β).

Σύγκριση της αποτελεσματικότητας του bi-shRNA

mousePDX-1, shRNA

mousePDX-1 ή με κενό φορέα σε αναστολή της PDX-1 έκφραση σε β TC-6 κύτταρα δείχνεται με τη χρήση κηλίδα western (α) και κυττάρων ανοσοχρώση (άνω πάνελ, β όπως υποδεικνύεται από το βέλος). έκφραση ινσουλίνης και της γλυκόζης προκαλούμενη έκκριση σε απόκριση knockdown του PDX-1 φαίνεται από κύτταρο ανοσοχρώση (κάτω πάνελ, β όπως υποδεικνύεται από το βέλος) (χ 200) και δοκιμασία ELISA (δ), αντίστοιχα. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε πέντε φορές. PDX-1 και της ινσουλίνης έκφραση σε TC-6 κύτταρα ανοσοχρωματισμένη β ποσοτικοποιούνται (γ). PDX-1 έκφραση επηρεάζεται το RIP-σκηνοθεσία έκφρασης ρεπόρτερ (RIP-mCherry) σε βTC-6 κύτταρα (ε και στ). Τα κύτταρα που εκφράζουν mCherry (κόκκινο) και GFP (πράσινη) οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού (ε και στ). (Χ 200).

Η

bi-shRNA

mousePDX-1 είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά μεγαλύτερη αναστολή της έκφρασης ινσουλίνης και PDX-1 έκφραση από αυτήν που παρατηρείται με shRNA

mousePDX-1 και κενό φορέα κύτταρα ελέγχου, αντίστοιχα (Σχήμα 4c, ρ & lt?. 0,05? και το Σχήμα 4β.). Η επιμόλυνση με bi-shRNA

mousePDX-1 είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά μεγαλύτερη αναστολή της έκκρισης ινσουλίνης γλυκόζης που διεγείρεται από β TC-6 κύτταρα

in vitro

σε σύγκριση με εκείνη που παρατηρείται με shRNA

mousePDX-1 και κενά έλεγχοι φορέα σε συγκεντρώσεις γλυκόζης του 5 και 11 mM (ρ & lt? 0,05), αντίστοιχα (Εικόνα 4d.). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι bi-shRNA

mousePDX-1 αναστέλλει την έκφραση της ινσουλίνης και έκκριση μέσω PDX-1 νοκ ντάουν, και το κάνουν σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι τα συμβατικά shRNA

mousePDX-1 σε κύτταρα ινσουλινώματος ποντικού.

Για να οριοθετηθούν περαιτέρω ο μηχανισμός με τον οποίο νοκ ντάουν της PDX-1 αναστέλλει την έκφραση της ινσουλίνης και έκκριση μέσω μειωμένη ενεργοποίηση της ινσουλίνης αρουραίου υποκινητή-1 (RIP), δημοσιογράφος κατασκευάζει (RIP-mCherry) με ή χωρίς shRNA

mousePDX-1 επιμολύνθηκαν σε β TC-6 κύτταρα. RIP-mCherry-H1-shRNA

mousePDX-1 είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην έκφραση mCherry σε σύγκριση με εκείνη του RIP-mCherry χωρίς shRNA

mousePDX-1 (10 ± 1,6% έναντι 35 ± 8.1% και 12 ± 2,1 % vs 66 ± 13,2% στις 24 ώρες και 48 ώρες, αντίστοιχα, ρ & lt? 0,05? Εικ. 4ε). Η επιμόλυνση του RIP-mCherry-CMV-eGFP-H1 αποκάλυψε ότι το 90% των κυττάρων μορφομετατράπηκαν επιτυχώς, όπως αποδεικνύεται από την έκφραση eGFP. Επιπλέον, το 69% του eGFP-κυττάρων που εκφράζουν εκφράζεται mCherry, και RIP-mCherry-CMV-eGFP-H1-shRNA

mousePDX-1 επιμολυσμένων κυττάρων, 88% των κυττάρων εξέφρασαν eGFP? Ωστόσο, μόνο το 12% των κυττάρων εξέφρασαν mCherry (ρ & lt? 0,05? Εικ. 4στ). Μειωμένη έκφραση PDX-1 επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας western blot. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση του υποκινητή της ινσουλίνης αναστέλλεται σημαντικά από shRNA

mousePDX-1 μέσω knockdown του PDX-1 έκφρασης.

Η επιμόλυνση με bi-shRNA

mousePDX-1 σε β TC-6 κύτταρα είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με χρήση δύο διαφορετικών δοκιμασία: η δοκιμασία MTS αποκάλυψε μειώσεις του 52%, 38%, και 31% έναντι κενά στοιχεία ελέγχου φορέα σε 24, 48, και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, αντίστοιχα (Σχήμα 5α). , και η δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU έδειξε μείωση 42%, 35%, και 42% σε 12, 24, και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, αντίστοιχα, (Σχήμα 5β.) (ρ & lt? 0.05 σε όλα τα χρονικά σημεία). bi-shRNA

mousePDX-1 είχε σαν αποτέλεσμα μεγαλύτερη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων από shRNA

mousePDX-1 σε χαμηλές δόσεις (6 ug /10-cm τρυβλίου) μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση (Εικ. 5c). ανάλυση πρωτεϊνών κυτταρικού κύκλου κατέδειξε μεγαλύτερη ρύθμιση προς τα κάτω των θετικών ρυθμιστών, κυκλίνη Ε, Cdk2, και Cdk4, και αυξητική ρύθμιση των αρνητικών ρυθμιστών, ρ53 και ρ27, σε bi-shRNA

mousePDX-1-κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη του άδειο έλεγχοι φορέα (ρ & lt? 0,05? Εικ. 5d). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι PDX-1 knockdown αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ινσουλινώματος ποντικού μέσω μεταβολές στις πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου.

δοκιμασία MTS έδειξε την χρονική πορεία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων για β TC-6 (α) κύτταρα επιμολυσμένα με bi-shRNA

mousePDX-1 και bi-shRNA

humanPDX-1, αντίστοιχα. Μία σύγκριση των ποσοστών της αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μεταξύ bi-shRNA και shRNA διαμόλυνση σε διαφορετικές δόσεις παρουσιάζεται στο β TC-6 κύτταρα (β). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με BrdU επίσης απεικονίζεται (C). Ανάλυση κηλίδας Western κυτταρολύματος 20 ug από β TC-6 κύτταρα τα οποία επιμολύνθηκαν με shRNAi

mousePDX-1 μετά από 48 ώρες πραγματοποιήθηκε με αντι-PDX-1, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4, ρ53 και ρ27 (δ).

η

In vivo

μελέτες.

Προηγουμένως, το εργαστήριο μας ανέπτυξε ένα θανατηφόρο ινσουλίνωμα ποντίκι μοντέλο, το οποίο έχει μελετηθεί καλά. Οι SCID ποντίκια εμφυτεύονται με κύτταρα ινσουλινώματος του ποντικιού και να υποκύψει σε υπερινσουλιναιμία και υπογλυκαιμία σε περίπου 60 ημέρες. Σε αυτό το μοντέλο ποντικού, τρεις κύκλους είτε ενδοφλέβια bi-shRNA

mousePDX-1 λιποσυμπλόκων (25 μg /ποντίκι δύο φορές την εβδομάδα) ή shRNA

mousePDX-1 λιποσυμπλόκων (35 μg /ποντίκι δύο φορές την εβδομάδα) απέτρεψε τον θάνατο από υπερινσουλιναιμία και υπογλυκαιμία ( Σχ. 6α και β, και γ και δ, αντίστοιχα). Παροδική υπεργλυκαιμία και υποϊνσουλιναιμία παρατηρήθηκαν, αλλά τα επίπεδα επέστρεψαν στα αρχικά επίπεδα κατά την ημέρα 150 μετά την αρχική θεραπεία και στις δύο ομάδες θεραπείας. Στην ομάδα ελέγχου, άδειο λιποσυμπλόκων φορέα δεν είχε επίδραση στη θανατηφόρο υπερινσουλιναιμία και υπογλυκαιμία, όπως φαίνεται στο Σχ. 6α και β.

Τα επίπεδα γλυκόζης Α και C που αντιστοιχούν σε επίπεδα ινσουλίνης Β και D αποκτήθηκαν από το β TC-6 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με bi-shRNAi

mousePDX-1 ή shRNAi

mousePDX-1 , αντίστοιχα. Σε κάθε καταλάβω ένα-d, η διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει τα δεδομένα της ομάδας ελέγχου και η διακεκομμένη γραμμή-dot αντιπροσωπεύει δεδομένα της ομάδας θεραπείας. Νησίδος κύτταρα που εκφράζουν PDX-1, η ινσουλίνη, PP, PCNA, ρ27, κυκλίνη Ε και cdk4 έδειξαν με IHC και απόπτωση κυττάρων νησιδίων δείχθηκε με δοκιμασία TUNEL, όπως υποδεικνύεται από τα βέλη (χ 200) (ε). επιβίωση ποντίκι μετά από τρεις κύκλους θεραπείας είτε κενό φορέα ή bi-shRNAi

mousePDX-1 και κενό φορέα ή shRNAi

mousePDX-1 αξιολογήθηκε και σε σύγκριση με τη χρήση Kaplan-Meier σε SPSS (στ).

η συνολική επιβίωση σε bi-shRNA

mousePDX-1 και shRNA

mousePDX-1 ομάδες θεραπείας ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των ελέγχων (106 ± 7.8d vs 53 ± 1.4D και 146 ± 9.5d vs 53 ± 1.4D, αντίστοιχα, p & lt? 0,05 vs ελέγχους, Σχήμα 6f, Σχ S2)… Πρέπει να σημειωθεί ότι η ασήμαντη διαφορά στην επιβίωση μεταξύ των δύο ομάδων θεραπείας οφειλόταν σε εκούσια θυσία του bi-shRNA

mousePDX-1 ομάδα των ποντικών σε προγενέστερο χρονικό σημείο (Εικ. S2F). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι PDX-1 knockdown χρήση συστημικής bi-shRNA

mousePDX-1 λιποσυμπλόκων εμποδίζει αποτελεσματικά υπερινσουλιναιμικές, υπογλυκαιμική θάνατο σε ένα μοντέλο ποντικού SCID ινσουλίνωμα? Ως εκ τούτου, οι θεραπείες έλεγχο της υπερβολικής ορμονική έκκριση που σχετίζονται με αυτή τη μορφή νεοπλασίας νησίδα.

Αξίζει να σημειωθεί ότι, η συστηματική bi-shRNA

mousePDX-1 και shRNA

mousePDX-1 λιποσυμπλόκων οδηγήσει σε χρονική υπεργλυκαιμία, που αντιπροσωπεύουν ένα προβλέψιμη εκτός στόχου αποτέλεσμα επί νησίδες ποντικού, αφού PDX-1 είναι ο κυρίαρχος ρυθμιστής της έκφρασης της ινσουλίνης. Μετά την επεξεργασία με δι-shRNA

mousePDX-1,

in situ

νησιδίων έκφρασης PDX-1 μειώθηκε σε αγωγή με τρόπο που εξαρτάται, από 88 ± 10,1% επί την ημέρα 0 έως 71 ± 8.6%, 49 ± 9,7% και 23 ± 6,6% τις ημέρες 7, 21, 35 μετά τις θεραπείες, αντίστοιχα, και επέστρεψε στην 83 ± 12,4% την ημέρα 120 μετά τις θεραπείες, όπως φαίνεται στο Σχ. 6ε, επάνω πίνακα. έκφραση ινσουλίνη επίσης μειώθηκε σημαντικά από 92 ± 8,3% κατά την ημέρα 0 έως 61 ± 9,8%, 32 ± 5,3%, και 12 ± 1,9% τις ημέρες 7, 21, 35 μετά τις θεραπείες, αντίστοιχα, και επέστρεψε στην 89 ± 15,3% την ημέρα 120 μετά τις θεραπείες, όπως φαίνεται στο Σχ. 6ε, 2

ου πίνακα. Τα επίπεδα έκφρασης του PP μειώθηκε επίσης σημαντικά στα ίδια χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία (Εικ. 6e, 3

Πίνακας rd). Δείκτες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων των νησιδίων, πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης μελετήθηκαν επίσης πριν και μετά τη θεραπεία. έκφραση Islet PCNA μειώθηκε σημαντικά από 16 ± 1,4% έως 10 ± 0.8%, 7 ± 0,6%, 5 ± 0,2% και 14 ± 2,0% κατά τις ημέρες 0, 7, 21, 35 και 120 μετά τις θεραπείες, αντίστοιχα (Εικ. 6e, 4

ου πίνακα). Τόσο IHC και αναλύσεις στυπωμάτων western των παγκρεατικών τομών έδειξαν αύξηση της έκφρασης ρ27 και μειώνοντας την έκφραση των επιπέδων της πρωτεΐνης στο κυκλίνης Ε και Cdk4 ακόλουθες τρεις κύκλους θεραπείας (Εικ. 6e, 5

ου, 6

ου και 7

ου πάνελ, και το Σχ. S3, αντίστοιχα). bi-shRNA

mousePDX-1 οδήγησε σε μια σημαντική αύξηση στην απόπτωση των νησίδων ποντικού από 1 ± 0,2% κατά την ημέρα 0, 14 ± 2,4%, 24 ± 3,6%, 42 ± 5,5%, και 10 ± 1,1% επί ημέρες 7, 21, 35 και 120 μετά τις θεραπείες, αντίστοιχα (Εικ. 6e κάτω πάνελ). Αδειάστε θεραπεία ελέγχου φορέα είχε καμία επίδραση στην νησίδα PDX-1, η ινσουλίνη, η έκφραση PP, πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Τα δεδομένα αυτά συμφωνούν με τα ευρήματα φαίνεται παρακάτω PDX-1 νοκ ντάουν σε κύτταρα ινσουλινώματος ποντικού

in vitro

. Προτείνουν επίσης ότι η συστηματική bi-shRNA

PDX-1 λιποσυμπλόκων οδηγήσει σε κροταφικό, ήπια υπεργλυκαιμία που προέρχονται από την καταστολή της PDX-1 εντός των νησίδων του Langerhans με επακόλουθη καταστολή της ινσουλίνης και την έκφραση PP, συσχετίζοντας με μεταβολές στις πρωτεΐνες του κύκλου των κυττάρων των νησιδίων και αυξημένη απόπτωση νησάκι.

Η έκφραση όλων των δεικτών νησίδα επανήλθε στις τιμές αναφοράς μετά τη θυσία, γεγονός που υποδηλώνει μια αναγεννητική ικανότητα του ποντικού νησάκια, με αποτέλεσμα την εξομάλυνση των βασικών επιπέδων ινσουλίνης και γλυκόζης. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τα υπολειμματικά όγκους PANC-1 κύτταρο που είχαν χαμηλά επίπεδα PDX-1 και αξιοσημείωτα αυξημένα απόπτωση, υποδηλώνοντας την έλλειψη αναγέννησης. Παρόμοιες μορφές εκφράσεως του PDX-1, η ινσουλίνη, PP, και οι πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου και απόπτωση σε κύτταρα νησιδίων επίσης παρατηρήθηκαν μετά από τρεις κύκλους shRNA

mousePDX-1 λιποσυμπλόκων (Εικ. S4). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η συστηματική bi-shRNA

mousePDX-1 λιποσυμπλόκων αποτρέψει αποτελεσματικά υπογλυκαιμικά θανάτου σε ένα μοντέλο ποντικού ινσουλίνωμα SCID και να οδηγήσει σε

in situ

knockdown του PDX-1 εντός των νησίδων, που οδηγεί σε καταστολή της ινσουλίνης έκφραση και έκκριση και την επακόλουθη υπεργλυκαιμία. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι τυχόν επιπτώσεις των νησιδίων εκτός στόχου ήταν ήπιες και διαχρονικά, γεγονός που υποδηλώνει μια αναγεννητική ικανότητα του ενδοκρινικού παγκρέατος ποντικού. Δεδομένου ότι δεν υπάρχουν υπολειμματικές ινσουλίνωμα κύτταρα που βρίσκονται σε αυτό το μοντέλο μετά τη θεραπεία, το νησάκι δεδομένα αποδεικνύουν την ικανότητα της να χορηγείται συστηματικά θεραπεία με νοκ ντάουν PDX-1 σε αυτό το μοντέλο.

Συστημικού shRNA

mousePDX-1 λιποσυμπλόκων αντίστροφη υπερινσουλιναιμία και υπογλυκαιμία και να μεταβάλλουν την ανοχή στη γλυκόζη σε υποτύπους υποδοχέα σωματοστατίνης 1 και 5 (SSTR

1/5

– /-) knockout ποντίκια

Η SSTR1 /5

– /- μοντέλο ποντικού χρησιμοποιήθηκε σαν τα ποντίκια αντιπροσωπεύουν μια ανοσο-ικανά ινσουλίνωμα-σαν μοντέλο ποντικού με υπερέκφραση του PDX-1 και στα δύο κυψελοειδή κύτταρα και κύτταρα νησιδίων, χαρακτήρισε με υπερινσουλιναιμία και υπογλυκαιμία. Θέλαμε να διαπιστωθεί αν από πολλαπλές ενδοφλέβιες θεραπείες θα μπορούσαν να ανατρέψουν τα βασικά υπερινσουλιναιμία και υπογλυκαιμία και να γίνουν ανεκτές σε αυτές τις ανοσο-ικανά ποντίκια. Τρεις κύκλοι shRNA

mousePDX-1 λιποσυμπλόκων (35 μg /ποντίκι) ήταν καλά ανεκτό και σημαντικά αντιστραφεί βασική υπερινσουλιναιμία και υπογλυκαιμία σε SSTR

1/5

– /- ποντίκια (3 ± 0.2 μg! /l και 83 ± 19,5 mg /dl την ημέρα 0 και 0,5 ± 0,1 μg /l και 205 ± 25,9 mg /dl την ημέρα 35 μετά από τρεις θεραπείες, αντίστοιχα, όπως φαίνεται στο σχήμα 5α και β).? άδειο λιποσυμπλόκων φορέα είχε καμία επίδραση στην υπερινσουλιναιμία και υπογλυκαιμία (Σχ. 7α και β). Αξιοσημείωτα, συστηματικά επίπεδα γλυκόζης και ινσουλίνης επέστρεψε στη βασική γραμμή την ημέρα 150 μετά την αρχική θεραπεία, γεγονός που υποδηλώνει μια αναγεννητική ικανότητα των εν λόγω ποντικού νησιδίων.

Τα επίπεδα γλυκόζης (α) και τα αντίστοιχα επίπεδα ινσουλίνης (β) μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στο το τμήμα μέθοδο. Η ανοσοχρώση για παγκρεατική διαφάνειες με PDX-1, PCNA και δοκιμασία TUNEL διενεργήθηκαν. Κόκκινο χρώση στην κορυφαία ομάδα (γ) δείχνει PDX 1-έκφραση (βέλος)? πράσινη χρώση στο μεσαίο πάνελ (γ) δείχνει την έκφραση PCNA (βέλος). κύτταρα αποπτωτικά όγκων από SSTR1 /5

– /- ποντίκια χρωματίζονται καφέ και εμφανίζονται στο κάτω πάνελ (c) (βέλος) (χ 200). δοκιμασία IPGTT έδειξαν επίπεδα γλυκόζης και τα επίπεδα ινσουλίνης (δ) την ημέρα 7 και τα επίπεδα γλυκόζης και ινσουλίνης (ε) την ημέρα 150 μετά shRNA

mousePDX-1 θεραπεία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± S.E.M. και P & lt? 0.05 δείχνουν τη σημασία

Η

Η ενδοπεριτοναϊκή τεστ ανοχής στη γλυκόζη (IPGTT) πραγματοποιήθηκαν σε SSTR

1/5

– /- ποντίκια κατά τις ημέρες 7 και 150 μετά το.