Αφηρημένο

Πρόσφατες πρόοδο στην τεχνολογία αλληλουχίας επέτρεψε ολοκληρωμένο προφίλ των γενετικών αλλοιώσεων σε καρκίνο. Έχουμε αναπτύξει μια στοχευμένη πλατφόρμα αλληλούχιση χρησιμοποιώντας την τεχνολογία επόμενης γενιάς αλληλουχίας (NGS) για κλινική χρήση, η οποία μπορεί να παρέχει δεδομένα μετάλλαξης και μεταβολή του αριθμού αντιγράφων. NGS διεξήχθη με ζευγαρωμένα-άκρο βιβλιοθήκη εμπλουτισμένη με εξώνια του 183 γονίδια σχετίζονται με τον καρκίνο. Φυσιολογικών και καρκινικών ιστών ζεύγη 60 ορθοκολικού αδενοκαρκινώματα χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση σκοπιμότητας. Σωματικά μετάλλαξη και ο αριθμός αντιγράφων αλλοίωση αναλύθηκαν. Ένα σύνολο 526 σωματικών μη συνώνυμες παραλλαγές αλληλουχίας βρέθηκαν σε 113 γονίδια. Μεταξύ αυτών, 278 και μόνο παραλλαγές νουκλεοτιδίου ήταν 232 διαφορετικές μεταλλάξεις σωματικών σημείο. 216 SNV ήταν 79 γνωστούς πολυμορφισμούς μονών νουκλεοτιδίων στο dbSNP. 32 indels ήταν 28 διαφορετικές μεταλλάξεις Indel. Διάμεσος αριθμός των μεταλλαγμένων γονιδίων ανά όγκο ήταν 4 (εύρος 0-23). αύξηση αριθμού αντιγράφων (& gt? Χ2 φορές) βρέθηκε σε 65 γονίδια σε 40 ασθενείς, ενώ η αντιγραφή απώλεια αριθμό (& lt? X0.5 φορές) βρέθηκε σε 103 γονίδια σε 39 ασθενείς. Οι πιο συχνά μεταβάλλονται γονίδια (μετάλλαξη ή /και τον αριθμό αντιγράφων της μετατροπής) ήταν

APC

σε 35 ασθενείς (58%),

TP53

σε 34 (57%), και

KRAS

σε 24 (40%). Altered λίστα γονίδιο αποκάλυψε ErbB μονοπατιού σηματοδότησης ως το πιο συχνά εμπλέκεται μονοπάτι (25 ασθενείς, 42%). Στοχευμένες πλατφόρμα αλληλουχίας με τη χρήση της τεχνολογίας NGS είναι εφικτό για κλινική χρήση και δίνει λεπτομερή στοιχεία για τη γενετική τροποποίηση

Παράθεση:. Χαν S-W, Kim Η-Ρ, Shin J-Υ, Jeong E-G, Lee W-C, Lee K-H, et al. (2013) Στοχευμένη αλληλουχίας των σχετιζόμενων με τον καρκίνο γονίδια για τον καρκίνο του παχέος Χρησιμοποιώντας Next-Generation αλληλουχίας. PLoS ONE 8 (5): e64271. doi: 10.1371 /journal.pone.0064271

Επιμέλεια: Noam Shomron, Πανεπιστήμιο του Τελ Αβίβ, Ισραήλ

Ελήφθη: 18 Φλεβάρη του 2013? Αποδεκτές: 10η του Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: May 21, 2013

Copyright: © 2013 Han et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από την κορεατική Υγείας τεχνολογίας Ε & amp? έργου D, Υπουργείο Υγείας, Πρόνοιας & amp? Οικογενειακών Υποθέσεων, Δημοκρατία της Κορέας (A091081). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς επιθυμούν να δηλώσουν ότι Jong-Yeon Shin και Jong-Il Kim είναι σύμβουλοι για Ψωμά Therapeutics και Jeong-Κυρ Seo είναι σύμβουλος για Macrogen. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Πολλαπλές γενετικές γεγονότα συσσωρεύονται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του ορθοκολικού καρκινογένεσης [1]. Υπάρχει ένας αριθμός μοριακών υποτύπων του ορθοκολικού καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων και αστάθεια μικροδορυφόρου χρωμοσωμική αστάθεια [2], [3]. Ωστόσο, οι υπότυποι έχουν περιορισμένη προγνωστική ή προγνωστική αξία και δεν επηρεάζουν την απόφαση θεραπεία στο μεταστατικό ρύθμιση. Σε αντίθεση,

KRAS

μετάλλαξη είναι το πιο σημαντικό και ευρέως χρησιμοποιούμενη μοριακή δοκιμή στο μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου. Κατάστασης μεταλλάξεων του

KRAS

καθοδηγεί απόφαση για τη θεραπεία γιατί η παρουσία της μετάλλαξης μπορεί να προβλέψει την έλλειψη κέρδους από

EGFR

-targeted αντισώματα [4].

αλληλουχίας μεγάλης κλίμακας αναλύσεις χρησιμοποιώντας συμβατικές μεθόδους προσδιορισμού αλληλουχίας παρείχε γενετική τοπίο του καρκίνου του παχέος εντέρου που δείχνει ότι υπάρχουν μερικά γονίδιο «βουνά» μεταλλαχθεί σε μεγάλο ποσοστό των όγκων και πολλά «λόφοι» μεταλλαγμένο σπάνια [5], [6]. Επιπλέον, το γονιδίωμα-ευρεία ανάλυση αριθμού αντιγράφων αποκάλυψε ότι ορθοκολικό καρκίνο έχει αριθμό λιγότερων αντιγράφων μεταβολές σε σύγκριση με τον καρκίνο του μαστού [7]. Πρόσφατη πρόοδο στην τεχνολογία αλληλούχισης χρησιμοποιώντας αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS) έχει διευκολύνει ανάλυση του συνόλου του γονιδιώματος σε μεμονωμένες καρκίνους και ταυτοποίηση νέων γενετικών αλλοιώσεων [8], [9]. Σε μελέτες του καρκίνου του παχέος εντέρου, έχουν νέα υποτροπιάζουσες γενετική συντήξεις έχουν ταυτοποιηθεί [10], [11]. Ωστόσο, σημαντικό μειονέκτημα της προσέγγισης αλληλουχίας ολόκληρο το γονιδίωμα ή exome είναι ο προσδιορισμός των πολλών λειτουργικά ασαφές, ασυνήθιστο, δυνατό «επιβάτης» μεταλλάξεις με άγνωστη κλινική σημασία. Επιπλέον, σχετικά χαμηλή κάλυψη της προσέγγισης μεγάλης κλίμακας έχει περιορισμό στην ευαισθησία και ειδικότητα, η οποία είναι ένα σημαντικό θέμα για εφαρμογή στην κλινική ρύθμιση. Γενετικές αλλοιώσεις που προσδιορίζονται από χαμηλή ανάλυση κάλυψης χρειάζεται επιβεβαίωση για να χρησιμοποιηθεί στη λήψη κλινικών αποφάσεων.

Στοχευμένες αλληλουχίας θα μπορούσε να είναι μια καλύτερη εναλλακτική λύση για την κλινική εφαρμογή της τεχνολογίας NGS. Πλεονέκτημα της στοχευμένη προσέγγιση είναι αύξηση σε βάθος κάλυψη σε σύγκριση με την προσέγγιση ολόκληρη exome μειώνοντας τον αριθμό των γονιδίων που αναλύθηκαν με παρόμοιο αριθμό των ζευγών βάσεων αλληλουχία. Αυτό επιτρέπει την παραγωγή αξιόπιστων δεδομένων με αρκετό βάθος αλληλουχίας των στοχευόμενων γονιδίων ενδιαφέροντος.

Έχουμε αναπτύξει μια στοχευμένη πλατφόρμα αλληλουχίας με τη χρήση της τεχνολογίας NGS, η οποία περιλαμβάνει 183 γονίδια και παρέχει μετάλλαξη και να αντιγράψετε τα δεδομένα παραλλαγή αριθμό. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να ελεγχθεί η σκοπιμότητα της στοχευμένη πλατφόρμα αλληλουχίας για τη μελλοντική κλινική εφαρμογή με τη χρήση του παχέος ιστούς όγκων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Το πρωτόκολλο της μελέτης αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review του Εθνικού Πανεπιστημίου της Σεούλ Νοσοκομείο (SNUH). Όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για τις τραπεζικές ιστού και γενετικό έλεγχο πριν από την επέμβαση. Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις συστάσεις της Διακήρυξης του Ελσίνκι για τη βιοϊατρική έρευνα σε ανθρώπους.

Μελέτη επισκόπηση

Ένα σύνολο 183 γονιδίων (Πίνακας S1) επιλέχθηκαν με τα ακόλουθα κριτήρια : γνωστό για την πρόβλεψη ανταπόκριση, θεραπευτικά δυνατότητα στόχευσης, που εμπλέκονται σε μεγάλες οδούς σηματοδότησης, και υψηλή συχνότητα μετάλλαξης στον κατάλογο των σωματικών μεταλλάξεων στη βάση δεδομένων του Καρκίνου (COSMIC). Κατεψυγμένα πρωτογενούς όγκου και γειτονικό φυσιολογικό δείγματα ιστών αποκτήθηκαν από SNUH όγκων Τράπεζα. Τα δείγματα deidentified και κλινικο-παθολογικές πληροφορίες που παρασχέθηκαν από τον όγκο Τράπεζα. DNA που εξάγεται από τον ιστό εστάλη Genome Medicine Institute, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ. αποτελέσματα Sequencing αναφέρθηκαν εντός 3 εβδομάδων (Σχήμα S1).

Target εμπλουτισμό του γονιδιακού DNA και αλληλούχιση

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από τα ζεύγη δειγμάτων χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp DNA Mini (Qiagen, Hilden, Γερμανία). Τρία μικρογραμμάρια του ΟΝΑ διασπασμένο χρησιμοποιώντας Covaris S2 (Covaris, Inc., Massachusetts, USA) για να -250 nt σε κύκλο 20%, το επίπεδο 5 ένταση και 200 ​​κύκλους ανά ριπή για 180 s. βιβλιοθήκες αλληλούχιση θραύσματος γραμμωτούς κωδικούς έγιναν χρησιμοποιώντας ένα Paired-άκρο kit προετοιμασία του δείγματος DNA (Illumina, California, USA) και Illumina πολυπλεξίας προσαρμογέα (Illumina) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την σύνδεση με τον προσαρμογέα Illumina, οι βιβλιοθήκες παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας AMPure χάντρα (Beckman Coulter, Inc., California, USA) και όχι καθαρισμό πηκτής. την ποιότητα της βιβλιοθήκης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Agilent 2100 Αναλυτής και το DNA 1.000 μάρκες (Agilent Τεχνολογίας, California, USA). Να σχεδιάσει τα δολώματα RNA για τη σύλληψη, θα χρησιμοποιηθεί η κοσμική (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic) και το site Agilent Technologies eArray (https://earray.chem.agilent.com/earray /). Οι στοχευμένες περιοχές περιλαμβάνονται όλα τα εξώνια των 183 γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορους καρκίνους και το συνολικό μήκος κατέλαβε ήταν περίπου 1 Μ Τα δολώματα ήταν μήκους 120 bp, και η μέση κάλυψη δόλωμα της κάθε βάσης στην περιοχή στόχος ήταν 2X. Αποφύγαμε τυπική επανάληψη μασκοφόροι περιοχές, αλλά επιτρέπεται κάθε δόλωμα για να επικαλύπτονται με μια επαναλαμβανόμενη περιοχή έως και 20 bp. Εντοπίσαμε επίσης αλληλουχίες εντός επαναλαμβανόμενες περιοχές που ήταν αρκετά μοναδική για να χρησιμεύσουν ως εύλογο δολώματα. Ένα ισογραμμομοριακό οκτώ plex πισίνα παρήχθη για εμπλουτισμό χρησιμοποιώντας ένα SureSelect Kit Target Εμπλουτισμός Συστήματος (Agilent Τεχνολογίας) και ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο. Πεντακόσια νανογραμμάρια συγκεντρωμένων DNA με 5 μl (100 ng) της συνήθειας δολώματα χρησιμοποιήθηκαν για εμπλουτισμό, με κλείδωμα ολιγονουκλεοτίδια ειδικά για ζεύγη τέλος βιβλιοθήκες αλληλουχίας και 24-h υβριδισμό. Βιοτινυλιωμένο υβρίδια βιβλιοθήκη RNA ανακτήθηκαν με χάντρες στρεπταβιδίνης. Οι κατέλαβε βιβλιοθήκες ενισχύθηκαν και αλληλουχία στην Illumina Γονιδιώματος αναλυτή IIx από 2 × 69 κύκλους. Εμείς ευθυγραμμιστεί η προκύπτουσα σύντομη ακολουθία διαβάζει στο γονιδίωμα αναφοράς (συναρμολόγηση NCBI ανθρώπινο γονιδίωμα χτίσει 37) χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Genomic Short-διαβάσει νουκλεοτιδικές Ευθυγράμμιση Πρόγραμμα (GSNAP) ευθυγράμμιση [12], με το επίδομα για 5% αναντιστοιχίες μετά τον συνυπολογισμό διπλότυπα PCR και αναφέρει ότι δεν ευθυγραμμιστούν με κατέλαβε περιοχές του γονιδιώματος αναφοράς. Τα δεδομένα αλληλουχίας που αποστέλλονται στην Ευρωπαϊκή νουκλεοτιδικές Αρχείο EBI (https://www.ebi.ac.uk/ena/home) με τον αριθμό πρόσβασης ERP002442.

παραλλαγή ενός νουκλεοτιδίου (SNV) και ανίχνευση Indel

Ζητήσαμε γονιδιωματικής παραλλαγές του κάθε δείγματος (SNVs και σύντομη indels) χρησιμοποιώντας τροποποιημένα κριτήρια από προηγούμενες δημοσιεύσεις μας στην αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος [13], [14]. Εν συντομία, SNVs και indels ορίστηκαν με βάση την ικανοποίηση από τις ακόλουθες τρεις προϋποθέσεις: (1) ο αριθμός των μοναδικά χαρτογραφηθεί διαβάζει στη θέση θα πρέπει να είναι δύο ή περισσότερα? (2) η μέση ποιότητα βάσης (

Phred

βαθμολογία Q) για τη θέση θα πρέπει να είναι 20? και (3) τη συχνότητα ανάγνωσης αλληλόμορφο στην θέση θα πρέπει να είναι 20%. Για την ανίχνευση των σωματικών μεταλλάξεων (SNVs και indels) στους ιστούς του καρκίνου, χρησιμοποιήσαμε τις ακόλουθες προϋποθέσεις: (1) nonsynonymous SNVs ή indels στους ιστούς του καρκίνου? (2) ο αριθμός αλληλόμορφο SNV πρέπει να είναι μηδέν στη στοχευμένη αλληλουχία του φυσιολογικού ιστού? (3), ο αριθμός αλληλόμορφο άγριου τύπου θα πρέπει να είναι 10 ή περισσότερα στη στοχευμένη αλληλουχία του φυσιολογικού ιστού? και (4) οι υποψήφιες θέσεις δεν θα πρέπει να είναι πολυμορφισμούς σύμφωνα με την dbSNP132. Οι λειτουργικές συνέπειες των νέων παραλλαγών παρερμηνεύσιμη είχαν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας Ταξινόμηση Δυσανεκτικοί από ανεκτική (SIFT) [15]. Μετάλλαξη στο

KRAS

επιβεβαιώθηκε με χρήση αλληλουχίας Sanger. Ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: codon12 και 13, προς τα εμπρός 5′-CGTCTGCAGTCAACTGGAAT-3 ‘και αντίστροφος 5′-GAGAGTGAACATCATGGACC-3′? κωδικόνιο 61, προς τα εμπρός 5’-CAGACTGTGTTCTCCCTTCTCA-3 ‘και αντίστροφη 5′-CTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3′? και το κωδικόνιο 146, προς τα εμπρός 5’-TGGACAGGTTTTGAAAGATATTTG-3 ‘και αντίστροφη 5′-ATTAAGAAGCAATGCCCTCTCAAG-3’. Όλες οι αντιδράσεις αλληλούχισης έγιναν σε τόσο προς τα εμπρός και να αντιστρέψει τις κατευθύνσεις, και όλες οι μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν τουλάχιστον δύο φορές από ανεξάρτητες PCR απομονώνει.

Αντιγραφή αριθμού αλλοίωση

Εμείς εκτίμησε την κάλυψη των γονιδίων με τη χρήση αλληλουχίας διαβάζει αντιστοιχίζονται με τις στοχευμένες περιοχές. Για την ανίχνευση αριθμού αντιγράφων μεταβολή για ένα δεδομένο ζεύγος του καρκίνου και φυσιολογικούς ιστούς, οι αναλογίες φορές κάλυψη (όγκος /φυσιολογικό) για 183 γονιδίων-στόχων υπολογίστηκαν. Μετά το στάδιο ομαλοποίησης θεωρώντας σύνολο βάσεων ανάγνωσης που λαμβάνεται από κάθε ιστό, η αναλογία φορές κάλυψη ρυθμίστηκε από την εκτιμώμενη καθαρότητα των κυττάρων του όγκου που περιγράφονται κατωτέρω. Ορίσαμε ότι ένα γονίδιο δείχνει να αντιγράψετε το κέρδος αριθμό όταν ο λόγος φορές η κάλυψη της ≥2.0 και την απώλεια, όταν ≤0.5.

Για να εκτιμηθεί η καθαρότητα του όγκου, χρησιμοποιήσαμε διαβάσετε μετρήσεις των σωματικών SNVs εντοπιστεί. Δεδομένου σωματικά SNVs για κάθε ιστό καρκίνου, υποθέσαμε ότι ο καρκίνος αποτελεί ένα σημαντικό κλώνου και οι SNVs προέρχεται από τον κλώνο. Επιπλέον, θεωρείται τις SNVs ως ετεροζυγώτες των οποίων αλληλόμορφο συχνότητα είναι 0,5. Με αυτές τις υποθέσεις, η καθαρότητα των όγκων εκτιμήθηκε ως εξής. Τα αναμενόμενα αριθμοί άγριου τύπου διαβάζει προήλθε από τον κλώνο του καρκίνου και φυσιολογικά κύτταρα υπολογίστηκαν. Στη συνέχεια, το ποσοστό του αγρίου τύπου συν SNP διαβάσει μετράει για τον καρκίνο μεταξύ του συνολικού αριθμού των μετρήσεων ανάγνωσης θεωρήθηκε ως το αντίστοιχο καθαρότητα του όγκου. Σε 3 δείγματα που δεν είχαν όγκο συγκεκριμένες SNV, η μέση τιμή των 57 δειγμάτων που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση του αντιγράφου παραλλαγές αριθμού.

Αντιγραφή αριθμού μεταβολή επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου με το σύστημα ανίχνευσης iCycler IQ ( Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) χρησιμοποιώντας SYBR Green Ι (Molecular Probe, Eugene, OR) εις τριπλούν αντιδράσεις. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην αντίδραση PCR ήταν ως εξής:

ERBB2

, προς τα εμπρός 5′-TGCTGGAGGACGATGACATG-3 ‘και αντίστροφος 5′-CTGGACAGAAGAAGCCCTGC-3’?

SRC

, μπροστά 5′-CGGTTACTGCTCAATGCAGA-3 ‘και αντίστροφη 5′-CAAGAGCGCTCGTACCTTTC-3’?

TP53

, μπροστά 5′-CCCTTCCCAGAAAACCTACC-3 ‘και αντίστροφη 5′-ACTGACCGTGCAAGTCACAG-3’?

PTEN

, μπροστά 5′-TGGCACTGTTGTTTCACAAG-3 ‘και αντίστροφη 5′-TGTTCCAATACATGGAAGGATG-3’?

BRCA1

, μπροστά 5′-GTTTGCCAGAAAACACCACA-3 ‘και αντίστροφη 5′-TTTATGCAGCAGATGCAAGG -3’?

BRCA2

, μπροστά 5′-TGCCTGGCCTGATACAATTA-3 ‘και αντίστροφη 5′-TTGCTGCTTCCTTTTCTTCC-3’? και

ACTB

, μπροστά 5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC και αντίστροφη 5′-GGATGCCACAGGACTCCA-3 ‘. Ο φθορισμός

σε in situ υβριδισμού

(FISH) ανάλυση του

ERBB2

/CEP17 εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ PathVysion (Vysis, Downers Grove, IL) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

μικροδορυφορικού κατάσταση

Η κατάσταση μικροδορυφόρων κάθε όγκου προσδιορίζεται με την εξέταση 5 δείκτες μικροδορυφορικού (D2S123, D5S346, D17S250, BAT25, και BAT26) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Είτε τα εμπρός ή αντίστροφο εκκινητή για κάθε δείκτη σημάνθηκε με φθορισμό, και τα προϊόντα της PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση και αναλύθηκαν. Εμείς κατατάσσονται κατάσταση MSI ως εξής:. MSI-υψηλή, αστάθεια σε δύο ή περισσότερους δείκτες μικροδορυφόρων, MSI-χαμηλά, η αστάθεια σε ένα δείκτη, και MSS, δεν δείκτη αστάθειας

ανάλυση Διαδρομή

Διαδρομή ανάλυση έγινε για τα γονίδια που έχουν μετάλλαξη ή τον αριθμό αντιγράφων μεταβολή σε κάθε όγκου χρησιμοποιώντας βάση δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (David) Βιοπληροφορική Πόρων έκδοση 6.7 που χρησιμοποιεί η οδός βάσεις δεδομένων BBID, Biocarta, και του Κιότο Εγκυκλοπαίδεια γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) [17 ]. Λειτουργικό διάγραμμα σχολιασμό στο DAVID δημιουργήθηκε με τη χρήση του ανθρώπινου γονιδιώματος ως φόντο, καθώς και κατώφλια για μετρούν ως 2 και το σκορ ευκολία όπως 0.1.

Αποτελέσματα

Τα χαρακτηριστικά των ασθενών και το προφίλ αλληλουχίας

χαρακτηριστικά των ασθενών είναι όπως περιγράφονται στον πίνακα 1. Αξιόπιστες δείγματα της πρωτοπαθή όγκο παχέος εντέρου και γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο αφαιρεθεί κατά τη λειτουργία χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση.

η

Μέση κάλυψη των 120 δείγματα που αναλύθηκαν was175X (εύρος 99x-435X) (Πίνακας S2). Ήταν 181X (100Χ-435X) για όγκο και 170x (99x-312x) για την κανονική βλεννογόνο. ποσοστό των κυττάρων του όγκου στο δείγμα όγκου θα μπορούσε να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας όγκου-ειδικά SNVs σε 57 δείγματα. Το μεσαίο ποσοστό αυτό ήταν 71% (εύρος 42 – 100).

Μεταλλάξεις

Ένα σύνολο 532 σωματικών nonsynonymous παραλλαγές σε 113 γονίδια βρέθηκαν (Σχήμα 1). 494 μόνο παραλλαγές νουκλεοτιδίων παρατηρήθηκαν σε 106 γονίδια από 60 ασθενείς και 38 μεταλλάξεις Indel (11 προσθήκες και 27 διαγραφές) σε 19 γονίδια από 21 ασθενείς (Πίνακας S3)

SNV, ενιαία παραλλαγή νουκλεοτιδίου.? SNP, μόνο νουκλεοτιδίου πολυμορφισμός? NMD, μη-νόημα μεσολάβηση αποσύνθεσης.

Η

Μεταξύ των 494 SNVs, 278 παραλλαγές ήταν 232 διαφορετικές μεταλλάξεις σημείου (67 προηγουμένως αναφερθεί μεταλλάξεις και 166 νέες μεταλλάξεις) και 216 είχαν προηγουμένως αναφερθεί 79 διαφορετικούς πολυμορφισμούς στο dbSNP .

σημειακές μεταλλάξεις που αποτελείται από 43 μεταλλάξεις ανοησίες και 189 μεταλλάξεις απουσίας. Βρήκαμε 2 επαναλαμβανόμενες μυθιστόρημα μεταλλάξεις,

JAK1

c.1595C & gt? T (p.R532H) σε 2 ασθενείς και

EWSR1

c.1769A & gt? C (p.Q590P) σε 2. Οι σημειακές μεταλλάξεις ήταν πιο συχνά παρατηρείται σε

APC

(32 μεταλλάξεις σε 29 ασθενείς), ακολουθούμενο από

TP53

(27 σε 27),

KRAS

(24 σε 24),

TTN

(36 σε 21), και

FBXW7

(15 σε 14) (Πίνακας 2).

Η

Οι 32 μεταλλάξεις Indel ήταν 3 γνωστών μεταλλάξεων και 25 νέες μεταλλάξεις , οι οποίες ήταν 2 απλές διαγραφές ενός αμινοξέως, 26 μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου. Μεταξύ των μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου, 14 προβλέπεται να έχει ως αποτέλεσμα τη μεσολάβηση ανοησίες αποσύνθεση. 3 νέες μεταλλάξεις Indel είχαν κατ ‘επανάληψη παρατηρηθεί:

ACVR2A

c.1303delA (p.K435fs) σε 3,

TGFBR2

c.449_450delAA (p.E150fs) σε 2, και

BLM

c.1536delA (p.G512fs) σε 2.

Ο διάμεσος αριθμός των μεταλλάξεων και μεταλλαγμένο γονίδιο ανά όγκο ήταν 4,5 (εύρος 0-32) και 4.0 (0-23), αντίστοιχα. Συνηθέστερα μεταλλαγμένα γονίδια ήταν

APC

(35 ασθενείς),

TP53

(27), και

KRAS

(24). Πραγματοποιήσαμε αλληλουχίας Sanger για την επικύρωση του

KRAS

μετάλλαξη και όλες οι μεταλλάξεις που προσδιορίζονται από NGS επιβεβαιώθηκε.

Αντιγραφή αριθμού μεταβολές

Αντιγραφή αλλαγή αριθμού παρατηρήθηκε σε 132 γονίδια και 51 όγκους (85%) (Σχήμα 2 και Πίνακας S4). αύξηση αριθμού αντιγράφων (& gt? Χ2 φορές) βρέθηκε σε 65 γονίδια από 40 όγκους και αντιγράψτε την απώλεια αριθμό (& lt? X0.5 φορές) σε 103 γονίδια από 39 όγκους. Μεταξύ των όγκων που δείχνει την αλλαγή του αριθμού αντιγράφων, διάμεσος αριθμός των γονιδίων που εμπλέκονται ήταν 6 (εύρος 1-44). Γονίδια πιο συχνά δείχνουν αύξηση του αριθμού αντιγράφων ήταν

SRC

(15 ασθενείς),

MAFB

(15),

TOP1

(14),

RECQL4

( 13), και

Gnas

(13). Εκτός από

RECQL4

βρίσκεται στο χρωμόσωμα 8q24, τα άλλα 4 γονίδια που βρίσκονται στο 20q 11-13. Γονίδια που δείχνουν συχνή απώλεια ήταν

TP53

(13 ασθενείς),

SMAD2

(12),

Smad4

(12),

MAP2K4

(11),

BCL2

(11),

WRN

(10), και

DCC

(10).

TP53

και

MAP2K4

βρίσκονταν σε 17p12-13, ενώ

SMAD2

,

Smad4

,

BCL2

, και em

DCC

βρίσκονταν στο 18q21, και

WRN

βρίσκεται στο 8p12. Ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση του αριθμού αντιγράφων μεταβολή του

SRC

,

ΕΚΒΒ2

,

TP53

,

PTEN

και

BRCA2

σε αντιπροσωπευτικά δείγματα και έδειξαν συγκρίσιμες τιμές.

ERBB2

περαιτέρω επικυρωθεί με τη χρήση FISH (Σχήμα 3). Οι

Δείγματα ευθυγραμμίζονται ανάλογα με τον αριθμό αναγνώρισης δείγματος στο Υ-άξονα και τα γονίδια ευθυγραμμίζονται σύμφωνα με χρωμοσωμική τοποθεσία στο Χ-άξονα.

Η

* οι τιμές είναι η κάλυψη αναλογίες φορές δεν προσαρμόζονται για την καθαρότητα των όγκων. Αντιπροσωπευτική εικόνα της ανάλυση FISH του

ΕΚΒΒ2

(κόκκινο) και CEP17 (πράσινο) δείχνει την ενίσχυση του

ΕΚΒΒ2

.

Η

Σε συνδυασμό γενετικών αλλοιώσεων

συνδυάζοντας μετάλλαξη και να αντιγράψετε τα δεδομένα αριθμό,

APC

ήταν το γονίδιο συχνότερη γενετική αλλαγή (35 ασθενείς). Τρεις ασθενείς είχαν απώλεια αριθμού αντιγράφων του

APC

, αλλά οι 3 όγκοι είχαν επίσης Indel μεταλλάξεις. Σε περίπτωση

TP53

, 6 ασθενείς είχαν ταυτόχρονα μετάλλαξη σημείου και αντιγράψτε την απώλεια αριθμό και 7 ασθενείς είχαν απώλεια αριθμού αντιγράφων ως το μοναδικό γενετικό μηχανισμό του

TP53

αδρανοποίηση. Δεν υπήρξε καμία αλλαγή αριθμού αντιγράφων σε

KRAS

. Ωστόσο, ο αριθμός αντιτύπων κέρδος

HRAS

βρέθηκε σε 6 ασθενείς.

MSI-H όγκους έτειναν να έχουν υψηλότερο αριθμό γονιδίων με μετάλλαξη σε σύγκριση με το MSS /MSI-L (μέση τιμή 10,8

vs

3,9, αντίστοιχα?

σ

= 0,11 με t-test) και κάτω αριθμό γονιδίων που έχει αριθμό αντιγράφων αλλοίωση (μέση 3,2

vs

8,6, αντίστοιχα?.

σ

= 0,22 με t-test). MSI-H όγκοι είχαν υψηλότερες συχνότητες των γενετικών αλλοιώσεων σε

ACVR2A

(1,9% το MSS /MSI-L

vs.

50,0% το MSI-H,

p =

0.002),

MLH1

(3,7%

vs.

33,3%,

σ

= 0,046),

MSH6

(1,9%

vs.

33,3%,

σ

= 0,024),

SPTAN1

(0%

vs.

33,3%,

σ

= 0.008), και

TGFBR2

(1,9%

vs.

33,3%,

σ

= 0,024). Σε αντίθεση, γενετικές μεταβολές του

TP53

(63,0%

vs.

0%,

σ

= 0.005), παρατηρήθηκαν πιο συχνά σε όγκους MSS /MSI-L.

Θα μπορούσαμε επίσης να εντοπίσουν γενετικές αλλοιώσεις που θα μπορούσαν να έχουν πιθανές θεραπευτικές επιπτώσεις (Πίνακας 3).

ΕΚΒΒ2

αντιγράψετε κέρδος αριθμός εντοπίστηκε σε 4 ασθενείς (εύρος x2.0-X71.5) και

ΕΚΒΒ2

σημειακή μετάλλαξη σε 5 ασθενείς (1 ασθενής είχε κέρδος αριθμό αντιγράφων και σημειακή μετάλλαξη). Γενετικές αλλοιώσεις στο

BRCA1

και

BRCA2

παρατηρήθηκαν σε 4 ασθενείς:

BRCA1

απώλεια (X0.49),

BRCA1

σημείο μετάλλαξης,

BRCA2

απώλεια (X0), και

BRCA2

μετάλλαξη διαγραφής σε 1 ασθενή η κάθε μία.

EGFR

αντιγράψετε κέρδος αριθμό βρέθηκε σε 4 ασθενείς (εύρος X2.0-8.2).

PIK3CA

σημειακή μετάλλαξη παρατηρήθηκε σε 4 ασθενείς και

PTEN

απώλεια και σημειακή μετάλλαξη σε 4 ασθενείς (εύρος X0-X0.49) και 1 ασθενής, αντίστοιχα.

Η

διαδρομή ανάλυση

Ένα σύνολο 33 ασθενών (55%) είχαν πιθανή αύξηση του κύκλου λειτουργίας μεταβολή στο

RAS

/

RAF

οδός: 20 ασθενείς με

μόνο, 3 με KRAS

μετάλλαξη

KRAS

μετάλλαξη και η αύξηση του

HRAS

, 1 με

KRAS

μετάλλαξη και

BRAF

μετάλλαξη, 3 με

NRAS

μετάλλαξη, 2 με

HRAS

κέρδος, 2 με

BRAF

μετάλλαξη, 1 με

BRAF

μετάλλαξη και

HRAS

κέρδος, και 1 με

RAF1

κέρδος.

λίστα τροποποιημένα γονίδια (μετάλλαξη και αντιγράψτε την αλλαγή του αριθμού) χρησιμοποιώντας DAVID εργαλεία λειτουργικής σχολιασμού Αναλύοντας, που σχετίζονται οδός εντοπίστηκε σε 53 ασθενείς (Πίνακας S5) . Διάμεσος αριθμός των μονοπατιού ανά ασθενή ήταν 19 (εύρος 3-70). Εξαιρουμένων των οδών σχετίζονται με την ασθένεια (π.χ., καρκίνο του παχέος εντέρου), ErbB μονοπατιού σηματοδότησης (KEGG hsa04012) ήταν η πιο συχνά εμπλέκονται οδός (25 ασθενείς, 42%).

Συζήτηση

Κατά τα προσεχή εποχή της εξατομικευμένης ιατρικής για τη θεραπεία του καρκίνου, είναι σημαντικό να έχουμε ακριβείς γενετικές πληροφορίες του ατόμου καρκίνου. Αριθμός των γενετικών πληροφοριών καθοδηγεί ήδη αποφάσεις για τη θεραπεία στην καθημερινή πρακτική. Παραδείγματα στη θεραπεία των συμπαγών όγκων περιλαμβάνουν

ΕΚΒΒ2

γονιδιακής ενίσχυσης (HER2) στην μαστού και καρκίνο του στομάχου,

EGFR

μετάλλαξη σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, και

KRAS

μετάλλαξη σε καρκίνο του παχέος εντέρου [18], [19], [20], [21]. Εξατομικευμένη θεραπεία του καρκίνου επιδιώκεται από το πρώιμο στάδιο της ανάπτυξης φαρμάκων όταν υπάρχει μια γνωστή στόχου [22]. Ωστόσο, πολλές από τις στοχευμένες παραγόντων υπό ανάπτυξη δεν έχουν προγνωστική γενετική βιοδείκτη. Πλήρη ενημέρωση των γενετικών κατάστασης των ασθενών που συμμετείχαν σε κλινικές δοκιμές και την ανάλυση του συνεταιρίζεσθαι πρώιμη φάση με την απάντηση μπορεί να επιταχύνει στόχο την αναγνώριση των ασθενών.

Έχουμε αναπτύξει μια στοχευμένη πλατφόρμα αλληλουχίας με τη χρήση της τεχνολογίας NGS να παράσχει πλήρη γενετική πληροφορία για μεμονωμένους ασθενείς. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι στοχευμένη πλατφόρμα αλληλούχιση NGS-based είναι εφικτή για κλινική χρήση. Ακόμα κι αν δεν μπόρεσε να επιβεβαιώσει κάθε γενετική τροποποίηση εντοπίστηκαν, το πείραμα επικύρωσης των

KRAS

μετάλλαξη και τον αριθμό αντιπροσωπευτικών αντίγραφο αλλοιώσεις (Σχήμα 3) δείχνει ότι τα αποτελέσματα της πλατφόρμας είναι αξιόπιστη. Επιπλέον, το προφίλ των κοινώς μεταλλαγμένα γονίδια και το σχέδιο του γονιδίου αριθμού αντιγράφων αλλοίωση (κέρδη 8q και 20q και οι απώλειες των 8p, 17ρ και 18q) είναι σύμφωνες με την προηγούμενη γνώση των γενετικών αλλοιώσεων σε καρκίνο του παχέος εντέρου [23].

σημαντικό πλεονέκτημα του στοχευόμενου πλατφόρμα αλληλούχιση NGS-based είναι ότι τα δεδομένα σχετικά με πολλαπλά γονίδια και πολλαπλές γενετικές αλλοιώσεις (σημειακή μετάλλαξη, μετάλλαξη Indel, και αριθμός αντιτύπου μεταβολή) δημιουργείται με ένα μόνο πείραμα. Η πλατφόρμα αλληλούχιση παροχή δεδομένων μετάλλαξης και αριθμός αντιγράφων μεταβολή απαιτεί λιγότερη ποσότητα του DNA ή του ιστού και το κόστος σε σύγκριση με την εξέταση κάθε επιμέρους γενετική μεταβολή δια προσδιορισμού αλληλουχίας ή FISH τα οποία συνήθως χρησιμοποιούνται στην τρέχουσα καθημερινή πρακτική. Επιπλέον, ανώτερη ευαισθησία πάνω αλληλούχισης Sanger μπορεί να ληφθεί με την αύξηση του βάθους κάλυψης, ειδικά σε περιπτώσεις με χαμηλή καθαρότητα του όγκου.

Εκτός από

KRAS

μετάλλαξη, μετάλλαξη άλλων γονιδίων στην οδό (

BRAF

,

NRAS

, και

PIK3CA

) έχει επίσης αρνητική επίδραση στην ανταπόκριση στο cetuximab [24]. Είναι πιθανό ότι εξετάζει πολλαπλά γονίδια στο μονοπάτι θα μπορούσε επίσης να βελτιώσει την πρόβλεψη απόκριση σε άλλες στοχευμένες θεραπείες. Στοχευμένη πλατφόρμα αλληλούχιση είναι μια ιδανική επιλογή για την αξιολόγηση πολλαπλά γονίδια την ίδια στιγμή. Εκτός από την

KRAS

μετάλλαξη, γενετικές αλλοιώσεις στο

NRAS

,

HRAS

,

BRAF

, και

RAF1

βρέθηκαν στην ορθοκολικό καρκίνο δείγματα που αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

Η εύρεση ασυνήθιστο γενετική τροποποίηση μπορεί να παρέχει νέα θεραπευτική επιλογή για κάθε ασθενή. Για παράδειγμα, ασθενείς με όγκους που έχουν

ΕΚΒΒ2

αντιγράψετε κέρδος αριθμός μπορεί να επωφεληθεί από

ΕΚΒΒ2

-targeted πράκτορες και οι όγκοι που έχουν μετάλλαξη ή απώλεια του

BRCA1

ή

BRCA2

από αναστολείς PARP. Επιπλέον, γενετικές αλλοιώσεις ή εμπλέκονται οδό μπορεί να καθοδηγήσει την επιλογή της κλινικής δοκιμής πρώιμη φάση για τους ασθενείς που πρόκειται να εγγραφεί. Ασθενείς με μεταβολή της

RAS /RAF

μονοπάτι θα μπορούσε να έχει περισσότερες πιθανότητες όφελος από τη συμμετοχή σε μια κλινική δοκιμή των αναστολέων που στοχεύουν το μονοπάτι.

Για την ανίχνευση πολλαπλών μεταλλάξεων με βελτιωμένη ευαισθησία, φασματομετρία μάζας based πλατφόρμα ανίχνευσης μετάλλαξης είναι σήμερα σε χρήση [25]. Ωστόσο, μόνο περιορισμένος αριθμός προκαθορισμένα μεταλλάξεις μπορούν να ανιχνευθούν και αριθμός αντιγράφων μεταβολή δεν μπορεί να ανιχνευθεί με την πλατφόρμα. Ως εκ τούτου, στοχευμένη πλατφόρμα αλληλούχιση χρησιμοποιώντας NGS είναι ανώτερη από την άποψη της γενετικής πληροφορίας που παράγεται και την ευελιξία να συνιστά γονιδίου σετ για ανάλυση. Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης δείξει τη χρησιμότητα των στοχευμένη προσέγγιση αλληλουχίας ή NGS σε κλινικό περιβάλλον [9], [26], [27].

σημαντικός περιορισμός της παρούσας μελέτης είναι ότι η πλατφόρμα είναι σε θέση να εντοπίσει τα γονίδια σύντηξης και μόνο φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστό χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση. Ανίχνευση γονιδίων σύντηξης θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί με την προσθήκη της αλληλουχίας χαμηλή RNA κάλυψη. Έχουμε τροποποιηθεί πειραματική διαδικασία να χρησιμοποιούν φορμόλη-σταθερής εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστού και έχουν αποκτήσει συγκρίσιμη ευαισθησία. Αυτή τη στιγμή μελετούν τη χρησιμότητα των στοχευμένων πλατφόρμα αλληλουχίας σε μια προοπτική τρόπο στην κλινική πράξη. Η μελέτη χρησιμοποιεί είτε νωπά ή FFPE ιστού και έχουμε τροποποιημένη λίστα γονίδιο να εκπροσωπεί καλύτερα druggable οδών και αυξημένο βάθος κάλυψη (& gt? X500).

Εν κατακλείδι, στοχευμένη πλατφόρμα αλληλουχίας με τη χρήση της τεχνολογίας NGS ήταν σε θέση να παράσχει πλήρη γενετική δεδομένα μεταβολή σε δείγματα ορθοκολικού όγκου και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε κλινικό περιβάλλον.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1. .

Μελέτη περίγραμμα

doi: 10.1371 /journal.pone.0064271.s001

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Gene λίστα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0064271.s002

(XLSX)

Πίνακας S2. .

Κάλυψη πληροφορίες

doi: 10.1371 /journal.pone.0064271.s003

(XLSX)

Πίνακα S3.

Γενετικές αλλοιώσεις ανά ασθενείς

doi:. 10.1371 /journal.pone.0064271.s004

(XLSX)

Πίνακας S4.

Αντιγραφή αριθμού αλλοίωση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0064271.s005

(XLSX)

Πίνακας S5. μονοπάτια

DAVID

doi:. 10.1371 /journal.pone.0064271.s006

(XLSX)