έχουν

Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν ενοχοποιηθεί για να διαδραματίσει κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα σε μια ποικιλία κακοηθειών. Ωστόσο, πολλές μελέτες έχουν διεξαχθεί στο

in vitro

επίπεδο και δεν θα μπορούσε να παρέχει το

in vivo

πληροφορίες σχετικά με τις λειτουργίες των miRNAs στην αντίσταση αντικαρκινικό φάρμακο. Εδώ, θα εισήγαγε ένα σύστημα διπλής γονιδίου αναφοράς απεικόνισης για μη επεμβατική παρακολούθηση της κινητικής έκφρασης των miRNA-16 κατά τη διάρκεια χημειοαντίσταση σε καρκίνο του στομάχου και

in vitro

και

in vivo

. Ανθρώπινα συμμεταφορέα ιωδιούχου νατρίου (hNIS) και λουσιφεράση πυγολαμπίδας (διακύμανση των) γονίδια που συνδέονται για να σχηματίσουν διακύμανση των διπλά γονίδιο hNIS /ρεπόρτερ σύντηξης και στη συνέχεια να δημιουργήσει ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή NF-3xmir16 και την αντίσταση σε πολλά φάρμακα κυτταρική σειρά NF-3xmir16 /VCR της. πρόσληψη ραδιοϊωδίδιο και σήματα φωταύγεια διακύμανση των

in vitro

συσχετίζονται καλά με αριθμούς βιώσιμων κυττάρων. Η πρόσληψη των δραστηριοτήτων λουσιφεράσης και ραδιοϊωδίδιο στο NF-3xmir16 κύτταρα εντυπωσιακά κατασταλεί με εξωγενή ή ενδογενή miRNA-16. Ο NF-3xmir16 /κύτταρα VCR παρουσίασαν σημαντική αύξηση της τάξης του

πρόσληψη 131I και φωταύγεια ένταση σε σύγκριση με NF-3xmir16 κύτταρα. Η ραδιενέργεια από το

in vivo

99mTc-υπερτεχνητικού απεικόνισης και η ένταση από την απεικόνιση βιοφωταύγεια ήταν επίσης αυξημένη σε NF-3xmir16 /VCR σε σύγκριση με εκείνη της NF-3xmir16 ξενομοσχεύματα όγκου. Επιπλέον, η χρήση αυτού του συστήματος γονιδίου αναφοράς, διαπιστώσαμε ότι η ετοποσίδη (VP-16) και 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) ενεργοποιούνται miRNA-16 έκφραση

in vitro

και

in vivo

, και η ρύθμιση προς τα πάνω του miRNA-16 είναι p38MAPK εξαρτώμενη αλλά ΝΡ-κΒ ανεξάρτητη. Αυτή η διπλή γονίδιο αναφοράς απεικόνισης μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα νέο εργαλείο για

in vivo

απεικόνιση των microRNAs στο χημειοαντίσταση των καρκίνων, καθώς και για την έγκαιρη ανίχνευση και διάγνωση σε κλινική

Παράθεση:. Wang F, Τραγούδι Χ, Λι Χ, Xin J, Wang S, Yang W, et al. (2013) Μη επεμβατική απεικόνιση των microRNA-16 στο χημειοαντίσταση του γαστρικού καρκίνου Χρησιμοποιώντας μια διπλή Reporter Gene Σύστημα Απεικόνισης. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10.1371 /journal.pone.0061792

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 21 Νοεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 13 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 Απριλίου, 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα του Εθνικού Βασική Έρευνα και την Ανάπτυξη του Προγράμματος της Κίνας (973) κάτω από Grant Νο 2012CB518101, 2011CB707702, το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας κάτω από Grant Νο 81090272, 81090274, 81227901, Ομάδα Καινοτομίας Grant Ανάπτυξης από το Τμήμα της Κίνας. Παιδείας (2010CXTD01), 863 Πρόγραμμα της Κίνας (2012AA02A603) και το Εθνικό Πρόγραμμα Στήριξης Τεχνολογία Βασικά κάτω από Grant Νο 2012BAI23B06. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συν-συγγραφέας Xiaoyuan Chen χρησιμεύει ως συντάκτης για το περιοδικό. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου παραμένει η πρώτη αιτία θανάτου από καρκίνο στην Κίνα και η τέταρτη πιο συχνή κακοήθειας σε όλο τον κόσμο, παρά τη δραματική μείωση της θνησιμότητας και της νοσηρότητας της κατά τις τρεις τελευταίες δεκαετίες [1]. Η χημειοθεραπεία έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη θεραπεία τόσο χειρουργήσιμη και προχωρημένο καρκίνο του στομάχου, οδηγώντας σε βελτιώσεις στη συνολική επιβίωση καθώς και της ποιότητας ζωής των ασθενών [2], [3]. Ωστόσο, η μακροπρόθεσμη χημειοθεραπεία συχνά αποτυγχάνει να εξαλείψει όλα τα κύτταρα του όγκου, λόγω της εγγενούς ή επίκτητης αντοχής πολυφαρμάκου (MDR), η οποία είναι η πιο κύρια αιτία της υποτροπής του όγκου [4]. Προς το παρόν, ο MDR έχει θεωρηθεί ως μια πολυπαραγοντική φαινόμενο εμπλέκονται πολλές κύριους μηχανισμούς, συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης μεταβολισμό των φαρμάκων, μειωμένη πρόσληψη υδατοδιαλυτών φαρμάκων, μεταβάλλονται οι στόχοι φαρμάκου, μειωμένη ενδοκυτταρική συγκέντρωση του φαρμάκου από αντλίες εκροής, τροποποιημένα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και επάγεται έκτακτης ανάγκης γονίδια απάντηση να βλάψει αποπτωτικά μονοπάτια,

κλπ

[5]. Αν και οι μηχανισμοί MDR έχουν εκτεταμένα διερευνηθεί, οι βασικοί καθοριστικοί παράγοντες αυτού του φαινομένου παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφής.

Τα microRNAs (miRNAs) αποτελούν μια νέα κατηγορία των μικρών RNA μη κωδικοποιητική (19-23 νουκλεοτίδια) που ρυθμίζουν αρνητικά την γονιδιακή έκφραση σε η μετα-μεταγραφικό επίπεδο από τέλεια ή ατελή σύζευξη βάσεων με το 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) του mRNA που στόχου και ως εκ τούτου διεγείρουν mRNAs αποικοδόμηση ή μετάφραση καταστολή [6]. Επί του παρόντος, οι αναδυόμενες μελέτες έχουν δείξει την ύπαρξη και τη σημασία της miRNAs στην εξέλιξη της αντίστασης αντικαρκινικό φάρμακο και miRNAs προφίλ έκφρασης μπορεί να συσχετισθεί με την ανάπτυξη αντοχής φαρμάκου [7] – [10], υποδεικνύοντας ότι η miRNAs μεσολάβηση μορφή αντίστασης φαρμάκου προσθέτει άλλο ένα μηχανισμό MDR. Στην προηγούμενη μελέτη μας, αναφέρθηκε ότι δύο miRNAs, miRNA-15β και miRNA-16, είχαν εκφράζεται διαφορικά σε πολυανθεκτικά ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή SGC7901 /VCR και γονική κυτταρική γραμμή του SGC7901 [11]. Ωστόσο, αυτό έγινε μόνο στο

in vitro

επίπεδο και δεν θα μπορούσε να αντανακλά τις

in vivo

πληροφορίες σχετικά με τις λειτουργίες των miRNAs στην αντίσταση αντικαρκινικό φάρμακο.

Οι πρόσφατες εξελίξεις σε τεχνικές μοριακής απεικόνισης επιτρέπει την μη επεμβατική απεικόνιση των φυσιολογικών και μη φυσιολογικών κυτταρικών διεργασιών σε ζώντα υποκείμενα σε μοριακό επίπεδο και όχι στο ανατομικό επίπεδο [12]. Αρκετές μη επεμβατική στρατηγικές, όπως η χρήση ενός φθορίζουσα πρωτεΐνη, λουσιφεράση γονίδιο ρεπόρτερ, νουκλεολίνης απταμερές ή φθορίζοντα μοριακού φανού συζευγμένο νανοσωματιδίων, έχουν αναπτυχθεί για την παρακολούθηση των προτύπων έκφρασης των διαφόρων miRNAs κατά τη διάρκεια καρκινογένεσης, νευρογένεσης ή η μυογένεση

in vitro

και

in vivo

[13] – [16]. Η παρούσα μελέτη ήταν να εισαγάγει μια μη επεμβατική μέθοδο για την παρακολούθηση miRNA-16 στο χημειοαντίσταση του γαστρικού καρκίνου μέσω ενός συστήματος γονιδίου ανταποκριτή διπλής απεικόνισης στην οποία ιωδιούχο ανθρώπινο νάτριο συμμεταφορέα (hNIS) και λουσιφεράση πυγολαμπίδας γονίδια (διακύμανση των) συνδέθηκαν με ένα γονίδιο σύντηξης για βιοφωταύγεια απεικόνισης και

99mTc-υπερτεχνητικού απεικόνιση γάμμα κάμερα

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα

Ειδικά ελεύθερα παθογόνων 8 εβδομάδων , παλιά θηλυκό BALB /c γυμνά ποντίκια ελήφθησαν από το κέντρο ζώων της Σαγκάης στην Κίνα και εκτρέφονται στο κέντρο ζώων Fourth Military Medical University, την Κίνα. Όλα τα πειραματόζωα στεγάστηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων. Τα πρωτόκολλα των ζώων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο Δεοντολογίας κριτική τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με την τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου διατυπώθηκε από την Εθνική Εταιρεία Ιατρικής Έρευνας.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Ποντίκι μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι hNIS (ab17795) αγοράστηκε από Abcam. Κουνέλι πολυκλωνικό αντίσωμα ειδικό για Bcl-2 αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (αναστολέας της NF-κΒ) και SB203580 (αναστολέας της ΜΑΡΚ p38) ελήφθησαν από Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας (Σαγκάη, Κίνα). Τα αντικαρκινικά φάρμακα συμπεριλαμβανομένης βινκριστίνη (VCR), ετοποσίδη (VP-16), μιτομυκίνη C (MMC), σισπλατίνη (CDDP), 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και αδριαμυκίνη (ADR) αγοράστηκαν από Wolsen Biotechnology (Xi’an, Κίνα). Το πλασμίδιο φακοϊό GV260-διακύμανση των-puro αποκτήθηκε από τη Σαγκάη GeneChem Company (Σαγκάη, Κίνα). Όλα τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας και ορού αγοράστηκαν από την Gibco (Grand Island, ΝΥ).

Διπλή πλασμίδιο του γονιδίου αναφοράς κατασκεύασμα

Η κωδικοποιητική αλληλουχία του γονιδίου hNIS ενισχύθηκε με PCR από ένα πλασμίδιο ευγενώς από Ο Δρ Weidong Yang (τέταρτο Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Κίνα) χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές:

hNIS-Fw: 5′-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 ‘

hNIS-Rev: 5′-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 «

Για την κατασκευή ενός διπλού φορέα έκφρασης, εισήχθη το cDNA του γονιδίου hNIS σε το

BamH

Ι και

θέσεις ενζύμου Ηλικία

μπορώ περιορισμό ενός φορέα λεντοϊού GV260 -Fluc-puro (Shanghai GeneChem, Κίνα) που κωδικοποιεί ένα γονίδιο διακύμανση των υπό τον έλεγχο του υποκινητή της ουβικιτίνης. Η προκύπτουσα κατασκευή διπλής έκφρασης GV260-hNIS /διακύμανση των περαιτέρω χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία GV260-hNIS πλασμιδίου /διακύμανση των-3xmir16. Τρία αντίγραφα των συμπληρωματικών αλληλουχιών κατά miRNA-16 (3xmir16) εισήχθησαν μετά το κωδικόνιο τερματισμού του γονιδίου σύντηξης hNIS /διακύμανση των για τη δημιουργία GV260-hNIS /διακύμανση των-3xmir16 (Εικόνα 1Α). Μια ομελέτα νουκλεοτιδική αλληλουχία του παρόμοιου μήκους με 3xmir16 επίσης εισαχθεί στην 3’UTR του γονιδίου σύντηξης hNIS /διακύμανση των για να αποκτήσετε ένα κατασκεύασμα ελέγχου (GV260-hNIS /διακύμανση των-αγωνίζομαι. Η ακολουθία 3xmir16 ακολουθία ή αγωνίζομαι ελήφθησαν με αναδιάταξη των ακόλουθων ολιγονουκλεοτιδίων :.

(Α) Σχέδιο του συστήματος γονιδίου αναφοράς στο οποίο hNIS και το γονίδιο διακύμανση των συγχωνεύθηκαν δημιουργήσει NF-κενά κατασκεύασμα (κορυφή) Τρία αντίγραφα των συμπληρωματικών αλληλουχιών κατά miRNA-16 (3xmir16 στόχοι) εισήχθησαν μετά την hNIS /γονιδίου σύντηξης διακύμανση των για την απόκτηση κατασκεύασμα NF-3xmir16 (κάτω). (Β) Ίδιος αριθμός τρεις τύπους κυττάρων (1 × 10

5) σπάρθηκαν και ακολουθείται από

in vitro

βιοφωταύγεια απεικόνισης για την ανίχνευση διακύμανση των έκφραση. τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) κηλίδωση Western για την ανίχνευση της έκφρασης hNIS με αντι-hNIS (1: 1000) ή αντι-β-ακτίνης (1: 2000) αντισώματα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό ελέγχου. τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. ένταση (D) Η φωταύγεια ανάλογα με τον αριθμό των κυττάρων. ανάλυση παλινδρόμησης (Ε) Γραμμική μεταξύ της έντασης της φωταύγειας και του αριθμού των κυττάρων. (F)

δοκιμασία πρόσληψης 131I ανάλογα με τον αριθμό των κυττάρων. ανάλυση παλινδρόμησης (G) Γραμμική μεταξύ

131I πρόσληψη και την κυτταρική σειρά. ανάλυση παλινδρόμησης (H) Γραμμική μεταξύ της έντασης βιοφωταύγεια και η ραδιενέργεια

Η

3xmir16-Fw:. 5′-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 ‘

3xmir16-Rev: 5′-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG -3 ‘

αγωνίζομαι-Fw: 5′-TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3′

αγωνίζομαι-Rev: 5′-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA

Γαστρικό καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων και σταθερή γενιά κυτταρική γραμμή

Ανθρώπινο γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή SGC7901 και πολυανθεκτικά παραλλαγή SGC7901 /VCR της (ορίζεται και διατηρείται στο εργαστήριο μας όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [11]) καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορό μόσχου και 100 μονάδες πενικιλλίνης και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Για να διατηρηθεί το MDR φαινότυπο, βινκριστίνη (με τελική συγκέντρωση 1 μg /ml) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας για κύτταρα SGC7901 /VCR. Για να δημιουργήσει σταθερή γραμμή κυττάρων, φορέας λεντοϊού GV260-hNIS /διακύμανση των ή GV260-hNIS /διακύμανση των-3xmir16 για πρώτη φορά ταυτόχρονα σε κύτταρα 293Τ με συσκευασία πλασμίδια (

gag, pol, νδν-

). Το μέσο ανάπτυξης μεταβλήθηκε σε 6 ώρες μετά την επιμόλυνση και το υπερκείμενο φακοϊό περιέχουν συλλέχθηκε στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Συγκομιδής υπερκείμενα φυγοκεντρήθηκαν στα 4000 g για 10 λεπτά ώστε να ιζηματοποιηθούν τα κυτταρικά κατάλοιπα. Συμπυκνωμένο ιός τιτλοδοτήθηκε σε κύτταρα 293Τ. SGC7901 κύτταρα και κύτταρα SGC7901 /VCR μετήχθησαν με GV260-hNIS /διακύμανση των και GV260-hNIS /διακύμανση των-3xmir16 ιού αντίστοιχα σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 10. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε διαλογή με πουρομυκίνη επί 3 εβδομάδες και κυτταρικές αποικίες ήσαν συλλέγονται για να επεκταθεί για το επόμενο βήμα πειράματα

RNA ολίγο και επιμόλυνση

Η miRNA-16 και αρνητικό έλεγχο (NC) ολίγο RNA συντέθηκαν (Shanghai GenePharma, Κίνα), χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες αλληλουχίες.:

miRNA-16 νόημα: 5′-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 ‘

miRNA-16 αντι-νόημα: 5′-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3′

NC νόημα: 5 «-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3 ‘

NC αντι-νόημα: 5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′

Πριν την επιμόλυνση, τα κύτταρα SGCC7901 σπάρθηκαν σε 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε ένα πλάκα 24 φρεατίων και αναπτύσσονται για 24 ώρες. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε με αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όλα διαμόλυνση διεξήχθησαν εις τριπλούν.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε από τα καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen). RT πραγματοποιήθηκε με PrimerScript RT Regent Kit (Takara, Ιαπωνία) και qPCR διεξήχθη με Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) και ΑΒΙ StepOne Plus πραγματικού χρόνου σύστημα PCR (Applied Biosystems) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή . Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε πηκτές αγαρόζης 3%. Η σχετική ποσότητα των miRNA-16 ομαλοποιήθηκε με U6 snRNA. Και η σχετική ποσότητα του διακύμανση των κανονικοποιήθηκε σε γονίδιο GAPDH. Η πολλαπλή μεταβολή για miRNA-16 ή διακύμανση των γονιδίων από την ομάδα πείραμα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την 2

-ΔΔCt μέθοδο, όπου ΔΔCt = ΔCt πείραμα – έλεγχο ΔΟΙ και ΔCt = Ct miRNA – Ct U6 ή ΔCt = Ct διακύμανση των – Ct GAPDH. PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για στελέχους-βρόχου RT-PCR για miR-16 παρατίθενται ως εξής:

U6 Fw: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ‘

U6 Rev: 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 «

miR-16 RT 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3 ‘

miR-16 Fw: 5′-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3′

miR-16 Rev: 5 «-TGCGTGTCGTGGAGTC-3 ‘

διακύμανση των-Fw: 5′-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3′

διακύμανση των-Rev: 5′-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3 ‘

GAPDH-Fw: 5′-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 ‘

GAPDH-Rev: 5′-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3′

Western ανάλυση κηλίδος

SGC7901 κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λύση σε ψυχρό ρυθμιστικό λύσης (20 mM NaCl, 200 mM Tris-HCI [ρΗ 7.4], 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 1% Triton Χ-100 και 1% απρωτινίνη) επί 30 λεπτά επί πάγου. Τα κυτταρικά λύματα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 12.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 8% SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες επωάστηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού που περιέχει 5% BSA για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν με υποδεικνυόμενα αντισώματα. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας ένα βελτιωμένο κιτ χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Corp, Piscataway, NJ).

ΜΤΤ δοκιμασία

Για τον προσδιορισμό των ρυθμών ανάπτυξης της NF-κενά, NF-3xmir16 και NF-3xmir16 /κυττάρων VCR, αυτοί οι τρεις τύποι κυττάρων εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων με τους ίδιους αριθμούς (5000 κύτταρα) ανά φρεάτιο. Σε διαφορετικά χρονικά σημεία (24, 48, 72, 96 h), 25 μΐ 5,0 mg /ml στείρου φιλτραρισμένου 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, 5- διφαινυλο βρωμιούχο τετραζόλιο (ΜΤΤ? Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Η χρωστική που δεν αντέδρασε αφαιρέθηκε μετά από 4 ώρες επώασης, και τα αδιάλυτα κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 100 μΙ διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Η απορρόφηση στα 570 nm (μήκος κύματος αναφοράς, 630 nm) μετρήθηκε με ένα Synergy II αναγνώστη πολύτροπη μικροπλάκας (BioTech Instruments, VT).

Ραδιενεργά πρόσληψη ιωδιούχου δοκιμασία

Για να προσδιορίσει τη σχέση μεταξύ ιωδιούχο πρόσληψη και τον αριθμό των κυττάρων, μια σειρά αραίωσης των κυττάρων εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Μετά από 12 ώρες επώασης, εξετάστηκε το επίπεδο πρόσληψης

131I. Η πρόσληψη ιωδιούχου προσδιορίστηκε με επώαση των κυττάρων με ισορροπημένο διάλυμα άλατος Hanks 500 μL (HBSS) που περιέχει 0.5% αλβουμίνη βόειου ορού με 37 kBq του φορέα χωρίς Na

131I και 10 mM ΝαΙ για 30 λεπτά. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές όσο το δυνατόν γρηγορότερα με 1 mL παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος HBSS. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη 200 μL, και η ραδιενέργεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας γ-μετρητή (Perkin-Elmer). Για να αξιολογηθεί η λειτουργική έκφραση του hNIS σε σύστημα γονιδίου αναφοράς, τα κύτταρα ΝΡ-3xmir16 σπάρθηκαν σε 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 24-φρεατίων την ημέρα πριν από την επιμόλυνση, τότε miRNA-16 και NC ολίγο επιμολύνθηκαν . 24 ώρες αργότερα, η πρόσληψη ιωδίου μετρήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

In vitro

απεικόνισης βιοφωταύγεια δοκιμασία

Για να προσδιορίσει τη σχέση μεταξύ των σημάτων φωταύγειας και αριθμούς κυττάρων, μια σειρά αραίωσης κυττάρων εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Μετά από 12 ώρες επώαση, κάθε φρεάτιο πλύθηκε με αλατούχο φωσφορικό beffered (PBS). Στη συνέχεια, D-λουσιφερίνης (Xenogen) σε συγκέντρωση 0,5 mmol /L προστέθηκε αμέσως πριν από τον προσδιορισμό. Βιοφωταύγεια μετρήθηκε με ένα IVIS 100 σύστημα απεικόνισης (Xenogen) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Living Image έκδοση λογισμικού 2.50 (Xenogen). Για να αξιολογηθεί η λειτουργική έκφραση του διακύμανση των σε σύστημα γονιδίου αναφοράς, τα κύτταρα ΝΡ-3xmir16 σπάρθηκαν σε 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 24-φρεατίων την ημέρα πριν από την επιμόλυνση, τότε miRNA-16 και NC ολίγο επιμολύνθηκαν . 24 ώρες αργότερα, η δοκιμασία βιοφωταύγειας μετρήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.

βιο-φωσφορισμού και

99mTc-υπερτεχνητικού απεικόνισης σε άτριχα ποντίκια

Ίσες αριθμούς (5 × 10

6 κύτταρα) NF-κενό και NF-3xmir16, ή ΝΡ-3xmir16 /VCR και NF-3xmir16 κύτταρα, ήταν ξενομόσχευμα υποδόρια σε πλευρό του αριστερού και του δεξιού οπισθίου κάθε γυμνού ποντικού όπως υποδεικνύεται στα αποτελέσματα. Απεικόνιση βιοφωταύγειας αποκτήθηκε μία ημέρα μετά την ένεση των κυττάρων. Όλοι οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με 2.5% ισοφλουράνιο σε οξυγόνο αέριο με ροή 1,5 L /min. Ένα υδατικό διάλυμα από D-luciferine (150 mg /kg σωματικού βάρους) εγχύθηκε διαδερμικά 10 λεπτά πριν από την απεικόνιση. Οι εικόνες σε ολόκληρο το σώμα για σήματα διακύμανση των αποκτήθηκαν για 2 λεπτά και Ζώντας λογισμικό εικόνας (Xenogen) έτρεχε να αποκτήσουν βιοφωταυγείς εικόνες. Μια ROI επιλέχθηκε το χέρι πάνω από την ένταση του σήματος. Τα σήματα βιοφωταύγεια εκφράζονται ως φωτόνια ανά δευτερόλεπτο ανά κυβικό εκατοστό ανά στερακτίνιο (p /sec /cm

2 /sr) μέσα σε ένα ROI.

Για πυρηνικής απεικόνισης, ο όγκος ποντίκια που έφεραν ενδοπεριτοναϊκή ένεση με 18,5 MBq της

99mTc-υπερτεχνητικού σε 2 εβδομάδες μετά την έγχυση των κυττάρων. 30 λεπτά μετά την ένεση, το ζώο τοποθετήθηκε σε ένα ανάπτυγμα-ύπτια θέση στο κρεβάτι του σαρωτή SPECT (Symbia Τ2, Siemens). Αναισθησία διεξήχθη με 1% -2% ισοφλουράνιο σε 100% O

2 κατά τη διάρκεια της ένεσης και απεικόνισης. Όλες οι εικόνες ανακατασκευάστηκαν με ένα 2-διαστάσεων παραγγείλει-υποσύνολα προσδοκία μέγιστο αλγόριθμο. Δραστηριότητα ποσοτικά με την προβολή των περιοχών ενδιαφέροντος (ROI) στους όγκους και την περιοχή της ΑΤΕ διατηρήθηκε σταθερή για όλες τις πυρηνικές και οπτικές εικόνες. Μετά bioluminescent και

99mTc-υπερτεχνητικού απεικόνισης, οι όγκοι συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν.

Στατιστική ανάλυση

αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση ± SD. Δεδομένα που δείχνει συγκρίσεις μεταξύ δύο ομάδες αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student. Συγκρίσεις μεταξύ περισσοτέρων των δύο ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με το κατάλληλο δοκιμών posthoc. Ρ τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Ίδρυση του γαστρικού καρκίνου κυτταρικές σειρές που εκφράζουν σταθερά hNIS και τα γονίδια διακύμανση των

Για να δημιουργήσετε ένα γονίδιο αναφοράς σύντηξης (GV260- hNIS /διακύμανση των, αναφέρονται NF-κενό), το cDNA hNIS κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα λεντοϊού (GV260-διακύμανση των-puro) που κωδικοποιεί ένα γονίδιο διακύμανση των να δημιουργήσει μια πρωτεΐνη σύντηξης, η οποία ήταν υπό τον έλεγχο του υποκινητή της ουβικιτίνης. Στη συνέχεια, εισήχθησαν τρία αντίγραφα συμπληρωματικών αλληλουχιών έναντι miRNA-16 (3xmir16) μετά το κωδικόνιο τερματισμού του γονιδίου σύντηξης hNIS /διακύμανση των να παράγουν ένα άλλο κατασκεύασμα (GV260-hNIS /διακύμανση των-3xmir16, αναφέρεται NF-3xmir16) (Σχήμα 1Α). Μια ομελέτα νουκλεοτιδική αλληλουχία του παρόμοιου μήκους με 3xmir16 επίσης εισαχθεί στην 3’UTR του γονιδίου σύντηξης hNIS /διακύμανση των για να αποκτήσετε ένα κατασκεύασμα ελέγχου (GV260-hNIS /διακύμανση των-αγωνίζομαι, αναφέρεται NF-αγωνίζομαι).

In vitro

βιοφωταύγεια απεικόνισης έδειξαν ότι η δραστηριότητα του γονιδίου διακύμανση των από NF-κενά κελιά ήταν παρόμοια με εκείνη από κύτταρα NF-αγωνίζομαι (Σχήμα S1 Α). Έτσι, επιλέγουμε το NF-άδειο κατασκεύασμα σε περαιτέρω μελέτη. Δύο κυτταρικές σειρές, μία MDR ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή SGC7901 /VCR και γονική κυτταρική σειρά της SGC7901, μετήχθησαν με τον φακοϊό περιέχει το NF-άδειο ή γονίδιο NF-3xmir16 αντίστοιχα να καθιερώσει τρεις σταθερές κυτταρικές σειρές NF-κενά /SGC7901, NF -3xmir16 /SGC7901 και NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (αναφέρεται NF-κενά, NF-3xmir16 και NF-3xmir16 /VCR). Πρώτα εκτελείται δοκιμασία ΜΤΤ για τη μέτρηση των ρυθμών ανάπτυξης των τριών αυτών κυτταρικών γραμμών (σχήμα S1B). Τότε perfomed δοκιμασία qPCR να διερευνήσει τις ολοκληρωμένα αντίγραφα του κατασκευάσματα ανταποκριτή στις τρεις κυτταρικές σειρές (Σχήμα S1c).

In vitro

βιοφωταύγειας απεικόνισης (Εικόνα 1Β) και κηλίδωση Western (Σχήμα 1C) περαιτέρω πραγματοποιήθηκαν για να αποδειχθεί η επιτυχής έκφραση των διακύμανση των και hNIS γονίδια σε αυτές τις τρεις κυτταρικές σειρές.

Γραμμικότητα συσχέτιση της διακύμανση των και τις δραστηριότητες του διαγονιδίου hNIS με αριθμούς κυττάρων

in vitro

η

Για την αξιολόγηση των δραστηριοτήτων του διαγονιδίου διακύμανση των και hNIS στα κύτταρα, πραγματοποιήσαμε

in vitro

απεικόνισης βιοφωταύγεια και

131I ραδιοϊωδίδιο πρόσληψη δοκιμασίες σε μια σειρά αραίωσης των NF-3xmir16 κυτταρικές σειρές. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, σύμφωνα με αυξήσεις στον αριθμό των κυττάρων, η συσσώρευση της φωταύγειας αυξήθηκε επίσης. σήματα βιοφωταύγεια βρέθηκαν να συσχετίζονται καλά με τους αριθμούς κυττάρων (γ

2 = 0.9990) (Σχήμα 1 Ε). Εν τω μεταξύ,

πρόσληψη 131I αυξήθηκε επίσης με αριθμούς κυττάρων (Σχήμα 1 F). Η πρόσληψη ραδιοϊωδίδιο παρατηρήθηκε συσχετίζεται καλά (γ

2 = 0,9543) με τους αριθμούς των κυττάρων (Σχήμα 1G). Επειδή η διακύμανση συντήχθηκε με hNIS, ένα καλά συσχέτιση μεταξύ της έντασης βιοφωταύγεια και

131I ραδιενέργειας παρατηρήθηκε σε κύτταρα σύμφωνα με την ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης (γ

2 = 0.9339) (Σχήμα 1).

επικύρωση των miRNA-16 δραστηριότητες

μέσω

το σύστημα γονιδίου αναφοράς

για να ελέγξετε αν NF-3xmir16 φορέα ρεπόρτερ που περιέχει miRNA-16 αλληλουχίες στόχους καταστάλθηκε από εξωγενείς miRNA-16, εξετάσαμε το δραστηριότητα διακύμανση των και hNIS μετά την εισαγωγή miRNA-16. Σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με NC oligos, το σήμα βιοφωταύγειας μειώθηκαν κατά 35% στα κύτταρα επιμολυσμένα με miRNA-16 (Σχήμα 2Α και 2Β). Και η

131I πρόσληψη ραδιοϊωδίδιο σε miRNA-16 επιμολυσμένα κύτταρα ήταν περίπου 70% εκείνης στον NC επιμολυσμένα κύτταρα ποσοτικοποιούνται με ραδιενεργό μέτρηση (Σχήμα 2C). Και η δραστηριότητα διακύμανση των και hNIS μειώθηκαν κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα S1D-F). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το κατασκεύασμα ανταποκριτή ΝΡ-3xmir16 θα μπορούσαν να διαμορφώνονται από miRNA-16.

(Α, Β)

In vitro

βιοφωταύγειας απεικόνισης και (Γ) ραδιοϊωδίδιο πρόσληψη δοκιμασία μετά την επιμόλυνση miRNA- 16 ή αρνητικό έλεγχο (NC) oligos RNA (50 ηΜ) σε ΝΡ-3xmir16 κύτταρα. πρόγραμμα ανάλυσης απεικόνισης (ζωντανή εικόνα έκδοση λογισμικού 2.50) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έντασης βιοφωτισμός. Τριπλά ανεξάρτητα πειράματα για κάθε ανάλυση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φορές αλλαγές στη miRNA 16-επιμολυσμένα κύτταρα σε σχέση με NC επιμολυσμένα κύτταρα, η οποία έχει οριστεί ως 1. (D, E)

In vitro

βιοφωτισμός απεικόνιση του NF-κενών και NF-3xmir16 κυττάρων με ίση αριθμούς (1 × 10

6). (F) Η σχετική πρόσληψης ραδιοϊωδίδιο μεταξύ NF-κενά και NF-3xmir16 κύτταρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φορές αλλαγές στη NF-3xmir16 σε σχέση με NF-κενά κελιά, οι οποίες έχουν οριστεί ως 1 (G) Ισότητα αριθμούς (1 × 10

7) της NF-κενά και NF-3xmir16 κύτταρα ήταν αντίστοιχα ξενο-μεταμόσχευσις σε αριστερό και το δεξιό οπίσθιο σκέλος του κάθε ποντικού (n = 6). Η ένεση του D-λουσιφερίνης (150 mg /kg) και, στη συνέχεια,

in vivo

απεικόνιση βιοφωταύγειας διεξήχθη. (H) Ένεση

99mTc-υπερτεχνητικού (18,5 MBq) και απεικόνισης της κάμερας γάμμα έγινε. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φορές αλλαγές στη NF-3xmir16 ξενομοσχευμάτων σε σχέση με NF-κενά ξενομοσχεύματα, οι οποίες ορίζονται ως 1.

* P & lt? 0,05,

** P & lt? 0.005. Τ = θυρεοειδούς? S = το στομάχι? Β = ουροδόχου κύστης.

Η

Ανίχνευση της ενδογενούς έκφρασης miRNA-16

in vitro

και

in vivo

Η

Για την ανίχνευση της ενδογενούς miRNA-16 επίπεδο έκφρασης σε καρκίνο του στομάχου κύτταρα

in vitro

, ίσο αριθμό (1 × 10

6) της NF-κενά και NF-3xmir16 κύτταρα ήταν seeded και στη συνέχεια εξετάστηκαν η δραστηριότητα διακύμανση των και hNIS. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2D και 2Ε, δραστηριότητα διακύμανση των προκύπτουν από NF-3xmir16 κυττάρων μειώθηκε κατά περίπου 50% από ενδογενή miRNA-16 σε σύγκριση με εκείνη από NF-κενά κελιά. Και η δραστηριότητα hNIS από κύτταρα ΝΡ-3xmir16 επίσης μειώθηκε κατά περίπου 40% σε απόκριση προς ενδογενή miRNA-16, σε αντίθεση με ότι από το NF-κενά κελιά (Σχήμα 2F). Η έλλειψη της καταστολής των διακύμανση των ή hNIS δραστηριότητες που παρατηρούνται στην NF-κενά κελιά είναι σε σχέση με ότι δεν υπήρχαν miRNA-16 περιοχές στόχου στο NF-άδειο κατασκεύασμα.

Το διττό σύστημα γονιδίου αναφοράς απεικόνισης επέτρεψε

στο vivo

οπτικοποίηση έκφρασης ενδογενούς miRNA-16 σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Ίσοι αριθμοί (1 × 10

7) του NF-κενών και NF-3xmir16 κύτταρα ήταν ξενομόσχευμα υποδόρια στην αριστερή και τη δεξιά οπίσθια πλευρά του κάθε γυμνού ποντικού (n = 6) και, στη συνέχεια, απεικόνιση βιοφωταύγειας και

99mTc-υπερτεχνητικού γάμμα απεικόνιση κάμερας αποκτήθηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2G, την ένταση της φωταύγειας από εμφυτευμένα κύτταρα ΝΡ-3xmir16 ήταν περίπου 55% χαμηλότερη από εκείνη από NF-κενά κελιά, ομοίως για τη διαφορά των δραστηριοτήτων λουσιφεράσης μετριέται

in vitro

(Εικόνα 2D και 2Ε). Μετά την ενδοπεριτοναϊκή ένεση

99mTc-υπερτεχνητικού στο 18,5 MBq, απεικόνιση με κάμερα γάμμα διεξήχθη. Σε αντίθεση με NF-κενά όγκων, η οποία έδειξε εξέχοντα πρόσληψη

99mTc-υπερτεχνητικού, NF-3xmir16 όγκων έδειξαν αμελητέα πρόσληψη (Σχήμα 2Η), υποδεικνύοντας την ενδογενή miRNA-16 μείωσε την έκφραση hNIS. Φυσιολογικές πρόσληψη παρατηρήθηκε επίσης στις θέσεις του θυρεοειδούς, του στομάχου και της ουροδόχου κύστης, στον οποίο hNIS εκφράζεται φυσιολογικά. Περιοχές ενδιαφέροντος (ROI) ανάλυση έδειξε ότι η δραστηριότητα hNIS μειώθηκε σημαντικά σε ξενομοσχεύματα NF-3xmir16 σε σύγκριση με εκείνη της NF-κενά ξενομοσχεύματα (Σχήμα 2Η). Μετά την απεικόνιση, θα συλλέγονται και ζυγίζονται τα NF-κενά και NF-3xmir16 όγκους (Σχήμα S1G). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι είχαν τα ίδια βάρη, έδειξε ότι οι διαφορές στην ένταση του σήματος είναι πράγματι οφείλεται σε ενδογενείς λειτουργία miRNA-16, αλλά δεν τα κινητά τους αριθμούς.

Οπτικοποίηση της αλλαγής έκφρασης των miRNA-16 σε MDR γαστρικά καρκινικά κύτταρα

in vitro

και

in vivo

Η

Η αλλαγή έκφρασης των miRNA-16 στο φάρμακο ανθεκτικά γαστρικά καρκινικά κύτταρα ανιχνεύθηκε

μέσω

δραστηριότητας διακύμανση των και hNIS από απεικόνισης βιοφωταύγεια και

131I δοκιμασίες πρόσληψης ραδιοϊωδίδιο. Τόσο διακύμανση των δραστικότητα (Σχήμα 3Α και 3Β) και δραστηριότητα hNIS (Σχήμα 3C) αυξήθηκε κατά περίπου 1,5 φορές σε ΝΡ-3xmir16 κύτταρα /VCR σε σύγκριση με εκείνη σε ΝΡ-3xmir16 κύτταρα, τα οποία πρότεινε ότι miRNA-16 προς τα κάτω σε ΝΡ-3xmir16 /κυττάρων VCR. Να επαληθεύσουν τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από το σύστημα γονιδίου αναφοράς, ποσοτική RT-PCR (Q-PCR) διενεργείται με την ανάλυση της διαφορικής έκφρασης των miRNA-16 σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές. Σύμφωνα με τα στοιχεία του συστήματος γονιδίου αναφοράς, Q-PCR έδειξε μειωμένη miRNA-16 επίπεδα σε NF-3xmir16 /VCR σε σύγκριση με τον ομόλογό του NF-3xmir16 κύτταρα (Εικόνα 3D).

(Α, Β)

In vitro

βιοφωτισμός απεικόνιση του NF-3xmir16 και NF-3xmir16 /κυττάρων βίντεο με ίσο αριθμό (1 × 10

6). (Γ) Η σχετική πρόσληψης ραδιοϊωδίδιο μεταξύ NF-3xmir16 και τα κύτταρα VCR NF-3xmir16 /. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φορές αλλαγές στη NF-3xmir16 /VCR σε σχέση με NF-3xmir16 κύτταρα, τα οποία έχουν οριστεί ως 1 (Δ) Ποσοτική RT-PCR ανιχνεύεται miRNA-16 έκφρασης σε NF-3xmir16 και τα κύτταρα VCR NF-3xmir16 /. προσδιορισμοί εις τριπλούν έγιναν για κάθε δείγμα RNA και η σχετική έκφραση του miRNA-16 κανονικοποιήθηκε ως προς U6 snRNA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φορές μεταβολής των επιπέδων miRNA στην NF-3xmir16 /VCR σε σχέση με NF-3xmir16 κύτταρα, τα οποία ορίζονται ως 1. (Ε) Ισότητα αριθμούς (1 × 10

7) της NF-3xmir16 και NF-3xmir16 /κυττάρων VCR ήταν αντίστοιχα ξενο-μεταμόσχευσις σε αριστερό και δεξιό οπίσθιο σκέλος του κάθε ποντικού (n = 6). Η ένεση του D-λουσιφερίνης (150 mg /kg) και στη συνέχεια το

in vivo πραγματοποιήθηκε

βιοφωταύγεια απεικόνισης. (F) Ένεση

99mTc-υπερτεχνητικού (18,5 MBq) και την απόκτηση

απεικόνιση γάμμα κάμερα 99mTc-υπερτεχνητικού. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φορές αλλαγές στη NF-3xmir16 /ξενομοσχευμάτων VCR σε σχέση με NF-3xmir16 ξενομοσχεύματα, οι οποίες ορίζονται ως 1.

* P & lt? 0,05,

** P & lt? 0.005. Τ = θυρεοειδούς? S = το στομάχι? Β = ουροδόχου κύστης.

Η

Για μη επεμβατική ποσοτική παρακολούθηση των miRNA-16 διαφορική έκφραση σε MDR γαστρικά καρκινικά κύτταρα στο

vivo

, bioluminescent απεικόνισης και

απεικόνιση γάμμα κάμερα 99mTc-υπερτεχνητικού ήταν εκτελείται. Η απεικόνιση βιοφωταύγειας έδειξε ότι τα σήματα φωταύγειας ήταν περίπου 1,7 φορές αυξήσεις στα ξενομοσχεύματα NF-3xmir16 /VCR έναντι ΝΡ-3xmir16 ξενομοσχεύματα (Σχήμα 3Ε), σύμφωνα με τις αυξήσεις της δραστηριότητας της λουσιφεράσης μετρήθηκε

in vitro

(Σχήμα 3Α και 3Β). Η ένεση του

99mTc-υπερτεχνητικού και η απόκτηση της απεικόνισης της κάμερας γάμμα έδειξε ότι ένα σημαντικά υψηλότερο συσσώρευση

99mTc-υπερτεχνητικού παρατηρήθηκε σε ξενομοσχεύματα NF-3xmir16 /VCR από ότι σε ΝΡ-3xmir16 ξενομοσχευμάτων. Φυσιολογική

99mTc-υπερτεχνητικού συσσωρεύσεις παρατηρήθηκαν επίσης στον θυρεοειδή αδένα, της ουροδόχου κύστης και του στομάχου (Σχήμα 3F). Και ο NF-3xmir16 και NF-3xmir16 /όγκους VCR είχαν τα ίδια βάρη (Σχήμα S1H).

VP-16 και 5-FU αυξητική ρύθμιση των miRNA-16 έκφραση μη επεμβατική απεικόνιση από το σύστημα γονίδιο διπλής ρεπόρτερ

για να προσδιοριστεί αν άλλα αντικαρκινικά φάρμακα θα μπορούσαν να αλλάξουν το προφίλ miRNA-16 έκφρασης, πέντε κλινικές φάρμακα για καρκίνο του στομάχου προστέθηκαν NF-3xmir16 κύτταρα που ακολουθείται από

in vitro

βιοφωταύγεια απεικόνισης και

131I δοκιμασίες. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η ένταση της φωταύγειας (Σχήμα 4Α και 4Β) ή η κυτταρική πρόσληψη ιωδίδιο (Σχήμα 4Ε) μειώθηκαν σημαντικά την έκθεση σε VP-16, 5-FU και CDDP, αλλά όχι να MMC και θεραπεία ADR σε σύγκριση με εκείνα μη επεξεργασμένο κύτταρα.

(Α, Β) NF-3xmir16 /κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με VP-16 (5 μg /ml), MMC (0,5 μg /ml), ADR (0,2 μg /ml), 5-FU (10 μmol /L) και CDDP (5 μmol /L), αντίστοιχα, για 48 ώρες και

in vitro

απεικόνιση βιοφωταύγειας διεξήχθη. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. (C, D) NF-κενά κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα παραπάνω φάρμακα και

in vitro

βιοφωταύγεια απεικόνισης εκτελέστηκε όπως περιγράφεται στο (Α). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. (Ε) κύτταρα ΝΡ-3xmir16 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα παραπάνω φάρμακα για δοκιμασία 48 ώρες και η πρόσληψη ραδιοϊωδίδιο διεξήχθησαν. (F) Ποσοτική RT-PCR ανιχνεύεται miRNA-16 έκφραση σε φάρμακο κατεργασμένα και ακατέργαστα κύτταρα ΝΡ-3xmir16. προσδιορισμοί εις τριπλούν έγιναν για κάθε δείγμα RNA και η σχετική έκφραση του miRNA-16 κανονικοποιήθηκε ως προς U6 snRNA. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων.

* P & lt? 0,05,

** P & lt? 0.005,

*** P & lt?. 0.001 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα

Η

Οι λόγοι για τη μείωση του σήματος που παρατηρείται σε αΑ-