Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες και τον υπόλοιπο κόσμο. Η έλευση των μοριακά σκηνοθεσία θεραπειών κρατά την υπόσχεση για βελτίωση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας. Κυτοσολικής φωσφολιπάσης Α2 (cPLA

2) συνδέεται με την εξέλιξη του όγκου και ραδιοαντοχή σε μοντέλα όγκου ποντικού. Αξιοποιώντας το cPLA

2 ειδικό αναστολέα PLA-695, προσδιορίσαμε αν η αναστολή cPLA2 radiosensitizes κύτταρα μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) και όγκων. Η θεραπεία με PLA-695 εξασθενημένη προκαλούμενη ακτινοβολία αυξάνει φωσφο-ΕΚΚ και φωσφο-Akt σε ενδοθηλιακά κύτταρα. NSCLC κύτταρα (LLC και Α549) συν-καλλιεργήθηκαν με ενδοθηλιακά κύτταρα (bEND3 και HUVEC) και προ-επεξεργασία με PLA-695 έδειξε ραδιοευαισθητοποίηση. PLA-695 σε συνδυασμό με ακτινοβολία (IR) μείωσε σημαντικά τη μετανάστευση και πολλαπλασιασμό σε ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC & amp? BEND3) και επαγόμενο κυτταρικό θάνατο και εξασθενημένα εισβολή από κύτταρα όγκου (LLC & amp? Α549). Σε μια ετεροτοπική μοντέλο όγκου, ο συνδυασμός του PLA-695 και ακτινοβολία καθυστερημένη ανάπτυξη τόσο LLC και όγκους Α549. LLC και Α549 όγκων σε επεξεργασία με ένα συνδυασμό των PLA-695 και η ακτινοβολία εμφάνισε μειωμένη αγγείωση του όγκου. Σε ένα μοντέλο ραχιαίο δέρμα αναδίπλωση LLC όγκων, την αναστολή της cPLA

2 σε συνδυασμό με ακτινοβολία οδήγησε σε αυξημένη καταστροφή των αιμοφόρων αγγείων του όγκου. Οι αντι-αγγειογενετική αποτελέσματα των PLA-695 και ενίσχυση της αποτελεσματικότητας της ακτινοθεραπείας σε μοντέλα ποντικών του NSCLC δείχνουν ότι οι κλινικές δοκιμές για την ικανότητά της να βελτιώσει τα αποτελέσματα της ακτινοθεραπείας δικαιολογημένη

Παράθεση:. Thotala D, Τέχνη JM, Ferraro DJ, Kotipatruni RP, Bhave SR, Jaboin JJ, et al. (2013) Κυτοσολικά PhospholipaseA2 Αναστολή με PLA-695 Radiosensitizes όγκοι σε μοντέλα του καρκίνου του πνεύμονα των ζώων. PLoS ONE 8 (7): e69688. doi: 10.1371 /journal.pone.0069688

Συντάκτης: Eric Deutsch, Institut Gustave Roussy, Γαλλία

Ελήφθη: 31 Οκτωβρίου του 2012? Αποδεκτές: 14, Ιούνη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 19, Ιουλίου 2013

Copyright: © 2013 Thotala et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Επιχορηγήσεων ΝΙΗ R01-CA12575706 και R01-CA14022002, Startup κονδύλια για Thotala από το Τμήμα Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας, Siteman Cancer Ταμείο Έρευνας από το Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον στο Σεν Λούις και ο Γκραντ από την Pfizer Inc. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, απόφαση δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. PLA-695 λήφθηκε από την Pfizer Inc. υπό τη βιοϊατρική συμφωνίας Pfizer-Washington University. Σύμφωνα με την βιοϊατρική συμφωνίας Pfizer-Washington University το χειρόγραφο υποβλήθηκε στην Pfizer Inc και εκκαθαριστεί για δημοσίευση. Ούτε οι συντάκτες ούτε οποιαδήποτε από τα μέλη της οικογένειάς τους έχουν κανένα οικονομικό ή μη οικονομικό ανταγωνιστικά συμφέροντα με PLA-695 ή Pfizer Inc. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν επίσης ότι αυτό δεν αλλάζει και τηρεί όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες. εκτιμήσεις της Αμερικανικής Αντικαρκινικής Εταιρείας για το 2012 δείχνουν ότι υπήρχαν πάνω από 225.000 νέα κρούσματα και πάνω από 160.000 θάνατοι από καρκίνο του πνεύμονα στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Η ακτινοθεραπεία (RT) εξακολουθεί να αποτελεί αναπόσπαστο μέρος της διαχείρισης καρκίνου του πνεύμονα [2]. Κατά την τελευταία δεκαετία, υπήρξαν σημαντικές βελτιώσεις στα αποτελέσματα της θεραπείας ακτινοβολίας που οφείλονται στις προόδους στην κλινική, φυσική και βιολογική έρευνα [3]. Παρά τις βελτιώσεις αυτές σε θεραπευτικές αγωγές, η τοπική υποτροπή του καρκίνου του πνεύμονα παραμένει ένα μόνιμο πρόβλημα [4]. Οι περισσότεροι ασθενείς με ανεγχείρητο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) έχουν φτωχή πρόγνωση με διάμεση επιβίωση περίπου 18 μήνες, παρά την επιθετική θεραπεία [5], [6]. Έτσι, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να αναπτυχθούν πιο αποτελεσματικές προσεγγίσεις για την αντιμετώπιση του NSCLC.

Η ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) δεν βλάπτει μόνο το πυρηνικό DNA, αλλά ενεργοποιεί επίσης μια σειρά από καταρράκτες σηματοδότησης εντός του κυττάρου [7], [8]. Η φωσφολιπάση Α2 (PLA

2, καταλύει την υδρόλυση των φωσφολιπιδίων της μεμβράνης στην θέση SN-2 για να απελευθερώσει λιπίδιο δεύτερους αγγελιοφόρους [9]. Η ιονίζουσα ακτινοβολία ενεργοποιεί κυτοσολικής φωσφολιπάσης Α2 (cPLA

2) σε ενδοθηλιακά κύτταρα [10]. Μετά την ενεργοποίηση, cPLA

2 διασπά παλμιτικό οξύ για να σχηματίσουν φωσφατιδυλοχολίνη (PC) [11], [12], [13], [14], η οποία στη συνέχεια οδηγεί στην παραγωγή λυσοφωσφατιδυλοχολίνης (LPC), λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA), προσταγλανδίνη Ε

2 (PGE2) και το αραχιδονικό οξύ [15], [16], [17], [18]. Το αραχιδονικό οξύ και LPA παίζουν σημαντικό ρόλο στην εισβολή και τη σηματοδότηση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου [14], [19], [ ,,,0],20], [21]. Η ενεργοποίηση της cPLA

2 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και προάγει τον σχηματισμό αγγειακών δικτύων [16], [17]. LPC πυροδοτεί την κατάντη ενεργοποίηση της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt και ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση (ΜΑΡ) /εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης (ERK), η οποία. οδηγεί σε αυξημένο κυτταρικής βιωσιμότητας του ενδοθηλίου στο μικροπεριβάλλον του όγκου [16], [17], [22]. Η ενεργοποίηση των cPLA

2 στο μικροπεριβάλλον του όγκου οδηγεί σε αυξημένη αγγείωση και αυξημένη ογκογένεση οδηγούν στην ραδιοαντοχή του όγκου και μείωση της αποτελεσματικότητας του ακτινοθεραπεία [23], [24]. Συνδυασμός της ακτινοβολίας με την αναστολή της cPLA

2 σε προκλινικά μοντέλα όγκων του καρκίνου του πνεύμονα έχει δειχθεί ότι κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και μειωμένη αγγειογένεση [25], [26].

Προηγούμενες έρευνες έχουν χρησιμοποιήσει cPLA

2 αναστολείς ακατάλληλη για μετάφραση στην κλινική λόγω της τοξικότητάς τους [17]. Μελετήσαμε τα αποτελέσματα της PLA-695, ένα cPLA

2 αναστολέα που έχει ήδη δοκιμαστεί σε κλινικές δοκιμές. Η μελέτη φάσης Ι (NCT00366262) την αξιολόγηση της ασφάλειας των PLA-695 σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο και η ναπροξένη έχει ολοκληρωθεί (κλινική trials.gov). Αργότερα, η κλινική δοκιμή Φάσης ΙΙ (NCT00396955) έναντι 4 δοσολογικά σχήματα του PLA-695, ναπροξένη, και του εικονικού φαρμάκου σε ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα του γόνατος (κλινική trials.gov). Η παρούσα μελέτη προσδιόρισε την αποτελεσματικότητα των PLA-695 σε συνδυασμό με ακτινοβολία για τη θεραπεία μοντέλα ποντικών του καρκίνου του πνεύμονα.

Βρήκαμε ότι PLA-695 αναστέλλει προκαλούμενη ακτινοβολία φωσφορυλίωση της ERK και Akt σε καλλιεργημένα ενδοθηλιακά κύτταρα. PLA-695 σε συνδυασμό με ακτινοβολία εμποδίζεται μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. PLA-695 ενισχύεται που προκαλείται από την ακτινοβολία κυτταρικό θάνατο και εξασθενημένα εισβολή του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων. PLA-695 ανέστειλε το σχηματισμό νέων αιμοφόρων αγγείων και την αγγειογένεση [26]. Επιπλέον, PLA-695 ενισχύεται η αποτελεσματικότητα της ακτινοβολίας σε δύο μοντέλα ποντικών του καρκίνου του πνεύμονα.

Μέθοδοι

Cell Culture και θεραπεία

Δημοτικό πολιτισμό του Ανθρώπου ενδοθηλιακά κύτταρα ομφαλικής φλέβας (HUVECs) συγκεντρώθηκαν από πολλαπλούς δότες λήφθηκε από Cambrex (East Rutherford, NJ, USA) και διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο ΕΒΜ-2 (Cambrex). Κύτταρα από διόδους 2-5 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. HUVECs στερήθηκαν για 1 ώρα πριν από την αγωγή σε πρόσθετο μέσο άνευ ΕΒΜ-2. κύτταρα μικροαγγειακά 3Β11 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 5% βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS). Κύτταρα από διόδους 3-6 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. 3B11s στερήθηκαν τροφής εντός ϋΜΕΜ + 1% FBS για 3 ώρες πριν από την όλες τις μελέτες. PLA-695 λήφθηκε από την Pfizer Inc υπό την βιοϊατρική συμφωνίας Pfizer-WU. Για την ακτινοβόληση των κυττάρων, Therapax 250 μηχάνημα ακτίνων Χ (Pantak Inc., East Haven, CT, USA) παρέχοντας 2,04 Gy /min σε 250 χρησιμοποιήθηκε kVp. Λόγω της υψηλής ευαισθησίας του HUVECs σε θερμοκρασία και το ρΗ, τα κύτταρα διατηρήθηκαν μέσα σε έναν επωαστήρα δίπλα στο irradiator πριν και μετά τη θεραπεία. Σε πειράματα με PLA-695, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 45 λεπτά πριν από την IR (3 Gy) είτε με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, έλεγχος οχήματος) ή διάφορες συγκεντρώσεις του φαρμάκου σε DMSO (10-600 ηΜ).

Co ΠΑΡΑΔΟΣΗΣ κλωνογονική δοκιμασία επιβίωσης

HUVEC (1,0 × 10

6) και κύτταρα bEnd.3 (1.0 × 10

6) επιστρώθηκαν σε πλάκες 100 mm και μετά από 24 ώρες, Α549 (2 × 10

6) και LLC (2 χ 10

6) κύτταρα επιστρώθηκαν πάνω σε ένθετα transwell (Corning Inc., Corning, ΝΥ). Μετά την συν-καλλιέργεια για 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 300 ηΜ του PLA-695 ή όχημα DMSO ελέγχου για 45 λεπτά πριν από την IR με 0, 2, 4, 6 ή 8 Gy. Μετά τις αγωγές ως συν-καλλιέργεια με είτε PLA-695 ή DMSO αριθμοί υπολογίζονται από LLC και τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν για να ενεργοποιήσετε κανονικοποίηση για αποδοτικότητα επιμετάλλωση. Δοκιμασίες κλωνογονικότητας πραγματοποιήθηκαν επίσης με LLC και AF549 μόνο. Σταθερό αριθμοί κυττάρων καλλιεργήθηκαν για να ενεργοποιήσετε κανονικοποίηση για αποδοτικότητα επιμετάλλωση. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν επί 5 ώρες και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 300 ηΜ του PLA-695 ή όχημα DMSO ελέγχου για 45 λεπτά πριν από την IR με 0, 2, 4, 6 ή 8 Gy. Μετά από επώαση πλάκες 7-10 ημερών σταθεροποιήθηκαν με 70% EtOH και βάφονται με 1% μπλε του μεθυλενίου. Αποικίες που αποτελούνται από & gt? 50 κύτταρα μετρήθηκαν με την προβολή των πλακών κάτω από ένα μικροσκόπιο. Τα κλάσματα επιβίωσης υπολογίστηκαν ως (αριθμός των αποικιών /αριθμός κυττάρων επιστρώθηκαν) /(αριθμός των αποικιών για αντίστοιχου ελέγχου /αριθμός κυττάρων επιστρώθηκαν).

Χρωματομετρική Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας κύτταρο τίτλος 96 Υδατικά μη ραδιενεργό αντιδραστήριο Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού κυττάρου (Promega). Η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών. κύτταρα συντομία υπέστησαν αγωγή είτε με έλεγχο DMSO ή 300 ηΜ PLA-695 για 45 λεπτά και τα ακτινοβολημένα με 3 Gy. Το μέσο αλλάχθηκε μετά από 1 ώρα και οι πλάκες επωάστηκαν για 96 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρωματομετρικά μετά από 96 ώρες με μέτρηση της απορρόφησης στα 490 nm. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και υπολογίστηκαν τα τυπικά σφάλματα.

μορφολογική ανάλυση κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ

κύτταρα LLC και Α549 αναπτύχθηκαν σε πλακίδια θαλάμου και αγωγή είτε με DMSO ή 300 ηΜ PLA-695 για 45 λεπτά και κατόπιν ακτινοβολείται με 3 Gy. Σε 96 ώρες μετά την ακτινοβόληση, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 4 παραφορμαλδεϋδη και στη συνέχεια βάφτηκαν με 2.5 μgml 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό. Μικροφωτογραφίες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού Ολύμπου ΒΧ60 εξοπλισμένο με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Πολυπύρηνα κύτταρα και κύτταρα που περιέχουν γιγαντιαία πυρήνες μετρήθηκαν σε διάφορα τυχαία επιλεγμένα πεδία. Το μέσο ποσοστό των κυττάρων αυτών επί συνολικός αριθμός των κυττάρων υπολογίστηκε από τρία πειράματα.

Tumor Transwell Invasion Δοκιμασία

Ο όγκος Transwell εισβολής σε Matrigel δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση των αλληλεπιδράσεων όγκο ενδοθηλίου και κυτταρική μετανάστευση. Αυτή η δοκιμασία χρησιμοποιεί ένα απλοποιημένο Boyden θάλαμο-όπως σχεδίαση που αποτελείται από δύο θαλάμους που χωρίζονται από ένα φίλτρο επικαλυμμένο με Matrigel. Α549 (1.0 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο) ή LLC (0.6 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο) αιωρήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό και προστέθηκαν στην κορυφή του 24 φρεατίων με 8 matrix- μεμβράνη μm υπόγειο ένθετα επικαλυμμένο πολυανθρακικής μεμβράνης (Bedford, ΜΑ, USA). 500 uL φρέσκου μέσου προστέθηκαν στον κάτω θάλαμο ως χημειο-προσελκυστικό. Για τις μελέτες ραδιοευαισθητοποίηση, και οι δύο θάλαμοι μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με φορέα DMSO ή 300 ηΜ PLA-695 για 45 λεπτά πριν από την IR με 4 Gy. Κύτταρα μετανάστευσαν από την κορυφή θάλαμο διαμέσου των επικαλυμμένων πόρους του φίλτρου στο κάτω μέρος του φίλτρου. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα που παραμένουν στον ανώτερο θάλαμο των ενθέτων μεμβράνης απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας ένα υγρό βαμβάκι. Τα κύτταρα τα οποία προσκολλώνται στην εξωτερική επιφάνεια της μεμβράνης ενθέτου transwell που είχαν εισβάλει μέσα από την Matrigel σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη και χρωματίζονται. Τα κύτταρα που είχαν εισβάλει σε 7-10 πεδίο υψηλής ισχύος (HPF) από κάθε δείγμα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας J εικόνας λογισμικού (ΝΙΗ, Bethesda, MD), και το μέσο αριθμό των κυττάρων που εισέβαλαν μέσω της μεμβράνης ανά HPF υπολογίστηκε. Μέσο και τυπικό σφάλμα για κάθε ομάδα αγωγής υπολογίστηκαν για κάθε ομάδα.

Μεταγωγή σήματος Pathway Analysis

Μετά την αγωγή, τα κύτταρα HUVECs συλλέχθηκαν στους χρόνους που υποδεικνύονται. Συνολική πρωτεϊνική εκχύλιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο M-PER (Pierce, Rockford, IL, USA) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και αναστολείς φωσφατάσης II και III (Sigma, ΜΟ). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο BCA (Pierce). Εκχυλίσματα πρωτεΐνης (40 μg) υποβλήθηκαν σε δυτικές immunoblot ανάλυση χρησιμοποιώντας αντισώματα για την ανίχνευση της φωσφο-Ακί (Thr308 /Ser473), φωσφο-ERK1 /2, (Thr202 /Tyr204), ολική Akt, και συνολική ERK1 /2 (όλα από την κυτταρική σηματοδότηση Technologies.

Danvers, ΜΑ, USA). Αντίσωμα προς ακτίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει πρωτεΐνη φόρτωση σε κάθε λωρίδα. Τα ανοσοστυπώματα αναπτύχθηκαν με χρήση του συστήματος Western Lightning Plus Χημειοφωταύγειας ανίχνευση (PerkinElmer, Wellesley, ΜΑ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή

Κυττάρων Η μετανάστευση

HUVEC και bEND3 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70%. – 80% συρροή σε πλάκες 60 mm. Τρεις παράλληλες τραύματα δημιουργήθηκαν σε κάθε πλάκα με ξύσιμο τη μονοστοιβάδα των κυττάρων με ένα ρύγχος πιπέτας 200 μΐ, και τα όρια των τραυμάτων σημάνθηκαν. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1 ώρα με όχημα (DMSO) ή 300 ηΜ PLA-695, ακολουθούμενο από 3 Gy IR. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν, και κύτταρα που βρίσκονται εντός και εκτός των ορίων του τραύματος μετρήθηκαν από έξι HPFS ανά δείγμα. Τα κύτταρα που κράτησε τα όρια ταξινομήθηκαν ως μη μετεγκατάσταση κύτταρα. Η πυκνότητα των κυττάρων εντός της πληγής παρουσιάζεται ως ποσοστό της συνολικής πυκνότητας κυττάρων στο τρυβλίο. Τα αποτελέσματα προέρχονται από δείγματα εις τριπλούν σε τρεις ανεξάρτητες αναλύσεις μηδέν.

Η ανάπτυξη του όγκου Καθυστέρηση

Η Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου της Ουάσιγκτον στο Σεντ Λούις εγκριθεί ειδικά αυτή τη μελέτη. LLC (10

6) ή Α549 (10

6) κύτταρα εμφυτεύθηκαν στην δεξιά πατούσα C57 /BL6 ποντίκια. Μόλις όλοι οι όγκοι έγιναν μετρήσιμοι από plethysomography, όπως καθορίζεται από τον όγκο του όγκου που φέρει πατούσας μείον όγκος του αντίπλευρου πατούσα, τα ποντίκια οφιοειδή ταξινομημένα σε ομάδες των έξι έως επτά ζώα που αντιπροσωπεύουν παρόμοιες κατανομές μεγεθών των όγκων (εύρος = 40-70 mm

3). Ποντικοί που φέρουν όγκο ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με φορέα (DMSO) ή PLA-695 στο 7,5 mg ανά kg σωματικού βάρους μία φορά την ημέρα για πέντε συνεχόμενες ημέρες. Τριάντα λεπτά μετά την ένεση οι ποντικοί φάρμακο αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνη και τοποθετημένα στο ακτινοβολητή Pantak και ακτινοβολήθηκε με 2 Gy την ημέρα για πέντε διαδοχικές ημέρες για ένα σύνολο 10 Gy. Μόλυβδος μπλοκ (πάχους 10 mm) χρησιμοποιήθηκαν για να προστατεύσει το κεφάλι, τον θώρακα, και την κοιλιά. Το μέγεθος του όγκου παρακολουθήθηκε κατά μήκος με πληθυσμογραφία. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν με CO

2 ασφυξία όγκους φορά φτάσει σε ένα όγκο περίπου 700 mm

3 ή όταν εξέλκωση έγινε εμφανής στην πατούσα σύμφωνα με τις οδηγίες φροντίδας των ζώων.

In vivo αγγειογένεση Δοκιμασία ραχιαίου δέρματος φορές Επιμελητήριο μοντέλο

Η τεχνική εμφύτευσης του μοντέλου θαλάμου της πτυχής του δέρματος της ραχιαίας έχει περιγραφεί στο παρελθόν [27]. Εν συντομία, θαλάμους διάχυσης που περιέχει κύτταρα LLC (1 × 10

6 κύτταρα ανά θάλαμο) εισήχθησαν στο θύλακα αέρα ραχιαίο γίνει κάνοντας μια επιφανειακή τομή οριζόντια κατά μήκος της άκρης του θύλακα αέρα ραχιαίο. Το δέρμα ράβεται προσεκτικά μετά την τοποθέτηση τους θαλάμους κάτω από το δέρμα ποντικών. Οι αγωγές ποντίκια διεξήχθησαν 5 έως 7 ημέρες μετά από χειρουργική εισαγωγή των θαλάμων διάχυσης. Το δέρμα που καλύπτει φορές τους θαλάμους αφαιρέθηκε προσεκτικά μετά euthanizing τα ποντίκια και φωτογραφήθηκε κάτω από το ορατό φως. Ο αριθμός των επαγόμενων όγκων αιμοφόρων αγγείων μετρήθηκε σε δέκα διαφορετικά πεδία εντός του θαλάμου στην περιοχή της περιτονίας αεροσάκου.

ιστολογική ανάλυση αγγειακό σύστημα του όγκου

Ο όγκος ποντικών που φέρουν θυσιάστηκαν 24 ωρών μετά αποκόπηκαν η τελική θεραπεία και οι όγκοι, μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη, ενσωματωμένο σε παραφίνη και τεμαχίστηκαν. Τμήματα (πάχους 5 μm) κατεργάστηκαν με 20 μg /ml πρωτεϊνάσης Κ για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύχτα με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι του ανθρώπινου παράγοντα Von Willebrand (vWF) (1:100 αραίωση? Dako, Carpinteria, CA ). Τομές ιστού στη συνέχεια επωάστηκαν με Alexa Fluor 488 αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (αραίωση 1:500? Invitrogen Molecular Probes) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Alexa Fluor 488 χρωματισμένο αγγεία μετρήθηκαν σε τρία τυχαία επιλεγμένα HPFS σε κάθε ένα από τρία τμήματα ανά όγκο. Αγγείωση προσδιορίστηκε ως ο μέσος αριθμός των χρωματισμένων σκαφών ανά HPF. Όγκου περιοχή αγγειακή διατομής καθορίστηκε Παρομοίως, χρησιμοποιώντας ΝΙΗ Image J λογισμικό, στο οποίο η περιοχή που περικλείεται από σκάφη που χωρίστηκε από τη συνολική έκταση του HPF για να προσδιοριστεί το ποσοστό αγγειακή περιοχή.

Στατιστική Ανάλυση

ο μέσος όρος και το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) από κάθε ομάδα θεραπείας υπολογίστηκαν για όλα τα πειράματα. Ο αριθμός των δειγμάτων αναφέρεται στην περιγραφή του κάθε πειράματος. Οι μαθητές T-test ήταν η χρήση να συγκρίνει δύο ομάδες θεραπείας. Ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει την αποτελεσματικότητα της θεραπείας σε μελέτες καθυστέρηση ανάπτυξης του όγκου. Ένα

ρ

αξία των & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Επίδραση των PLA-695 σε Pro-σηματοδότηση επιβίωσης μετά από ακτινοβολία

Η ενεργοποίηση της ERK και Akt συμβαίνει ταχέως μετά την ακτινοβολία στα κύτταρα HUVEC (Εικ. 1). Η θεραπεία με PLA-695 εξασθενεί την προκαλούμενη από IR ERK φωσφορυλίωση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1 Α). ενεργοποίηση ERK ανάγεται σε βασική γραμμή (κύτταρα ψευδο-θεραπεία) κατά 300 ηΜ PLA-695. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, (600 nm), τα επίπεδα του ΕΚΚ φωσφορυλίωση πτώση κάτω από τα αρχικά επίπεδα. Το IR επαγόμενη φωσφορυλίωση της Akt επίσης καταργείται όταν τα κύτταρα HUVEC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 300 ηΜ του PLA-695 (Εικ. 1 Β). Βρήκαμε παρόμοια αποτελέσματα 3Β11 κύτταρα κατεργασμένα με 300 ηΜ PLA-695 (Εικ. 1 C και D).

κύτταρα HUVEC (Α) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του PLA-695 όπως υποδεικνύεται για 45 λεπτά πριν από τη θεραπεία με 3 Gy, τα κύτταρα λύθηκαν σε 5 λεπτά μετά την IR. HUVEC (Β) και 3Β11 (C & amp? D) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 300 ηΜ PLA-695 για 45 λεπτά πριν από τη θεραπεία με 3 Gy. Τα κύτταρα λύθηκαν σε 5 λεπτά μετά την IR. Ορατή είναι αναλύσεις ανοσοστυπώματος χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα προς φωσφο-Ακί

Ser473, ολική Akt, φωσφο-ERK1 /2, σύνολο ERK1 /2, και ακτίνη.

Η

PLA-695 ευαισθητοποιεί Α549 και LLC Cells σε ιοντίζουσα ακτινοβολία

για να αξιολογηθεί ο ρόλος του cPLA

2 στην βιωσιμότητα των ακτινοβολημένων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, υποβάλλαμε σε αγωγή καρκίνου πνεύμονος κυτταρική σειρά ποντικού LLC και της ανθρώπινης καρκίνου του πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή με 300 ηΜ του PLA-695 για 45 λεπτά πριν από την ακτινοβολία. Πραγματοποιήσαμε κλωνογόνο δοκιμασίες είτε ως ανεξάρτητες καλλιέργειες (Εικ. 2Α) ή σε συν-καλλιέργεια (Εικ. 2Β) με ενδοθηλιακά κύτταρα (LLC με bEND3 και Α549 με HUVEC). Η αποτελεσματικότητα επιμετάλλωση των κυττάρων LLC ήταν 66% για τα επεξεργασμένα κύτταρα DMSO και 60% για κύτταρα κατεργασμένα PLA-695. Η ικανότητα επίστρωσης των κυττάρων Α549 ήταν 64% για το DMSO κατεργασμένα κύτταρα και 52% για κύτταρα κατεργασμένα PLA-695. Τα κύτταρα κανονικοποιήθηκαν για την επίστρωση της αποδοτικότητας κατά τον υπολογισμό του κλάσματος επιβίωσης για κλωνογόνο δοκιμασίες. Προεπεξεργασία των κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα με PLA-695 πριν από την IR είχε καμία επίπτωση στην clonogencity όταν αναπτύσσονται ως ανεξάρτητες καλλιέργειες είτε LLC (2 Gy P = 0,53, 4 Gy P = 0,87, 6 Gy P = 0,02, 8 Gy P = 0.01) ή Α549 (2 Gy Ρ = 0,753, 4 Gy Ρ = 0.441, 6 Gy Ρ = 0,636) (Σχ. 2Α). LLC και Α549 κύτταρα που αναπτύσσονται ως συν-καλλιέργειες και να αντιμετωπίζονται με PLA-695 πριν από την IR έδειξε σημαντικά μειωμένη επιβίωση των κυττάρων και στα δύο κύτταρα LLC (2 Gy P = 0,003, 4 Gy P & lt? 0.001, 6 Gy P & lt? 0.001, 8 Gy P = 0,012) και τα κύτταρα Α549 (2 Gy Ρ = 0,163, 4 Gy Ρ & lt? 0.001, 6 Gy Ρ & lt? 0.001, 8 Gy Ρ = 0,031) σε σύγκριση με κύτταρα που κατεργάζονται με ακτινοβολία μόνο (Σχήμα 2Β).. παράγοντες ενίσχυσης της δόσης υπολογίστηκαν κατά την κυτταρική επιβίωση 10% διαιρώντας τη δόση της ακτινοβολίας από την καμπύλη επιβίωσης ακτινοβολίας μόνο με την αντίστοιχη δόσης από το PLA-695 συν καμπύλη ακτινοβολία. Οι παράγοντες ενίσχυσης δόση ήταν 1.17 για τα κύτταρα LLC, 1,28 για τα κύτταρα Α549 (Σχ. 2Β).

LLC και Α549 κύτταρα αναπτύχθηκαν ανεξάρτητα (Α) ή ως συν-καλλιέργειες (Β) με κύτταρα HUVEC και bEND3 και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 300 ηΜ PLA-695 σε μέσο ελεύθερο ορού για 45 λεπτά πριν από την IR. Τα κύτταρα στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 0, 2, 4, 6 και 8 Gy και επιστρώθηκαν για δοκιμασία κλωνογόνο επιβίωση. Μετά από 7-10 ημέρες, τα κύτταρα υπέστησαν χρώση με 1% κυανούν του μεθυλενίου και οι αποικίες που αποτελούνται από & gt? 50 κύτταρα μετρήθηκαν με μικροσκοπία. Επιβίωση αποικιών κανονικοποιήθηκαν για επιμετάλλωση απόδοση. Εμφανίζονται είναι κατά μέσο όρο κλάσματα επιβίωσης και SEM.

Η

PLA-695 Μειώνει Διάδοση στα ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα μετά από ακτινοβόληση

Για να διαλευκανθεί ο ρόλος της cPLA

2 τόσο στην ενδοθηλιακή κύτταρα και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, ερευνήσαμε πώς PLA-695 επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό σε LLC, Α549, bEND3 και HUVEC κύτταρα (Σχ. 3Α). Ίσοι αριθμοί από LLC, Α549, bEND3 και τα κύτταρα HUVEC τοποθετήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 300 ηΜ του PLA-695 για 45 λεπτά πριν από την IR. Οι πλάκες αναγνώστηκαν στα 24, 48, 72, ή 96 h χρησιμοποιώντας την δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων χρωματομετρική με μέτρηση της απορρόφησης στα 490 nm. κύτταρα bEND3 σε επεξεργασία με PLA-695 μόνος παρουσίασαν σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με DMSO σε 24 ώρες (Ρ & lt? 0.001), 48 ώρες (Ρ = 0,002) και 96 ώρες (Ρ & lt? 0.001) και στις 72 ώρες (Ρ = 0,047). κύτταρα bEND3 αγωγή με θεραπεία συνδυασμού του PLA-695 με IR έδειξαν σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με IR μόνη της σε 72 ώρες (Ρ = 0,001) και 96 ώρες (Ρ = 0,002) και μείωσε τον πολλαπλασιασμό κατά 24 ώρες (Ρ = 1,0) και 48 ώρες (Ρ = 0,023). HUVEC κύτταρα σε επεξεργασία με PLA-695 μόνος παρουσίασαν σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με DMSO σε 24 ώρες (Ρ = 0,003), 48 ώρες (Ρ = 0,016), 72 ώρες (Ρ = 0,013), και 96 ώρες (Ρ & lt? 0.001). HUVEC κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με συνδυασμό θεραπεία του PLA-695 με IR έδειξαν σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με μονοθεραπεία στις 24 ώρες (Ρ = 0.004) 72 ώρες (Ρ = 0,002) και 96 ώρες (Ρ & lt? 0.001) IR. κύτταρα LLC σε επεξεργασία με PLA-695 μόνος έδειξε μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με DMSO σε 24 ώρες (Ρ = 0,076), 48 ώρες (Ρ = 0,017), 72 ώρες (Ρ = 0,028) και 96 ώρες (Ρ = 0,175). κύτταρα LLC αγωγή με θεραπεία συνδυασμού του PLA-695 με IR έδειξαν σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με IR μόνη της σε 24 ώρες (Ρ = 0,001), 48 ώρες (Ρ = 0,010), 72 ώρες (Ρ & lt? 0.001) και 96 h (P & lt? 0.001). Α549 κύτταρα κατεργασμένα με PLA-695 μόνος έδειξαν μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με DMSO σε 24 ώρες (Ρ = 0,017), 48 ώρες (Ρ = 0,008), 72 ώρες (Ρ = 0,070) και 96 ώρες (Ρ = 0,079). Α549 κύτταρα που κατεργάζονται με μια θεραπεία συνδυασμού PLA-695 με IR έδειξε σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με IR μόνη της σε 72 ώρες (Ρ = 0,003) και 96 ώρες (Ρ = 0,003).

Ίσοι αριθμοί bEND3 , HUVEC, LLC και τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 300 ηΜ PLA-695 για 45 λεπτά πριν από τη θεραπεία με 3 Gy. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με χρωματομετρική δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε 24, 48, 72 και 96 ώρες μετά τη θεραπεία. Ορατή είναι η απορρόφηση στα 490 nm. Β PLA-695 ενισχύει τον κυτταρικό θάνατο σε ακτινοβολημένα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. LLC και Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 300 ηΜ PLA-695 ή DMSO για 45 λεπτά πριν από τη θεραπεία με 3 Gy. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αννεξίνη V-APC και ιωδιούχο προπίδιο και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής σε 24, 48, 72 ή 96 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Παρουσιάζονται οι γραφικές παραστάσεις γραμμή που δείχνει διπλάσια αύξηση του κυτταρικού θανάτου κατά τον έλεγχο για κάθε θεραπεία με SEM από τρία πειράματα.

Η

PLA-695 Ενισχύει κυτταρικό θάνατο σε ακτινοβολημένα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα

cPLA

2 έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούν σηματοδότηση μέσω του Ras /Raf /ERK μονοπάτι [10], [28]. Η ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης Α2 έχει επίσης υποδειχθεί ότι είναι η αιτία της καθυστερημένης κυτταρικού θανάτου που επάγεται από την H

2O

2 [29]. Μελετήσαμε τον κυτταρικό θάνατο σε LLC και Α549 με χρώση για αννεξίνη V και, ΡΙ χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής σε 24, 48, 72 και 96 ώρες μετά την IR (Σχ. 3Β). θεραπεία PLA-695 κυττάρων LLC δεν προκάλεσε καμία σημαντική κυτταρικό θάνατο σε όλα τα χρονικά σημεία δοκιμάστηκαν. Α549 κύτταρα κατεργασμένα με PLA-695 έδειξε μια μικρή αύξηση σε κυτταρικό θάνατο με το χρόνο. IR μόνη προκάλεσε επίπεδο του κυτταρικού θανάτου σε αμφότερα LLC και τα κύτταρα Α549 η οποία ήταν παρόμοια σε όλα τα χρονικά σημεία που ελέγχθηκαν (24, 48, 72 και 96 ώρες). Συνδυασμένη θεραπεία με PLA-695 και IR δεν προκάλεσε αυξημένο κυτταρικό θάνατο σε σύγκριση με IR μόνη της σε 24 ώρες και στις δύο κύτταρα LLC (Ρ = 0,831) και τα κύτταρα Α549 (Ρ = 0,192). Στις 48 ώρες η συνδυασμένη θεραπεία παρουσίασαν μέτρια κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα LLC (Ρ = 0.100) και σημαντική κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα Α549 (Ρ & lt? 0.001). Στις 72 h και 96 h, η συνδυασμένη θεραπεία παρουσίασαν σημαντική κυτταρικό θάνατο σε δύο κύτταρα LLC (Ρ & lt? 0.001) και τα κύτταρα Α549 (Ρ & lt? 0.001).

Αξιολογήσαμε επόμενο το πυρηνικό μορφολογία των ακτινοβολημένων κυττάρων χρησιμοποιώντας χρώση ϋΑΡΙ (Εικ. 4)? τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια με την εκτίμηση που έγινε από χρώση με ιωδιούχο αννεξίνης V /προπίδιο. Σε 96 ώρες μετά την ακτινοβόληση, η συνδυασμένη θεραπεία με PLA-695 και IR οδήγησε σε σημαντικά πιο πολυπύρηνα κύτταρα και κύτταρα με διευρυμένη πυρήνες (χαρακτηριστικό της μιτωτικής καταστροφής) και στα δύο LLC κύτταρα και κύτταρα Α549 (Ρ 0,006), σε σύγκριση με IR μόνο ( LLC, Ρ = 0,001? Α549, Ρ = 0.006) και PLA695 μόνο (LLC, Ρ = 0.001?. Α549, Ρ = 0,002)

LLC και Α549 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλακίδια θαλάμου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 300 ηΜ PLA -695 ή DMSO για 45 λεπτά πριν από την ακτινοβολία με 3 Gy. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν 96 ώρες αργότερα και βάφονται με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-phenyllindole (DAPI). Παρουσιάζονται οι μικρογραφίες των ϋΑΡΙ βαμμένων κυττάρων, τα βέλη δείχνουν πολυπύρηνα κύτταρα και γιγαντιαία κύτταρα. Πολυπύρηνα και γιγαντιαία κύτταρα μετρήθηκαν σε πέντε τυχαία επιλεγμένα πεδία. Ένα ιστόγραμμα που απεικονίζει το μέσο ποσοστό των πολυπύρηνα γιγαντιαία κύτταρα /για κάθε θεραπεία εμφανίζεται.

Η

PLA-695 Μειώνει μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων μετά από ακτινοβολία

Πραγματοποιήσαμε βαθειά πληγή δοκιμασίες κλείσιμο με HUVEC και κύτταρα bEND3 να προσδιοριστεί η επίδραση του PLA-695 (Εικ. 5). Σε αυτή τη δοκιμασία, μια πληγή δημιουργήθηκε στην κυτταρική καλλιέργεια (Baseline) και κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα (DMSO), όχημα και 3 Gy (DMSO + IR), PLA-695 (300 ηΜ), ή με συνδυασμό των PLA-695 και 3 Gy (PLA-695 + IR). Η μετανάστευση των κυττάρων υπολογίστηκε μετρώντας τον αριθμό των κυττάρων που κινούνται εντός του τραύματος (Εικ. 5). Βρήκαμε ότι 24 ώρες μετά τη θεραπεία, η βαθειά πληγή είχε σχεδόν πλήρως καλυμμένα σε HUVEC και bEND3 καλλιέργειες που κατεργάζονται με DMSO. Η ακτινοβόληση μόνη της οδήγησε σε μείωση της μετανάστευσης σε HUVEC (82%) και bEND3 κύτταρα (77%). Παρόμοια μείωση παρατηρήθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με PLA-695 μόνη της σε τόσο HUVEC (74%) και bEND3 (62%). Ο συνδυασμός των PLA-695 και IR οδήγησε σε σημαντική μείωση της μετανάστευσης των HUVEC (61%? Ρ = 0,003) και bEND3 (48%? Ρ = 0,012) κύτταρα σε σύγκριση με IR μόνο (Σχήμα 5).

HUVEC και bEND3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 60 mm και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε 80% συρροή. Το κυτταρικό στρώμα ημι-συρροή ήταν ξύνεται χρησιμοποιώντας 200 μl αποστειρωμένου ρύγχος πιπέτας για να δημιουργήσετε μια γρατσουνιά /τραύμα άνευ κυττάρων. Τα υπόλοιπα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με έκδοχο ελέγχου ή 300 ηΜ PLA-695 για 45 λεπτά πριν από την IR με 3 Gy. Η μετανάστευση εκτιμήθηκε στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία. Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν στο μηδέν /τραύμα μετρήθηκαν και κανονικοποιήθηκαν ως προς τις γύρω πυκνότητα κυττάρων ανά HPF. Παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες και ιστογράμματα που αντιπροσωπεύουν τις μέσες ποσοστά των μεταναστευτικών κυττάρων σε σχέση με τους αντίστοιχους ελέγχους με SEM από τρία πειράματα.

Η

PLA-695 Μειώνει εισβολή των καρκινικών κυττάρων μετά από ακτινοβολία

cPLA

2 έχει ενοχοποιηθεί στην κυτταρική μετανάστευση, σχηματισμός σωληναρίων [26] και εισβολή [30]. Εξετάσαμε την επίδραση της PLA-695 επί των κυττάρων του όγκου εισβολή στο LLC και κυτταρικές γραμμές Α549 χρησιμοποιώντας τους προσδιορισμούς transwell-εισβολή. Σε LLC, παρατηρήσαμε μία μείωση 24% στο κελί εισβολή όταν τα κύτταρα ακτινοβολούνται με 4 Gy? Ωστόσο, προ-θεραπεία με 300 ηΜ PLA-695 πριν από την IR οδήγησε σε περαιτέρω μείωση 56% στο κελί εισβολή (Ρ = 0,003? Εικ. 6). Η επεξεργασία των κυττάρων LLC με PLA-695 μόνος έδειξαν μείωση 63% σε εισβολή σε σύγκριση με τον έλεγχο. Ομοίως σε κύτταρα Α549, ακτινοβολία μόνο προκάλεσε μείωση κατά 30% σε εισβολή, ενώ τα προ-θεραπεία με 300 ηΜ PLA-695 πριν από την IR μειωθεί εισβολή περαιτέρω κατά 37% (Ρ & lt? 0,001? Εικ. 6) .Treatment των κυττάρων Α549 με PLA-695 μόνο παρήγαγε μια μείωση 58% σε εισβολή σύγκριση με τον έλεγχο.

LLC και Α549 κύτταρα προστέθηκαν στα 8 ένθετα micron και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 300 ηΜ PLA-695 ή DMSO για 45 λεπτά πριν από την 3 Gy ακτινοβολία. Τα κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλουν /μεταναστεύσει από την κορυφή θάλαμο διαμέσου των επικαλυμμένων πόρους του φίλτρου στην πλήρες μέσο στο κάτω μέρος των ενθέτων για 48 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και τα κύτταρα που εισέβαλαν μέσω της μεμβράνης υπολογίστηκε μετρώντας τον αριθμό των κυττάρων ανά HPF. Ορατή είναι αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες και μια γραφική παράσταση ράβδων που παριστάνει τον αριθμό των μεταστατικών κυττάρων με SEM? * P & gt?. 0.05

Η

PLA-695 Radiosensitizes όγκοι σε ζωικά μοντέλα της NSCLC

Για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα των PLA-695 ως radiosesitizer στο NSCLC, χρησιμοποιήσαμε ετεροτοπική LLC και Α549 μοντέλα όγκων που αναπτύσσονται σε C57 και γυμνά ποντίκια, αντίστοιχα. Όταν οι LLC και Α549 όγκοι ήταν ψηλαφητοί (εύρος = 40-70 mm

3), οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε αγωγή επί πέντε διαδοχικές ημέρες με DMSO (όχημα), ακτινοβολία (IR) μόνο (10 Gy σύνολο, 5 κλάσματα 2 Gy ), PLA-695 μόνο (7,5 mg /kg /ημέρα, ενδοπεριτοναϊκή), ή ένας συνδυασμός των PLA-695 και IR. Μεταγενέστερες ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πληθυσμόμετρο. Αναλύσαμε όγκου καθυστέρηση ανάπτυξης σε αυτά τα πειράματα με δύο τρόπους. Πρώτον, ο χρόνος για τον όγκο του όγκου να φτάσει ένα μέγεθος των 0,25 εκατοστών

3 προσδιορίστηκε. Δεύτερον, αναλύσαμε τους όγκους όγκου την ημέρα 7 για όγκους LLC και την ημέρα 15 για όγκους Α549 (Εικ. 7). Οι όγκοι LLC μεγαλώνουν πολύ πιο γρήγορα από ό, τι οι όγκοι Α549. Τα ανεπεξέργαστα όγκων και IR αντιμετωπίζονται οι όγκοι πήρε 7 ημέρες για να φθάσει σε όγκο του όγκου από 0,25 cm

3, ενώ PLA-695 όγκων αγωγή έλαβαν 7,5 ημέρες. Οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με ένα συνδυασμό PLA-695 και IR πήρε 9,5 ημέρες για να φθάσει σε όγκο 0,25 cm

3. Την ημέρα 7 οι όγκοι σε επεξεργασία με ένα συνδυασμό των PLA-695 και IR ήταν μικρότερες (0,13 cm

3) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα (0,27 cm

3? Ρ = 0,019), IR μόνο του (0,24 cm

3 ? Ρ = 0.038) και PLA-695 μόνος (0,22 cm

3? Ρ = 0,100)

LLC ή Α549 κύτταρα εμφυτεύθηκαν στην δεξιά πατούσα ποντικών C57 /BL6.. Οι όγκοι ακτινοβολούνται με 2 Gy για 5 διαδοχικές ημέρες για ένα σύνολο 10 Gy. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 7,5 mg /kg βάρους σώματος ή όχημα ελέγχου για 30 λεπτά πριν από την IR κατά τις ημέρες 1, 3, 5, 7 και 9. Παρουσιάζονται οι μέσοι όγκοι του όγκου για LLC και Α549 με SEM από κάθε ομάδα αγωγής των ποντικών. Όγκου καθυστέρηση της ανάπτυξης για LLC και όγκους Α549 υπολογίστηκε ως ο αριθμός των ημερών για να φτάσουν οι όγκοι 0. 25 cm

3 (Β). Ορατή είναι μια γραφική παράσταση ράβδων που παριστάνει την μέση καθυστέρηση ανάπτυξης του όγκου με SEM από κάθε ομάδα θεραπείας από 7 ποντικούς? * P & lt? 0,05. Οι όγκοι των όγκων αναλύθηκαν την ημέρα 7 για όγκους LLC και την ημέρα 15 για όγκους Α549. Ορατή είναι μια γραφική παράσταση ράβδων που παριστάνει την ανάπτυξη του όγκου την ημέρα 7 για όγκους LLC και την ημέρα 15 για τους όγκους Α549 με SEM από κάθε ομάδα θεραπείας από 6 ποντικούς?