Αφηρημένο

Wnt7a είναι γνωστό ότι είναι ένα ογκοκατασταλτικό που χάνεται στα NSCLC, αλλά κανένας μηχανισμός της απώλειας έχει καθιερωθεί. Η μεθυλίωση των περιοχών υποκινητή έχει καθιερωθεί ως ένα κοινό μηχανισμό της απώλειας της έκφρασης ογκοκατασταλτικών σε NSCLC. Έχουμε προηγουμένως αποδειχθεί ότι η απώλεια του Wnt7a σε μη μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές πνεύμονα επιθηλιακών οδήγησε σε αύξηση της κυτταρικής ανάπτυξης, φυσιολογική ανάπτυξη του πολιτισμού 3-D, και αυξημένη μετανάστευση. Η

Wnt7a

υποκινητής έχει ένα υψηλότερο ποσοστό μεθυλίωσης στον ιστό του όγκου σε σύγκριση με NSCLC συμφωνημένα φυσιολογικό ιστό πνεύμονα και μεθυλίωση της περιοχής του υποκινητή οδηγεί σε μειωμένη δραστικότητα. Εμείς αντιμετωπίζονται κυτταρικές σειρές Η157 και Η1299 NSCLC με 5-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη και ανιχνεύεται απώλεια του

Wnt7a

μεθυλίωση προαγωγού, αυξημένη έκφραση Wnt7a, και την αυξημένη δραστηριότητα της οδού σηματοδότησης Wnt7a πνεύμονα. Όταν η έκφραση DNMT1 χτυπήθηκε κάτω από shRNA, έκφραση Wnt7a αυξηθεί και μεθυλίωση μειώθηκε. Μαζί αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι σε NSCLC, Wnt7a χάνεται με μεθυλίωση σε μια υποομάδα των όγκων και ότι αυτή η μεθυλίωση συντηρείται από DNMT1. Αποκατάσταση της έκφρασης Wnt7a μέσω απομεθυλίωση μπορούσε να είναι μια σημαντική θεραπευτική προσέγγιση στη θεραπεία του NSCLC

Παράθεση:. Πονγκ MA, VanScoyk MM, Wilson LA, Kelley Ν, Winn RA (2012) Η μεθυλίωση του

Wnt7a

διαμορφώνεται από DNMT1 και ο καπνός του τσιγάρου συμπυκνωμάτων σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (3): e32921. doi: 10.1371 /journal.pone.0032921

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12, Αυγούστου του 2011? Αποδεκτές: 6η Φεβρουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Μάρτη του 2012

Copyright: © 2012 Τένις et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από ένα βραβείο ΝΙΗ R21 (CA153268-01). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα εξακολουθεί να είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο, με ελάχιστες επιλογές που είναι διαθέσιμες για τη θεραπεία των όγκων συνήθως διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια. Μας ενδιαφέρει το ρόλο των μη-κανονικών σηματοδότηση Wnt σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), και συγκεκριμένα οι δραστηριότητες κατασταλτική του όγκου των Wnt7a και του υποδοχέα της περμανάντ 9 (Fzd9). Wnt7a εκφράζεται υψηλά σε εμβρυϊκά πνεύμονα και χρησιμεύει για να διατηρηθεί ένα φυσιολογικό επιθηλιακό φαινότυπο στον ενήλικα πνεύμονα [1], [2]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι Wnt7a συχνά χάνεται σε NSCLC και ότι η αποκατάσταση της έκφρασης Wnt7a οδηγεί σε μειωμένη ανάπτυξη μετασχηματισμένο σε κυτταρικές σειρές NSCLC [2]. NSCLC κυττάρων με επανέκφραση του Wnt7a έχουν μειωμένο πολλαπλασιασμό, μειωμένη αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη, και την αποκατάσταση ενός επιθηλιακού φαινοτύπου [2]. Wnt7a βρίσκεται στο χρωμόσωμα 3ρ25, το οποίο είναι ένα «hotspot» για διαγραφή, όμως, έχουμε την υποψία ότι η έκφραση Wnt7a στον NSCLC μπορεί να ρυθμίζεται από μια επιγενετική μηχανισμό [3].

Η μεθυλίωση των υποκινητών ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε NSCLC έχει αναφερθεί σε περισσότερα από 40 γονίδια, μερικά με συχνότητες τόσο υψηλές όσο 100% [4]. Απώλεια της έκφρασης των γονιδίων, όπως ρ16 /ΙΝΚ4 & με μεθυλίωση νωρίς στην ανάπτυξη του NSCLC έχει προταθεί ως βιοδείκτη για την έγκαιρη ανίχνευση [5]. Η μεθυλίωση των γονιδίων όπως FHIT έχουν συσχετιστεί με σταδιοποίηση του όγκου και την πρόγνωση σε NSCLC [6]. Οι διαφορές στη μεθυλίωση σχετίζεται με ιστολογία του όγκου έχουν προσδιοριστεί για γονίδια όπως RASSF1A και ρ16 /ΙΝΚ4 & [7], [8]. Οι ενώσεις μεταξύ της έκθεσης στον καπνό του τσιγάρου και παρεκκλίνουσα μεθυλίωση παρατηρηθεί για p16, RASSF1A και RARβ2 μεταξύ άλλων [9], [10], [11]. Μια σύνδεση μεταξύ της έκθεσης σε καρκινογόνες ουσίες του καπνού και η μεθυλίωση μπορεί να υπάρχουν μέσω DNA μεθυλτρανσφεράσες (DNMT) που ενεργοποιούνται από αυτές τις καρκινογόνες ουσίες. Εάν οι στόχοι της DNMTs υπεύθυνη για την επιδιόρθωση του DNA γίνει ανάρμοστα απενεργοποιείται με μεθυλίωση, βλάβες που προκύπτουν από τις καρκινογόνες ουσίες μπορεί να επιμένουν, οδηγώντας σε ογκογένεση [12].

Καθώς οι περισσότεροι Wnt και Wnt που σχετίζονται με τις μελέτες της πρωτεΐνης στον καρκίνο σχετίζονται με την κανονική σηματοδότηση , ο προσδιορισμός των Wnt-ειδική μεθυλίωση δεν είναι κοινή. Η μεθυλίωση είναι γνωστό ότι είναι ένας μηχανισμός απώλειας για άλλους καταστολείς όγκων σε NSCLC, αλλά οι περισσότερες μελέτες του Wnt-μεθυλίωση στο στόχο του πνεύμονα Wnt ανταγωνιστές στην κανονική μονοπάτι σηματοδότησης Wnt. Λίγες μελέτες έχουν προσδιορίσει υπερμεθυλίωση Wnt5a και Wnt9a σε επιθηλιακούς καρκίνους και υπερμεθυλίωση των Wnt7a έχει παρατηρηθεί σε μία υποομάδα πορογενές καρκίνο του παγκρέατος [13], [14], [15], [16]. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε αποδείξει ότι η απώλεια της Wnt7a είναι ένα σημαντικό γεγονός για επιθηλιακά κύτταρα πνεύμονα και ότι αυτή η ζημία προκαλείται από μεθυλίωση μέσω της δραστηριότητας DNMT1 σε ένα υποσύνολο των NSCLC.

Αποτελέσματα

Απώλεια της έκφρασης Wnt7a σε κύτταρα του πνεύμονα οδηγεί σε ένα μετασχηματισμένο φαινότυπο

Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι η έκφραση Wnt7a μεταβάλλει τα μετασχηματισμένα χαρακτηριστικά των κυττάρων NSCLC. NSCLC κύτταρα με εκ νέου Wnt7a έχουν μειωμένο πολλαπλασιασμό, μειωμένη αγκυροβόλιο ανεξάρτητη ανάπτυξη, και την αποκατάσταση ενός επιθηλιακού φαινοτύπου. Το αντίστροφο, απώλεια Wnt7a από ένα μη-μετασχηματισμένο επιθηλιακών κυττάρων, θα αναμένεται να οδηγήσει σε αύξηση των χαρακτηριστικών των μετασχηματισμένων κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση shRNA να γκρεμίσουμε έκφραση του mRNA της Wnt7a σε δύο μη-μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές πνευμονικού επιθηλίου, HBEC και Beas2B (B2B), και επιβεβαιώθηκε γκρεμίζω από QPCR και κηλίδα western (Εικ. 1Α). Μειωμένη έκφραση Wnt7a οδήγησε σε αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα Β2Β, καταδεικνύεται από έναν προσδιορισμό ανάπτυξης 6 ημερών κυττάρων (Εικ. 1Β). τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HBEC αυξήθηκε επίσης με την απώλεια της Wnt7a όπως μετρήθηκε με δοκιμασία MTS (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε κύτταρα Β2Β, αλλοιωμένη ανάπτυξη σε Matrigel 3D καλλιέργεια παρατηρήθηκε σε 5 ημέρες με απώλεια της έκφρασης Wnt7a (Εικ. 1 C). Αυξημένη κυτταρική μετανάστευση σε μια δοκιμασία μηδέν στις 24 ώρες παρατηρήθηκε με απώλεια της έκφρασης Wnt7a, όπου τα βέλη υποδεικνύονται τα άκρα του εισαχθέντος μηδέν (Εικ. 1 C).

Α) Εκφραση Wnt7a μετρήθηκε με QPCR σε HBEC και τα κύτταρα B2B μετά από σταθερή επιμόλυνση με Wnt7a shRNA ή αρνητική shRNA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως πολλαπλή μεταβολή στην έκφραση Wnt7a κανονικοποιήθηκε προς GAPDH. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι η SE πειραμάτων εις τριπλούν. Wnt7a γκρεμίσουμε επιβεβαιώθηκε επίσης με western blot με έλεγχο φόρτωσης β-ακτίνης. Β) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε σε κύτταρα που εκφράζουν Β2Β Wnt7a shRNA ή αρνητική shRNA. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε μια δοκιμασία ανάπτυξης 6 ημερών. Γ) Β2Β κυττάρων με Wnt7a shRNA αναλύθηκαν σε μία δοκιμασία 3D καλλιέργειας χρησιμοποιώντας Matrigel και παρατηρήθηκε μετά από 5 ημέρες ανάπτυξης για αλλαγές στην μορφολογία σε σύγκριση με ένα αρνητικό έλεγχο shRNA. Β2Β κυττάρων με Wnt7a shRNA αναλύθηκαν επίσης σε μία δοκιμασία μετανάστευσης μηδέν και παρατηρήθηκε σε 24 ώρες για την κίνηση μέσα στο εισάγεται γρατσουνιά σε σύγκριση με ένα αρνητικό έλεγχο shRNA. Τα βέλη δείχνουν τα άκρα του μηδέν. Εικόνες αντιπροσωπεύουν τριπλούν πειραμάτων.

Η

Wnt7a μεθυλιώνεται σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές και ιστούς NSCLC

Το ζήτημα του πώς Wnt7a έκφρασης χάνεται θα μπορούσε να αντιμετωπιστεί με διάφορους τρόπους.

Wnt7a

θα μπορούσε να διαγραφεί, μεταλλαχθεί, ή μεθυλιωμένο, μεταξύ άλλων μηχανισμών. Ενώ το χρωμόσωμα που περιέχει

Wnt7a

(3ρ25) συχνά διαγράφονται στο NSCLC, το μηχανισμό αυτό της απώλειας, μαζί με μετάλλαξη γονιδίων, προσφέρει σήμερα λίγο με τον τρόπο της θεραπευτικής παρέμβασης [17]. Η παρουσία της επιγενετικής μηχανισμό της μεθυλίωσης θα προσφέρει τη δυνατότητα χρήσης τρέχουσες κλινικές παρεμβάσεις για τη θεραπεία NSCLC. Εμείς αντιμετωπίζονται HBEC και κυττάρων Β2Β με καρκινογόνο καπνό ΝΝΚ, το οποίο είναι γνωστό ότι οδηγεί σε συσσώρευση DNMT1 και αυξημένη ογκοκατασταλτικών υπερμεθυλίωση σε NSCLC [18]. Στα κατεργασμένα κύτταρα παρατηρήθηκε μια μείωση στην έκφραση Wnt7a mRNA με QPCR σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2Α). ανάλυση μεθυλίωσης απέδειξαν ότι ο προωθητής Wnt7a σε Β2Β και HBEC κυττάρων έχει αυξηθεί μεθυλίωσης μετά από έκθεση σε 10 υΜ ΝΝΚ (Σχήμα 2Α). Αυτό πρότεινε ότι

Wnt7a

μεθυλιώνεται με την έκθεση στον καπνό και μπορεί να είναι ένας μηχανισμός της απώλειας στον καπνό που σχετίζεται με NSCLC. Για να προσδιοριστεί αν η μεθυλίωση του

Wnt7a

ήταν παρούσα στον ιστό του όγκου ανθρώπινου πνεύμονα, μετρήσαμε μεθυλίωση ενός νησιού CpG στον προαγωγό σε 82 ζεύγη του ανθρώπινου ιστού όγκου πνεύμονα και συμφωνημένα φυσιολογικό πνευμονικό ιστό. Μέση ποσοστιαία μεθυλίωση των CpG θέσεων 13 που μετρήθηκε ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό όταν αναλύεται με ένα αντιστοιχισμένο t-test (Εικ. 2Β). Πίνακας S1 δείχνει τοις εκατό μεθυλίωσης σε κάθε θέση CpG αναλύονται και συγκρίνονται μεταξύ όγκου και φυσιολογικών ιστών. Καμία μεμονωμένη τοποθεσία CpG αναλύθηκαν μπορεί να χαρακτηριστεί ως κρίσιμη για την αδρανοποίηση του

Wnt7a

προαγωγού, ωστόσο, φαίνεται να είναι μια τάση προς αυξημένη μεθυλίωση σε όγκους σε θέσεις CpG πλησιέστερα προς τη θέση έναρξης μεταγραφής εκεί. Δύο κυτταρικές σειρές κυττάρων NSCLC, Η157 και Η1299, ταυτοποιήθηκαν ως φιλοξενούν

Wnt7a

μεθυλίωση προαγωγού με Pyrosequencing και χρησιμοποιήθηκαν για μετέπειτα πειράματα in vitro (Σχ. 2Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η απώλεια της έκφρασης Wnt7a με μεθυλίωση λαμβάνει χώρα σε ένα υποσύνολο του NSCLC.

Α) Β2Β και HBEC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ ΝΝΚ για 2 ώρες και η έκφραση Wnt7a μετρήθηκε με QPCR σε σύγκριση με ένα μη κατεργασμένο έλεγχο . Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι η SEM των πειραμάτων εις τριπλούν. Ποσοστό μεθυλίωση σε Β2Β και κύτταρα HBEC αναλύθηκε με χρήση του συστήματος Methyl Profiler μετά από 2 ώρες 10 θεραπεία υΜ ΝΝΚ σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Β) Μέση ποσοστιαία μεθυλίωση του υποκινητή Wnt7a μετρήθηκε με Pyrosequencing σε NSCLC ιστό και σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό συμφωνημένα παρακείμενα πνεύμονα κατά ζεύγη t-test. Μέση ποσοστιαία μεθυλίωση του Β2Β, κυτταρικές σειρές Η157 και Η1299 μετρήθηκε με Pyrosequencing. Γ) Ένα λουσιφεράσης υποστηρικτής Wnt7a τροποποιήθηκε από SSSI, ΗραΙΙ και HhaI ένζυμα μεθυλίωσης και παροδικά σε γραμμές B2B και HBEC κυττάρων. Πολλαπλή μεταβολή στην δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σε σύγκριση με το μη τροποποιημένο δραστικότητα λουσιφεράσης Wnt7a υποκινητή. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι το SE πειραμάτων εις τριπλούν.

Η

Ο προαγωγός Wnt7a απενεργοποιείται με μεθυλίωση αποκαθίσταται με 5-αζα-2 θεραπεία δεοξυκυτιδίνης ‘

Όπως μεθυλίωση του

Wnt7a

δεν είχαν μελετηθεί προηγουμένως, θέλαμε να επαληθεύσει ότι η μεθυλίωση της περιοχής του υποκινητή θα οδηγήσει σε απενεργοποίηση του υποκινητή. Ένα

Wnt7a

λουσιφεράσης υποκινητή υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SSSI, ΗρβΙΙ, και μεθυλάσες HhaI να προσδιοριστεί η επίδραση της μεθυλίωσης στο

Wnt7a

περιοχή προαγωγού. SSSI επηρεάζει όλες τις περιοχές CpG, ΗρβΙΙ μόνο το ΚΚΕ μέσα σε 5 «CCGG, και HhaI μόνο το ΚΚΕ μέσα 5’GCGC. Επιμόλυνση του

Wnt7a

λουσιφεράσης υποκινητή σε Β2Β και κυτταρικές σειρές HBEC καταδείξει μειωμένη δραστικότητα λουσιφεράσης μετά τη θεραπεία με τα τρία μεθυλάσες σε σύγκριση με ένα μη επεξεργασμένο

Wnt7a

λουσιφεράση υποκινητή, υποδεικνύοντας ότι ακόμη και η περιορισμένη μεθυλίωση απενεργοποιεί το

Wnt7a

υποκινητή (Σχ. 2C). Είχαμε προσδιόρισε δύο NSCLC κυτταρικές σειρές με μεθυλίωση του

Wnt7a

περιοχή προαγωγέα, Η157 και Η1299, και ήθελε να προσδιοριστεί το αποτέλεσμα της θεραπείας με έναν παράγοντα απομεθυλίωσης, 5-αζα-2 ‘δεοξυκυτιδίνη (5 Aza). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 6 υΜ 5 Αζα για 1-4 ώρες και η έκφραση του Wnt7a μετρήθηκε με QPCR και στύπωμα western. Η έκθεση σε 5 Αζα οδήγησε σε αυξημένη έκφραση του Wnt7a mRNA και της πρωτεΐνης (Εικ. 3Α και Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, 5 Αζα οδήγησε επίσης σε μειωμένη μεθυλίωση του

Wnt7a

περιοχή υποκινητή (Σχ. 3D). Wnt7a είναι γνωστό ότι σηματοδοτούν μέσω υποδοχέα της Fzd9 σε κατάντη στόχου ΡΡΑΚγ, έτσι ώστε να αντιμετωπίζονται τα κύτταρα Η157 και Η1299 με 5 Aza, μαζί με παροδική διαμόλυνση Fzd9, και ανέλυσε τη δραστηριότητα του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt7a [19]. Το PPAR στοιχείο απόκρισης λουσιφεράσης (PPRE), η οποία ενεργοποιείται από PAPRγ, επέδειξε αυξημένη δραστηριότητα αφού τα κύτταρα με μετουσιωμένο

Wnt7a

εκτέθηκαν σε 5 Aza και έκφραση του Fzd9 (Σχ. 3C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι φαρμακευτικές αγωγή κυττάρων NSCLC μπορεί να αντιστρέψει την μεθυλιωμένη κατάσταση του

Wnt7a

υποκινητή.

Α) 157 και 1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 Αζα για 2 ώρες και Wnt7a μετρήθηκε με QPCR σε σύγκριση με μη κατεργασμένους ελέγχους. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι η SEM των πειραμάτων εις τριπλούν. Β) 157 και 1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 Aza για 1, 2, και 4 ώρες και σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. έκφραση πρωτεΐνης Wnt7a μετρήθηκε με ανοσοστύπωμα με β-ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης. Γ) 157 και 1299 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με Fzd9 και PPRE λουσιφεράσης και 48 ώρες μετά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 Αζα για 2 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε και επεξεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με ένα άδειο μάρτυρα. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι η SE πειραμάτων εις τριπλούν. Δ) 1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 Αζα για 2 ώρες και τοις εκατό μεθυλίωσης του υποκινητή Wnt7a μετρήθηκε με το σύστημα μεθυλο-Profiler. Τα επεξεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με ένα μη κατεργασμένο έλεγχο. μπαρ σφάλμα είναι η SE πειραμάτων εις τριπλούν.

Η

μεθυλίωση υποστηρικτής Wnt7a διαμορφώνεται από DNMT1

μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMT) διαμορφώνουν μεθυλίωσης του DNA και η υπερέκφραση τους έχει συνδεθεί με τον καρκίνο του πνεύμονα [4 ]. DNMT1 είναι γνωστό ότι συσσωρεύονται στον πυρήνα των κυττάρων NSCLC σε απόκριση στην έκθεση σε καρκινογόνο καπνό ΝΝΚ? βρήκαμε ότι η έκθεση σε ΝΝΚ μειωμένη έκφραση του mRNA Wnt7a μετράται με QPCR (Εικ. 2Α) [18]. Όταν χτύπησε κάτω την έκφραση της DNMT1 σε Wnt7A μετουσιωμένο κυτταρικές σειρές Η157 και Η1299 χρήση shRNA, έκφραση DNMT1 μειώθηκε και η έκφραση της Wnt7a αντίστοιχα αυξήθηκε κατά QPCR (Σχ. 4Α). Μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης DNMT1 και αυξημένη έκφραση Wnt7a παρατηρήθηκε επίσης σε Η1299 κύτταρα (Σχ. 4Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, η μεθυλίωση του Wnt7a στο DNMT1 γκρεμίζω Η1299 κύτταρα μειώθηκε όταν μετράται με Pyrosequencing (Εικ. 4Β). Παρόμοια με μια μελέτη από Kassis et al. που βρέθηκε μείωση του πολλαπλασιασμού με εξάντληση RNAi του DNMT1, παρατηρήθηκε μια μείωση της ικανότητας κλωνισμού σε Η1299 κύτταρα με χτυπήσει κάτω των DNMT1 σε σύγκριση με το άδειο και αρνητικές επιμολύνσεις shRNA (Εικ. 4C). Παρατηρήσαμε επίσης μια επιστροφή στην κλωνογονικότητας του κενού επιμόλυνση με την προσθήκη Wnt7a shRNA στις DNMT1 shRNA επεξεργασμένα κύτταρα. Αυτή η μειωμένη κλωνογονικότητας παρατηρήθηκε με μιμείται θεραπεία DNMT1 shRNA μειώνει τον πολλαπλασιασμό που παρατηρήθηκε με την αποκατάσταση της έκφρασης Wnt7a σε προηγούμενες μελέτες [2]. Αυτό, σε συνδυασμό με την αυξημένη κλωνογονικότητας παρατηρήθηκε με την προσθήκη του Wnt7a shRNA, δείχνει ότι η απώλεια της έκφρασης Wnt7a θα μπορούσε να είναι εν μέρει υπεύθυνη για τις αρνητικές επιδράσεις που συνδέονται με την υπερέκφραση DNMT1 σε NSCLC [20]. Γκρεμίζω του Dnmt3a ή 3b στα κύτταρα Η1299 δεν οδήγησε σε αυξημένη έκφραση Wnt7a, γεγονός που υποδηλώνει ότι DNMT1 είναι υπεύθυνη για

de novo

και μεθυλίωση συντήρηση του

Wnt7a

προαγωγό (Σχήμα S1).

Α) 1.299 κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με DNMT1 shRNA και σε σύγκριση με άδειο και shRNA κύτταρα αρνητικού ελέγχου επιμολυσμένα. DNMT1 και η έκφραση Wnt7a mRNA μετρήθηκε με QPCR και παρουσιάζονται ως πτυσσόμενο αλλαγή σε σχέση με το κενό έλεγχο. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι η SE πειραμάτων εις τριπλούν. DNMT1 shRNA και ένας αρνητικός μάρτυρας shRNA διαμολύνθηκαν σταθερά εντός 1299 κύτταρα και DNMT1 και πρωτεΐνη Wnt7a μετρήθηκαν με immnoblot με έναν έλεγχο φόρτωσης β-ακτίνης. Β) Παροδικά διαμολυσμένα 1299 κύτταρα αναλύθηκαν για μεθυλίωση προαγωγού Wnt7a χρησιμοποιώντας Pyrosequencing. DNMT1 shRNA και ένα αρνητικό κύτταρα ελέγχου επιμολυσμένα shRNA συγκρίθηκαν με κενά κελιά. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι η SE πειραμάτων εις τριπλούν. C) 1299 κύτταρα με παροδική DNMT1 shRNA ή /και έκφραση Wnt7a shRNA συγκρίθηκαν με ένα άδειο ελέγχου και αρνητικό έλεγχο shRNA σε μια δοκιμασία ικανότητας κλωνισμού. Τα κύτταρα βάφτηκαν μετά από 4 ημέρες ανάπτυξης, φωτογραφήθηκε, και μετρήθηκαν για την αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι το SE των διπλών πειραμάτων.

Η

έκθεσης τσιγάρο συμπύκνωμα καπνού οδηγεί σε Wnt7a μεθυλίωση υποστηρικτής

Η μεθυλίωση έχει αποδειχθεί ότι αυξάνεται με την έκθεση σε καρκινογόνους παράγοντες καπνού, έτσι ήμασταν ενδιαφέρει στην επίδραση της συμπύκνωμα καπνού τσιγάρου (CSC) σε μεθυλίωση του

Wnt7a

υποκινητή [20]. Μεγαλώσαμε των μη μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές HBEC και Β2Β σε 1% CSC πολυμέσων για 12 εβδομάδες και στη συνέχεια εκχυλίζεται το RNA, DNA, και πρωτεϊνών. QPCR ανάλυση έδειξε μειωμένη έκφραση Wnt7a στις δύο κυτταρικές σειρές μετά από 12 εβδομάδες έκθεσης σε CSC (Εικ. 5Α). Η αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης DNMT1 επιβεβαιώθηκε σε κύτταρα B2B με την έκθεση CSC (Εικ. 5Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, η αυξημένη μεθυλίωση του

Wnt7a

περιοχή προαγωγού ταυτοποιήθηκε επίσης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 5C). Η έκθεση των πνευμόνων επιθηλίου στις καρκινογόνες ουσίες στον καπνό του τσιγάρου συνδέεται με αυξημένη μεθυλίωση και επακόλουθη μειωμένη έκφραση Wnt7a.

Α) HBEC και Β2Β κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1% CSC σε μέσο κυτταρικής ανάπτυξης για 12 εβδομάδες και Wnt7a έκφραση μετρήθηκε με QPCR. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι η SE πειραμάτων εις τριπλούν. Β) Έκφραση DNMT1 μετρήθηκε με κηλίδα western σε κύτταρα Β2Β σε επεξεργασία με 1% CSC για 12 εβδομάδες. Φόρτωση ελέγχου είναι β-ακτίνης. Γ) HBEC και κυττάρων Β2Β σε επεξεργασία με 1% CSC για 12 εβδομάδες αναλύθηκαν για μεθυλίωση Wnt7a υποκινητή σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ελέγχους χρησιμοποιώντας το σύστημα μεθυλο-Profiler. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι το SE πειραμάτων εις τριπλούν.

Η

Συζήτηση

Τα δεδομένα από αυτή τη μελέτη υποστηρίζουν τη ρόλος του Wnt7a ως καταστολέας των όγκων στα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα και τονίζουν το ρόλο της Wnt7a στην διατήρηση ενός επιθηλιακού φαινοτύπου σε ενήλικο ιστό του πνεύμονα. Wnt7a φαίνεται να είναι μοναδική στη βιβλιογραφία μέχρι σήμερα, όπως έχει προσδιοριστεί κανένα άλλο Wnt σε NSCLC ως καταστολέας όγκου ή ως σχετικές με τη διατήρηση ενός φαινοτύπου πνεύμονα επιθηλιακά. Wnt5a είναι γνωστό ότι ανταγωνίζεται σηματοδότηση β-κατενίνης σε καρκίνο του οισοφάγου, αλλά σε NSCLC έκφραση του Wnt5a φαίνεται να αυξάνει τον πολλαπλασιασμό [13], [21], [22]. Το σημαντικές δυσμενείς επιπτώσεις της απώλειας της Wnt7a σε επιθηλιακά κύτταρα πνεύμονα κίνητρο την αποφασιστικότητά μας ενός μηχανισμού απώλειας. Επίσης σημαντική είναι η δυνατότητα να αντιμετωπίσει τις θεραπευτικές στρατηγικές που απασχολούν επανέκφραση του Wnt7a.

Η συχνή απώλεια Wnt7a σε NSCLC έχει περιγραφεί προηγουμένως και στην παρούσα μελέτη, παρουσιάζονται δεδομένα που υποστηρίζουν τη σημασία της έκφρασης της Wnt7a στον πνεύμονα επιθήλιο [2]. Όταν η έκφραση Wnt7a χάνεται από μη-μετασχηματισμένα πνεύμονα επιθηλιακών κυτταρικών σειρών, τα κύτταρα αποκτούν χαρακτηριστικά των μετασχηματισμένων κυττάρων και να αρχίσουν να μοιάζουν περισσότερο κυτταρικές σειρές NSCLC σε ρυθμό πολλαπλασιασμού, αναπτύξεως της καλλιέργειας 3D, και τη μετανάστευση. Εάν αυτή η απώλεια Wnt7a επρόκειτο να συμβεί σε έναν άνθρωπο ασθενή σε συνδυασμό με την αυξημένη δραστηριότητα των ογκογονιδίων, τα αποτελέσματα θα μπορούσαν να οδηγήσουν στην ανάπτυξη ενός όγκου του πνεύμονα που έχει υποστεί EMT, η οποία συνδέεται με χειρότερη πρόγνωση [23].

DNMT1 πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνος για τη διατήρηση μοτίβα μεθυλίωσης και η αυξημένη έκφραση του έχει προσδιοριστεί ως προγνωστικός παράγοντας σε NSCLC εξέλιξη [24]. Βρήκαμε ότι όταν η έκφραση DNMT1 μειώνεται, Wnt7a μεθυλίωση μειώνεται και η έκφραση αυξάνει. Δείξαμε επίσης ότι η Wnt7a είναι υπεύθυνος για ένα μέρος της μειωμένης κυτταρικής ανάπτυξης που παρατηρείται με την απώλεια DNMT1. Τυπικά, ένα πρόσθετο DNMT εμπλέκεται σε συγκεκριμένες de novo μεθυλίωση προαγωγού γονιδίου, ενώ διατηρεί αυτήν DNMT1 μεθυλίωσης. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει ότι DNMT1 έχει επίσης

de novo

μεθυλοτρανσφεράσης στις περιοχές CpG [12]. Μας εύρημα ότι η απώλεια του Dnmt3a ή έκφραση 3b δεν έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση Wnt7a σε Η1299 κύτταρα υποδηλώνει ότι DNMT1 μπορεί να είναι ο μοναδικός DNMT υπεύθυνη για μεθυλίωση προαγωγού του Wnt7a. Αν ναι, αυτό μπορεί να κάνει θεραπευτική απομεθυλίωση του

Wnt7a

μέσω της μείωσης της δραστηριότητας DNMT λιγότερο περίπλοκη, καθώς μόνο μία DNMT θα πρέπει να απευθύνονται και να παρακολουθούνται.

Η έκθεση σε καρκινογόνες ουσίες του καπνού in vitro και in vivo έχει συσχετιστεί με αλλαγές στη δραστηριότητα DNMT και επιγενετικές μεταβολές [11], [18], [25], [26]. Στη μελέτη μας, η θεραπεία των μη μετασχηματισμένων επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα με CSC οδήγησε σε αυξημένη μεθυλίωση Wnt7a και αντίστοιχη μείωση της έκφρασης. Μια προηγούμενη μελέτη από τους Liu et al. βρέθηκε μειωμένη έκφραση Wnt7a από σειρά μετά την CSC έκθεση [11]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει αυξημένη έκφραση πρωτεΐνης DNMT1 ή συσσώρευση και αυξημένη μεθυλίωση των ειδικών γονιδίων μετά την έκθεση σε καρκινογόνους παράγοντες καπνού [18], [25], [26]. Η απώλεια της έκφρασης Wnt7a έχει αναγνωριστεί ως ένα συχνό συμβάν σε NSCLC, αλλά αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που προτείνει ένα μηχανισμό της απώλειας και να δείξει ότι οι καρκινογόνες ουσίες του καπνού μπορεί να επηρεάσει την απώλεια αυτή [2].

Wnt7a διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση ενός φυσιολογικά επιθηλιακά φαινότυπο στον πνευμονικό ιστό. Ως εκ τούτου, η απώλεια της Wnt7a θα μπορούσε να έχει σημαντικές επιπτώσεις στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα, ειδικά όταν συνδυάζεται με την προς τα πάνω ρύθμιση του ένα ισχυρό ογκογονίδιο. Αυτή η μελέτη ερευνά το σημαντικό ζήτημα του πώς Wnt7a έκφραση έχει χαθεί και πως η έκφρασή του μπορεί να αποκατασταθεί σε μια προσπάθεια για την αντιμετώπιση του καρκίνου του πνεύμονα. Αποκατάσταση της έκφρασης Wnt7a μπορούν επίσης να έχουν δυνητική εφαρμογή σε άλλα επιθηλιακά καρκίνους ή ασθένειες των πνευμόνων. Θεραπευτική αποκατάσταση της Wnt7a σηματοδότησης σε NSCLC θα μπορούσε να επιτευχθεί με μέσα τα οποία είναι ήδη σε κλινική χρήση, συμπεριλαμβανομένης απομεθυλίωση πράκτορες και του αναλόγου προστακυκλίνης Iloprost, το οποίο ταυτοποιήθηκε πρόσφατα ως ενεργοποιητής της οδού Wnt7a [27] σηματοδότησης. Περαιτέρω εργασίες θα πρέπει να γίνει για να καθοριστεί το χρονοδιάγραμμα της απώλειας Wnt7a και τη δυνατότητα in vivo επιδράσεις της θεραπείας για

Wnt7a

μεθυλίωσης. Τα δεδομένα από τη μελέτη αυτή παρουσιάζει μια σημαντική και προηγουμένως μη περιγραφείσα βήμα προς την ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών Wnt7a για NSCLC.

Μέθοδοι

Cell Culture, Ανθρωπίνων Ιστών και Αντιδραστήρια

NSCLC και κυτταρικές σειρές Beas2B καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Η κυτταρική σειρά HBEC (ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα) καλλιεργήθηκε σε Βρογχικό Βασικού μέσου επιθηλίου στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την ATCC (www.atcc.org), εκτός από την κυτταρική γραμμή HBEC, το οποίο ελήφθη το 2009 από τον Dr. Robert Doebele στο Πανεπιστήμιο του Κολοράντο [28]. Μορφολογία όλων των κυττάρων γραμμών παρακολουθήθηκε δύο φορές την εβδομάδα και τα αποθέματα των κυτταρικών γραμμών δεν περάστηκαν πάνω από δέκα φορές για χρήση σε πειράματα. RNA και DNA από 82 ζεύγη ανθρώπινου πνευμονικού ιστού και γειτονικό φυσιολογικό ιστό πνεύμονα ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Κέντρο Καρκίνου σπόριο Καρκίνο του Πνεύμονα Pathology Core. ΝΝΚ (Sigma) εφαρμόστηκε σε 10 μΜ για 2 ώρες σε μέσα κυτταρικής ανάπτυξης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης (5 Αζα) (Sigma) σε 6 μΜ σε μέσο κυτταρικής ανάπτυξης επί 1-4 ώρες, ανάλογα με την δοκιμασία. συμπύκνωμα καπνού τσιγάρου (CSC) (ΜιιΠγ Pharmaceuticals) εφαρμόστηκε σε σταθερή συγκέντρωση 1% στο μέσο ανάπτυξης των κυττάρων για 12 εβδομάδες.

Νοκ ντάουν μελέτες, διάδοση, 3D πολιτισμό, και δοκιμασία μηδέν

έκφραση Wnt7a χτυπήθηκε κάτω σταθερά στην HBEC και κυτταρικές σειρές B2B χρησιμοποιώντας ένα λεντοϊού σύστημα shRNA από το Open Biosystems με την επιλογή πουρομυκίνης. Dnmt έκφραση χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας σίγουρος κατασιγάσει shRNA από SABiosciences με την επιλογή υγρομυκίνης για σταθερή έκφραση. Παροδική γκρεμίσουμε της Wnt7a επιτεύχθηκε με ένα σύστημα ρετροϊικού shRNA από το Open Biosystems. ανάλυση πολλαπλασιασμός διεξήχθη σε κύτταρα Β2Β χρησιμοποιώντας ένα αριθμό των κυττάρων 6-ημερών, όπου ίσοι αριθμοί κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε έξι φρεάτια και ένα φρεάτιο υπολογίζεται κάθε μέρα. Σε HBEC κύτταρα, οι κυτταρικές Titer Υδατικό δοκιμασία (Promega) χρησιμοποιήθηκε και τα κύτταρα αναλύθηκαν κάθε 24 ώρες για 72 ώρες. Σε 1299 κύτταρα, μία δοκιμασία ικανότητας κλωνισμού χρησιμοποιήθηκε, όπου 1000 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κανονικό μέσο ανάπτυξης και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες για την ανάπτυξη του κλώνου κατά την ημέρα 4. Οι αποικίες φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν για την αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης. Κλωνοποίηση απόδοση είναι ο αριθμός των αποικιών διαιρείται με τον αριθμό των κυττάρων που απλώθηκαν. Τρισδιάστατο καλλιέργειες βασικής μεμβράνης καθορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Εν συντομία, 5000 κύτταρα /φρεάτιο αναπτύχθηκαν σε 2% matrigel (BD Bioscience) με EGF σε μια στρώση βάσης matrigel 50%. Για τη δοκιμασία μηδέν, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο ανάπτυξης μέχρι 90-100% συρροή. Ένας χώρος 3 πιπί εισήχθησαν κατά μήκος της διαμέτρου του κάθε πλάκα. Στο χρόνο μηδέν, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μg /ml μιτομυκίνης να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Η μετανάστευση των κυττάρων καταγράφηκε σε 24 ώρες. Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση ενός φακού 40 × για ένα ελαφρύ μικροσκόπιο και μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή.

Η επιμόλυνση

Το πλασμίδιο αναφοράς PPAR Στοιχείο Απόκρισης λουσιφεράσης (PPRE) (3 μg), Fzd9 πλασμίδιο, και Wnt7a -luciferase επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine (Invitrogen? Carlsbad, CA, USA). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και επαναιωρήθηκαν σε λουσιφεράσης Lysis Buffer (Promega). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως πολλαπλή μεταβολή σε σχετικές μονάδες φωτός /χιλιοστομονάδες του β-γαλακτοσιδάσης και αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τροποποίηση της λουσιφεράσης Wnt7a διεξήχθη με SSSI, ΗρβΙΙ, και HhaI σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (New England Biolabs). Παροδική ή σταθερή επιμόλυνση των DNMT και Wnt7a shRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας σίγουρος κατασιγάσει shRNA από SABiosciences ή ρετροϊικής shRNA από το Open Biosystems και αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Attractene (Qiagen).

Ποσοτική PCR

Το RNA που εξάγεται από κύτταρα με το AllPrep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen) και 5 μg του RNA μετατράπηκε σε cDNA. PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας SABioscience RT

2 εναύσματα και master μίγμα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση όλων των δειγμάτων. Τα δεδομένα QPCR παρουσιάζεται ως πολλαπλές μεταβολές σε κανονικοποιημένη επίπεδα του mRNA για τον έλεγχο εναντίον πειραματικά δείγματα και είναι ο μέσος όρος τουλάχιστον εις τριπλούν πειράματα με τυπικό σφάλμα παρουσιάζονται ως ράβδοι σφάλματος.

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Cells συλλέχθηκαν και τα εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα κινάσης ΜΑΡ. Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με χημειοφωταύγεια και το σύστημα ChemiDoc (BioRad). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοκηλίδωση: Wnt7A (R &? D Systsems), DNMT1 (Abcam) και β-ακτίνη (Abcam). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

μεθυλίωσης του DNA ανάλυση

DNA απομονώθηκε από κυτταρικές γραμμές και δείγματα όγκου χρησιμοποιώντας το AllPrep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen) και τροποποιήθηκε με χρήση του EZ Η μεθυλίωση του DNA-Χρυσό σετ (Zymo Research). 1 μg DNA χρησιμοποιήθηκε για Pyrosequencing για

Wnt7a

σε μία δοκιμασία σχεδιάστηκε και διεξήχθη από Epigendx. Δεδομένα από Pyrosequencing παρουσιάζονται ως μέση επί τοις εκατό μεθυλίωσης, η οποία είναι ο μέσος όρος των επί τοις εκατό μεθυλίωσης σε 13 θέσεις CpG εντός της νησίδος CpG στον υποκινητή Wnt7a. Το σύστημα μεθυλο-Profiler από SABiosciences χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση Wnt7a μεθυλίωση σε 5-αζα και CSC επεξεργασμένα κύτταρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ποσοστό μεθυλιωμένο DNA εντός του υποκινητή Wnt7a.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Έκφραση των Wnt7a δεν αυξάνεται με Dnmt3a ή 3Β νοκ ντάουν. QPCR χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των επιπέδων του mRNA της Dnmt3a ή 3Β και Wnt7a σε Η1299 κυττάρων με εξουδετέρωση των Dnmt3a ή 3Β. δεδομένα shRNA συγκρίνεται με ένα αρνητικό μάρτυρα και παρουσιάζονται ως πτυσσόμενο αλλαγή ρυθμίζεται σύμφωνα με GAPDH

doi:. 10.1371 /journal.pone.0032921.s001

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Μεθυλίωση ιστός ανθρώπινου όγκου πνεύμονα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Pyrosequencing. Κάθε όγκου αναλύθηκε σε 13 περιοχές CpG στο

Wnt7a

υποκινητή. Η επί τοις εκατό των όγκων μεθυλιωμένο σε μεγαλύτερη από 0% του DNA εμφανίζεται στο κάτω μέρος του πίνακα για κάθε χώρο. Η μεθυλίωση του φυσιολογικού πνευμονικού ιστού ταιριάζουν στους ιστούς του όγκου στον Πίνακα S1 αναλύθηκε με Pyrosequencing. Κάθε δείγμα αναλύθηκε σε 13 θέσεις CpG στον υποκινητή Wnt7a. Το ποσοστό των δειγμάτων με μεθυλίωση μεγαλύτερη από 0% εμφανίζεται στο κάτω μέρος του πίνακα για κάθε χώρο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0032921.s002

(PDF)