Αφηρημένο

18β-γλυκυρροχητινικό οξύ (18β-GA) είναι ένα βιοενεργό συστατικό της γλυκόριζας. Η αντικαρκινική δράση του 18β-GA έχει μελετηθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου, ενώ τα αποτελέσματά της στον καρκίνο του πνεύμονα παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Αρχικά έδειξε ότι 18β-GA κατέστειλε αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ανέστειλε την έκφραση καθώς επίσης και δραστικότητα της θρομβοξάνης συνθάσης (TxAS) σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC) Α549 και ΝΟΙ-Η460. Επιπλέον, η χορήγηση 18β-GA δεν είχε καμία επιπλέον ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της μείωσης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που προκαλείται από επιμόλυνση με TxAS μικρή παρεμβολή RNA (siRNA). Επιπλέον, 18β-GA απέτυχαν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στα αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα 16HBE-T και μια άλλη κυτταρική γραμμή NSCLC ΝΟΙ-Η23, και τα δύο εκ των οποίων εκφράζονται ελάχιστο επίπεδο TxAS σε σύγκριση με Α549 και ΝΟΙ-Η460. Ωστόσο, 18β-GA κατάργησε την ενίσχυση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που προκαλείται από επιμόλυνση των ΝΟΙ-Η23 με pCMV6-TxAS πλασμίδιο. Περαιτέρω μελέτη διαπίστωσε ότι η ενεργοποίηση και των δύο εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης (ERK) 1/2 και κυκλικές στοιχείο απόκρισης μονοφωσφορική αδενοσίνη πρωτεΐνη (CREB) που προκαλείται από την επιμόλυνση TxAS cDNA σύνδεσης μπορεί να μπλοκαριστεί πλήρως από 18β-GA. Συνολικά, έχουμε οριοθετείται ότι, μέσω της αναστολής της TxAS και ξεκίνησε ERK /σηματοδότηση CREB της, 18β-GA καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC. Η μελέτη μας έχει τονίσει τη σημασία της 18β-GA σε σχέση με την πρόληψη και τη θεραπεία του NSCLC

Παράθεση:. Huang R-Υ, Chu Υ-L, Huang Q-C, ο Τσεν Χ-Μ, Jiang Ζ-Β, Zhang Χ, et al. (2014) 18β-Glycyrrhetinic Οξύ Καταστέλλει κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω αναστέλλοντας συνθάσης θρομβοξάνης σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (4): e93690. doi: 10.1371 /journal.pone.0093690

Επιμέλεια: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Δεκεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 9 του Μαρτίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: δεύτερης Απριλίου 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. . Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Επιχορήγηση υποστήριξης : η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81302799), η Κίνα Ίδρυμα Μεταδιδακτορικός Science (Αρ 2013M531838) και 2012 Εξαιρετική Νέοι Ίδρυμα επιστήμονας από Guangzhou Πανεπιστήμιο της Κινέζικης Ιατρικής (Νο KAB111133K08). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα βότανα που χρησιμοποιούνται σε παραδοσιακά φάρμακα παρέχουν μια πλούσια δεξαμενή για την εξαγωγή βιολογικά δραστικές ενώσεις. Για παράδειγμα, γλυκόριζα έχει χρησιμοποιηθεί συχνά σε ασιατική ιατρική εδώ και χιλιάδες χρόνια, και τα μεγάλα βιοδραστικό συστατικό γλυκυρριζικού οξέος της διαθέτει διάφορα βιολογικά, φαρμακολογικών, και φαρμακευτικών δραστηριοτήτων, οι οποίες είναι παρόμοιες με εκείνες των ρετινοειδών και στεροειδών [1]. Γλυκυρριζικό οξύ υδρολύεται εύκολα προς 18β-GA στο ανθρώπινο σώμα, ασκώντας με αυτόν τον τρόπο αντιφλεγμονώδη, αντι-virus και ακόμη και αντικαρκινικές επιδράσεις του [2] – [4]. Αν και χημειοπροληπτική δυναμικό της 18β-GA έχει τεκμηριωθεί σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων, όπως ανθρώπινα επιθηλιακό καρκίνωμα ωοθηκών, καρκίνο του μαστού και το γλοιοβλάστωμα [5] – [7], λίγα είναι γνωστά για τις επιπτώσεις της 18β-GA στην ανάπτυξη του όγκου του πνεύμονα .

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η ανεξέλεγκτη ανάπτυξη των ανώμαλων κυττάρων σε ιστούς του πνεύμονα. Περισσότεροι από 1,5 εκατομμύρια θανάτους σε όλο τον κόσμο είναι από καρκίνο του πνεύμονα, που υπερβαίνουν εκείνα από άλλες κακοήθειες [6]. Μεταξύ των πολλών υποτύπων, NSCLC αντιπροσωπεύει το 80% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα [8]. Μέχρι πρόσφατα υπήρχαν ικανοποιητικές θεραπευτικές στρατηγικές για τη διαχείριση των NSCLC. TxAS έχει παρατηρηθεί ότι υπερ-εκφράζεται σε δείγματα NSCLC, σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων [9] – [11]. Σε καρκινικούς ιστούς, TxAS βρίσκεται κατάντη του κυκλοοξυγενασών (COX) -2, και μπορεί να συνθέσει θρομβοξάνης (Τχ) -Α2 από προσταγλανδίνη (PG)-H2, το οποίο μετατρέπεται από COXs από το αραχιδονικό οξύ (ΑΑ) [12]. Η βιολογική ημιζωή του ΤχΑ2 είναι περίπου 30 s σε μοντέλα in-vitro, έτσι ΤχΑ2 ταχέως και μη ενζυματικά υποβαθμισμένη σε ανενεργό μορφή του ΤχΒ2 σε υδατικό διάλυμα [12], [13]. Έτσι, ΤχΑ2 δρα ως παρακρινείς /αυτοκρινών ορμόνη με ισχυρά αποτελέσματα της συσσωμάτωσης των αιμοπεταλίων, αγγειοσυστολή, πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και εισβολή [12], [14]. Τα αποτελέσματα της ΤχΑ2 διαμεσολαβείται μέσω αλληλεπίδρασης με ειδικό υποδοχέα της, ο υποδοχέας θρομβοξάνης (ΤΡ), η οποία είναι μέλος της G-πρωτεΐνης-συζευγμένο οικογένειας υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας [12], [13]. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων 5 ετών, TxAS και των σχετικών TP της έχουν μελετηθεί εκτενώς στην έρευνα για τον καρκίνο. Ο θετικός ρόλος του TxAS και ΤΡ σε παθολογία του όγκου καθορίζεται συνεπώς, και οι αναστολείς /ανταγωνιστές τους έχουν προταθεί να είναι οι πολλά υποσχόμενες αντικαρκινικές παράγοντες [10], [15]. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι και οι δύο TxAS και ανάντη COX-2 του ελέγχονται από ΤΡ, και TxAS είναι σε θέση να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου του πνεύμονα μέσω αυτής της αυτόματης ρυθμιστικής ανατροφοδότησης βρόχο [16]. Περιέργως, σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα αποτελέσματα του αγωνιστή TP μπορεί να μιμηθεί από 18β-GA με παρόμοια χρονική πορεία και την αποτελεσματικότητα [17], γεγονός που υποδηλώνει τη σύνδεση μεταξύ 18β-GA και μοριακή TxAS.

Έτσι, έχουν διερευνήσει την πιθανή επίδραση ενός καρκίνου του 18β-GA στα κύτταρα NSCLC. Αναφέρουμε εδώ ότι 18β-GA θα μπορούσε να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα NSCLC μέσω, τουλάχιστον εν μέρει, την αναστολή της έκφρασης και της δραστηριότητας TxAS. Τέτοια αποτελέσματα μπορεί να αναμένεται να είναι μεγάλη κλινική σημασία.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και τις χημικές ουσίες

Το ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα γραμμές NCI-H23, NCI-Η460 και Α549, καθώς και μια αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή 16HBE-T αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD). Αμφότερα τα κύτταρα NCI-Η23 και 16HBE-T καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM), και ΝΟΙ-Η460 και Α549 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) σε ατμόσφαιρα που περιείχε 5% CO2 στους 37 ° C.

18β-GA και το αραχιδονικό οξύ αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich, και σισπλατίνη παρασχέθηκε από ALADDIN Chemical Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα).

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 5000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Μετά από κατάλληλη επεξεργασία, ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία, χρησιμοποιώντας MTS δοκιμασία, που εκτελούνται εις τετραπλούν, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega, Madison, WI). Η απορρόφηση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας σε μήκος κύματος 492 nm.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

5 κύτταρα /10 ml σε τρυβλία 6 φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύχτα. Ζωντανά κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS. κύτταρα χρωματίστηκαν με χρωστική φλουορεσκεΐνη Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 15 λεπτά. κύτταρα στη συνέχεια εναιωρούνται εκ νέου σε 400 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος αννεξίνης-δέσμευσης (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Τα βαμμένα κύτταρα διατηρήθηκαν επί πάγου και αναλύθηκαν με Beckman Flow κυτταρομετρητές.

Ανοσοενζυμική (ΕΙΑ) δοκιμασία

δραστηριότητα

TxAS παρακολουθήθηκε με προσδιορισμό του επιπέδου της θρομβοξάνης Β2 (ΤχΒ2), ένα σταθερό προϊόν της μη-ενζυματική ενυδάτωση του ΤχΑ2 [12]. Α549 και ΝΟΙ-Η460 κύτταρα σπάρθηκαν στην ίδια πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /10 ml μέσου σε μια πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων. Το υπερκείμενο της καλλιέργειας συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε ακολούθησε την κατάλληλη θεραπεία. ΤχΒ2 ανιχνεύθηκε με συζυγή ΤχΒ2 σημασμένο με υπεροξειδάση χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανοσοδοκιμασίας ενζύμου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Cayman Chemical, Αηη Arbor, ΜΙ).

Παροδικές επιμολύνσεις

Τα κύτταρα σπάρθηκαν με την ίδια πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /10 ml μέσου σε μια πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων. 10 ηΜ TxAS siRNA και των μη στοχευόμενων siRNA (μάρτυρας) επιμολύνθηκαν σε Α549 και ΝΟΙ-Η460, ενώ 2 μg κενή pCMV6 (έλεγχος) ή pCMV6-TxAS πλασμίδιο επιμολύνθηκε σε ΝΟΙ-Η23, με τη βοήθεια των αντιδραστηρίων Lipofectamine 2000 (Invitrogen , Carlsbad, CA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (τεχνολογίες ΟηΟεηε, Rockville, MD). Η έκταση του συγκεκριμένου γονιδίου knockdown ή υπερ-έκφραση ανιχνεύθηκε με πείραμα PCR πραγματικού χρόνου.

Η αλληλουχία του TxAS siRNA είναι rGrUrArArCrUrUrUrArCrCrArArCrArGrArArUrGrGrCrGTC. Οι προϋποθέσεις για siRNA επιμολύνσεις έχουν ως εξής: τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους πυκνότητα 70% με το πρότυπο μέσο. Μετά την απομάκρυνση του μέσου, τα κύτταρα επωάστηκαν με DMEM (χωρίς αντιβιοτικά) που περιέχει προαναμεμιγμένο siRNA (10 ηΜ) και 7.5 μΙ αντιδραστηρίου Lipofectamine 2000, και περαιτέρω επωάστηκαν για 72 ώρες.

ανάστροφης μεταγραφάσης (RT) -PCR και σε πραγματικό χρόνο ποσοτική PCR

RT-PCR και πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [16]. Οι ακόλουθες αλληλουχίες εκκινητών ειδική γονιδιακή χρησιμοποιήθηκαν: 5′-AATAAGAACCGAGACGAACT-3 ‘(νοηματικό) και 5′-GGCTTGCACCCAGTAGAG-3′ (antisense) για ανθρώπινη TxAS? 5’-GGAAATCGTGCGTGACATT-3 ‘(νοηματικό) και 5′-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3’ (antisense) για την ανθρώπινη β-ακτίνη. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του CFX96 Touch Deep Καλά ™ Real-Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR (Bio-Rad Laboratories, Inc. Berkeley, CA). Η πτυχή της αλλαγής του ελέγχου στην έκφραση του mRNA TxAS υπολογίστηκε από την 2

-ΔΔCT μέθοδο.

Western Blot Ανάλυση

Η ολική πρωτεΐνη (20 μg) επιλύθηκε κατά 7% SDS- πηκτής πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western, χρησιμοποιώντας το πιο εξελιγμένο σύστημα χημειοφωταύγειας ανίχνευση (Bio-Rad Laboratories). Western στυπώματα ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι TxAS (τεχνολογίες ΟηΟεηε), μια κατσίκα πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι β-ακτίνης (Santa Cruz Biotechnology), και τα πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι GAPDH, PARP, συνολική και φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 και το συνολικό και φωσφορυλιωμένο CREB (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ). Για να διασφαλιστεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών, οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν και εν συνεχεία ανιχνεύθηκαν με αντι-GAPDH ή αντι-β-ακτίνης αντισώματα.

Στατιστικές Αναλύσεις

Δεδομένα απεικονίζονται ως μέσοι ± SD από τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες πειράματα. t δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για τις συγκρίσεις μεταξύ δύο ομάδες, ενώ μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από τεστ Dunnett εκδόθηκε για να συγκριθούν οι διαφορές μεταξύ περισσότερων από δύο ομάδες. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με SPSS 11.6 στατιστικό λογισμικό (SPSS, Chicago, IL). Ένα δίπλευρη τιμή Ρ & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική για όλα τα πειράματα

Αποτελέσματα

18β-GA κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της επαγωγής της απόπτωσης

Και οι δύο Α549 και NCI-Η460 είναι NSCLC κυτταρικές σειρές. Ο πρώην ανήκει στο αδενοκαρκίνωμα, και το τελευταίο είναι ένα μεγάλο πνεύμονα καρκινική κυτταρική γραμμή. Εκτίμηση του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων με δοκιμασία MTS έδειξε ότι 24 ώρες θεραπεία της 18β-GA κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1Α). Προηγούμενη μελέτη in-vitro έδειξαν ότι το IC

50 αξία του 18β-GA για παρεμπόδιση ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα ήταν 145,3 μΜ [18]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α και 1Β, 18β-GA στα 160 μΜ μειώθηκε σημαντικά το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε περίπου 40,5 ± 10,5% σε Α549 και 38,3 ± 4,6% σε NCI-Η460 (ρ & lt? 0,01 αντίστοιχα). Όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 320 μΜ 18β-GA, μεγαλύτερο ανασταλτικά αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων δείχθηκε, καθώς το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων ήταν κάτω του 30% σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες (ρ & lt? 0.001). Ως εκ τούτου, φάνηκε ότι 160 μΜ 18β-GA ήταν μια βέλτιστη συγκέντρωση για να επιτευχθεί μια σημαντική καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε κύτταρα NSCLC.

Α και Β, τα πειράματα έδειξαν ότι MTS 18β-GA ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των Α549 και NCI -H460 κύτταρα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, 18β-GA αυξημένη κυτταροτοξικότητα των χημειοθεραπευτικών με σισπλατίνη. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01. C, ανάλυση κηλίδος Western κατέδειξε την αυξημένη διασπασμένη PARP (85 kDa) με τη μειωμένη πλήρους μήκους PARP (116 kDa) σε Α549 και κύτταρα ΝΟΙ-Η460 σε επεξεργασία με 18β-GA. GAPDH (37 kDa) χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. D, Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της κυτταρικής απόπτωσης. Ποσοστό κυττάρων σε πρώιμη ή όψιμη απόπτωση παρέχεται στην κάτω δεξιά και πάνω δεξιά τεταρτημόρια, αντίστοιχα. Τα στοιχεία είναι το αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα που επιλέγονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Η σισπλατίνη αποτελεί μέρος του προτύπου της φροντίδας για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Για να προσδιοριστεί η πιθανότητα ότι 18β-GA θα μπορούσαν να έχουν αθροιστική δράση στη σισπλατίνη επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, και οι δύο κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν αναπτύχθηκαν με την παρουσία 5 μg /ml σισπλατίνης μόνος ή 5 μg /ml σισπλατίνης μαζί με 80 μΜ 18β-GA. Όταν έλαβαν μόνο σισπλατίνη, το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων μειώθηκε μόνο κατά 20,5 ± 6,8% σε Α549 και 38,7 ± 6,0% σε NCI-Η460 σε σύγκριση με το μάρτυρα (ρ = 0,076 και 0,041 αντίστοιχα, Σχήμα 1Α και 1Β). Ωστόσο, όταν συνδυάζεται με 80 μΜ 18β-GA, είχαν ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, ο ρυθμός καταστολής μετά συνδυασμένη αγωγή ήταν κάτω του 40% των ελέγχων (ρ & lt? 0,01)., Παρόμοια με την αποτελεσματικότητα των 160 μΜ και μόνο 18β-GA

Για να επιβεβαιωθούν τα δεδομένα που παρατηρήθηκαν με προσδιορισμούς MTS και για να προσδιοριστεί αν η καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων οφείλεται εν μέρει σε αύξηση της απόπτωσης, διασπασμένη PARP μετρήθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα PARP κουνελιού πολυκλωνικό ανίχνευση τόσο πλήρους μήκους όσο και διασπασμένο μορφές. Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 1Γ, η θεραπεία με 18β-GA στα 160 μΜ και 320 μΜ μείωσε τα επίπεδα του πλήρους μήκους PARP και αύξησε τα επίπεδα της διασπασμένης PARP. Το αποτέλεσμα αυτό ενισχύεται περαιτέρω με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της επισήμανσης αννεξίνης-ν σε φωσφατιδυλοσερίνη, ένα φωσφολιπίδιο μεμβράνης που εκτίθεται στην επιφάνεια των αποπτωτικών κυττάρων [19]. Μετά 24 ώρες κατεργασία με 160 μΜ 18β-GA, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ανεξίνη-V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη και ΡΙ. Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 1ϋ, το κλάσμα των κυττάρων σε πρώιμη απόπτωση, που υποδεικνύεται με ΡΙ-θετικά κύτταρα, ήταν σημαντικά υψηλότερη στην 18β-GA-αγωγή ομάδες (περίπου 3,5-φορές για Α549, και περίπου 3,9 φορές για ΝΟΙ-Η460, αντίστοιχα ? P & lt? 0.001). Επιπλέον, περισσότερα αποπτωτικά κύτταρα βρέθηκαν στη θεραπεία της σισπλατίνης σε συνδυασμό με 18β-GA από θεραπεία της σισπλατίνης και μόνο, υποστηρίζοντας περαιτέρω ότι η 18β-GA έχει αθροιστική δράση στη σισπλατίνη.

18β-GA ανέστειλε την έκφραση και δραστικότητα TxAS

Προηγούμενες μελέτες ενοχοποιηθεί έναν πιθανό ρόλο του TxAS στην παθογένεση πολλών διαφορετικών τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των NSCLC [10], [16]. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε αν 18β-GA θα μπορούσε να επηρεάσει TxAS έκφρασης και δραστηριότητας. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι 18β-GA μειωμένο επίπεδο πρωτεΐνης TxAS με χρονο και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Α και 2Β). Συνεπής με αποπτωτικό αποτέλεσμα 18β-GA φαίνεται στο σχήμα 1, 12 ώρες θεραπεία της 18β-GA στα 160 μΜ και 320 μΜ μειωθεί δραματικά τα TxAS επίπεδα. Επιπλέον, 18β-GA (160 μΜ) ανέστειλε το επίπεδο TxAS ήδη από 3 ώρες σε NCI-Η460 και 6 ώρες σε Α549 μετά την επεξεργασία. mRNA εκχυλίστηκε επίσης από κύτταρα επεξεργασμένα με 160 μΜ 18β-GA για 6 ώρες, 12 ώρες και 24 ώρες και στη συνέχεια υποβάλλεται σε PCR πραγματικού χρόνου πειράματα. Εικόνα 2C έδειξε ότι το επίπεδο TxAS mRNA μειώθηκε σημαντικά από 18β-GA σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, η οποία είναι σύμφωνη με τα δεδομένα που παρατηρήθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western.

Α και Β, ανάλυση κηλίδος Western βρήκαν ότι 18β -GA ανέστειλε πρωτεΐνη έκφραση του TxAS (60 kDa) σε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Ακτίνης (45 kDa) χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Εικόνα που εμφανίζεται είναι αντιπροσωπευτικό τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, και πυκνότητας για κηλίδες παρουσιάστηκε στη δεξιά πλευρά της fig.A και το κάτω πάνελ της fig.B. * P & lt? 0.05 και ** Ρ & lt? 0.01 σε σύγκριση με μάρτυρα. C, σε πραγματικό χρόνο PCR αποκάλυψε ότι η έκφραση του mRNA TxAS μπορούσε να μειωθεί με 18β-GA σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Dare εκφράζονται ως πολλαπλάσια του ελέγχου, η οποία υπολογίστηκε από 2

-ΔΔCT μέθοδος με βάση τα δεδομένα που παρατηρήθηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα γίνονται εις τριπλούν. * P & lt? 0.05 και ** Ρ & lt? 0.01. D και Ε, δοκιμασίες ΤχΒ2 ΕΙΑ απέδειξαν τις επιδράσεις της 18β-GA στη δραστηριότητα TxAS στις δύο Α549 κύτταρα και ΝΟΙ-Η460 υπό την απουσία ή παρουσία 0,4μΜ ΑΑ. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο, # p & lt? 0,01 σε σύγκριση με τη θεραπεία AA

Η

Επιπλέον, η επίδραση της 18β-GA σχετικά με τη δραστηριότητα TxAS μετρήθηκε στη συνέχεια.. Όπως προαναφέρθηκε, ΤχΑ2 είναι χημικά ασταθής in-vitro, δραστικότητα TxAS Επομένως, παρακολουθείται με προσδιορισμό του επιπέδου της ΤχΒ2, ένα σταθερό προϊόν της μη-ενζυματική ενυδάτωση του ΤχΑ2 [16]. Αμφότερα τα κύτταρα Α549 και ΝΟΙ-Η460 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 160 μΜ 18β-GA για 24 ώρες, και το μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε για να εκτελέσει δοκιμασία ΤχΒ2 ΕΠΕ. Σε αυτά τα πειράματα, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 0,4 μΜ ΑΑ η οποία είναι ο πρόδρομος της ΤχΑ2 χρησίμευσαν ως θετικοί έλεγχοι, και τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με συγκεκριμένες TxAS αναστολέα φουρεγρελατικό (1 mM) χρησίμευσαν ως επιπλέον ελέγχους. Τα επιλεγμένα δόσεις αυτών των χημικών ουσιών είναι συγκρίσιμες με τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται σε in-vitro πειράματα που αναφέρονται σε άλλες μελέτες [16], [20]. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2D και 2Ε, στις δύο κυτταρικές σειρές, η βιοσύνθεση της ΤχΑ2 κατεστάλη σημαντικά με 18β-GA απουσία ή παρουσία του ΑΑ. 0.4 μΜ ΑΑ προκαλούμενη TXB

2 από 1,8-φορές σε κύτταρα Α549 (ρ & lt? 0,01) και 2,8-φορές σε κύτταρα ΝΟΙ-Η460 (ρ & lt? 0,01) σε σύγκριση με τον έλεγχο. Ωστόσο, η προσθήκη 160 μΜ 18β-GA εξασθενημένα σημαντικά ΑΑ προκαλούμενη TXB

2 από σχεδόν 91% το Α549 και 89% σε NCI-Η460 (ρ & lt? 0,001 αντίστοιχα). Είναι σημαντικό, 18β-GA στα 160 μΜ είναι το ισοδύναμο σε αποτελεσματικότητα με 1 mM φουρεγρελατικό. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι 18β-GA είναι σε θέση να καταργήσει δραστηριότητα TxAS στα κύτταρα NSCLC.

Μαζί, τα δεδομένα του εν λόγω 18β-GA θα μπορούσε να αναστείλει σημαντικά την έκφραση και τη δραστηριότητα των TxAS σημαίνει ότι 18β-GA μπορεί να καταστείλει κυττάρων πολλαπλασιασμού μέσω αναστολής της δράσης TxAS.

18β-GA δεν είχε επιπλέον επιπτώσεις στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όταν TxAS χτυπήθηκε κάτω

για να επαληθεύσετε την πιθανότητα ότι η 18β-GA μπορεί να καταστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω αναστολής της TxAS, εμείς χτυπηθεί κάτω έκφραση TxAS σε Α549 και κύτταρα ΝΟΙ-Η460 χρησιμοποιώντας siRNA επιμόλυνση και 160 μΜ 18β-GA συνέχεια προστέθηκε για 24 ώρες. Μη στόχος siRNA επίσης επιμολύνθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές για να χρησιμεύσει ως μάρτυρας. Real-time PCR έδειξε ότι η έκφραση του TxAS στις δύο κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά καταστέλλεται από 24 ώρες επιμόλυνση TxAS-siRNA, με σχεδόν το 90% της αποτελεσματικότητας καταστολής (Σχήμα 3Α). Η αποτελεσματικότητα διαμόλυνσης επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανάλυση στυπώματος Western (σχήμα 3Β). Μετά την προσθήκη 160 μΜ 18β-GA για άλλες 24 ώρες, δοκιμασίες MTS διεξήχθησαν και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ποσοστά πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549 σε επεξεργασία με 18β-GA, TxAS-siRNA, και ο συνδυασμός των δύο ήταν 41,7 ± 1,7%, 38,3 ± 4,4% και 35,4 ± 6,4% της ομάδας ελέγχου αντίστοιχα (σχήμα 3C). Στα κύτταρα NCI-H460, ήταν 38,9 ± 3,7%, 31,1 ± 3,4% και 28,4 ± 8,0% των ελέγχων, αντίστοιχα (Σχήμα 3D). Φαίνεται ότι σε σύγκριση με TxAS-siRNA επιμόλυνση, η πρόσθετη χορήγηση 18β-GA δεν είχε σημαντικές πρόσθετες επιδράσεις στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.

Α και Β, η καταστολή αποτελεσματικότητα των siRNA στην έκφραση TxAS αποκαλύφθηκε από την πραγματική -Time PCR και ανάλυση κηλίδας Western. Σε πραγματικό χρόνο τα δεδομένα PCR παρατηρήθηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα γίνονται εις τριπλούν και υπολογίζονται από 2

-ΔΔCT μέθοδο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η πτυχή του ελέγχου, ** Ρ & lt? 0,01. Γ και Δ, αναλύσεις MTS έδειξαν ότι TxAS-siRNA επιμόλυνση ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε Α549 και NCI-Η460, και η συμπληρωματική χορήγηση 18β-GA δεν είχαν αθροιστικά αποτελέσματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ποσοστά του ελέγχου και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. ** P & lt? 0,01

Η

Αξίζει να σημειωθεί ότι το αποτέλεσμα αυτό siRNA της TxAS μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων, η οποία είναι σύμφωνη με τα δεδομένα που παρατηρήθηκαν σε προηγούμενες μελέτες μας δείχνουν ότι συγκεκριμένες TxAS αναστολέα φουρεγρελατικό μπορούν να αναστείλουν δραματικά. κυτταρικής ανάπτυξης σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα [11], [16]. Προς στήριξη των δεδομένων μας, Cathcart MC et al έδειξε ότι ένα άλλο TxAS αναστολέα οζαγρέλη ανέστειλε πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω επαγωγής της απόπτωσης σε κύτταρα NSCLC [10], και Moussa O κ.ά. έδειξαν ότι TxAS shRNA κατέστειλε καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρική ανάπτυξη [19]. Επιπλέον, Nie D et al παρατήρησαν ότι κυττάρου όγκου προστάτη κινητικότητα εξασθένισε με αναστολείς TxAS [21].

καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού με 18β-GA συνδέθηκε με TxAS κατάσταση

Τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν ανωτέρω υποστήριξε ότι τα ανασταλτικά αποτελέσματα της 18β-GA μπορεί να οφείλεται στην καταστολή της TxAS σε κύτταρα NSCLC. Για να επαληθευθούν περαιτέρω αυτή η πιθανότητα, έχουμε την επόμενη διαλογή μία σειρά από πνεύμονα κυτταρικών σειρών για την έκφραση TxAS. πειράματα RT-PCR έδειξε ότι, σε σύγκριση με Α549 και ΝΟΙ-Η460, ένα αθανατοποιημένη ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή 16HBE-T και μια άλλη κυτταρική γραμμή NSCLC ΝΟΙ-Η23 εκφράζεται ελάχιστο επίπεδο TxAS (Σχήμα 4Α). Αυτές οι δύο κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις 18β-GA για 24 ώρες, και δοκιμασία MTS διεξήχθη για την ανίχνευση της πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Β και 4C, 18β-GA απέτυχε να καταργήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων τόσο 16HBE-T και ΝΟΙ-Η23, αν και με μικρή τάση καταστολής. Το ποσοστό καταστολής σε δόση των 500 μΜ δεν ήταν περισσότερο από 20% του ελέγχου σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές.

Α, το ελάχιστο επίπεδο TxAS σε 16HBE-T και ΝΟΙ-Η23 και το υπερ-έκφραση του TxAS σε Α549 και ΝΟΙ-Η460 αποκαλύφθηκαν με RT-PCR. Εικόνα που εμφανίζεται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β και Γ, MTS έδειξε ότι ενώ υπήρχε μια μικρή ανασταλτική τάση, 18β-GA απέτυχε να ελέγξει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε 16HBE-T και NCI-H23. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ποσοστά του ελέγχου και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. D και Ε, έκφραση TxAS σε NCI-H23 ήταν υπερ-εκφράζεται από επιμόλυνση με pCMV6-TxAS πλασμίδιο. Σε πραγματικό χρόνο τα δεδομένα PCR παρατηρήθηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα γίνονται εις τριπλούν και υπολογίζονται από 2

-ΔΔCT μέθοδο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η πτυχή του ελέγχου, ** Ρ & lt? 0,01. F, δοκιμασίες MTS έδειξε ότι η προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με επιμόλυνση με pCMV6-TxAS καταργήθηκε με 18β-GA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ποσοστά του ελέγχου και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. ** Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο, # ρ & lt?. 0.01 σε σύγκριση με pCMV6-TxAS διαμόλυνση

Η

Επειδή ΝΟΙ-Η23, που ανήκουν σε αδενοκαρκίνωμα, είναι μια κυτταρική γραμμή NSCLC με το ελάχιστο επίπεδο TxAS, εμείς υπερεκφράζεται TxAS σε αυτή την κυτταρική σειρά με επιμόλυνση με pCMV6-TxAS πλασμίδιο. Κενή πλασμίδιο επίσης επιμολυσμένα για να χρησιμεύσει ως μάρτυρας. Σχήμα 4D απεικονίζεται ότι TxAS ήταν υπερ-εκφράζεται περίπου 8,2-φορές από ό, τι του ελέγχου μετά από 24 ώρες διαμόλυνση με TxAS cDNA. Η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε επίσης για να επιβεβαιώσει την αποτελεσματικότητα διαμόλυνσης (σχήμα 4Ε). Τα κύτταρα στη συνέχεια κατεργάζεται με 160 μΜ 18β-GA για άλλες 24 ώρες. Πειράματα έδειξαν ότι MTS επιμόλυνση με TxAS cDNA προωθηθεί σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από 181,4 ± 3,6% σε σύγκριση με τον μάρτυρα (ρ & lt? 0.001), η επίδραση καταργήθηκε με προσθήκη 18β-GA. Η πολλαπλασιαστική ποσοστό των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά από 18β-GA σε 111,2 ± 2,2% του ελέγχου, σχεδόν ακόμη και με το επίπεδο ελέγχου (Σχήμα 4F). Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν ότι η επίδραση της 18β-GA στο NSCLC συνδέεται με την αλλαγή της έκφρασης TxAS.

Σηματοδότησης

ERK /CREB είχε εμπλακεί σε αποτελέσματα 18β-GA

Σε προηγούμενες μελέτες μας, έδειξαν ότι η ενεργοποίηση και των δύο ΕΚΚ και CREB μπορεί να ανασταλεί από τους αναστολείς ή ανταγωνιστές TxAS TP, και η ενεργοποίηση του CREB καταστέλλεται από ειδικό αναστολέα της ERK [11], [16]. TxAS μονοπάτι /ERK /CREB απευθύνεται επίσης από άλλες μελέτες που έχουν γίνει στο μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα [22], [23]. Ως εκ τούτου, η τελική σειρά πειραμάτων Western blotting έγιναν για να διερευνηθεί αν μονοπάτι ERK /CREB συμμετείχε στις επιδράσεις όγκο καταστολή της 18β-GA. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5Α, τα κύτταρα επιμολυσμένα με pCMV6-TxAS παρουσίασε τα υψηλότερα επίπεδα φωσφορυλιωμένης ERK1 /2 (ρ-ERK1 /2) και φωσφορυλιωμένο CREB (ρ-CREB), τα αποτελέσματα ήταν δραματικά εξασθενημένη με επεξεργασία 160 μΜ 18β- GA. Το αποτέλεσμα είναι, σύμφωνα με τα στοιχεία που τηρούνται από MTS αναλύσεις (Σχήμα 4F). Επιπλέον, προσδιορίσαμε επιδράσεις της 18β-GA στην ενεργοποίηση ERK /CREB σε Α549 και ΝΟΙ-Η460, δύο από τα οποία παρουσιάζουν υψηλά επίπεδα TxAS όπως φαίνεται στο σχήμα 4Α. Το σχήμα 5Β έδειξε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των TxAS με siRNA μπλοκάρει /2 φωσφορυλίωση ERK1 σε Α549 και Η460 κύτταρα. Σταθερά, 160 μΜ 18β-GA κατέστειλε αποτελεσματικά τα υψηλά επίπεδα ρ-ERK και π-CREB σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές. Όχι μεταβολή ήταν ανιχνεύσιμη όσον αφορά την έκφραση του συνόλου των ERK ή ολική CREB σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν.

Α, Western blotting πειράματα έδειξαν ότι η ενεργοποίηση του ERK1 /2 (42/44 kDa) και CREB (43 kDa) που προκαλείται από pCMV6-TxAS επιμόλυνση θα μπορούσε να καταργηθεί από την 18β-GA στα κύτταρα NCI-H23. Εικόνα που εμφανίζεται είναι αντιπροσωπευτικό τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, και πυκνότητας για κηλίδες παρουσιάστηκε στο δεξί πλαίσιο. * Ρ & lt? 0,05 ** ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο? # Ρ & lt? 0,05 και ## ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τη θεραπεία με 18β-GA σε κύτταρα επιμολυσμένα με κενό πλασμίδιο. Β, η καταστολή της ERK1 /2 και ενεργοποίηση CREB μέσω TxAS-siRNA και 18β-GA σε Α549 και ΝΟΙ-Η460 αποκαλύφθηκε με ανάλυση κηλίδος Western. Σε αυτά τα πειράματα, οι συνολικές ERK1 /2 (42/44 kDa), η συνολική CREB (43 kDa) και ακτίνη (45 kDa) χρησίμευσαν ως μάρτυρες φόρτωσης. Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που μπορεί να ανιχνεύσει τα ενδογενή επίπεδα της p-CREB και τη φωσφορυλιωμένη μορφή της πρωτεΐνης CREB που σχετίζονται με την ενεργοποίηση της μεταγραφής παράγοντα-1 (ρ-ATF-1) χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη. Εικόνα που εμφανίζεται είναι αντιπροσωπευτικό τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, και πυκνότητας για κηλίδες παρουσιάστηκε στο δεξί πλαίσιο. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Συζήτηση

Ως ένα από τα βότανα που χρησιμοποιούνται συχνά στην ασιατική ιατρική με χαμηλή τοξικότητα, γλυκόριζα είναι μια αμερικανική Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) ενέκρινε. συμπλήρωμα διατροφής που χρησιμοποιείται σε πολλά προϊόντα. Όπως προαναφέρθηκε, γλυκυρριζικού οξέος είναι το κύριο συστατικό βιοδραστικό, και είναι εύκολα υδρολύεται για να είναι 18β-GA στο ανθρώπινο σώμα για να ασκήσει διάφορες επιπτώσεις, συμπεριλαμβανομένων αντικαρκινική δράση [1] – [4]. Η μελέτη αυτή κατέδειξε την ογκο-κατασταλτικό αποτέλεσμα 18β-GA σε κύτταρα NSCLC και TxAS βρέθηκε να εμπλέκεται σε αυτό το αποτέλεσμα.

Αρχικά έδειξε ότι 18β-GA δοσοεξαρτώμενο μειωμένο πολλαπλασιασμό κυττάρων σε NSCLC κύτταρα Α549 και NCI-Η460. Η ID50 της 18β-GA στα κύτταρα HepG2 ήταν 80 μΜ [24], ενώ στο μοντέλο μας η δόση των 160 μΜ μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων κάτω από το 50% του ελέγχου, η οποία είναι σύμφωνη με την προηγούμενη έκθεση που δείχνει ότι το IC

50 αξία του 18β-GA ήταν 145,3 μΜ σε ένα εξαιρετικά δυνητικά μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή PGCL3 [18]. 80 μΜ 18β-GA σε συνδυασμό με σισπλατίνη απέδωσε ένα σημαντικό αποτέλεσμα καταστολής όγκου, παρά 18β-GA μόνη της σε 80 μΜ δεν είχε καμία αποτελεσματική αποτελεσματικότητα για να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα. Αυτό το αποτέλεσμα υποδεικνύει τη συνεργική επίδραση της 18β-GA επί χημειοθεραπευτικό παράγοντα. Α549 έδειξαν υψηλότερη αντοχή στη σισπλατίνη σε σύγκριση με τα κύτταρα NCI-H460, η οποία είναι σύμφωνη με άλλες μελέτες που αποδεικνύουν ότι Α549 είναι πιο ανθεκτική σε cisplatin από κάποιες άλλες κυτταρικές γραμμές [25], [26]. Η ανάλυση στυπώματος Western παρουσίασε περαιτέρω την αυξημένη σχάση-PARP με την μειωμένη πλήρους μήκους PARP σε κύτταρα κατεργασμένα με 18β-GA στις δόσεις των 160 μΜ και 320 μΜ. Έτσι, η αλλαγή στη συνολική αριθμού βιώσιμων κυττάρων στις 24 ώρες μετά την θεραπεία με 18β-GA σημειώνεται σε πειράματα MTS μπορεί να αποδοθεί στην αυξημένη απόπτωση, η οποία επιβεβαιώνεται από τα δεδομένα που παρατηρήθηκαν με αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής. Συλλογικά, φαίνεται ότι 18β-GA είναι ένας πολλά υποσχόμενος αντικαρκινικός παράγοντας για εφαρμογή στην πρόληψη και τη θεραπεία NSCLC.

προέβη στην εξέταση των μοριακών μηχανισμών που επιτρέπουν 18β-GA ασκεί ογκο-κατασταλτική επίδραση σε κύτταρα NSCLC. Δυνάμει της καταλύει το σχηματισμό ΤχΑ2 που λειτουργεί μέσω ΤΡ υποδοχέα του, TxAS έχει αποδειχθεί ότι έχουν ένα δυνητικό ρόλο στον φαινότυπο του καρκίνου [10], [11], [14] – [16]. Σημαντικά, TxAS και το προϊόν της ΤχΑ2 βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα, σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων [9] – [11], [27]. Μια προηγούμενη έκθεση που δείχνει ότι η 18β-GA είναι το ισοδύναμο σε αποτελεσματικότητα με έναν αγωνιστή TP σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα [17] μας οδήγησε να ρωτήσω αν TxAS είχε εμπλακεί σε αποτελέσματα 18β-GA στο NSCLC. Αυτή η υπόθεση, επίσης, φωτίζεται από ένα γεγονός ότι γλυκυρριζικού οξέος, ο πρόδρομος της 18β-GA, δρα εν μέρει μέσω της αναστολής της COX-2 [28], η οποία προβλέπει PGH2 για TxAS να καταλύουν το σχηματισμό ΤχΑ2 [12], [29]. Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα ότι 24 ώρες θεραπεία της 18β-GA δοσοεξαρτώμενο κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται, η μείωση του TxAS από 12 ώρες αγωγή της 18β-GA υποδηλώνει ότι η 18β-GA επαγόμενη αναστολή της TxAS είναι ένα ανάντη περίπτωση αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση σε NSCLC, η οποία ενισχύεται περαιτέρω από τα ακόλουθα πειράματα πορεία του χρόνου. Επιπλέον, τα επίπεδα του mRNA της TxAS μπορούσε να μειωθεί με 18β-GA σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, υπονοώντας ότι 18β-GA ανέστειλε έκφραση TxAS στο μεταγραφικό επίπεδο. Επιπλέον, η δραστηριότητα TxAS, αντικατοπτρίζεται από το επίπεδο TxB2 εκκρίνεται στο μέσο καλλιέργειας, ανεστάλη δραματικά από 18β-GA. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι TxAS θα μπορούσε να είναι μια κρίσιμη μοριακή βάση της 18β-GA επίδραση στα κύτταρα NSCLC. Με επιμόλυνση με TxAS-siRNA, πολλαπλασιαστικού κυττάρου ικανότητα τόσο του Α549 και ΝΟΙ-Η460 ήταν αποτελεσματικά ανέστειλε, υποστηρίζοντας περαιτέρω το θετικό ρόλο της TxAS στον καρκίνο του πνεύμονα [10], [11], [16]. Είναι σημαντικό ότι, η πρόσθετη χορήγηση 18β-GA δεν έχουν τα αποτελέσματα πρόσθετης ύλης TxAS-siRNA επιμόλυνση. Για την επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων, έχουμε διαλογή μία σειρά από πνεύμονα κυτταρικών σειρών για να προσδιοριστεί η έκφραση του TxAS. NSCLC είναι οποιοσδήποτε τύπος επιθηλιακού καρκίνου του πνεύμονα εκτός από μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα (SCLC), έτσι χρησιμοποιήσαμε 16HBE-Τ το οποίο είναι ένα αθανατοποιημένο ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή για να χρησιμεύσει ως έλεγχος για κυτταρικές γραμμές NSCLC. Σύμφωνα με άλλες μελέτες [9] – [11], το επίπεδο TxAS βρέθηκε να είναι ελάχιστη σε 16HBE-Τ, ενώ ήταν υπερ-εκφράζεται σε NSCLC Α549 κύτταρα και ΝΟΙ-Η460. Μια άλλη κυτταρική σειρά NSCLC NCI-H23 εξέφρασε επίσης ελάχιστο επίπεδο TxAS, καθιστώντας το ιδανικό μοντέλο για την επιμόλυνση των TxAS cDNA. Όπως αναμενόταν, 18β-GA απέτυχε να καταστείλει αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του 16HBE-T και ΝΟΙ-Η23. Φάνηκε ότι οι διαφορετικές επιδράσεις της 18β-GA σε όλες αυτές τις κυτταρικές γραμμές ήταν λόγω της διαφοράς της έκφρασης TxAS.