Αφηρημένο

Η επικράτηση των συγκεκριμένων λοιμώξεων σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη Ηνωμένο Βασίλειο διερευνήθηκε. Ορός από 84 ασθενείς και 62 μάρτυρες ελέγχθηκε για την εξουδετέρωση του ιού ξενοτροπικών ιού που σχετίζονται με λευχαιμίας ποντικού (XMRV) Φάκελος. Δεν αντιδραστικότητα βρέθηκε στα δείγματα ασθενών. Επιπλέον, ένα περαιτέρω δείγματα DNA 100 προστάτη ελέγχθηκαν για XMRV, ιό ΒΚ,

Trichomonas vaginalis

και ανθρώπινους ιούς θηλώματος με τεχνικές ανίχνευσης νουκλεϊνικών οξέων. Παρά επιδεικνύοντας ακεραιότητα του DNA και ευαισθησία της δοκιμασίας, δεν καταφέραμε να ανιχνεύσουν την παρουσία οποιουδήποτε από αυτούς τους παράγοντες σε δείγματα DNA, μπαρ ένα δείγμα το οποίο ήταν ασθενώς θετικά για HPV16. Ως εκ τούτου, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι αυτές οι λοιμώξεις είναι απούσα σε αυτή την τυπική ομάδα των ανδρών με καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Γαμπρός HCT, Warren AY, Neal DE, Επίσκοπος KN (2012) Δεν υπάρχουν ενδείξεις για μόλυνση του Ηνωμένου Βασιλείου Καρκίνος του προστάτη Οι ασθενείς με XMRV, BK Virus,

Trichomonas vaginalis

ή Ανθρώπινων θηλωμάτων ιοί. PLoS ONE 7 (3): e34221. doi: 10.1371 /journal.pone.0034221

Επιμέλεια: Mark Wainberg, το Πανεπιστήμιο McGill Κέντρο AIDS, Καναδάς

Ελήφθη: 22 Νοέμ 2011? Αποδεκτές: 24 του Φλεβάρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 28 Μαρτίου 2012

Copyright: © 2012 Γαμπρός et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ιατρικό Συμβούλιο του Ηνωμένου Βασιλείου Έρευνας [KNB U117592729] και το Wellcome Trust [KNB 084955]. KNB είναι ένα Wellcome Trust Εξέλιξης Fellow. Οι συγγραφείς θα ήθελαν να αναγνωρίσουμε την υποστήριξη του Πανεπιστημίου του Cambridge, Cancer Research UK, και το Εθνικό Ινστιτούτο Έρευνας Υγείας, το οποίο χρηματοδοτεί το Cambridge Βιο-ιατρική Κέντρου Ερευνών, Cambridge, UK. Η τράπεζα ιστών του ανθρώπινου ερευνητικού υποστηρίζεται από το Κέντρο Ερευνών NIHR Cambridge Βιοϊατρικής. Οι συγγραφείς θα ήθελαν επίσης να αναγνωρίσουμε την υποστήριξη του National Cancer Research Καρκίνος του προστάτη: Μηχανισμοί της εξέλιξης και θεραπεία (ΑΜΕΣΗ) συνεργατική (κωδικός επιχορήγηση G0500966 /75466), το οποίο έχει χρηματοδοτήσει συλλογές ιστού και ούρων στο Cambridge. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PC) συμβάλλει σημαντικά στην παγκόσμια επιβάρυνση ασθενειών που οφείλονται στον καρκίνο και είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες στο Ηνωμένο Βασίλειο (https://info.cancerresearchuk.org/cancerstats). Οι τρέχουσες μέθοδοι ελέγχου και αποφάσεων για τη διαχείριση του ασθενούς παρεμποδίζεται από μια θεμελιώδη έλλειψη διορατικότητας στη φυσική ιστορία της νόσου, η οποία είναι πιθανό να είναι πολυπαραγοντική. Οι ερευνητές πρότειναν μολυσματική αιτία ήδη από τη δεκαετία του 1950 και έκτοτε διάφορα παθογόνα έχουν συσχετισθεί με τη νόσο (που επισκοπείται στο [1]). Αν και επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι μια ιστορία της απόκτησης των σεξουαλικά μεταδιδόμενων ασθενειών αυξάνει τον κίνδυνο του PC, καμία οριστική σύνδεση με μια συγκεκριμένη μόλυνση έχει αποδειχθεί. Αποφασίσαμε να εξετάσουμε συγχρόνως την επικράτηση των τεσσάρων διαφορετικών μολυσματικών παραγόντων που έχουν το καθένα ανεξάρτητα συσχετισθεί με PC. Έχουμε ως στόχο να αυξήσει τις πιθανότητες ανίχνευσης μελετώντας δείγματα από ένα καλά χαρακτηρισμένο ομάδα των ασθενών με σοβαρή PC.

Πρώτον, ψάξαμε για το νέο gammaretrovirus, ξενοτροπικά ιό λευχαιμίας ποντικού (MLV)-σχετικών ιό (XMRV ), που απομονώθηκε από το οικογενειακό ιστό ασθενούς PC το 2006 [2]. Μια δεύτερη, μεγαλύτερη, ελεγχόμενη μελέτη το 2009 πρότεινε ότι XMRV συνδέθηκε με όγκους υψηλού βαθμού και δεν περιορίζεται σε οικογενείς περιπτώσεις PC [3]. Ωστόσο, αρκετές μεταγενέστερες μελέτες έχουν βρει καμία σχέση με XMRV και η συσχέτιση αυτή παρέμεινε αμφιλεγόμενο. . Ενώ αυτό το χειρόγραφο ήταν στο πλαίσιο της προετοιμασίας μια μελέτη από Paprotka

et al

κατέδειξε την πιθανή ανασυνδυασμένη προέλευση XMRV [4]? Αυτές οι προγονικές ιοί έχουν έκτοτε περαιτέρω χαρακτηρίζεται από [5]. Πρόσφατα, Martinez-Fierro και οι συνεργάτες ανιχνεύεται ανθρώπινους ιούς θηλώματος (HPV) σε 20% των περιπτώσεων PC με PCR [6]. Υψηλή HPVs κίνδυνος είναι αιτιολογικοί παράγοντες στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και Ε6 τους και 7 πρωτεΐνες είναι σε θέση να αθανατοποίηση κυττάρων του προστάτη [7]. Ιών θηλώματος έχουν επίσης τη δυνατότητα για καρκινογένεση και του ιού ΒΚ (BKV) έχει συχνά ανιχνευθεί σε δείγματα PC, και πιο πρόσφατα στον ιστό, τα ούρα και το πλάσμα [8], [9]. Τέλος, το παράσιτο

Trichomonas vaginalis

(TV) είναι γνωστό ότι προκαλεί προστατίτιδα και έδειξε ελαφρώς αυξημένο ποσοστό επιπολασμού σε PC σε μια πρόσφατη μελέτη ασθενών-μαρτύρων [10]. Ως εκ τούτου, οι τρεις αυτές παθογόνα διερευνήθηκαν επιπροσθέτως XMRV.

Εξετάσαμε DNA ιστό PC για XMRV, BKV, τηλεόραση και HPV νουκλεϊκά οξέα, καθώς και τους ορούς των ασθενών δοκιμές PC για την παρουσία εξουδετερωτικών αντισωμάτων προς XMRV Εην. Παρά αποδεικνύουν τις δοκιμασίες ήταν εξαιρετικά ευαίσθητο, κανένα από τα δείγματα ασθενούς ήταν θετικά για μόλυνση, με την εξαίρεση ενός δείγματος DNA HPV-θετικές. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι δεν υπάρχει καμία συσχέτιση με οποιοδήποτε από τους παράγοντες και τον υπολογιστή και ότι οι κλινικές προσεγγίσεις δεν θα πρέπει να επικεντρωθεί στην αντιμετώπιση αυτών των μολυσματικών παραγόντων στους άνδρες.

Αποτελέσματα

Ογδόντα τέσσερις UK PC ασθενή και 62 οροί ελέγχου (από άνδρες με χαμηλό ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA) ή υψηλής PSA με αρνητική βιοψία) εξετάστηκαν για την παρουσία αντισωμάτων αντι-XMRV χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία εξουδετέρωσης που έχει περιγραφεί προηγουμένως [11]. Παρά επικυρωμένη μονοκλωνικό αντίσωμα ελέγχου που δείχνει αναπαραγώγιμες δραστηριότητα εξουδετέρωσης σε αυτή τη δοκιμασία, κανένας από τους ορούς ασθενών PC έδειξαν καμία απόδειξη των αντισωμάτων αντι-XMRV. Ένα δείγμα ορού από έναν έλεγχο, Q2, έκαναν επίδειξη ειδική αντιδραστικότητα ενάντια XMRV σε υψηλές συγκεντρώσεις στον ορό (Σχήμα 1).

Μολυσματικότητα XMRV μετά από επώαση με τον ορό του ασθενούς ή μονοκλωνικά εναιώρημα. Μολυσματικότητα (που μετράται ως μονάδες σχετικής β-γαλακτοσιδάση) παριστάνεται γραφικά έναντι το αντίστροφο της αραίωσης ορού (μαύρα σύμβολα) ή μονοκλωνικά εναιώρημα (σημεία μπλε στοιχεία, τα μονοκλωνικά 603, αρνητικός έλεγχος? Κόκκινα σημεία δεδομένων, 83A25 », θετικός έλεγχος). Διακεκομμένη γραμμή δείχνει το επίπεδο της μολυσματικότητας σε απουσία ορού /μονοκλωνικά. είναι Q1-10 ονομασίες των ασθενών. Q2 εκθέματα εξουδετέρωση.

Η

Δυστυχώς, το DNA δεν ήταν διαθέσιμο από την ίδια ομάδα ασθενών εξετάστηκαν παραπάνω και έτσι το DNA εξήχθη από επιπλέον δείγματα καρκινικού ιστού εκατό του προστάτη από ένα άλλο παρόμοιο καλώς χαρακτηρισμένα ομάδα. δείγματα DNA δοκιμάστηκαν για την ακεραιότητα με

hgapdh

PCR και 96 έδειξαν ανιχνεύσιμο προϊόν μετά ένα γύρο (ένα υποσύνολο φαίνεται στο Σχήμα 2Α). Τα τέσσερα δείγματα που απέτυχαν να ενισχύσουν προϊόν συμπεριλήφθηκαν σε περαιτέρω δοκιμές, όπως έλεγχοι για μόλυνση δοκιμασίας. Εκχυλισμένο DNA δοκιμάστηκε για XMRV χρησιμοποιώντας μια ένθετη PCR ενίσχυση του ιικού

gag

γονίδιο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [2]. Αυτό το PCR ανιχνεύει αξιόπιστα ενιαία αντίγραφα του ελέγχου πλασμιδίου αραιωμένο σε περίσσεια ανθρώπινου DNA σε κάθε πείραμα (Σχήμα 2Β). Αυτό το PCR είναι επίσης κατάλληλη για την ανίχνευση σχετικών gammaretroviruses (MLVs), συμπεριλαμβανομένων εκείνων που βρέθηκαν, όπως ενδογενών ιών σε ποντικούς. Έξι από 100 δειγμάτων DNA PC έδωσε ένα προϊόν του αναμενόμενου μεγέθους (Σχήμα 2C). Όπως XMRV σχετίζεται με ενδογενείς ρετροϊούς παρούσα σε ποντίκια, η παρουσία του μολυσματικού ποντικού DNA θα μπορούσε να οδηγήσει σε ένα θετικό αποτέλεσμα σε αυτή την PCR. Για τον έλεγχο για αυτό, θετικά δείγματα ελέγχθηκαν επίσης για το DNA ποντικού χρησιμοποιώντας ένα συγκεκριμένο PCR για ποντικού ενδογενή ρετροϊική στοιχείο εγκεφαλικής δεξαμενής σωματίδια Α (IAP) [12]. Αυτό το PCR μπορεί να ανιχνεύσει χαμηλά επίπεδα DNA ποντικού, λόγω της υψηλής συχνότητας του ΙΑΡ σε γονιδιωμάτων ποντικού (Σχήμα 3Α). Όλα τα έξι δείγματα που ήταν θετικά για XMRV gag

ήταν επίσης θετικά με τη χρήση του ΙΑΡ PCR (Σχήμα 3Β, Πίνακες 1 και S1). Για να διευκρινιστεί η προέλευση αυτών των ζωνών με μεγαλύτερη ακρίβεια, οι αμπλικόνια κλωνοποιήθηκαν και αλληλουχήθηκαν. Φυλογενετική ανάλυση της αλληλουχία «

gag

» αμπλικόνια υποστήριξε τον ισχυρισμό ότι προέρχονται από μολυσματικά ποντικού νουκλεϊκών οξέων (Σχήμα S1).

Πίνακες Α-Γ δείχνουν γελών 1% αγαρόζης που βάφτηκε με βρωμιούχο αιθίδιο. Για όλους, Μ δηλώνει δείκτη, W υποδεικνύει το νερό, οι αριθμοί στα αριστερά δείχνουν το μέγεθος των δεικτών στα ζεύγη βάσεων, βέλη δείχνουν αναμενόμενο μέγεθος μπάντα για κάθε PCR. Α) Ανίχνευση

hgapdh

στο DNA που απομονώθηκε από δείγματα DNA PC ιστού 1-24 χρησιμοποιώντας μόνο γύρο PCR. Αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος PCR, 225 ζεύγη βάσεων. Β) Πρότυπη καμπύλη για τον προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης της XMRV

gag

ένθετη PCR. Δέκα-φορές σειριακές αραιώσεις από 10

6 προς 1 μόριο ανά μΐ του πλασμιδίου XMRV (pcDNA3.1 /VP62) πραγματοποιήθηκαν σε ένα υπόβαθρο μιας περίσσειας του ανθρώπινου γενωμικού DNA. Τα προϊόντα δεύτερης γύρο ενίσχυση του

gag

ένθετα PCR φαίνονται. Οι αριθμοί πάνω από λωρίδες αναφέρεται ο αριθμός εισόδου των μορίων. Αναμενόμενο PCR μέγεθος του προϊόντος 413 ζεύγη βάσεων. Η αλληλουχία του βραδύτερη μεταναστεύουν αμυδρή ζώνη στη λωρίδα «0» (ανθρώπινο γονιδίωμα ΟΝΑ μόνο) έδειξε αυτό να είναι μη-ειδική ενίσχυση των ανθρώπινων γονιδίων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Γ) Ανίχνευση XMRV

gag

αλληλουχίες στο DNA που απομονώθηκε από δείγματα ιστού καρκίνου του προστάτη. Τα Δεύτερος γύρος προϊόντα ενίσχυσης από ένα υποσύνολο των ασθενών φαίνονται όπως στο (Β). Δείγματα 4, 8 23, 60, 62 και 72 είναι θετικές. Πηκτωμάτων αγαρόζης 1%

Η

Πίνακες Α και Β δείχνουν χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Για όλους, Μ δηλώνει δείκτες, οι αριθμοί στα αριστερά δείχνουν το μέγεθος των δεικτών στα ζεύγη βάσεων, W υποδεικνύει το νερό, τα βέλη δείχνουν αναμενόμενο μέγεθος μπάντα για κάθε PCR. Προϊόντα εμφανίζονται ως επίχρισμα οφείλεται σε διάφορα μήκη αμπλικόνιο. Για αναφορά, υπάρχουν περίπου χίλια ΙΑΡ αντίγραφα ανά γονιδίωμα του ποντικού. Α) εντός της δεξαμενής DNA σωματιδίων τύπου Α ενισχύθηκε από διαδοχικές αραιώσεις του DNA ποντικιού (0,001 – 10

3 ισοδύναμα γονιδιώματος, είτε C56BL /6 ή

Mus spretus

). Τα προϊόντα που προέρχονται από ένα γύρο ενίσχυσης δείξει. Οι αριθμοί πάνω από λωρίδες αναφέρεται ο αριθμός των ισοδυνάμων γονιδιώματος ποντικού στην αντίδραση PCR. Β) Τα προϊόντα από PCR ενίσχυση της ενδο-δεξαμενής DNA σωματιδίων τύπου Α από δείγματα DNA ιστού επιλεγμένο υπολογιστή. Οι αριθμοί πάνω από λωρίδες δείχνουν ονομασίες των ασθενών. Δείγματα 4, 8, 23, 60, 62, 70 και 72 είναι θετικές. +/- Δείχνουν θετικό ή αρνητικό αποτέλεσμα στο

gag

PCR (Σχήμα 2).

Η

δείγματα DNA ελέγχθηκαν επίσης για την παρουσία του BKV από ένθετη PCR. Παρά αξιόπιστη ανίχνευση ενός μορίου BKV πλασμίδιο σε επανειλημμένες προσπάθειες (pBR322-Dunlop, Εικόνα 4Α), κανένα από τα δείγματα των ασθενών έδωσε μια μπάντα του κατάλληλου μεγέθους (υποσύνολο φαίνεται στο Σχήμα 4Β). Ομοίως, τα δείγματα των ασθενών ήταν αρνητικά για την τηλεόραση χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο πραγματικού χρόνου κιτ PCR δοκιμασία (Σχήμα 4C). Αυτή η δοκιμασία ήταν ικανή να ανιχνεύει αξιόπιστα δέκα αντίγραφα της τηλεόρασης (Σχήμα 4C + D). Αυτά τα αρνητικά αποτελέσματα δεν ήταν εξαιτίας αποτυχίας της διαδικασίας εκχύλισης ως ένας εσωτερικός έλεγχος εκχύλισης ενισχύθηκε επιτυχώς. Όλα τα δείγματα του DNA στη συνέχεια εξετάστηκαν για HPV και όλα τα δείγματα εκτός από ένα, η οποία είχε αδύναμη υβριδισμού προς HPV 16, βρέθηκαν να είναι αρνητική, παρά την επιτυχή ενίσχυση του ανθρώπινου DNA χρησιμοποιώντας τον ανιχνευτή ελέγχου kit σε όλα εκτός από ένα δείγμα (Δείγματα 1-3 δείχνεται στο Σχήμα 5). Μια περίληψη αυτών των αποτελεσμάτων για όλα τα 100 δείγματα DNA PC δίνεται στους Πίνακες 1 και S1.

πηκτές αγαρόζης 1% πλαίσια Α και Β δείχνουν χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Και για τα δύο, Μ δηλώνει δείκτες, οι αριθμοί στα αριστερά δείχνουν το μέγεθος των δεικτών σε ζεύγη βάσεων, τα βέλη δείχνουν ζώνες του αναμενόμενου μεγέθους για το δεύτερο γύρο (453 bp). Α) Σειριακές αραιώσεις BKV πλασμίδιο (pBR322-Dunlop) έγιναν από 10

6 προς 1 μόριο (-α) και ενισχύθηκαν με ένθετη PCR. Τα προϊόντα του δεύτερου γύρου του πολλαπλασιασμού δείχνεται. Οι αριθμοί πάνω από λωρίδες αναφέρεται ο αριθμός των μορίων στην αντίδραση PCR. Β) Τα προϊόντα από το δεύτερο γύρο της ενίσχυσης PCR ένθετα του BKV από ένα υποσύνολο δειγμάτων DNA PC ιστού. Οι αριθμοί πάνω από λωρίδες δείχνουν ονομασίες των ασθενών. Γ) οικόπεδο Ενίσχυσης δείχνει τις καμπύλες για την ποσοτική PCR αντιδράσεις ανίχνευση τηλεόραση χρησιμοποιώντας Ποσοτικοποίηση των Trichomonas vaginalis Σύνθετη Kit. Σειριακές αραιώσεις του θετικού ελέγχου φαίνονται καθώς και η έλλειψη ενίσχυσης για δείγματα DNA PC ιστού 1-50 (χωρίς ενίσχυση και ως εκ τούτου όλα κάτω από τη γραμμή ορίου). Είσοδοι είχαν ως εξής: int, εσωτερικός έλεγχος εκχύλισης (ανιχνευθεί σε ένα ξεχωριστό φίλτρο), Α, 10

6 μόρια τηλεόραση, b, 10

5 τηλεόραση μόρια, c, 10

4 μόρια τηλεόραση, d, 10

3 TV μόρια, e, 10

2 μόρια τηλεόραση, στ, 10 μόρια τηλεόραση. Οικόπεδο δείχνει δέλτα Rn με τον αριθμό κύκλο. Δ) Οικόπεδο Ct τιμές του log του θετικού μάρτυρα, καταδεικνύοντας συγκέντρωση εισόδου γραμμικότητα, R

2 & gt?. 0.99

Η

HPV DNA σε δείγματα DNA PC ιστού ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας INNO-LiPA HPV Γονοτυπικές Extra. HPV DNA ενισχύθηκε από δείγματα χρησιμοποιώντας εναρκτήρες προς συντηρημένες αλληλουχίες δημιουργία βιοτινυλιωμένα προϊόντα. Βιοτινυλιωμένα αμπλικόνια στη συνέχεια υβριδίστηκαν με λωρίδες φέρουν συντηρημένες και ειδικού τύπου HPV ανιχνευτές. Συγκροτήματα δείχνουν πρόσδεση του βιοτινυλιωμένου DNA του δείγματος με τον στόχο που υποδεικνύεται. Marker είναι για ευθυγράμμιση λωρίδες, συζυγές έλεγχος επιβεβαιώνει τα αντιδραστήρια λειτουργούν σωστά, ο έλεγχος hDNA υποδεικνύει την παρουσία του ανθρώπινου DNA στο δείγμα, HPV (ευρεία) υποδεικνύει πρόσδεση του HPV DNA σε ανιχνευτές που δεσμεύονται διατηρημένες περιοχές. Όλες οι άλλες διακεκομμένες γραμμές δείχνουν περιοχές που δεσμεύονται με ειδικά HPVs π.χ. HPV16 (φαίνεται). Οι αριθμοί πάνω από λωρίδες είναι ονομασίες ασθενούς (μόνο 3 λωρίδες δείγματος δείχνεται για σαφήνεια), -, αρνητικός έλεγχος (νερό), +, θετικός έλεγχος (παρέχεται με το κιτ). Αποτέλεσμα για την ενιαία HPV θετικό δεν εμφανίζεται όπως ήταν πάρα πολύ εξασθενημένοι για να εμφανιστεί σε μια σαρωμένη εικόνα.

Η

Συζήτηση

Μια εκτενής και αμφιλεγόμενη βιβλιογραφία υπάρχει σύνδεση μολυσματικών παραγόντων στο PC, ιδιαίτερα XMRV και HPV [1], [13]. Όπως είχαμε πρόσβαση σε ένα μεγάλο, καλά χαρακτηρισμένο ομάδα ασθενών PC και εμπειρία στη χρήση μοριακών τεχνικών για την ανίχνευση των ιών, θεωρήσαμε ότι θα ήταν χρήσιμο να διερευνηθεί η παρουσία των τεσσάρων παραγόντων? XMRV, BKV, τηλεόραση και HPV, στα ίδια δείγματα PC.

Τα τελευταία χρόνια υπήρξε μεγάλο ενδιαφέρον και η διαμάχη με τη σύνδεση των XMRV με το PC. Σε μία δοκιμασία που αναπτύχθηκε για να ανιχνεύσει μια ανοσολογική απόκριση σε XMRV, ένα δείγμα ορού στη μελέτη μας ήταν σε θέση να εξουδετερώνουν τον ιό (Q2, Εικόνα 1). Ωστόσο, αυτός ο ορός ήταν από άτομο χαμηλή έλεγχο PSA και ως εκ τούτου δεν υπήρχε σύνδεση με PC. Αυτή η δοκιμασία εξουδετέρωσης ήταν παρόμοια με αυτή που χρησιμοποιείται από τον Arnold

et al.

, Εκτός του ότι τα όμοια με ιό σωματίδια ψευδότυπου χρησιμοποιούνται βασίστηκαν σε MLV αντί HIV [14]. Αυτό αντιπροσωπεύει θεωρητικά ένα ψευδώς θετικό αποτέλεσμα οφείλεται σε επιτόπιο διασταυρούμενη αντιδραστικότητα. Δυστυχώς, ούτε περαιτέρω ορού για τη δοκιμή αντιδραστικότητας με Western Blot ούτε DNA για δοκιμές με PCR ήταν διαθέσιμα για το άτομο αυτό. Επιπλέον, δεν βρήκαμε καμία απόδειξη για την κανονική XMRV [2] σε δείγματα DNA PC με PCR. Έξι δείγματα ενίσχυσαν ένα προϊόν στον gag

PCR αλλά ήταν επίσης θετικά για το DNA του ποντικού, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτή η PCR είχε ενισχυμένων ενδογενείς ρετροϊικές αλληλουχίες ποντικού που υπάρχουν σε υψηλούς αριθμούς αντιγράφων σε ποντίκια (Σχήματα 2 και 3). Η φυλογενετική ανάλυση των αμπλικονίων υποστηρίζει αυτή την υπόθεση (Σχήμα S1). Επιπλέον, ένα

gag

αρνητικό δείγμα ήταν θετικό στην ΙΑΡ PCR, που δείχνουν ότι η IAP PCR είναι ικανή να ενισχύει μολύνουν ποντικού DNA που δεν ανιχνεύθηκε από το gag

PCR.

Μαζί, οι ορολογικές μας και τα δεδομένα PCR δεν δείχνουν καμία συσχέτιση των gammaretroviruses και PC. Αυτό συμφωνεί με τις πρόσφατες γενετικές αποδείξεις προσδιορισμό της προέλευσης των XMRV που υποδεικνύει ότι οι ιοί XMRV σχετίζονται στην πραγματικότητα δεν είναι ανθρώπινα παθογόνα [4], που επισκοπείται στο [15]. Παρά καταβάλλει κάθε δυνατή προσπάθεια για την απομόνωση του DNA και να εκτελέσει δοκιμασίες στο ποντίκι-δωρεάν εγκαταστάσεις που χρησιμοποιούν νέο εξοπλισμό που αγοράζονται για αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα IAP PCR μας αναδεικνύουν το πρόβλημα της μόλυνσης των δειγμάτων με το DNA του ποντικού. Πράγματι, έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι προηγουμένως θετικά δείγματα μπορεί να οφείλεται σε μόλυνση [16], [17], [18]. Η μόλυνση είναι ένα θέμα που συζητήθηκε ευρέως στην XMRV βιβλιογραφία [13]. Οι ερευνητές χρησιμοποιούν εξαιρετικά ευαίσθητες τεχνικές νουκλεϊκών οξέων για την ανίχνευση παθογόνων σε δείγματα ασθενών θα πρέπει να είναι δύσπιστοι όσον αφορά παρερμηνεύουν προφανή θετικά αποτελέσματα [19]. Στην περίπτωση των XMRV, αρκετές μέθοδοι επιμόλυνσης είναι δυνατές. Αλληλουχίας προϊόντων PCR είναι απαραίτητη, μαζί με τον έλεγχο για την παρουσία του μυϊκού DNA που θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε προϊόντα PCR λόγω του υψηλού επιπέδου των ενδογενών ρετροϊών. Ωστόσο, ιδιαίτερα σχετικές ενδογενείς αλληλουχίες ή μολυσματικό πλασμίδιο DNA δεν μπορεί να επισημανθεί με τη μέθοδο αυτή. Ειδικά PCR δοκιμασίες έχουν σχεδιαστεί για την ανίχνευση αυτών προσμείξεις πρέπει να χρησιμοποιούνται [20]. Viral ρυπαντές ή μόλυνση με μολυσμένα ανθρώπινα κύτταρα στο εργαστήριο προέρχονται είναι αδύνατον να διαφοροποιηθούν από

καλόπιστους

ανθρώπινη μόλυνση. Ο μόνος τρόπος για να επιβεβαιώσει ένα φαινομενικά θετικό αποτέλεσμα είναι από ανεξάρτητα την αναπαραγωγή τους, γι ‘αυτό είναι σημαντικό για αρκετές ομάδες να διεξάγουν τις δικές τους μελέτες. Ενώ αυτό το χειρόγραφο ήταν στο πλαίσιο της προετοιμασίας δύο βασικά έγγραφα επικαλούμενη την ανίχνευση των XMRV σε δείγματα σύνδρομο χρόνιας κόπωσης των ασθενών είχαν ανασυρθεί υπό το πρίσμα των αποδεικτικών στοιχείων όσον αφορά τη ρύπανση [21], [22], [23], [24].

Αξιοποιήσαμε επίσης αναλύσεις PCR για τη διαλογή δειγμάτων μας ασθενή για τρεις παθογόνων στο παρελθόν συνδεθεί με τον υπολογιστή. Χρησιμοποιήσαμε δημοσιεύονται εκκινητών που αναφέρθηκαν για την ανίχνευση BKV σε δείγματα PC [25], και δύο εμπορικά κιτ να ψάξουν για την τηλεόραση και τον HPV. Το κιτ τηλεόραση είναι σχεδιασμένη να έχει την ευρύτερη δυνατή προφίλ ανίχνευση ενώ παραμένει ειδικά για το γονιδίωμα τηλεόραση. Η δοκιμασία HPV έχει ήδη χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση δείγματα τραχηλικού ιστού και μπορεί να εντοπίσει 28 τύποι του ιού HPV, συμπεριλαμβανομένων όλων των σήμερα γνωστών υψηλού κινδύνου και την πιθανή γονότυπων υψηλού κινδύνου, καθώς και μια σειρά από είδη χαμηλού κινδύνου. Εάν μια ένωση βρέθηκε με PC και οποιοδήποτε από αυτά τα παθογόνα τότε αυτές οι δοκιμασίες θα παρέχουν ένα ταχύ, απλό τρόπο για τη διαλογή των ασθενών και τον εντοπισμό εκείνων για τους οποίους θεραπείες αντι-παθογόνο μπορεί να είναι ευεργετική. Όλες οι δοκιμασίες επικυρωθεί με τη χρήση θετικών μαρτύρων (Σχήμα 4Α, Γ και Δ) και την ποιότητα του DNA από δείγματα PC εκτιμήθηκε με ενίσχυση των ανθρώπινων γονιδίων (Σχήματα 2 και 5, Πίνακες 1 και S1). Ωστόσο, κανένα από τα δείγματα βρέθηκαν θετικά για ΒΚΥ ή τηλεόραση και μόνο ένα δείγμα βρέθηκε θετικό για τον HPV (τύπος 16). Αυτό υποδηλώνει ότι αυτά τα παθογόνα δεν είναι κοινή σε PC ιστό και ως εκ τούτου θεραπεία για λοιμώξεις είναι απίθανο να βοηθήσει τους ασθενείς σε γενικές γραμμές.

Παρά το γεγονός ότι ένα αρνητικό αποτέλεσμα είναι δύσκολο να αποδειχθεί με βεβαιότητα, θα υποστηρίζαμε ότι τα δείγματα DNA μας ήταν επαρκή ποιότητα για την ενίσχυση ανθρώπινων γονιδίων ελέγχου και ότι η ενίσχυση του εσωτερικού ελέγχου έδειξε ότι η διαδικασία εκχύλισης δεν αναστέλλει PCR. Είναι πιθανό ότι η διαδικασία της φορμαλίνη στερέωσης και εμβάπτιση σε παραφίνη οδήγησε σε κατακερματισμό του DNA. Αν συνέβαινε αυτό, τότε η

hgapdh

ελέγχου θα μπορούσε να επιβεβαιώσει μόνο την πιθανή ανίχνευση αμπλικονίων μικρότερη από 225 bp (HPV και τηλεόραση). Ωστόσο, εάν ο επιπολασμός της XMRV ή BKV ήταν υψηλές, κάποιος θα εξακολουθεί να αναμένει να ανιχνεύσει τις ιικές αλληλουχίες σε μερικά από τα δείγματα, παρά τυχαίες κατακερματισμό. Επιπλέον, οι XMRV, ΒΚν και τηλεόραση δοκιμασίες ήταν ικανή ανίχνευσης ένα-προς-δέκα ισοδύναμα γονιδιώματος υπονοώντας τις δοκιμασίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν υπερβολικά ευαίσθητο. Αυτά τα όρια ανίχνευσης παρατηρήθηκαν αξιόπιστα στις επανειλημμένες προσπάθειες. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν τα συμπεράσματα της Sfanos

et al.

που εξέτασε την επίπτωση αυτών των παραγόντων στο υλικό του υπολογιστή, ως μέρος μιας ευρύτερης μελέτης επικεντρώθηκε στον εντοπισμό της βακτηριακής μόλυνσης του προστάτη [26]. Αυτοί οι συγγραφείς ήταν επίσης σε θέση να ανιχνεύσουν οποιοδήποτε από αυτά τα παθογόνα σε ασθενείς με PC εξαίρεση ένα θετικό αποτέλεσμα BKV.

μελέτες που βρήκαν DNA του παθογόνου σε ιστό προστάτη μπορεί να αντανακλά τη μόλυνση του προστάτη με παθογόνα που συνδέονται με τα εγγύς ιστούς ή ακόμη και μη-ανθρώπινες πηγές. Η ιστορική σύνδεση του PC με σεξουαλικώς μεταδιδόμενο νόσημα θα μπορούσε να αντανακλά αυξημένη φλεγμονή οφείλεται σε μόλυνση, αλλά δεν μπορούν να απαιτούν μόλυνση με ένα συγκεκριμένο παθογόνο. Εναλλακτικά, αυτή η μελέτη δεν μπορεί να συμπεριλαμβάνεται το πιο σχετικό παθογόνο ή να είναι αρκετά μεγάλη για να αποκαλύψει την μικρή συνεισφορά καθενός από τους παράγοντες της έρευνας. Μια γενικά μειωμένη έκθεση σε σεξουαλικά μεταδιδόμενες λοιμώξεις τα τελευταία χρόνια, σε συνδυασμό με τις σχετικά μικρές ποσότητες στη μελέτη μας, μπορεί να αποκλείει τον εντοπισμό των μολυσμένων ατόμων. Ωστόσο, η ομάδα εξέτασε είναι μια ομάδα καλά χαρακτηρισμένων ασθενείς με σοβαρή νόσο και εάν οποιαδήποτε από τις ανωτέρω λοιμώξεις συνδέθηκαν στενά με υπολογιστή, και ως εκ τούτου κλινικά σχετική, θα περίμενε κανείς να τα έχουν ανιχνευθεί σε αυτή τη μελέτη. Ως εκ τούτου, καταλήγω στο συμπέρασμα ότι XMRV, BKV, τηλεόραση και HPV δεν είναι διαδεδομένη σε αυτόν τον υπολογιστή ομάδα και δείχνουν ότι η εναλλακτική αιτιολογία να θεωρηθεί για το PC.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

τα δείγματα ασθενών συλλέχθηκαν μέσω της προτροπής της μελέτης με τους κανόνες δεοντολογίας έγκριση από τον Trent Πολυκεντρική Επιτροπής Ερευνών Ηθικής και με τεκμηριωμένη, έγγραφη συγκατάθεση.

πλασμίδια

HG1 είναι ανίκανη παράγωγο αναπαραγωγή του ροϋΝΑ3. 1 /VP62 με διαγραφές στο σήμα περιοχή προαγωγού και συσκευασίας [27]. pLTR-LacZ είναι ένα MLV που βασίζεται ρετροϊικό φορέα που κωδικοποιεί β-γαλακτοσιδάση [27]. Το πλασμίδιο pBR322-Dunlop (ATCC # 45025) ελήφθη από Mike Imperiale (Ann Arbor) και έχει περιγραφεί στο παρελθόν [28].

συλλογή και την επεξεργασία των δειγμάτων

Τα δείγματα ορού από τέσσερις ομάδες ασθενείς αναλύθηκαν: 30 χαμηλή έλεγχοι PSA, 32 υψηλό PSA αλλά αρνητική βιοψία μάρτυρες και 84 ασθενείς PC. DNA απομονώθηκε από 100 εμπεδωθεί με παραφίνη φέτες PC σταθεροποιημένο με φορμαλίνη χρησιμοποιώντας την QIAamp DNA FFPE Kit Tissue (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, εκτός από τα δείγματα επωάστηκαν σε ρυθμιστικό λύσης για όλη τη νύχτα για να εξασφαλιστεί η πλήρης λύση. DNA εκλούστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης 50 μΙ και η συγκέντρωση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop.

Ανίχνευση αντισωμάτων εξουδετέρωσης XMRV σε

ορού

δοκιμασίες εξουδετέρωσης χρησιμοποιώντας XMRV έχουν περιγραφεί προηγουμένως [11]. Τα μονοκλωνικά αντισώματα 83A25 ‘και 603 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι αντίστοιχα, και τα κύτταρα παρακολουθήθηκαν για βιωσιμότητα με οπτική επιθεώρηση κατά το χρόνο της συγκομιδής.

PCR

Sequences όλων των εναρκτήρων έχουν προηγουμένως περιγράφονται ως πράξεις και δίνονται στον πίνακα 2. Ενιαία γύρο PCR ανίχνευση

hgapdh

και ένθετη PCR για XMRV

gag

πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο [2] με τη χρήση εκκινητών hGAPDH-66F και hGAPDH -291R και gag-ΤΗΣ, GAG-OR, GAG-IF και GAG-IR. ΙΑΡ DNA μόνο γύρο PCR διεξήχθησαν περιγράφεται στο [12] και την ανίχνευση των BKV διεξήχθη με ένθετη PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25] με τη χρήση εκκινητών BKV

για, BKV

rev, BKVnes

για και BKVnes

rev. Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας, 10 φορές διαδοχικές αραιώσεις από 1 έως 10

6 μόρια του pcDNA3.1 /VP62 για XMRV, C56BL /6 ή

Mus spretus

DNA για ΙΑΡ ή pBR322-Dunlop για BKV, ήταν δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας τα παραπάνω PCRs. Τα προϊόντα όλων των μόνο γύρο /ένθετων PCRs αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής. Για την ανίχνευση του

Trichomonas vaginalis

, δείγματα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας την ποσοτικοποίηση των Trichomonas vaginalis Σύνθετη Kit (PrimerDesign Ltd) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με τη χρήση του βασικού μείγματος Mini ακριβείας Low-Rox (PrimerDesign) και το ΑΒΙ 7500 Σε πραγματικό Σύστημα PCR χρόνο (Applied Biosystems). Οι εσωτερικοί έλεγχοι εκχύλιση του DNA χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις μεθόδους ανίχνευσης παράλληλα με μια θετική καμπύλη πρότυπο ελέγχου και αρνητικοί έλεγχοι κατάλληλες για κάθε προσδιορισμό. Η ενίσχυση του HPV DNA για την πληκτρολόγηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το INNO-LiPA HPV γονοτυπική Extra κιτ Amp σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δακτυλογράφηση στη συνέχεια διεξάγεται χρησιμοποιώντας το INNO-LiPA HPV του γονότυπου επιπλέον σετ σε ένα όργανο

Auto

-LiPA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (όλα Innogenetics).

Η

ανάλυση αμπλικονίου

τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν στον φορέα pSMART® HCKan χρησιμοποιώντας το CloneSmart HCKan Blunt Cloning Kit (Lucigen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το συνδεδεμένο pSMART φορείς αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητές φαίνονται στον Πίνακα 2. Οι αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν με την κατάλληλη περιοχή του

gag

σε αλληλουχίες XMRV διαθέσιμη στις PubMed και σχετικές αλληλουχίες MLV χρησιμοποιώντας MegAlign (DNASTAR LaserGene 8). Οι αλληλουχίες έχουν κατατεθεί στην GenBank (JQ048948-JQ048955). Περαιτέρω λεπτομέρειες των αλληλουχιών και αριθμούς αναζητήσεως δίδονται στην λεζάντα σχήματος. επιλογή μοντέλου για φυλογενετική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Modelgenerator v8.5 [29] και Μπεϋζιανή φυλογενέσεων είχαν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας το γενικό χρόνο αναστρέψιμη μοντέλο υποκατάστασης νουκλεοτιδίων και γάμμα-κατανεμημένο ετερογένεια ποσοστό χρησιμοποιώντας τα MrBayes προγράμματος [30]. Ο αλγόριθμος MCMC είχε τρέξει για 4.000.000 γενιές, δειγματοληψία τα δέντρα κάθε 100 γενιές. τιμές ΕΣΣ υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας Tracer (https://beast.bio.ed.ac.uk/Tracer). Η συναίνεση δέντρο με μήκη υποκατάστημα και τις αξίες υποστήριξη οπίσθια πιθανότητα για τους εσωτερικούς κόμβους οπτικοποιήθηκε σε Figtree (https://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree), ριζοβολία σε MoMLV ως εξω και να επεξεργαστείτε χρησιμοποιώντας το Adobe Illustrator .

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

φυλογενετική ανάλυση των

gag

αμπλικόνια ακολουθία. Αμπλικόνια από

gag

ένθετη PCR (Εικόνα 2) κλωνοποιήθηκαν, αλληλουχήθηκαν και συγκρίθηκαν προς την ίδια περιοχή από γνωστές XMRV και αλληλουχίες MLV. Ταυτόσημες αλληλουχίες στο αρχικό πάνελ απομακρύνθηκαν από το φυλογενετική ανάλυση για την πρόληψη προκατάληψη. αριθμοί πρόσβασης είναι οι εξής: PreXMRV1 (προγονική ακολουθία Πιθανόν XMRV, NC_007815.2), ποντικού τύπου C ρετροϊό (X94150), ÅKV (ενδογενής οικοτροπικά MLV, J01998), ΓΔ-75 (xenoptropic παραλλαγή Moloney MLV, AF221065), ποντικού AIDS ιός (S80082), 22Rv1 (XMRV προέρχεται από 22Rv1 κύτταρα, FN692043.2), VP62 (αρχική XMRV απομονώσει από έναν ασθενή PC, DQ399707). αλληλουχίες Xmv, ΜΡΜν και PMV (πολυτροπικά ενδογενή MLV xenoptropic, τροποποιημένο πολυτροπικά και) ελήφθησαν από Jern

et al. PLoS Genet

, 2007. FB579966 και FJ907198 αναφέρονται απομονώνει από έναν ασθενή και τα κύτταρα 22Rv1 αντίστοιχα. Bayesian φυλογενέσεων είχαν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας το γενικό χρόνο αναστρέψιμη μοντέλο υποκατάστασης νουκλεοτιδίων και γάμμα-κατανεμημένο ετερογένεια ποσοστό χρησιμοποιώντας τα MrBayes προγράμματος. Ο αλγόριθμος MCMC είχε τρέξει για 4.000.000 γενιές για δύο ταυτόχρονες ανεξάρτητες αναλύσεις, δειγματοληψία τα δέντρα κάθε 100 γενιές. Στο τέλος της ανάλυσης PSRF = 1,000 και τυπική απόκλιση = 0. τιμές ESS ήταν 899 και 959 για τις δύο αναλύσεις (προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας Tracer v1.5). Η συναίνεση δέντρο εμφανίζεται με μήκη υποκατάστημα και τις αξίες υποστήριξη οπίσθια πιθανότητα για τους εσωτερικούς κόμβους οπτικοποιούνται σε Figtree V1.3.1, ριζοβολία για Moloney MLV ως εξω. Οι αλληλουχία αμπλικόνια εμφανίζεται σε μπλε χρώμα. Αυτές οι αλληλουχίες έχουν κατατεθεί στην GenBank (JQ048948-JQ048955). Η αρχικά περιγραφείσα αλληλουχία XMRV, VP62, εμφανίζεται με κόκκινο χρώμα. αξίες υποστήριξης, και ως εκ τούτου, η εμπιστοσύνη, περιορίζεται από την έλλειψη της απόκλισης στο

gag

, όμως η ομαδοποίηση των αμπλικονίων με ενδογενείς ρετροϊικές ακολουθίες είναι υποστηρικτική της σύνταξής τους που προέρχονται από μολυσματικά ποντικού DNA

doi:. 10.1371 /περιοδικό. pone.0034221.s001

(ΔΕΘ)

πίνακα S1. .

Πλήρη αποτελέσματα ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων

doi: 10.1371 /journal.pone.0034221.s002

(DOC)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Γιώργος Κασσιώτης για την παροχή C56BL /6 και

Mus spretus

DNA, Mike Imperiale για pBR322-Dunlop, Ασίφ Tamuri για βοήθεια σχετικά με την ερμηνεία του φυλογενετικές αναλύσεις και John Doorbar για τις χρήσιμες συζητήσεις. Οι απόψεις και οι γνώμες που εκφράζονται εκεί είναι αυτές των συγγραφέων και δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα εκείνες του Υπουργείου Υγείας.