Αφηρημένο

Ιστορικό

Ενώ η κλασική οδός /p65 ΝΡ-κΒ είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και σχετίζεται με κακή έκβαση των ασθενών, ο ρόλος του εναλλακτικού πρωτεΐνης ΝΡ-κΒ /RelB δεν είναι καλά καθορισμένη. Εδώ αναλύσαμε την ενεργοποίηση και των δύο οδών ΝΡ-κΒ σε προστάτη καρκινικούς ιστούς και συσχετίζονται αυτή την ενεργοποίηση με κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου.

Μέθοδοι

Μια τεχνική πολλαπλής ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκε για να συγχορηγείται και ποσοτικά απεικονίσει ο πυρηνικός εντοπισμός της ρ65 και RelB σε 200 ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα. Επιθήλια ορίστηκαν με τη χρήση κατάλληλων δεικτών φθοριοχρώμιο και τα προκύπτοντα σήματα ανοσοφθορισμού προσδιορίστηκαν ποσοτικά με ένα αυτοματοποιημένο σύστημα βαθμολόγησης.

Αποτελέσματα

Η πυρηνική συχνότητα του p65 βρέθηκε να αυξηθεί σημαντικά σε ιστούς όγκων σε σύγκριση με φυσιολογικό γειτονικό ιστό, ενώ η συχνότητα για RelB μειώθηκε (p & lt? 0.001, Wilcoxon τεστ). Όπως έχει ήδη αναφερθεί, p65 πυρηνική συχνότητας συνδέθηκε με κίνδυνο της βιοχημικής υποτροπής. Παρά το γεγονός ότι, RelB πυρηνική συχνότητα μόνη της δεν προβλέπουν υποτροπή, η παρουσία των ενεργοποιημένων RelB μείωσε τον κίνδυνο υποτροπής που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του p65.

Συμπέρασμα

Για πρώτη φορά p65 /RelB συνεργασία κατανομή εκτιμήθηκε σε ιστούς του καρκίνου του προστάτη και πρότεινε μια αρνητική στιχομυθία μεταξύ των δύο οδών NF-κΒ στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Labouba Ι, Le Page C, Κοινοτικών L, Kristessen Τ, Μπορείτε Χ, Péant Β , et al. (2015) Πιθανές Cross-Talk μεταξύ Εναλλακτικές και Κλασικών NF-κΒ Pathways στον καρκίνο του προστάτη ιστοί όπως μετράται με ανοσοφθορισμού Δοκιμασία Co-Localization Multi-χρώσης. PLoS ONE 10 (7): e0131024. doi: 10.1371 /journal.pone.0131024

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 9 Φεβ 2015? Αποδεκτές: 26 Μαΐου 2015? Δημοσιεύθηκε: 17 του Ιούλη 2015

Copyright: © 2015 Labouba et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και συνοδευτικά αρχεία της

Χρηματοδότηση:. αμαξίδιο en Καρκίνος de la προστάτη (Université de Montreal, https://www.recherche.umontreal.ca/en/research-at-udem/our- ερευνητικές μονάδες /προφίλ /ενώσει /449 /pid /15 /) βραβείο CUOG (https://www.cuog.ca) Réseau de recheche en καρκίνου (https://www.rrcancer.ca/fr/scientifique/biobanques/Lister /2). Visiopharm »παρέχεται υποστήριξη με τη μορφή ενός μισθού για συγγραφέα ΤΚ, αλλά δεν είχε καμία πρόσθετη ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Ο ειδικός ρόλος του συγγραφέα αρθρώνεται στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η υπαγωγή του συγγραφέα ΤΚ στην εταιρεία Visiopharm δεν μεταβάλλει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών .

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος του στη Βόρεια Αμερικής άνδρες και είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τα αρσενικά μετά του πνεύμονα και του παχέος εντέρου [1]. Τυπικά, ο καρκίνος του προστάτη παραμένει εντοπισμένη εντός του προστάτη αδένα. Ωστόσο, μπορεί επίσης να αναπτύσσεται επιθετικά πέραν της κάψουλας του προστάτη και να οδηγήσει στο σχηματισμό μετάστασης [2]. Ενώ μερικοί ασθενείς με καρκίνο του προστάτη απαιτούν μόνο ενεργό παρακολούθηση της ασθένειας, άλλοι χρειάζονται περισσότερο ριζικές θεραπείες [3, 4]. Επί του παρόντος, η πλειονότητα των ασθενών με εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία ή θεραπεία στέρησης ανδρογόνων ως θεραπεία πρώτης γραμμής [5]. Ωστόσο, παρά τα υψηλά ποσοστά επιτυχίας που λαμβάνονται με αυτές τις θεραπείες, το 25% των ασθενών αναπτύσσουν βιοχημικής υποτροπής (BCR) μετά από θεραπεία με ορμόνες θεραπεία και την πρόοδο προς μια πιο επιθετική ασθένεια [6, 7]. Έτσι, μια μεγάλη πρόκληση για τον καρκίνο του προστάτη είναι η σωστή διάκριση των ασθενών με λανθάνουσα ή αργή πρόοδο της νόσου από εκείνους με μια πιο επιθετική μορφή καρκίνου. Τέτοιες διακρίσεις θα βοηθήσει τη θεραπεία ειδικά σχεδιασμένη κατάλληλα για μεμονωμένους ασθενείς. Για την καλύτερη διαστρωμάτωση πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του προστάτη, ο προσδιορισμός των συγκεκριμένων μοριακών βιοδεικτών σε θέση να προβλέψει το αποτέλεσμα θα αντιπροσωπεύει μια σημαντική πρόοδο έναντι των υπαρχόντων κλινικών εργαλείων. Στο πλαίσιο αυτό, η ομάδα μας ήταν η πρώτη για να αντιμετωπίσει την προγνωστική δυνατότητα της p65 υπομονάδας του πυρηνικού Factor (NF) -κB στον καρκίνο του προστάτη [8] και επισημάνετε ένα δυνητικό ρόλο της πυρηνικής Factor (NF) -κB στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη [9, 10].

Η οικογένεια NF-κΒ περιλαμβάνει πέντε πρωτεΐνες μεταγραφικού παράγοντα χαρακτηρίζεται από την περιοχή rel-ομολογίας τους. Υπάρχουν υποδιαιρούνται σε δύο κύριες ομάδες: Κατηγορία Ι (NFκB1 και NFκB2) και τάξης II (ΚεΙΑ /p65, RelB, και γ-συνδεδεμένη). Η NFκB1 και NF-κΒ2 μεταφράζονται σε πρωτεΐνες P100 και ρ 105 που υποβάλλονται σε επεξεργασία σε αντίστοιχες p50 και p52 υπομονάδων τους [11]. Δύο σημαντικές οδοί ελέγχουν ΝΡ-κΒ σηματοδότηση: την κλασική οδό, με την οποία το ετεροδιμερές ρ65 /ρ50 είναι το κύριο δραστικό διμερές, και την εναλλακτική οδό όπου ο RelB /ρ52 είναι το ενεργό διμερές. Υπό κανονικές συνθήκες, ο ΝΡ-κΒ διατηρείται ανενεργός στο κυτταρόπλασμα από την ΙκΒ ή ρ100 πρωτεϊνών. Κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης, με την κλασική οδό (ΙΚΚβ-εξαρτώμενο), το σύμπλοκο ΙΚΚ φωσφορυλιώνει ΙκΒ, προκαλώντας ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση της από το πρωτεάσωμα. Αυτό οδηγεί στην πυρηνική μετατόπιση του p65 /p50 ή διμερή ρ50 /c-rel. Στην εναλλακτική οδό (ΙΚΚα-εξαρτώμενο), το σύμπλοκο ΙΚΚ ρυθμίζει την επεξεργασία του προδρόμου ρ100, σε αντίθεση με την ΙκΒ [12-15], η οποία παράγει ρ52 και την πυρηνική μετατόπιση του ρ52 /RelB διμερές.

Πολυάριθμες μοριακές και βιολογικές λειτουργίες, όπως η φλεγμονή [16, 17], η αγγειογένεση [18], την επιβίωση, τη μετανάστευση και εισβολή [19] έχει αποδειχθεί ότι συνδέεται με τη δραστηριότητα των κλασικών ΝΡ-κΒ πυρηνικών παραγόντων εξέλιξης του καρκίνου ( αναθεωρούνται στο [20]). Ενώ σημαντική εργασία έχει επικεντρωθεί στη μελέτη της κλασσικής οδού του ΝΡ-κΒ, πρόσφατα, η προσοχή έχει κατευθυνθεί προς την εναλλακτική οδό ΝΡ-κΒ, και ιδιαίτερα σε σχέση με την επιρροή της στη φλεγμονή. Οι βιολογικές λειτουργίες του ΝΡ-κΒ περιλαμβάνουν επίσης αλληλοπαρεμβολές μεταξύ των κλασικών και των εναλλακτικών οδών σε διάφορα επίπεδα, από ανάντη προς σηματοδότηση πυρηνικών αλληλεπιδράσεων μέσω του σχηματισμού των διαφορετικών διμερών NF-κΒ. Ανάλογα με το πλαίσιο και ερεθίσματα, οι δύο οδοί μπορούν να συνεργάζονται, ή παρεμβαίνει αρνητικά στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Επιπλέον, οι βιολογικές λειτουργίες που κατευθύνονται από την στιχομυθία των δύο οδών παραμένουν ελάχιστα κατανοητή και δεν έχει ποτέ διερευνηθεί σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

καρκίνο του προστάτη, αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι τόσο RelB και ρ65 μπορεί να είναι υποθετική προγνωστικός βιοδείκτες που σχετίζονται με την εξέλιξη της νόσου. Εμείς, και άλλοι, έχουν παρατηρηθεί στο παρελθόν με ανοσοϊστοχημεία (IHC) σε ιστό καρκίνου του προστάτη, ότι αυξημένες ποσότητες της πυρηνικής ρ65 σχετίστηκαν με πιο επιθετική νόσο [8, 21]. Στη συνέχεια, αποδείχθηκε ότι ο πυρηνικός εντοπισμός του p65 είναι εξαιρετικά προβλεπτική της λεμφαδένων εισβολή [9] και συνδέθηκε με βιοχημική υποτροπή (BCR), είτε μόνο του ή σε συνδυασμό με τον ενεργοποιημένο ErbB /Akt σηματοδότηση [21-25]. Πιο πρόσφατα, παρατηρήσαμε μια αυξημένη παρουσία πυρηνικών RelB σε προστάτη καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με μη-νεοπλασματικών ιστών, γεγονός που υποδεικνύει ότι η εναλλακτική οδός ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται επίσης κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου [10]. Επιπλέον, φάνηκε σε ένα

in vitro

μοντέλο ότι η αναστολή της έκφρασης RelB αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των 22Rv1 ευνουχισμού ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων του προστάτη και διεγείρει την κυτταρική autophagy [26]. Άλλες μελέτες διαπίστωσαν ότι RelB αυξάνει ραδιοευαισθησία των ευνουχισμού-ανθεκτικά κύτταρα [27-30] φαινομενικά μέχρι ρύθμισης IL-8 [31]. Σύμφωνα με αυτές τις πρώτες παρατηρήσεις, διαπιστώθηκε επίσης δείξει ότι RelB υπερεκφράζεται σε αδένες του προστάτη σε απόκριση σε ανδρογόνα στέρηση [32] και την θεραπεία ακτινοβολίας [33], και επάγει επίσης έκφραση της β του-γαλακτοζίτη α2,3-σιαλυλτρανσφεράσης, ένα γονίδιο εμπλέκονται στην γαγγλιοσίδες έκφραση και ο καρκίνος εξέλιξη [34]. Πιο πρόσφατα, μια αρνητική στιχομυθία παρουσιάστηκε μεταξύ RelB και AR, και σύνδεσης με την επιβίωση και μεταστατικό καρκίνο [35].

Για να εκτιμηθεί ο ρόλος των RelB και η στιχομυθία μεταξύ του κλασικού και του εναλλακτικού NF-κΒ μονοπάτια, εφαρμόσαμε μια τεχνική φθορισμού πολυ-χρώση, έτσι ώστε να αναλύσει ποσοτικά την ταυτόχρονη παρουσία των πυρηνικών p65 και RelB στις ίδιες προστάτη πυρήνες καρκινικού ιστού. Η ποσοτικοποίηση του σήματος φθορισμού υποστηρίχθηκε από ένα αυτοματοποιημένο σύστημα. Για την αξιολόγηση του βιολογικού ρόλου των δύο δραστηριοτήτων μονοπατιού ΝΡ-κΒ, εμείς συσχετίζεται το πυρηνικό εντοπισμό του ρ65 ή RelB με κλινικές παραμέτρους και κίνδυνο βιοχημικών αναδρομική εξίσωση για να undrstand καλύτερα το δυναμικό ρόλο του μονοπατιού στιχομυθία ΝΡ-κΒ σε εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

κοόρτης ασθενών

Η παρούσα μελέτη βασίστηκε σε μια αναδρομική ομάδα 200 ασθενών με καρκίνο του προστάτη των οποίων Φορμόλης Σταθερή τομές παραφίνης (FFPE) δείγματα πρωτοπαθή καρκίνο του προστάτη, ήταν που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή των ιστικές μικροσυστοιχίες (TMAs). Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση μεταξύ του 1992 και του 2006 και υπό την προϋπόθεση ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση. Όλες οι συγκαταθέσεις ήταν ασφαλώς κατατεθεί σε ένα κλειδωμένο χώρο και σαρώνεται συναινεί σε μια προστατευμένη με κωδικό πρόσβασης ηλεκτρονικό φάκελο. Το κριτήριο ένταξης για αυτήν την αναδρομική μελέτη ήταν η απουσία οποιασδήποτε θεραπείας πριν από τη ριζική προστατεκτομή (RP). Μετά από επανεξέταση διαλογή των κλινικών δεδομένων, 11 ασθενείς αποκλείστηκαν από τη μελέτη, καθώς δεν πληρούσαν το κριτήριο ένταξης. Η μέση παρακολούθηση των ασθενών ήταν 96 μήνες. BCR (βιοχημικής υποτροπής) ορίστηκε με βάση μια PSA (ειδικό προστατικό αντιγόνο) υποτροπής πάνω από 0,3 ng.ml

-1 από την ημερομηνία της χειρουργικής επέμβασης (RP). διάστημα χωρίς υποτροπή ορίστηκε ως ο χρόνος μεταξύ RP και την ημερομηνία της πρώτης αύξηση του PSA πάνω από 0,3 ng.ml

-1. Το τελικό σταδιοποίηση, τη διαλογή και την ιστολογική διάγνωση βασίστηκε στην έκθεση κλινικής παθολογίας από το Hôpital Notre-Dame, (CHUM, Montreal, QC, Καναδάς). έγκριση Δεοντολογίας λήφθηκε από την κατάλληλη επιτροπή δεοντολογίας (Comité d’éthique de la recherche du CHUM). Γραπτές συγκαταθέσεις ήταν ασφαλώς κατατεθεί σε ασφαλή χώρο, καθώς και ηλεκτρονικά σαρωμένης συναινέσεις σώθηκαν σε ένα προστατευμένο με κωδικό ηλεκτρονικό φάκελο. έγκριση Δεοντολογίας λήφθηκε από την κατάλληλη επιτροπή δεοντολογίας (Comité d’éthique de la recherche du CHUM). Οι κύριες κλινικές παραμέτρους των 189 περιπτώσεων της κλάσης είναι: Η μέση παρακολούθηση 95 μήνες? 49% σκορ Gleason & gt? 7? 44% σκορ Gleason = 7? 7% σκορ Gleason & lt? 7? 18 περιπτώσεις με σπερματοδόχων κύστεων συμμετοχή κατά 170 χωρίς? 26% με εξωπροστατικών επέκταση, το 32% με θετική χειρουργική περιθώριο? 3% με λεμφαδένων εισβολή? 142 με παθολογικό στάδιο 2 και 47 με παθολογικές στάδιο 3? το συγκεκριμένο ποσοστό καρκίνου είναι 3% και η βιοχημική υποτροπή είναι 28%

μικροσυστοιχίες ιστών

Από τα δείγματα ανθρώπινου ιστού FFPE, επιλεγμένες περιοχές του όγκου με βάση τα σχόλια των αιματοξυλίνη /ηωσίνη (Η & amp?. Ε ) -stained διαφάνειες από έναν παθολόγο. μπλοκ όγκου FFPE στη συνέχεια σε βιοψία χρησιμοποιώντας μια βελόνα 0,6 χιλιοστά arrayer διάμετρο ιστό και τα προκύπτοντα πυρήνες διατάσσονται σε ένα πλέγμα σε μια ομάδα αποδέκτη παραφίνης. Κάθε σύνολο περιείχε TMA, ένας πυρήνας ενός δείγματος όγκου και ένα πυρήνα ενός φυσιολογικό γειτονικό προστάτη αδενικό ιστό για συνολικά 100 ασθενείς. Αυτά TMAs χτίστηκαν εις διπλούν με την ανάλυση δύο ανεξάρτητους πυρήνες από κάθε τύπο ιστού ανά περιπτώσεις. δείγματα TMA ήταν χωρισμένο, χρωματισμένο τόσο από την H & amp?. Ε-και ανοσοϊστοχημεία (IHC) για υψηλού μοριακού βάρους Cytokeratin (HMCK), και εν συνεχεία υποβλήθηκε σε ανεξάρτητη επανεξέταση παθολογίας να επιβεβαιώσει και να σχολιάσετε την ιστολογία του κάθε πυρήνα

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

IHC πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Benchmark XT αυτοματοποιημένο χρώσης (Ventana Medical System Inc. VMSI), Tucson, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Αντιγόνο ανάκτηση πραγματοποιήθηκε με το τηλέφωνο Ρύθμιση 1 αντιδραστηρίου Ventana (VMSI # 950 – 124). Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: αντι-ρ65 (sc-8008), αντι-RelB (sc-226), αντι-κυτοκερατίνης (CK) 18 (sc-6259) και αντι-PSA (sc-7638), όλα αποκτήθηκαν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) και αντι-CK19 (ms-198-P0) από την Thermo Scientific Lab Vision (Ottawa, ON, Καναδάς). Η εξειδίκευση των παραπάνω αντισωμάτων έναντι p65 και RelB είχε προηγουμένως ελεγχθεί από δυτικές-κηλίδα [26, 36]. Αντισώματα αραιώθηκαν από 1:25 έως 1: 1000 σε ρυθμιστικό αραιωτικό αντισώματος (VMSI # ADB250), εκτός των αντι-PSA που αραιώθηκε σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Τα αραιωμένα αντισώματα χειροκίνητα διανέμεται στις διαφάνειες και επωάστηκαν στους 37 ° C για 60 λεπτά. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης Ultraview DAB (VMSI # 760-500) και πλακίδια στη συνέχεια βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη και αντιδραστήριο λουλάκι (VMSI # 760-2021 και # 760 – 2037). Όλα τα τμήματα σαρώθηκαν με στόχο 20x 0.75NA με ανάλυση των 0,3225 χιλιοστών, χρησιμοποιώντας το VS-110 σαρωτή διαφανειών (Όλυμπος, Richmond Hill, ON, Καναδάς) και αναλύθηκαν οφσάιντ πλάι με κυτοκερατίνης χρώση HW να λογοδοτήσουν για καλοήθεις αδένες.

ανοσοφθορισμού (IF)

Εμείς παράγεται ένα επιθηλιακά μάσκα χρησιμοποιώντας διάφορα ειδικά επιθηλιακά αντιγόνα να διακρίνουν στρωματικών και επιθηλιακών εξαρτήματα στο εσωτερικό του ιστού. Για να εξασφαλιστεί η κάλυψη όλων των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, ακόμη και σε πιο αδιαφοροποίητη κατάσταση τους, χρησιμοποιήσαμε ένα κοκτέιλ από CK18, CK19 και PSA που όλοι επισημασμένο να εκπέμπει στο κανάλι πορτοκαλί. Τα πλακίδια επίσης χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε) για την ταυτοποίηση πυρήνων. Δευτερεύοντα αντισώματα έναντι ρ65 και RelB σημάνθηκαν να εκπέμπει στα κόκκινα και πράσινα κανάλια, αντίστοιχα. Αυτό μας επέτρεψε να διακρίνουμε ειδική χρώση του p65 και RelB στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών κυττάρων

Συγκεκριμένα, η ανάκτηση αντιγόνου για πρώτη φορά διεξάγεται με τηλέφωνα Ρύθμιση 1 (VMSI? # 950-124). Χρησιμοποιώντας το Bench Mark XT αυτοματοποιημένη χρώσης (Ventana Medical System Inc.). Τα πρωτογενή αντισώματα έναντι ρ65 και RelB αραιώθηκαν 1: 125 σε PBS, εφαρμόζεται με το χέρι σε διαφάνειες, και επωάστηκαν στους 37 ° C για 60 λεπτά. Τα ακόλουθα στάδια με το χέρι έγινε στον πάγκο κάτω από συνθήκες για την προστασία των διαφανειών από το φως. Αμφότερα τα δευτερογενή φθορίζοντα αντισώματα επωάστηκαν ταυτόχρονα για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT): αντι-ποντικού Cy5 (# A10524, Life Technologies Inc., ΟΝ, Καναδάς) για ρ65 και αντι-κουνελιού Alexa Fluor 488 (Α488) (# A11008, Life Technologies Inc.) για RelB, ήταν και οι δύο σε αραίωση 1: 250 σε 1Χ PBS. Μετά από δύο διαδοχικές πλύσεις με 1Χ PBS, TMA πλακίδια αποκλείστηκαν για 60 λεπτά με το κλείδωμα Mouse-On-Mouse αντιδραστήριο (1 σταγόνα σε 250 μL PBS, MKB-2213, Vector Laboratories, CA, USA) και στη συνέχεια επωάστηκαν για 90 λεπτά σε RT με αντι-PSA (1: 100 σε PBS). Τα πλακίδια TMA πλύθηκαν δύο φορές και επωάστηκαν για 45 min σε RT με ένα δευτερεύον φθορίζον Cy3 αντι-κατσίκα (# 705-165-003, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., ΡΑ, USA) σε αραίωση 1: 250 σε 1Χ PBS. Τα σλάϊντς στη συνέχεια δεσμεύτηκαν για μία ακόμη φορά με το ποντίκι-On-Mouse αποκλεισμού αντιδραστήριο επί μία νύκτα στους 4 ° C. Ακολούθως, επωάστηκαν για 90 λεπτά σε RT με ένα μείγμα από αντι-CK18 και αντι-CK19 (τόσο στο 1: 100 σε 1Χ PBS) και στη συνέχεια 45 λεπτά σε RT με δευτερογενή φθορισμού αντι-ποντικού Alexa Fluor 546 (A546 αντίσωμα) (# A10036, Life Technologies Inc.). Τέλος, τα πλακίδια επωάστηκαν για 15 λεπτά σε RT με 0,1% (w /v) διάλυμα Sudan Black σε 70% αιθανόλη για τη σβέση του ιστού αυτόματης φθορισμού. Οι πλάκες τοποθετούνται με παρατείνουν Χρυσό αντιξεθωριάσματος έγκλεισης με DAPI (Ρ-36931, Life Technologies Inc.) για τη χρώση των πυρήνων. Μεταξύ κάθε βήμα, TMA slides πλύθηκαν δύο φορές με 1Χ PBS. Τα πλακίδια αποθηκεύθηκαν στους 4 ° C και σαρώνονται την επόμενη ημέρα. Μια αρνητική διαφάνεια ΤΜΑ ελέγχου και γίνεται παράλληλα και επωάστηκε με 1Χ PBS στη θέση όλων των πρωτογενών αντισωμάτων.

Βαφή ποσοτικοποίηση

Η χρώση και βαθμολόγηση διεξήχθησαν τύφλωσε στη μελέτη τελικό σημείο. Οι τομές ιστών σαρώθηκαν με ένα μικροσκόπιο Olympus και VS110 slide scanner συνδεδεμένο με ένα λογισμικό πρόγραμμα προβολής εικόνων OlyVia (xvViewer.exe). φθορίζουσα χρώση ποσοτικοποιήθηκε στη συνέχεια με το λογισμικό VisiomorphDP (Visiopharm, Δανία) που επιτρέπει την αυτοματοποιημένη ανάλυση εικόνας. Η χρώση μέσω δεικτών /PSA CK18 /CK19 χρησιμοποιήθηκε για να περιορίσει την ανάλυση με τα επιθηλιακά περιοχές όπως η περιοχή ενδιαφέροντος # 1 (ROI # 1), ενώ ϋΑΡΙ χρησίμευσαν για την αξιολόγηση του φθορισμού μόνο σε πυρήνες (ROI # 2) (S1 Εικ) . Πυρήνες με καθορισμένες ROI # 1 και # 2 ήταν το χέρι αναθεωρηθεί προκειμένου να διασφαλιστεί η σωστή επιλογή των επιθηλιακών κυττάρων και να αφαιρέσετε περιβάλλοντα ιστό με νέκρωση ή φλεγμονώδεις ζώνες από το ROI. Συνεχής τιμές της έντασης φθορισμού τόσο για ROI # 1 και # 2 στη συνέχεια συλλέχθηκαν από το λογισμικό VisiomorphDP και μεταφέρονται στο Excel για τον ορισμό των επιθηλιακών και πυρηνικά βαθμολογίες NF-κΒ. Τα θετικά και αρνητικά σήματα βασίστηκαν σε καθορισμένες τιμές κατωφλίου (μέσες εντάσεις + τυπική απόκλιση) και χρησιμοποιείται για να υπολογίσει τη συχνότητα των θετικών πυρήνων ανά πυρήνα. Ο μέσος όρος των πυρήνων του όγκου από τον ίδιο ασθενή χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση. Η συσχέτιση ενδο κατηγορία (ICC) μεταξύ των διπλών πυρήνων ήταν 0,68 και 0,70 (

σ

& lt? 0.001, Spearman). Για την πυρηνική p65 και την πυρηνική RelB αντίστοιχα

Στατιστικές αναλύσεις

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SPSS 16.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). Η σύγκριση μεταξύ της κανονικής γειτονικά και συμφωνημένα πυρήνων όγκου εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μη-παραμετρικό τεστ Wilcoxon. Η συσχέτιση με κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητών εκτιμήθηκε με ένα μη-παραμετρικό τεστ συσχέτισης Spearman. Λόγω της φύσης του ανοσοφθορισμού, οι πυρήνες θεωρήθηκαν θετικά για την πυρηνική ΝΡ-κΒ όταν οι τιμές ήταν τουλάχιστον 5% σε σχέση με χρώση υποβάθρου. Χρησιμοποιήσαμε Δέκτης λειτουργικής Χαρακτηριστικές καμπύλες υπολογισμού (ROC) από τη συχνότητα όλων των πυρήνων για να καθορίσει την τιμή κατωφλίου για κάθε NF-κΒ υπομονάδα σε ανάλυση Kaplan-Meier. καμπύλες BCR επιβίωση χωρίς απεικονίσθηκαν με τη χρήση του εκτιμητή Kaplan-Meier και η δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει σημαντικές διαφορές. Η αναλογία του p65 /RelB υπολογίστηκε από τη συχνότητα των πυρηνικών p65 σε σύγκριση με την πυρηνική RelB. Οι μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική μοντέλα αναλογικών κινδύνων (Cox παλινδρόμησης) χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση των λόγων κινδύνου για κάθε NF-κΒ ως κατηγορική μεταβλητή, ενώ οι τιμές που λείπουν δεν θεωρήθηκαν. Η πολυπαραγοντική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια Εισάγετε σταδιακή μοντέλο κινδύνου στην μονοπαραγοντική ανάλυση που απαιτείται για την είσοδο στο μοντέλο. Ένα μέγεθος δείγματος n = 10k θεωρήθηκε πριν την εφαρμογή του πολυπαραγοντικό μοντέλο (n = αριθμός των γεγονότων, k = αριθμός των μεταβλητών). Οι covariables δεν εξαρτάται από το χρόνο. Πρόσθετες κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές που περιλαμβάνονται προ-operatory PSA, το σκορ Gleason, την κατάσταση χειρουργική περιθώριο, εκτός του προστάτη και των σπερματοδόχων επέκταση συμμετοχή κύστη.

Ηθική Δήλωση

Μια δεοντολογική έγκριση για τη μελέτη λήφθηκε από την κατάλληλη συμβούλιο επιθεώρησης (Comité d’éthique de la recherche du CHUM). Μια γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες.

Αποτελέσματα

Ανάλυση ανοσοφθορισμού multi-χρώση p65 και RelB

Ο σκοπός της μελέτης είναι να αναλύσει p65 και RelB στην κανονική δίπλα ή κακοήθεις ιστούς επιθηλιακό καρκίνο του προστάτη, στην ίδια αντικειμενοφόρο TMA χρησιμοποιώντας μια ποσοτική και ημι-αυτοματοποιημένη διαδικασία. Μια ποσοτική ανάλυση παρέχει συνεχή δεδομένα, επιτρέποντας ένα ευρύτερο φάσμα ανίχνευσης και ακριβέστερο προσδιορισμό της χρώσης χαμηλής και υψηλής έντασης. Προκειμένου να διευκολυνθεί αυτή η διαδικασία και να επιτευχθεί η μέγιστη ειδικότητα, επιλέξαμε να εφαρμόσει ένα πολυ-ανοσοφθορισμού τεχνική χρώσης (IF).

Κατ ‘αρχάς, επιλέξαμε επιθηλιακά τομείς που πρέπει να αναλυθούν. Λόγω των γνωστών συστατική έκφραση του σε επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη, κυτοκερατίνης 18 (CK18) επιλέχθηκε για τον προσδιορισμό επιθηλιακών κυττάρων σε δείγματα μας [37]. Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι τα δείγματα ιστού χρωματίζονται με IHC που παράγονται μεταβλητά επίπεδα έκφρασης CK18 και ότι η χρώση ήταν ασθενέστερη σε πτωχά διαφοροποιημένα όγκους (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), μειώνοντας έτσι την ακρίβεια της αναγνώρισης κυττάρου όγκου σε προχωρημένα ιστούς καρκίνου του προστάτη. Για να ξεπεραστεί αυτό, επιλέξαμε CK19 και PSA ως επιθηλιακά αντιγόνα, δεδομένου ότι είναι γνωστό ότι εκφράζεται υψηλά σε επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη [37, 38]. Οπτική επαλήθευση της ταυτόχρονης χρώσης του CK18, CK19 και PSA με πορτοκαλί φθορίζουσες χρωστικές (A546 για CK18 και CK19, και Cy3 για PSA) επιβεβαίωσε την πλήρη επιθηλιακά κάλυψη από το παρόν τρι-αντιγόνου χρώση κοκτέιλ, παρέχοντας την ευαισθησία και ειδικότητα που απαιτείται για τον εντοπισμό του προστάτη επιθηλιακά κύτταρα ανεξάρτητα από το επίπεδο της διαφοροποίησης ιστού (S1 Σχήμα).

το πορτοκαλί επιθηλιακών μάσκα χρησιμοποιήθηκε με την πυρηνική χρώση ϋΑΡΙ να περιορίσει τον ποσοτικό προσδιορισμό των ρ65 και RelB σε επιθηλιακό πυρήνες. Η ρ65 υπομονάδες και RelB βάφτηκαν με Cy5 (κόκκινη) και Α488 (πράσινο) βαφές, αντίστοιχα (σχέδιο 1). Μετά από αυτό το τετράκλινο ΕΑΝ χρώση, πραγματοποιήσαμε μια ποσοτική ανάλυση της p65 και RelB από σαρωμένες εικόνες χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ανάλυσης ανοσοφθορισμού εικόνα VisiomorphDP. Μια τιμή κατωφλίου της έντασης φθορισμού ορίστηκε για τη διάκριση θετικών και αρνητικών σημάτων φθορισμού, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η συγκεκριμένη συχνότητα (%) του p65- ή RelB- θετικών πυρήνων σε κάθε πυρήνα ιστό (συμπεριλαμβανομένων των διπλών θετικών πυρήνων) (Σχήμα 1).

Α. Επιθηλιακά χρώση με CK18, CK19 και PSA καθορίζει την επιθηλιακά μάσκα χρησιμοποιώντας πορτοκαλί φθοριοχρώμων (A546, Cy3). B. Ταυτοποίηση των επιθηλιακών περιοχής (που παρουσιάζονται σε γκρι για βέλτιστη αντίθεση σε επόμενες αναλύσεις) ως ROI # 1 (περιοχή ενδιαφέροντος # 1). Προσδιορισμός των πυρήνων (γκρι που περιβάλλεται από κόκκινο ιχνηλάτηση) ως ROI # 2 από προκαθορισμένες ROI # 1. Ρ65 και φθορισμού RelB στη συνέχεια αξιολογήθηκαν ξεχωριστά σε ROI # 1 και # 2. χρώση Γ RelB με πράσινη φθορίζουσα χρωστική (Α488) και χρώση p65 με κόκκινη φθορίζουσα χρωστική (Cy5). Βήματα 1, 2 και 3 αντιστοιχούν με τη διαδικασία ανάλυσης φθορισμού που ακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Visiomorph DP.

Η

Σύγκριση της έκφρασης p65 χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία και ποσοτική αυτοματοποιημένη ανάλυση ανοσοφθορισμού

TMAs, που περιέχει τον ασθενή συμφωνημένα πυρήνες από καρκινικούς ιστούς 200 προστάτη και φυσιολογικό παρακείμενο επιθηλίου βάφτηκαν, σαρώνονται και αξιολογούνται για την p65 και θετικό μήνυμα RelB. Μετά την αναθεώρηση των κλινικών δεδομένων μόνο 11 περιπτώσεις αποκλείστηκαν επειδή δεν πληρούν πλέον τα κριτήρια ένταξης. Παρουσία p65 και RelB ήταν ως επί το πλείστον παρατηρήθηκε σε επιθήλιο, τόσο με κυτταροπλασματική και πυρηνικά διαμερίσματα που εμφανίζουν θετική χρώση (Σχήμα 2Α). Χρησιμοποιώντας το αυτοματοποιημένο πρόγραμμα βαθμολόγησης, ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει αρνητική, μόνο p65 (Cy5) ή RelB (Α488), και το διπλό (Cy5 /Α488) βάφονται πυρήνες (Σχήμα 2Α).

Α. Μεγέθυνση (40Χ) τονίζοντας αδενικό δομές σε ιστούς του καρκίνου του προστάτη. Συγχώνευση: επάλληλα εικόνες RelB (Α488) σε πράσινο, ρ65 (Cy5) σε κόκκινο και πυρήνες (ϋΑΡΙ) σε μπλε, σε φυσιολογικά παρακείμενα (άνω) ή καρκινικούς ιστούς (κάτω). Τα βέλη δείχνουν χρωματισμένο πυρήνες. Β Συγκριτικό ποσοτικοποίηση από IHC (αριστερά) και IF (δεξιά) χρώση του p65. Γραφήματα δείχνουν την κατανομή συχνότητας των πυρηνικών p65 όπως αξιολογείται οπτικά (IHC) ή αυτόματα (IF). Γ Συχνότητα των πυρηνικών ρ65 (αριστερά), RelB (μέση) και διπλό χρωματισμένο πυρήνες (δεξιά) σε φυσιολογικό γειτονικό και καρκινικών ιστών. Η σύγκριση μεταξύ των γειτονικών φυσιολογικών και καρκινικών πυρήνων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία Wilcoxon του.

Η

Για την αξιολόγηση της απόδοσης αυτής της τεχνικής IF, εφαρμόζονται για την ποσοτικοποίηση των πυρηνικών δεικτών στον ιστό του καρκίνου του προστάτη, συγκρίναμε τα αποτελέσματα ποσοτικοποίησης από την αυτοματοποιημένη ανάλυση με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τη χρήση παραδοσιακών χρώση IHC. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, η συχνότητα του p65 χρωματισμένων πυρήνων αξιολογήθηκε. Πήραμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ των δύο συνόλων δεδομένων (r = 0.410,

σ

& lt? 0.001 Spearman), η οποία είναι στο ίδιο εύρος με την συσχέτιση μεταξύ των διπλών πυρήνων εντός της δεδομένης τεχνική. Η παραδοσιακή μέθοδος IHC, με βάση την οπτική βαθμολόγηση, δεν ήταν σε θέση να διακρίνουν μεταξύ χρώση χαμηλή (ή καθόλου), οδηγώντας έτσι σε υπερεκτίμηση του αρνητικού πυρήνες έκφρασης ρ65 (Σχήμα 2Β). Χρησιμοποιώντας τις καμπύλες εκτίμηση Kaplan-Meier, συγκρίναμε επίσης τη συσχέτιση μεταξύ της συχνότητας επιβίωση των πυρηνικών ρ65 και κίνδυνο BCR, όπως αναλύθηκε προηγουμένως σε πολλές άλλες ομάδες του καρκίνου του προστάτη [21, 22, 25, 39]. Πυρηνική p65 βρέθηκε να ομοίως και σημαντικά που συνδέονται με τον κίνδυνο της BCR τόσο στην παραδοσιακή IHC και λογισμικό αναλύονται Αν τα δείγματα (log rank = 4.38,

σ

= 0,036 και Log rank = 4.83,

p

= 0,0028, αντίστοιχα). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά επικυρώνουν τη χρήση αυτόματων ανάλυση με IF για την αξιολόγηση της τοπικής προσαρμογής υπομονάδας ΝΡ-κΒ και τον ποσοτικό προσδιορισμό σε ιστούς καρκίνου του προστάτη.

Ανάλυση της πυρηνικής διανομής ρ65 και RelB σε ιστούς καρκίνου του προστάτη

Ενώ ρ65 πυρηνικού εντοπισμού αυξήθηκε σε όγκους του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικούς γειτονικούς ιστούς (Σχήμα 2C,

ρ

& lt? 0.000, Wilcoxon τεστ), RelB εμφάνισε υψηλότερη έκφραση σε φυσιολογικό γειτονικό ιστό vs. ιστό του όγκου (p = 0,001, δοκιμή Wilcoxon, εικ 2C). Το ποσοστό των διπλών /πυρήνων RelB χρωματισμένο p65 δεν έδειξε κάποια σημαντική διαφοροποίηση μεταξύ των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών (Σχήμα 2C).

Σε πυρήνες των όγκων, η ενεργοποίηση της κλασσικής οδού, όπως φαίνεται από την πυρηνική p65, ήταν σημαντικά συσχετίζεται με την ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού, όπως αντιπροσωπεύεται από τον πυρηνικό εντοπισμό RelB (r = 0,522, p & lt? 0.001 Spearman). Για να εκτιμηθεί η ποσότητα της αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο οδών ΝΡ-κΒ, συγκρίναμε την πυρηνική συχνότητα κάθε υπομονάδας με την παρουσία ή απουσία του άλλου υπομονάδας. Όταν εκφράστηκε πυρηνικών RelB, υπήρξε μια ταυτόχρονη αύξηση p65 συχνότητα πυρηνικού εντοπισμού σε σύγκριση με πυρήνες χωρίς πυρηνική RelB (27% και 19%, αντίστοιχα). Ομοίως, η παρουσία των πυρηνικών p65 σχετίστηκε με μια αύξηση στην πυρηνική εντόπιση του RelB (18% και 10%, αντίστοιχα).

Συσχέτιση των μεταβλητών ΝΡ-κΒ με κλινικο- παθολογικές παράμετροι

Στη συνέχεια αξιολογήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της πυρηνικής ρ65 (που αντιπροσωπεύει την ενεργοποίηση της κλασσικής οδού) ή RelB (που αντιπροσωπεύει την ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού) και κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Παρά το γεγονός ότι η πυρηνική έκφραση αυτών των δύο πρωτεϊνών δεν συσχετίστηκε σημαντικά με τις περισσότερες παραμέτρους του καρκίνου του προστάτη επιθετικότητα, υπήρξε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ των πυρηνικών p65 και των σπερματοδόχων κυστιδίων εμπλοκή (r = 0,121, ρ = 0,048, Spearman, Πίνακας 1) .Furthermore, υπήρχε τάση μεταξύ των πυρηνικών RelB και τον ασθενή Gleason σκορ (r = -0,105, p = 0,081, Spearman, Πίνακας 1).

η

Ανάλυση της συν-έκφραση της p65 και RelB

Για να αξιολογούν τον ρόλο του κάθε μονοπατιού ΝΡ-κΒ σε εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και του δυναμικού αλληλοπαρεμβολές μεταξύ των δύο οδών, χρησιμοποιήσαμε βιοχημικής υποτροπής (BCR) ως ένα λειτουργικό δείκτη αυτών των δραστηριοτήτων. Η πυρηνική συχνότητα της p65 συνδέθηκε με τη συνολική BCR (

σ

= 0,028, log rank = 4.843, Σχ 3Α). αναλύει μια παλινδρόμησης Cox επιβεβαίωσε τη σχέση μεταξύ p65 και BCR στη μονοπαραγοντική (HR = 1,93,

σ

= 0,017) και τα μοντέλα πολλών μεταβλητών (HR = 3,15,

σ

= 0,003), συμπεριλαμβανομένων των κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρων όπως σκορ Gleason, έξτρα-προστατική επέκταση, των λεμφαδένων εισβολή, σπερματοδόχων συμμετοχή κύστη, και χειρουργικά όρια (Πίνακας 2). Σε αντίθεση με την p65, την εκτίμηση κατά Kaplan-Meier και μονοπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox έδειξαν ότι το καθεστώς RelB από μόνη της δεν συσχετίστηκε με BCR (

σ

= 0.301, Σχ 3Β και Πίνακας 2). Παραδόξως, η συχνότητα της p65 /RelB διπλά θετικά πυρήνες δεν ήταν σημαντικά πρόβλεψης της BCR, αλλά παρατηρήθηκε μια τάση προς μια χειρότερη πρόγνωση (

σ

= 0.078, Σχ 3C).

Kaplan-Meier βιοχημικές καμπύλες επιβίωσης χωρίς υποτροπή Α High (& gt? 20%) και χαμηλή (& lt? 20%) συχνότητα των πυρηνικών p65 στα επιθήλια των καρκινικών ιστών. Β High (& gt? 5%) και χαμηλή (& lt? 5%) συχνότητα των πυρηνικών RelB στα επιθήλια των καρκινικών ιστών. Σημασία (

σ

) υποδεικνύεται από βαθμού καταγραφής. Γ Double πυρηνική επιθηλιακό χρώση του p65 και RelB. Δ Τα επιθηλιακά και πυρηνική χρώση του p65 και RelB. Η αρνητική μεταβλητή κΒ αντιπροσωπεύει ασθενείς χωρίς θετικά πυρήνες ιστού για p65 και RelB. Το p65 μεταβλητή μόνη της ή RelB μόνη της αντιπροσωπεύει ασθενείς θετικοί μόνο για την πυρηνική p65 ή την πυρηνική RelB. Η μεταβλητή p65 + RelB είναι ασθενείς με παρουσία και των δύο πυρηνικών υπομονάδων με τον ίδιο πυρήνα. E. Ανάλυση της επιθηλιακής ποσοστό των πυρηνικών p65 σε RelB σε πυρήνες ιστού μέσα σε τόσο p65 και χρώση RelB. Η αναλογία ρ65 /RelB αντιπροσωπεύει τη συχνότητα του p65 με την συχνότητα του RelB. Το p65 μεταβλητή & gt? RelB αντιπροσωπεύει ένα λόγο τουλάχιστον 2 φορές περισσότερο από ό, τι p65 RelB? p65-RelB αντιπροσωπεύει μια αναλογία μεταξύ 0,50 και 2 φορές, και RelB & gt? p65 αντιπροσωπεύει ένα λόγο τουλάχιστον 2 φορές περισσότερο από ό, τι RelB p65

Η

Η δραστηριότητα και την αλληλεπίδραση μεταξύ της p65 και RelB. μονοπάτια μπορούν να ποικίλουν ευρέως μέσα σε ένα ενιαίο ιστό που μπορεί να περιέχει ένα μικτό σχήμα έκφρασης με τα κύτταρα που δείχνουν μόνο p65 ή μόνο RelB ενώ άλλοι είναι διπλά θετικό. Για τον προσδιορισμό των επιμέρους ρόλους των p65 και RelB, συγκρίναμε τους ιστούς των ασθενών με την ενεργοποίηση ενός μόνο μονοπατιού, εκπροσωπούμενη από την πυρηνική συχνότητα είτε p65 ή RelB, και οι ασθενείς χωρίς καμία δραστηριότητα NF-κΒ (Σχήμα 3D). Ασθενείς με μόνη δραστηριότητα p65 έδειξε ένα σημαντικά μικρότερο χρόνο υποτροπής σε σύγκριση με ασθενείς χωρίς καμία δραστηριότητα NF-κΒ (138 μήνες και 98 μήνες αντίστοιχα, Log rank = 8,8,

σ

= 0,002,) ή σε σύγκριση με τους ασθενείς με RelB μόνο (

σ

= 0,021, Log Rank = 5.4, Σχήμα 3D). Αυτό επιβεβαιώνει ότι το κλασικό μονοπάτι ΝΡ-κΒ προωθεί έντονα την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Αντίθετα, στην ομάδα μας ασθενή, δραστηριότητα RelB μόνη της δεν φάνηκε να επηρεάζει υποτροπής σε σύγκριση με ασθενείς χωρίς ενεργοποίηση του NF-κΒ

(p = 0,741

, Σχήμα 3D). Είναι ενδιαφέρον ότι η πυρηνική παρουσία τόσο p65 και RelB στον ίδιο πυρήνα δεν συσχετίστηκε σημαντικά με BCR (

σ

= 0.252), γεγονός που υποδηλώνει ότι RelB μπορεί να εξουδετερώσει τη βιολογική δράση του p65.

Για να καθορίζουν το δυναμικό του ρόλου των RelB στη δραστηριότητα p65, διερευνήσαμε την επίδραση της κάθε οδού από την άλλη σε ποικίλες αναλογίες. Η αναλογία των πυρηνικών p65 και RelB χρησιμοποιήθηκε για να διαχωρίσουν τους ιστούς των ασθενών με διπλή χρώση των ρ65 και RelB (Σχήμα 3Ε). Τρεις κατηγορίες έγιναν: οι ασθενείς με υψηλότερο ποσοστό της πυρηνικής ρ65 από RelB (μεγαλύτερο από 2 φορές), οι ασθενείς με υψηλότερο ποσοστό της πυρηνικής RelB από ρ65, και οι ασθενείς με σχετικά ίσο αριθμό p65- και RelB-θετικών πυρήνων (έως 2 φορές διαφορά). Όπως ήταν αναμενόμενο, ένα υψηλό επίπεδο πυρηνικής p65 σχετίζεται με σημαντικό κίνδυνο BCR (log rank = 6,8,

σ

= 0.026 Σχήμα 3Ε) σε σύγκριση με τις περιπτώσεις παρόμοιο επίπεδο των p65 και RelB.