Αφηρημένο

Ο μετασχηματισμός του αυξητικού παράγοντα-SS1 ( ΤΟΡ-β1) είναι μια πολυλειτουργική κυτοκίνη που εμπλέκεται σε διάφορες παθοφυσιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της εξέλιξης του καρκίνου και των ινωτικών διαταραχών. Εδώ, δείχνουμε ότι η αγωγή με ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) που προκαλείται από προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2), που οδηγεί σε μειωμένη σύνθεση της προσταγλανδίνης Ε2 (PGE2), σε ανθρώπινα κύτταρα πνεύμονα Α549 καρκίνος. Η επεξεργασία των κυττάρων με ειδικούς αναστολείς της COX-2 ή του υποδοχέα PGE2 σαν αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης, υποδεικνύοντας ότι η COX-2 /PGE2 μονοπάτι συμβάλλει σε πολλαπλασιασμό με αυτοκρινή τρόπο. θεραπεία ΤΟΡ-β1 επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης, η οποία εξασθενεί με εξωγενή PGE2. ΤΟΡ-β1 είναι επίσης ένας ισχυρός επαγωγέας της επιθηλιακής μεσεγχυματικής μετάβασης (ΕΜΤ), μια αλλαγή του φαινοτύπου στην οποία επιθηλιακά κύτταρα διαφοροποιούνται σε ινοβλαστοειδή κύτταρα. Η συμπλήρωση με PGE2 ή PGE2 υποδοχέα ΕΡ4 αγωνιστής PGE1-αλκοόλης, σε σύγκριση με ΕΡ1 /3 sulprostone αγωνιστή, ανέστειλε ΤΟΡ-β1-επαγόμενη έκφραση της ινονεκτίνης και του κολλαγόνου Ι (συστατικά εξωκυττάριας μήτρας). Εξωγενές PGE2 ή αγωνιστές υποδοχέα PGE2 κατέστειλε επίσης την αναδιαμόρφωση ακτίνη επάγονται από ΤΟΡ-β1. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η PGE2 έχει μια αντι-ινωτική δράση. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ο ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μειορύθμιση της COX-2 /PGE2 σηματοδότηση εμπλέκεται στην διευκόλυνση της ινωτικής απόκρισης ΕΜΤ σε κύτταρα Α549

Παράθεση:. Takai Ε, Tsukimoto Μ, Kojima S (2013) TGF-β1 ρυθμίζει προς τα κάτω COX-2 Έκφραση οδηγεί σε μείωση της τάξης του PGE2 σε ανθρώπινα καρκίνο του πνεύμονα Α549 κύτταρα, η οποία εμπλέκεται στην Ινωτικές απάντηση σε TGF-β1. PLoS ONE 8 (10): e76346. doi: 10.1371 /journal.pone.0076346

Επιμέλεια: Ruby John Άντο, Rajiv Gandhi Κέντρο Βιοτεχνολογίας, Ινδία

Ελήφθη: May 23, 2013? Αποδεκτές: 23 Αύγ. 2013? Δημοσιεύθηκε: 2, Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Takai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο μετασχηματισμός του αυξητικού παράγοντα-SS1 (TGF-β1) αρχικά ανακαλύφθηκε ως μία εκκρινόμενη πρωτεΐνη που επάγει μετασχηματισμό και την ανάπτυξη των φυσιολογικών ινοβλαστών [1], και έχει πλέον καθιερωθεί να συμμετέχουν σε διάφορες ινωτικές διαταραχές, όπως η πνευμονική ίνωση και ηπατική [2-4]. Πράγματι, ο ΤΟΡ-β1 είναι μια πολυλειτουργική κυτοκίνη που ρυθμίζει διάφορες φυσιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης και ογκογένεση. Είναι εκκρίνεται εντός μικροπεριβάλλοντα όγκου από πολλά καρκινικά κύτταρα και δρα ως προαγωγός όγκων με διέγερση της αγγειογένεσης, ανοσο-διαφυγής και μετάσταση [5-7]. Πνευμονική ίνωση, όπως η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση (IPF), είναι καλά γνωστό ότι σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα. Από την άλλη πλευρά, έχει επίσης προταθεί ότι η ίνωση των πνευμόνων του όγκου είναι ένα δευτερεύον φαινόμενο και όχι ένας πρόδρομος του καρκίνου, και καταδείχθηκε ότι ο βαθμός της ίνωσης συσχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου και την πρόγνωση [8,9]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί της ανάπτυξης ίνωσης σε πνεύμονα όγκου δεν είναι καλά κατανοητοί.

σε επιθηλιακά κύτταρα, ΤΟΡ-β1 επάγει μια αλλαγή του φαινοτύπου που ονομάζεται επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), η οποία είναι η διαδικασία μέσω της οποίας τα επιθηλιακά κύτταρα διαφοροποιούνται σε ινοβλάστες όπως μεσεγχυματικών κυττάρων. EMT είναι μια φυσιολογική διαδικασία απαραίτητη για τη σωστή εμβρυογένεσης και μορφογένεση των ιστών. Από την άλλη πλευρά, ΕΜΤ εμπλέκεται επίσης στην αποκατάσταση τραύματος και τον καρκίνο εξέλιξης σε ιστούς ενηλίκων [10,11]. Αν και μια συμβολή από ΕΜΤ-προερχόμενο ινοβλάστες σαν κύτταρα σε ίνωση έχει προταθεί [12,13], οι μηχανισμοί σηματοδότησης που διέπουν TGF-β1 που προκαλείται βιολογικά γεγονότα στα καρκινικά κύτταρα δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

κυκλοοξυγενάσης (COX ) είναι το περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο στη σύνθεση προστανοειδών. Ενώ COX-1 εκφράζεται, COX-2 επάγεται, και είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε φλεγμονή. Η έκφραση της COX-2 είναι αυξημένη σε πολλούς ιστούς όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [14,15]. Η προσταγλανδίνη Ε2 (PGE2), η οποία είναι το κυρίαρχο προσταγλανδίνης, ασκεί τις βιολογικές δράσεις του μέσω G υποδοχέων που συζευγνύονται με πρωτεΐνη (δηλαδή, ΕΡ1-ΕΡ4) [16]. Έχει αναφερθεί ότι η PGE2 εμπλέκεται στην ανάπτυξη του όγκου, ανοσοκαταστολή, ή αγγειογένεση [17-20]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι η COX-2 υπερεκφράζεται σε πολλούς καρκίνους του πνεύμονα, και PGE2 εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό, την αντοχή σε απόπτωση και επαγωγή των Τ-ρυθμιστικών κυττάρων [21-24]. Σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), υπερέκφραση ή ενεργοποίηση μετάλλαξη του υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), οδηγεί σε ανώμαλο πολλαπλασιασμό ή μετανάστευση. Ως εκ τούτου, EGFR έχει καθιερωθεί ως μοριακού δείκτη του NSCLC, και χρησιμοποιείται ευρέως για την πρόβλεψη της πρόγνωσης ή για την επιλογή της θεραπείας. COX-2, καθώς επίσης και EGFR, είναι μια πιθανή μοριακό δείκτη του NSCLC [14].

Έχουμε αναφέρει πρόσφατα ότι η θεραπεία των ανθρώπινων κυττάρων Α549 NSCLC με ΤΟΡ-β1 επάγει EMT που οδηγεί σε αύξηση της κυτταρικής μετανάστευσης [ ,,,0],25]. Στην παρούσα μελέτη, για να αποκαλύψει τον μηχανισμό του ΤΟΡ-β1 που προκαλείται από την πρόοδο του καρκίνου του πνεύμονα, διερευνήσαμε την επίδραση του ΤΟΡ-β1 επί της έκφρασης του COX-2 σε κύτταρα Α549. Προηγουμένως, έχει αναφερθεί ότι ο ΤΟΡ-β1 επάγει έκφραση COX-2 κατά τη διάρκεια EMT σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού [26]. Αντίθετα με την περίπτωση σε επιθηλιακά κύτταρα θηλαστικού, βρήκαμε για πρώτη φορά ότι ο ΤΟΡ-β1 ρυθμίζει προς τα κάτω την COX-2 σε ανθρώπινα κύτταρα Α549 NSCLC. Δείχνουμε εδώ ότι αυτή η δράση σχετίζεται με την αναστολή της ανάπτυξης και η διευκόλυνση των ινωτικών απόκριση EMT, γεγονός που υποδηλώνει ότι η COX-2 /PGE2 σηματοδότηση είναι σημαντική για τον έλεγχο των κυτταρικών διαδικασιών σε κύτταρα Α549.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

DMEM, ανθρώπινη ανασυνδυασμένη TGF-β1, SB431542, κυκλοεξιμίδιο και μεθυλο οξικού αγοράστηκαν από την Wako Pure Chemical (Osaka, Japan). FBS αγοράστηκε από Biowest (Nuaillé, France). AH6809, L798106, L161982, sulprostone, butaprost και PGE1 αλκοόλ αγοράστηκαν από την Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Η προσταγλανδίνη Ε2, ακτινομυκίνη D και αντίσωμα αντι-Ν-καντερίνης αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Ειδικός αναστολέας της Smad3 (SIS3) και NS-398 αγοράστηκαν από την Merck (Darmstadt, Γερμανία). Ροδαμίνη phalloidin αγοράστηκε από Cytoskeleton, Inc. (Denver, CO, USA). αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό αντι-COX-2 αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, ΜΑ, USA). Πολυκλωνικός αντι-υψηλής κινητικότητας ομάδα στη θέση 1 (HMGB1) αντίσωμα αγοράστηκε από Abcam (Cambridge, UK). Πολυκλωνικός αντι-COX-1 αντίσωμα και μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Mouse μονοκλωνικό αντι-Ε-καδερίνης αντίσωμα (Κλώνος 36B5) αγοράστηκε από Thermo, Fisher Scientific (Waltham, ΜΑ, USA). Mouse μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-φιβρονεκτίνης αγοράστηκε από την BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA).

Κυτταροκαλλιέργεια

κύτταρα αδενοκαρκινώματος Α549 ανθρώπινα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλλίνη (100 μονάδες /ml) και στρεπτομυκίνη (100 mg /mL) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα στους 37 ° C.

ανοσοαποτύπωσης

τα κύτταρα λύθηκαν σε PBS που περιείχε 10 mM HEPES-NaOH, ρΗ 7,4, 1% Triton Χ100, 5 mM EDTA, 30 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 50 mM φθοριούχο νάτριο, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 1,04 mM 4- (2-αμινοαιθυλο) βενζολοσουλφονυλο φθορίδιο, 0.8 μΜ απροτινίνης, 21 μΜ leupeptin, 36 μΜ βεστατίνης, 15 μΜ πεπστατίνη Α και 14 μΜ Ε-64, στους 4 ° C για 30 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στα 10.000 χ g για 15 λεπτά. Μετά την απομάκρυνση των κυτταρικών συντριμμάτων, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Δοκιμασίας Πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Ίσες ποσότητες υλικού λύσεως πρωτεΐνης διαλύθηκαν σε 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος (50% γλυκερίνη, 2% SDS, 125 mM Tris, 10 mM DTT) και έβρασε για 10 λεπτά. Κλάσματα των δειγμάτων που περιέχουν 6 μα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με την βοήθεια 7,5-15% SDS-PAGE και οι ζώνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Τα στυπώματα φράχθηκαν για μία νύχτα σε TBST με 1% BSA, 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε 4 ° C, μετά επωάζονται με κουνελιού αντίσωμα COX-2 (1: 1000), κουνέλι COX-1 αντίσωμα (1: 1000), αντίσωμα HMGB1 κουνελιού ( 1: 1000), αντίσωμα ποντικού ακτίνη (1: 1000), αντίσωμα ποντικού Ε-καδερίνης (1: 1000), αντίσωμα ποντικού Ν-καδερίνης (1: 1000) ή αντίσωμα ινονεκτίνης ποντικού (1: 1000) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Αφού πλυθεί με TBST, τα στυπώματα επωάστηκαν με κατσικίσιο IgG αντίσωμα αντι-κουνελιού συζευγμένο με HRP (Cell Signaling Technology, Inc.) ή γίδινο αντι-ποντικού IgG αντίσωμα-HRP (Santa Cruz Biotechnology) για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κηλίδες πλένονται και πάλι με TBST, και ειδικές πρωτεΐνες έγιναν ορατές με τη χρήση αντιδραστηρίων κηλίδωση ανίχνευσης ECL Western (GE Healthcare) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εντάσεις μπάντα ποσοτικά με πυκνομετρική ανάλυση χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health).

PGE2 ΕΠΕ

παραγωγή PGE2 από τα κύτταρα προσδιορίστηκε με ένα ένζυμο ανοσοδοκιμασία (ΕΙΑ) κιτ (Cayman Chemical) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, PGE2-ακετυλοχολινεστεράσης συζυγούς, μονοκλωνικό ποντικού αντι-ΡΟΕ2 αντίσωμα, και είτε το πρότυπο ή το δείγμα προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο ενός ΕΙΑ πλάκα επικαλυμμένη με κατσίκα πολυκλωνικό αντι-ποντικού IgG. Μετά από επώαση για 18 ώρες στους 4 ° C, η πλάκα πλύθηκε πέντε φορές να απομακρυνθούν όλα τα μη δεσμευμένου αντιδραστηρίων. αντιδραστήριο Ellman προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε φρεάτιο, και η πλάκα αναπτύχθηκε αναγνώσθηκε στα 405 nm με ένα μετρητή multilabel WALLAC ARVO SX (PerkinElmer, Inc., Waltham, ΜΑ, USA).

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα Α549 χρησιμοποιώντας ένα Fast κιτ Καθαρό RNA (Takara Bio). Το cDNA πρώτου κλώνου συντέθηκε από ολικό RNA με PrimeScript ανάστροφης μεταγραφάσης (Takara Bio). Το cDNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για την ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR: αντιδράσεις διεξήχθησαν σε ένα Stratagene Mx3000P

® σύστημα QPCR (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA). Οι αλληλουχίες των ειδικών εκκινητών για την ανθρώπινη COX-2 ήταν 5′-GAGAAAACTGCTCAACACCGGA-3 ‘(νοηματικό) και 5′-CACAACGTTCCAAAATCCCTTG-3′ (antisense), εκείνες που προορίζονται για ανθρώπινη COL1A1 ήταν 5’-CACACGTCTCGGTCATGGTA-3 ‘(νοηματικό) και 5 ‘- AAGAGGAAGGCCAAGTCGAG-3’ (antisense). αφυδρογονάση αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (GAPDH) πιΚΝΑ προσδιορίστηκε ως θετικός έλεγχος. Κάθε δείγμα αναλύθηκε σε ένα μίγμα αντίδρασης ενισχύσεως που περιέχει 20 μι cDNA, εκκινητές (5 μΜ εκάστου των με νόημα και αντινόημα εναρκτήρες) και 2x ΚΑΠΑ SYBR

® FAST qPCR Master Mix (ΚΑΠΑ Biosystems, Woburn, ΜΑ, USA). Το πρόγραμμα ενίσχυσης περιελάμβανε 40 κύκλους των 95 ° C για 3 sec και 60 ° C για 30 sec. Φθορισμού προϊόντα ανιχνεύθηκαν στο τελευταίο βήμα του κάθε κύκλου. Οι τιμές που ελήφθησαν ήταν εντός της γραμμικής περιοχής της πρότυπης καμπύλης και ομαλοποιήθηκαν με την έκφραση GAPDH mRNA.

κυτταρικού κύκλου ανάλυσης

Η κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με ιωδιούχο προπίδιο χρώση (PI). Α549 κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 70% αιθανόλη για 60 λεπτά σε πάγο. RNA απομακρύνθηκε με επεξεργασία με RNase Α (0.34 mg /mL), στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με 50 mg /mL του ΡΙ για 30 λεπτά επί πάγου. Βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), και αξιολογήθηκαν δέκα χιλιάδες κύτταρα. Το προφίλ του DNA έδειξε την σχετική αφθονία του κυτταρικού πληθυσμού σε G0 /G1, S και G2 /M φάσεις. Τα ποσοστά των κυττάρων σε κάθε φάση του κύκλου του κυττάρου προσδιορίστηκαν με στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cell Quest (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού

προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων ήταν διεξάγεται χρησιμοποιώντας την βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) (χρωματομετρική) τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ELISA (Roche, Mannheim, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα Α549 σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή αντιδραστήρια σε τελικό όγκο 100 μι /φρεάτιο. Ακολούθως, 10 μι διαλύματος σήμανσης BrdU προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και η επώαση συνεχίστηκε για 2 ώρες. Μετά την απομάκρυνση του διαλύματος σήμανσης BrdU, τα κύτταρα ξηραίνονται και επωάστηκαν με διάλυμα FixDenat του κιτ για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την μετουσίωση του DNA, τα δείγματα επωάστηκαν με αντι-Βτάυ αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση για 90 λεπτά. Χωρίς περιορισμούς αντισώματα ξεπλένονται και προστέθηκαν 100 μι του υποστρώματος φωταύγειας. Η φωταύγεια ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν μετρητή multilabel WALLAC ARVO SX.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναλύθηκε επίσης με μέτρηση των κυττάρων. Κύτταρα Α549 εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β1 και PGE2. Μετά την επώαση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα TC10

TM αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρων (Bio-Rad Laboratories).

φθορισμού απεικόνισης

Για τη χρώση ακτίνης F, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4 % παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 για 5 λεπτά σε πάγο. Σταθερή κύτταρα επωάστηκαν με 100 ηΜ ροδαμίνη phalloidin για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αντιχρωματισμός με Hoechst 33258 (10 μg /mL) χρησιμοποιήθηκε για την επιβεβαίωση της θέσης και της ακεραιότητας των πυρήνων. Βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο σάρωσης ομοεστιακό λέιζερ (TCS SP2? Leica, Mannheim, Germany) εξοπλισμένο με ένα HCX PLApo 63 x 1,32 NA έλαιο αντικειμενικό φακό. Leica ομοεστιακό λογισμικού (TCS SP2, έκδοση 2.6.1) χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση και επεξεργασία εικόνας.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Η μετανάστευση των κυττάρων αναλύθηκε με τη χρήση 24-φρεατίων φρεατίων (διαμέτρου 6,5 χιλιοστών ? μέγεθος πόρων 8 μm πολυανθρακικής μεμβράνης, Corning, Lowell, MA, USA). Το ανώτερο διαμέρισμα σπάρθηκε με κύτταρα Α549 (2 χ 10

4 κύτταρα) σε βασικό μέσο καλλιέργειας. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει ΤΟΡ-β1. Ο άνω θάλαμος περιείχε 5% FBS, αντί του 10%. Μετά την επώαση για περαιτέρω 24 ώρες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και επωάστηκαν με 50 μg /mL της PI για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μη μεταναστεύσαντα κύτταρα επί της άνω επιφάνειας της μεμβράνης απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει μέσω της μεμβράνης στην κατώτερη επιφάνεια μετρήθηκαν με τη χρήση ενός μικροσκοπίου φθορισμού (ΒΖ-9000? KEYENCE).

Στατιστικά

οι

αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση ± SE. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ ελέγχου και άλλες ομάδες υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τεστ Dunnett ή ζευγαρωμένο t τεστ με την Instat έκδοση 3.0 στατιστικό πακέτο (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Το κριτήριο της σημαντικότητας ορίστηκε στο P & lt? 0.05.

Αποτελέσματα

ΤΟΡ-β1 ρυθμίζει προς τα κάτω έκφραση COX-2 και την παραγωγή PGE2 σε κύτταρα Α549

Σε πολλούς τύπους καρκίνου, ΤΟΡ-β1 εκκρίνεται στο μικροπεριβάλλον του όγκου και δρα ως προαγωγός όγκων. Για να διερευνηθεί ΤΟΡ-β1 επαγόμενη εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονος ανθρώπου, εμείς διεγερμένα ανθρώπινα κύτταρα πνεύμονα Α549 καρκίνος με ΤΟΡ-β1. Η COX-2 ιδιοσυστατικά υπερεκφράζεται σε κύτταρα Α549 κάτω από πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων. Αναπάντεχα, βρήκαμε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης COX-2 ελαττώθηκε δραματικά με θεραπεία με 5 ng /mL του ΤΟΡ-β1 (Σχήμα 1Α). Η μείωση της πρωτεΐνης COX-2 σε 24 ώρες μετά τη διέγερση ήταν ΤΟΡ-β1 δοσοεξαρτώμενη (Εικόνα 1Β). Από την άλλη πλευρά, η έκφραση του COX-1 σε κύτταρα Α549 ήταν χαμηλή, και δεν άλλαξε με κατεργασία του ΤΟΡ-β1 (Σχήμα 1Α, Β). ΤΟΡ-β1 ενεργοποιεί ΤΟΡ-β σερίνης /θρεονίνης κινάσης των υποδοχέων. Μετά την δέσμευση συνδέτη, ο υποδοχέας ΤΟΡ-β τύπου Ι (TßRI) και τύπου II υποδοχέας (TßRII) σχηματίζουν ένα τετραμερή heterocomplex υποδοχέα που οδηγούν σε φωσφορυλίωση των Smad πρωτεϊνών, των κύριων κατάντη μόρια-τελεστές για αυτούς τους υποδοχείς, από τις δραστηριότητες της κινάσης της κυτταροπλασματικής τομέα της TßRI. Η θεραπεία με αναστολέα TßRI SB431542 ή Smad3 αναστολέα SIS3 [27] μπλοκαριστεί COX-2 προς τα κάτω ρύθμιση από τον TGF-β1 (Σχήμα 1C). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μειορύθμιση του COX-2 συνδέεται με την ενεργοποίηση του ΤΟΡ-β υποδοχείς και της οδού σηματοδότησης Smad.

(Α) Έκφραση πρωτεΐνης COX-2 ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωση όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Η θεραπεία με ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) κατέστειλε την έκφραση της COX-2 αλλά όχι ΟΟΧ-1 σε κύτταρα Α549. HMGB1 μετρήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης. (Β) Δόση εξαρτώμενη προς τα κάτω ρύθμιση του COX-2 από τον TGF-β1. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά τη διέγερση του ΤΟΡ-β1 (1-10 ng /mL), η έκφραση της COX-2 και COX-1 ανιχνεύθηκε. (C) SB431542 (10 μΜ) ή SIS3 (30 μΜ) μπλοκάρει ΤΟΡ-β1 επαγόμενη COX-2 ενεργότητας. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία επί 60 λεπτά με τον αναστολέα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με ή χωρίς TGF-β1 (5 ng /mL) για 24 ώρες. (D) ΤΟΡ-β1 κατέστειλε παραγωγή COX-2 σε κύτταρα Α549. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΟΡ-β1 (1-10 ng /ml) ή NS-398 (50 μΜ) για 24 ώρες, τότε η συγκέντρωση του PGE2 σε μέσο καλλιέργειας μετρήθηκε με ΕΙΑ όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SE (η = 4). Οι σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων που αναφέρονται και την ομάδα ελέγχου που υποδεικνύεται από ** (Ρ & lt? 0,01).

Η

Τα ένζυμα COX μετατροπή του αραχιδονικού οξέος σε προσταγλανδίνη Η2, η οποία υφίσταται περαιτέρω επεξεργασία σε διάφορες προσταγλανδίνες, συμπεριλαμβανομένης της PGE2 , η κυρίαρχη προσταγλανδίνης σε πνεύμονα [28,29]. Για την αξιολόγηση της παραγωγής PGE2 σε κύτταρα Α549, μετρήσαμε την εξωκυτταρική συγκέντρωση της PGE2 σε μέσο καλλιέργειας χρησιμοποιώντας ενζυμική ανοσοανάλυση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, εξωκυτταρική συγκέντρωση της PGE2 μειώθηκε κατόπιν θεραπείας με ΤΟΡ-β1 για 24 ώρες. Ένας εκλεκτικός αναστολέας της COX-2, NS-398, εξαλειφθεί πλήρως PGE2 από το μέσο καλλιέργειας, υποδεικνύοντας ότι η παραγωγή της PGE2 σε κύτταρα Α549 εξαρτάται κυρίως από την λειτουργία του COX-2. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η διέγερση TGF-β1 καταστέλλει έντονα την έκφραση της COX-2 και καταλήγει σε μία μείωση της παραγωγής PGE2 σε κύτταρα Α549.

Καταστολή της έκφρασης COX-2 από τον TGF-β1 διαμεσολαβείται από μεταγραφική καταστολή

επόμενο διερευνηθεί ο μηχανισμός του ΤΟΡ-β1 επαγόμενη COX-2 προς τα κάτω ρύθμιση σε κύτταρα Α549. έκφραση της πρωτεΐνης COX-2 θα μπορούσε να επηρεαστεί από την υποβάθμιση πρωτεΐνη, αλλοιωμένη σταθερότητα του mRNA και αλλαγμένη ρυθμό μεταγραφής. Χρησιμοποιώντας ανάλυση σε πραγματικό χρόνο RT-PCR, εξετάσαμε την έκφραση της COX-2 mRNA κατά την κατεργασία του ΤΟΡ-β1 από 0,5 έως 3 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, COX-2 mRNA μειώθηκε ταχέως, φθάνοντας περίπου το 50% του ελέγχου εντός 30 λεπτών μετά τη διέγερση. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η μείωση της πρωτεΐνης COX-2 μετά διέγερση TGF-β1 είναι κυρίως το αποτέλεσμα της μείωσης της COX-2 mRNA. Για να εξεταστεί κατά πόσο ο ΤΟΡ-β1 επηρεάζει COX-2 σταθερότητα του mRNA, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με το μεταγραφικό αναστολέα ακτινομυκίνη D πριν ΤΟΡ-β1 διέγερση. Στη συνέχεια, η COX-2 mRNA επίπεδο εξετάστηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα κύτταρα μάρτυρες που έλαβαν θεραπεία με ακτινομυκίνη D μόνη της έδειξε σημαντική μείωση στην COX-2 mRNA. Η θεραπεία με ΤΟΡ-β1 δεν επηρέασε COX-2 mRNA σταθερότητα, όπως η ταχύτητα αποικοδόμησης ήταν πανομοιότυπο με αυτό που παρατηρήθηκε σε κύτταρα μάρτυρες (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, εξετάσαμε COX-2 σταθερότητα πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας τη κυκλοεξιμίδιο αναστολέα πρωτεϊνικής σύνθεσης (CHX). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CHX ή CHX συν ΤΟΡ-β1, και στη συνέχεια, το επίπεδο της πρωτεΐνης COX-2 εξετάσθηκε με ανοσοστύπωμα. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, πρωτεΐνη COX-2 ήταν μειωμένη σε κύτταρα μάρτυρες που έλαβαν θεραπεία με CHX μόνο και ΤΟΡ-β1 δεν επηρέασε COX-2 πρωτεϊνική σταθερότητα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ο TGF-β1 δεν επηρεάζει COX-2 αποικοδόμηση πρωτεΐνης και mRNA σταθερότητα, αλλά μάλλον δρα στο μεταγραφικό επίπεδο.

(Α) Χρόνος δοσοεξαρτώμενη μείωση της έκφρασης COX-2 mRNA με επεξεργασία με ΤΟΡ -β1 (5 ng /mL). COX-2 mRNA επίπεδο μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ακτινομυκίνη D (5 μg /mL) για 1 ώρα και επωάστηκαν με ή χωρίς TGF-β1 (5 ng /mL) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. TGF-β1 δεν επηρέασε μείωση της COX-2 mRNA με ακτινομυκίνη COX-2 τα επίπεδα έκφρασης Δ κανονικοποιήθηκαν για επίπεδα έκφρασης GAPDH και εκφράζεται ως ποσοστό του ότι σε μη-κατεργασμένα κύτταρα (ελέγχου). Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SE (η = 3). (C) Τα κύτταρα επωάστηκαν με CHX (50 μg /mL) ή CHX συν ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και η έκφραση πρωτεΐνης COX-2 ανιχνεύθηκε με ανοσοκηλίδωση. TGF-β1 δεν επηρέασε μείωση πρωτεΐνης COX-2 με CHX. Οι εντάσεις ζωνών ποσοτικοποιήθηκαν και αξίες COX-2 /ακτίνης εκφράστηκαν ως σε σχέση με εκείνες του ελέγχου. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SE (η = 4).

Η

Η μειωτική ρύθμιση του COX-2 σχετίζεται με ΤΟΡ-β1 επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων Α549

Για να διευκρινιστεί η σημασία του ΤΟΡ-β1 επαγόμενη COX-2 μειορύθμιση, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε τι ρόλους παίξει COX-2 και PGE2 στις βιολογικές λειτουργίες των κυττάρων Α549. PGE2 ενεργοποιεί τους υποδοχείς του ΕΚ, οι οποίες ταξινομούνται σε 4 υποτύπους? Gq πρωτεΐνη-συζευγμένο ΕΡ1, Gi συζευγμένου με πρωτεΐνη ΕΡ3, Gs συζευγμένου με πρωτεΐνη ΕΡ2 και ΕΡ4. Αυτοί οι υποδοχείς ΕΡ έχουν ενοχοποιηθεί για τον πολλαπλασιασμό των διαφόρων καρκινικών κυττάρων [22,30-32]. Προτάθηκε επίσης ότι οι PGE2 και ΕΡ υποδοχείς που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC [33]. Εξετάσαμε την εμπλοκή του COX-2 /PGE2 στον κυτταρικό κύκλο των κυττάρων Α549. Η θεραπεία με COX-2 αναστολέα NS-398 για 3 ημέρες είχε ως αποτέλεσμα μείωση του S φάση και την αύξηση του G0 /G1 φάση (Σχήμα 3Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, ΕΡ1 /2 ανταγωνιστής AH6809, ΕΡ3 ανταγωνιστής L798106 ή ανταγωνιστής ΕΡ4 L161982 επίσης μείωσε σημαντικά την αναλογία των κυττάρων S φάσης. Εξετάσαμε περαιτέρω πολλαπλασιασμό των κυττάρων χρησιμοποιώντας δοκιμασία BrdU? ενσωμάτωση του BrdU δεικνύει τη σύνθεση του DNA κατά την διάρκεια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Η θεραπεία με αυτούς τους ανταγωνιστές ΕΡ καταστέλλεται ενσωμάτωσης BrdU σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 3C). Αναλύσαμε επίσης την έκφραση των υποδοχέων του ΕΚ σε κύτταρα Α549 με RT-PCR, και επιβεβαίωσε έκφραση όλων των υποτύπων υποδοχέα 4 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ιδιοσυστατική παραγωγή του PGE2, τουλάχιστον σε κάποιο βαθμό, συμβάλλει στην εξάπλωση των Α549 κυττάρων μέσω υποδοχέων ΕΡ υπό τυπικές συνθήκες καλλιέργειας.

(Α) κύτταρα Α549 επωάστηκαν με NS-398 (50 μΜ) για 3 ημέρες και του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Η θεραπεία με NS-398 μείωσε την αναλογία των κυττάρων S φάσης. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SE (η = 3). (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AH6809 (30 μΜ), L798106 (30 μΜ) ή L161982 (30 μΜ) για 3 ημέρες, στη συνέχεια ο κυτταρικός κύκλος αναλύθηκε και το ποσοστό της φάσης S υπολογίστηκε. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SE (η = 5-7) (Γ) Κατεργασία με AH6809 (30 μΜ), L798106 (30 μΜ) ή L161982 (30 μΜ) για 3 ημέρες κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εξετάσθηκε με ανίχνευση BrdU όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. επίπεδα ενσωμάτωσης BrdU εκφράστηκαν σε σχέση με εκείνο σε μη κατεργασμένα κύτταρα (ελέγχου). Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SE (η = 6). Οι σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων που αναφέρονται και ομάδα ελέγχου υποδεικνύονται με * (Ρ & lt? 0,05) και ** (Ρ & lt? 0,01)

Η

Ως εκ τούτου, ο ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μειορύθμιση της COX-2. θα μπορούσαν να επηρεάσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549. Η διέγερση με ΤΟΡ-β1 επίσης μειώθηκε φάση S και αυξημένη G0 /G1 φάση του Α549 κύτταρα (Σχήμα 4Α). Αυτή η διακοπή του κυτταρικού κύκλου παρατηρήθηκε από 3 ημέρες μετά τη θεραπεία, όταν τα κύτταρα Α549 μπορεί να εκφράζουν λιγότερο COX-2. Πράγματι, ο ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μείωση των κυττάρων φάσης S έτειναν να καταργείται από εξωγενές PGE2 με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Β). Για να διερευνηθεί περαιτέρω η επίδραση του ΤΟΡ-β1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549, μετρήσαμε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με τη βοήθεια του ποσοτικού προσδιορισμού BrdU. Επιβεβαιώσαμε ότι BrdU ενσωμάτωση μειώθηκε με διέγερση TGF-β1 επί 3 ημέρες, και αυτή η TGF-β1 επαγόμενη καταστολή της ενσωμάτωσης BrdU εν μέρει εξασθενημένη παρουσία PGE2 (Σχήμα 4C). Βρήκαμε επίσης ότι ο TGF-β1 δεν επηρέασε την μορφή έκφρασης του υποτύπων υποδοχέα ΕΡ σε κύτταρα Α549 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την ιδέα ότι ο TGF-β1 επαγόμενη COX-2 προς τα κάτω ρύθμιση συσχετίζεται με την καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Α549. Στην πραγματικότητα, ο αριθμός των κυττάρων σε δείγματα που έλαβαν θεραπεία με ΤΟΡ-β1 επί 3 ημέρες μειώθηκε, σε σύγκριση με την περίπτωση των μη κατεργασμένων κυττάρων, και η προσθήκη του PGE2 αυξήθηκαν τον αριθμό των κυττάρων του ΤΟΡ-β1-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 4D). Έτσι, τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν ότι ο TGF-β1 επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων Α549 εν μέρει διαμεσολαβείται από ρύθμιση προς τα κάτω της COX-2. Από διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων σε G0 /1 φάση είναι απαραίτητη για την κυτταρική διαφοροποίηση, ΤΟΡ-β1 επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων Α549 μπορεί να σχετίζεται με EMT επάγεται από ΤΟΡ-β1 σε Α549 κύτταρα.

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε. Η θεραπεία με ΤΟΡ-β1 ελάττωσε την αναλογία των κυττάρων S φάσης. (Β-D) Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επώαση με ή χωρίς ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL), κύτταρα συμπληρώθηκαν με PGE2 (10, 25 μΜ) και περαιτέρω επωάστηκαν για 2 ημέρες. Ο πολλαπλασιασμός εξετάστηκε με ανάλυση του κυτταρικού κύκλου (Β), BrdU δοκιμασίας (C) και μέτρηση των κυττάρων (D) όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. PGE2 κατήργησε ΤΟΡ-β1 επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SE (η = 3-5). Οι σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων που αναφέρονται και ομάδα ελέγχου υποδεικνύονται με * (Ρ & lt? 0,05) και ** (Ρ & lt? 0,01)

Η

ρύθμιση προς τα κάτω της COX-2 επιταχύνει ΤΟΡ-β1 που προκαλείται από ινωτική. EMT απόκριση

ΤΟΡ-β1 είναι καλά γνωστό ότι είναι ένας ισχυρός επαγωγέας της ΕΜΤ, η οποία είναι μια αλλαγή του φαινοτύπου που περιλαμβάνει τη διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων σε ινοβλαστοειδή κύτταρα όμοια. Κατά τη διαδικασία της ΕΜΤ, επιθηλιακά πρωτεΐνες δείκτες, όπως Ε-καδερίνης, χάνονται και μεσεγχυματικά πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένης της Ν-καντερίνης και φιμπρονεκτίνη, αυξορυθμίζονται. Επιβεβαιώσαμε τη μείωση του Ε-καδερίνης και αύξηση του Ν-καντερίνης στις 48 ώρες μετά τη διέγερση TGF-β1. Παράλληλα, η έκφραση της φιβρονεκτίνης ανυψώθηκε (Σχήμα 5Α). Για να διερευνηθεί η εμπλοκή του COX-2 προς τα κάτω ρύθμιση σε αυτά τα ΤΟΡ-β1 που προκαλείται αποκρίσεις ΕΜΤ, τα κύτταρα συνδιεγέρθηκε με ΤΟΡ-β1 και PGE2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, PGE2 (25 μΜ) δεν επηρέασε την απώλεια Ε-καδερίνης ή προς τα πάνω ρύθμιση του Ν-καντερίνης που επάγεται από ΤΟΡ-β1. Από την άλλη πλευρά, ο ΤΟΡ-β1 επαγόμενη προς τα πάνω ρύθμιση της ινωδονεκτίνης ανεστάλη έντονα από εξωγενείς PGE2. PGE2 κατέστειλε ΤΟΡ-β1 επαγόμενη έκφραση ινωδονεκτίνης σε δόσεις τόσο χαμηλές όσο 5-10 μΜ (Σχήμα 5C). Στη συνέχεια, εξετάσαμε επίσης την επίδραση των αγωνιστών του υποδοχέα του ΕΚ για την έκφραση ινωδονεκτίνης. Η θεραπεία με butaprost αγωνιστή υποδοχέα ΕΡ2 ή ΕΡ4 αγωνιστή υποδοχέα PGE1-ΟΗ ανέστειλε την αύξηση της φιμπρονεκτίνης που επάγεται από ΤΟΡ-β1, ενώ ΕΡ1 /3 sulprostone αγωνιστή υποδοχέα δεν είχε καμία επίδραση (Σχήμα 5D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ΕΡ2 και ΕΡ4 υποδοχείς μεσολαβούν στην κατασταλτική δράση της PGE2 σε TGF-β1 επαγόμενη έκφραση ινωδονεκτίνης.

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και έκφραση της Ε-καδερίνης, Ν-καντερίνης και φιμπρονεκτίνη ανιχνεύθηκε με ανοσοκηλίδωση. (Β) Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επώαση με ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) και PGE2 (25 μΜ), την έκφραση της Ε-καδερίνης, Ν-καντερίνης και ινονεκτίνη αξιολογήθηκε. (C) Τα κύτταρα επωάστηκαν με ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) και PGE2 (5-25 μΜ) για 48 ώρες και η έκφραση της φιβρονεκτίνης εξετάστηκε. PGE2 καταστέλλεται επαγωγή ινονηκτίνης από τον TGF-β1. (D) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) και όχημα (οξικό μεθύλιο), sulprostone, butaprost ή PGE1-ΟΗ (20 μΜ) για 48 ώρες και η έκφραση της φιβρονεκτίνης αξιολογήθηκε. Η θεραπεία με butaprost ή PGE1-ΟΗ ανέστειλε ΤΟΡ-β1-προκαλούμενη αύξηση της φιμπρονεκτίνης έκφρασης. HMGB1 ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι εντάσεις ζωνών ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία και εκφράζεται ως σχέση με εκείνες του κάθε ελέγχου.

Η

Η ινονηκτίνη είναι ένα συστατικό της ECM και αλλαγμένη έκφραση ινωδονεκτίνης σχετίζεται με ινωτικές διαταραχές. Ερευνήσαμε περαιτέρω το εάν ΤΟΡ-β1 επάγει έκφραση του κολλαγόνου Ι, η οποία είναι ένα σημαντικό συστατικό της ECM σε ινωτικές ιστούς [34-36]. Το επίπεδο μεταγραφής COL1A1 (που κωδικοποιεί κολλαγόνο Ι) ήταν αυξημένα με διέγερση με ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 6Α). Αυτό ΤΟΡ-β1-επαγόμενη έκφραση του COL1A1 εξασθένισε με συμπλήρωση με εξωγενή PGE2 (Σχήμα 6Β). Καθώς και PGE2, PGE1-ΟΗ έντονα καταστέλλεται COL1A1 επαγωγή από τον TGF-β1, ενώ butaprost και sulprostone εμφάνισαν μόνο μέτρια κατασταλτικά αποτελέσματα (Σχήμα 6C). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι προς τα κάτω ρύθμιση του COX-2 και την παραγωγή της PGE2 από τον TGF-β1 εμπλέκεται στην παραγωγή συστατικό ECM σε κύτταρα Α549.

(Α) Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με ΤGF-β1 (5 ng /mL) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους? τότε το ολικό RNA εκχυλίστηκε και COL1A1 γονιδιακής έκφρασης εξετάστηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. (Β) Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την αγωγή με ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) και PGE2 (5-25 μΜ), εξετάσθηκε η έκφραση COL1A1 γονίδιο. PGE2 κατήργησε ΤΟΡ-β1 επαγόμενη έκφραση COL1A1 γονίδιο. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) και όχημα (οξικό μεθύλιο), sulprostone, butaprost ή PGE1-ΟΗ (20 μΜ) για 24 ώρες, και μετρήθηκε το επίπεδο COL1A1 mRNA. PGE1-ΟΗ καταστέλλεται COL1A1 επαγωγή από τον TGF-β1. COL1A1 επίπεδα γονιδιακής έκφρασης κανονικοποιήθηκαν για έκφραση GAPDH και εμφανίζονται ως ποσοστό των κυττάρων που σε ΤΟΡ-β1-θεραπεία. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SE (η = 3). Οι σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων που αναφέρονται και την ομάδα ελέγχου που υποδεικνύεται από ** (Ρ & lt? 0,01).

Η

ΤΟΡ-β1 επαγόμενη καταστολή της παραγωγής PGE2 εμπλέκεται στην αναδιαμόρφωση της ακτίνης σε κύτταρα Α549

Ερευνήσαμε επίσης το σχηματισμό ινών στρες ακτίνης, η οποία έχει θεωρηθεί ως ένα σήμα κατατεθέν της ινοβλαστοειδή κύτταρα, καθώς και ένα μέρος της EMT. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Α, ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) εντυπωσιακά επάγεται τον πολυμερισμό της ακτίνης, ενώ ακτίνης ίνες στρες μετά βίας ανιχνεύθηκε σε κύτταρα PGE2 φάρμακο. Η θεραπεία με butaprost ή σχηματισμό ινών στρες ΤΟΡ-β1 επαγόμενη ακτίνη PGE1-ΟΗ ανέστειλε επίσης. Από την άλλη πλευρά, sulprostone κατασταλεί ελαφρώς τον πολυμερισμό της ακτίνης από τον TGF-β1. Δεδομένου ότι οι ακτίνης ίνες στρες που σχετίζονται με την κυτταρική κινητικότητα, εξετάσαμε επίσης τη μετανάστευση των κυττάρων με τη δοκιμασία Transwell. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Β, η διέγερση με ΤΟΡ-β1 αυξημένη κυτταρική μετανάστευση μέσα σε 24 ώρες, ενώ ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν μειώθηκε σε παρουσία PGE2. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο TGF-β1 επαγόμενη καταστολή της παραγωγής PGE2 σχετίζεται με το σχηματισμό ακτίνης ινιδίων του στρες και τη μετανάστευση των κυττάρων Α549.

(Α) κύτταρα Α549 επωάστηκαν με ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) και PGE2 (10 μΜ), όχημα (οξικό μεθύλιο), sulprostone, butaprost ή PGE1-ΟΗ (20 μΜ) για 12 ώρες. Στη συνέχεια, F-ακτίνης χρώση χρησιμοποιώντας phalloidin ροδαμίνης (κόκκινο) και βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ στο Χ63 μεγέθυνση. σχηματισμός ινών ακτίνης στρες ΤΟΡ-β1 επαγόμενη καταστάλθηκε από PGE2, butaprost ή PGE1-ΟΗ. Για την επαλήθευση της θέσης των πυρήνων, τα κύτταρα βάφτηκαν με Hoechst33258 (μπλε). μετανάστευση (Β) Cell εξετάσθηκε με ανίχνευση Transwell όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β1 (5 ng /mL) και PGE2 (10 μΜ) για 24 ώρες?