Αφηρημένο

Ρυθμιστικές Τ κυττάρων (Treg) μεσολάβηση ανοσοκαταστολή αποτελεί ένα από τα κρίσιμα όγκου ανοσολογικούς μηχανισμούς φοροδιαφυγής και είναι ένα βασικό εμπόδιο για την επιτυχή ανοσοθεραπεία όγκου. Η υποξία, ένα κοινό χαρακτηριστικό των συμπαγών όγκων, έχει συσχετισθεί με ενισχύεται ανοσοκαταστολή, μειωμένη θεραπευτική ανταπόκριση, κακοήθη πρόοδο και την τοπική εισβολή. Δυστυχώς, η σύνδεση μεταξύ υποξία και Treg ανοσολογικής ανοχής σε γαστρικό καρκίνο παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Στη μελέτη μας, Tregs και υποξία διεγέρσιμο παράγοντα-1α βρέθηκαν να συσχετίζονται θετικά με το άλλο και είχαν αυξηθεί με την εξέλιξη του όγκου. Μια επακόλουθη

in vitro

μελέτη έδειξε ότι τα υπερκείμενα που προέρχονται από καρκίνο του στομάχου κύτταρα υπό υποξικές συνθήκες, θα μπορούσε να επάγει την έκφραση του Foxp3 μέσω ΤΟΡ-β1. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαίωσαν τον καθοριστικό ρόλο των Tregs ως θεραπευτικός στόχος στο γαστρικό θεραπεία του καρκίνου και παρείχαν χρήσιμες σκέψεις για το σχεδιασμό των ανοσοθεραπεία για καρκίνο του στομάχου στο μέλλον

Παράθεση:. Deng Β, Zhu JM, Wang Υ, Liu TT, Ding YB, Xiao WM, et al. (2013) εντός του όγκου υποξία Προωθεί ανοσολογικής ανοχής με επαγωγή ρυθμιστικών κυττάρων Τ μέσω του TGF-β1 σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 8 (5): e63777. doi: 10.1371 /journal.pone.0063777

Επιμέλεια: Nupur Gangopadhyay, Πανεπιστήμιο του Pittsburgh, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Γενάρη του 2013? Αποδεκτές: 6 Απρίλη 2013? Δημοσιεύθηκε: May 27, 2013

Copyright: © 2013 Deng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή υποστηρίχθηκε από την Επιστήμη και την Τεχνολογία της Επιτροπής της Σαγκάης (10410709400, 10411950100), Εθνικό Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας (81000968, 81101540, 81101637 και 81172273) και το Εθνικό Κλινική Βασικά Ειδικό Θέμα της Κίνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικό καρκίνο αντιπροσωπεύει μια από τις πιο κοινές αιτίες των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται παγκοσμίως [1]. Παρά τις σημαντικές προόδους στις διαγνωστικές και θεραπευτικές προσεγγίσεις κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, η πρόγνωση του γαστρικού καρκίνου παραμένει ζοφερή λόγω της υψηλής υποτροπής και μετάσταση του [2]. Ανοσοκύτταρα έχουν από καιρό αναγνωριστεί ως παράγοντας ανάπτυξης όγκου προώθηση στο μικροπεριβάλλον του όγκου [3], ωστόσο, η υποκείμενη μοριακή βάση παραμένει σε μεγάλο βαθμό αινιγματική. Μια καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών σε γαστρικό καρκίνο θα είναι επωφελής για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπευτικών συστημάτων.

ενδονεοπλασματική υποξία είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό των συμπαγών όγκων, η οποία θα μπορούσε να επηρεάσει την εξέλιξη των όγκων με την ενεργοποίηση βασικών βιοχημικών και κυτταρικών οδών [4 ], [5], [6]. Μελέτες έδειξαν επίσης ότι η υποξία παίζει κεντρικό ρόλο σε όγκο ανοσολογική καταστολή, συμβάλλοντας για τη διατήρηση της ανοσολογικής διαφυγής των όγκων [7], [8]. Πρόσφατα, μια επιβεβαιωμένη σχέση μεταξύ της υποξίας όγκου και ανοσολογικής ανοχής μέσω της πρόσληψης των ρυθμιστικών Τ κυττάρων (Tregs) έχει καθιερωθεί στον καρκίνο των ωοθηκών [9]. Έτσι, μία υπόθεση έχει παρουσιαστεί ότι η υποξία μπορεί να παρέχει εμπόδια για θεραπευτικές παρεμβάσεις του ανοσοποιητικού.

Αυξημένη Tregs έχουν αναφερθεί στην κυκλοφορία και του όγκου ιστούς των ασθενών με διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στομάχου, του καρκίνου του παχέος εντέρου, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και καρκίνο του παγκρέατος [10]. Συσσωρευμένα στοιχεία έδειξαν επίσης ότι η παρουσία των Tregs κατέληξε σε αυξημένο κίνδυνο για την εξέλιξη του καρκίνου [11], [12], [13]. Επιπλέον, Treg μεσολάβηση ανοσοκαταστολή θεωρείται ένα από τα σημαντικότερα ανοσολογικούς μηχανισμούς φοροδιαφυγής σε όγκο σύμφωνα με την οποία είναι σε θέση να ξεπεράσει την αντικαρκινική δραστικότητα των CD8 κυτταροτοξικών κυττάρων, δενδριτικών κυττάρων και των φυσικών φονικών κυττάρων [14]. Έτσι, διαλεύκανση του υποκείμενου μηχανισμού εμπλουτισμού Treg σε γαστρικό καρκίνο θα είναι χρήσιμες για τη στόχευση Tregs για ένα ωφέλιμο κλινικό αποτέλεσμα. Αν και οι μηχανισμοί δεν είναι πλήρως κατανοητή, μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο TGF-β1 εμπλέκεται σε αυτό [15].

Σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι γαστρικό καρκίνο μπορεί να αποκτήσει ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα από την επαγωγή των Tregs υπό υποξία μέσω μονοπατιού σηματοδότησης ΤΟΡ-β1 αποφύγει έτσι ανοσολογική επιτήρηση. Για να καταδειχθεί η υπόθεση μας, αναλύσαμε την έκφραση της υποξίας επαγώγιμου παράγοντα-1α (HIF-1α) και Foxp3 στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς, αξιολόγησε την επίδραση της υποξίας στην παραγωγή ΤΟΡ-β1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, και, τέλος, διευκρινίσθηκε ο ρόλος της υποξίας διαμεσολαβητικό Treg εμπλουτισμό σε γαστρικό καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα

εγκλεισμένα σε παραφίνη, τομές όγκων μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη ελήφθησαν από 99 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου που υποβλήθηκε σε χειρουργική εκτομή από Δεκέμβριος 2006 – Φεβρουάριος 2008 κατά τη Δεύτερη Κλινική Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Yangzhou. Παρακολούθηση δεδομένων συνοψίστηκαν από τον Οκτώβριο του 2012, με διάμεση παρακολούθηση 53 μήνες (εύρος 4-70 μήνες). Συνολική επιβίωση (OS) ορίστηκε ως από τη στιγμή της χειρουργικής επέμβασης για την τελευταία παρακολούθηση ή χρόνο του θανάτου.

δείγματα περιφερικού αίματος συλλέχθηκαν από 20 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου μία ημέρα πριν και 10 ημέρες μετά την επέμβαση από τον Ιούλιο 2012 έως τον Οκτώβριο του 2012. οι οροί καταψύχθηκαν στους -80 ° C αμέσως μετά τη φυγοκέντρηση για μελλοντική χρήση. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) απομονώθηκαν αμέσως από μία βαθμίδα πυκνότητας Ficoll.

Κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει ανοσοκατασταλτικά φάρμακα ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική εκτομή. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας (Επιτροπή Δεοντολογίας της δεύτερης Κλινική Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Yangzhou, Yangzhou), και γραπτές πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη.

ανοσοϊστοχημική χρώση

Serial τμήματα (5 μm), τα δείγματα εγκλεισμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη έγιναν. Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αλκοόλη. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη δια κατεργασίας των διαφανειών σε ρυθμιστικό EDTA σε φούρνο μικροκυμάτων για 10 λεπτά. Κουνέλι αντι-ανθρώπινο HIF-1α πρωτογενές αντίσωμα (Bioworld, USA), αντίσωμα ΤΟΡ-β1 ποντικού αντι-ανθρώπου (Santa Cruz, USA) και αντι-ανθρώπινο αντίσωμα Foxp3 ποντικού (Abcam, USA) χρησιμοποιήθηκαν για τα πρωτεύοντα αντισώματα. Διαμινοβενζιδίνη (DAB) χρησιμοποιήθηκε για υπόστρωμα μετά αντικηλίδωση με αιματοξυλίνη για απλή χρώση. Διπλή χρώση πραγματοποιήθηκε με 2 διαφορετικούς χρωμογόνα:. DAB χρωμογόνου (καφέ χρώμα) για HIF-1α και γρήγορη-κόκκινο χρωμογόνου (κόκκινο χρώμα) για τον ΤΟΡ-β1 ή Foxp3

Ανοσοαντιδραστικότητα Scoring

HIF -1α χρώση πυρήνα αξιολογήθηκε ακολουθώντας τη μέθοδο που αναφέρεται [16], χρώση βαθμολογία = ένταση του ανοσοαντιδραστικότητα (IR) × ποσοστό θετικά χρωματισμένων κυττάρων. Ένταση IR διαστρωματώθηκε σε τέσσερις κατηγορίες: 0, χωρίς IR? 1, αδύναμη IR? 2, μετρίως ισχυρή IR? και 3, ισχυρή IR. Η αναλογία των θετικών κυττάρων ταξινομούνται σε πέντε ομάδες: 0, καθόλου χρώση? 1, & lt? 2% χρώση? 2, 2-10% χρώση? 3, 11-29% χρώση? και 4, & gt?. 30% χρώση

Ένα τροποποιημένο σύστημα βαθμολόγησης που χρησιμοποιείται για Foxp3

+ κύτταρα [17]. Δέκα πεδία μετρήθηκαν σε υψηλής ισχύος για Foxp3. Ο απόλυτος αριθμός των λεμφοκυττάρων ανά πεδίο υψηλής ισχύος (HPF 400) ήταν αποφασισμένος. υπολογίστηκε ο μέσος αριθμός των θετικών χρώση κυττάρων ανά πεδία υψηλής ισχύος.

Cell Culture και υποξία επαγωγή

Ανθρώπινο κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, AGS και BGC823, ελήφθησαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Κυτταρικής Βιολογία, κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Όλα τα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C σε DMEM ή RPMI 1640 (HyClone Tianjin, Κίνα) συμπληρωμένο με 10% FBS (Gibco, Αυστραλία), 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 mg /ml στρεπτομυκίνη ( HyClone Tianjin, Κίνα). Για πειράματα υποξίας, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, όταν αυξήθηκε σε 60-80% συρροή, διατηρούνται σε μέσο AIMV χωρίς ορό (Invitrogen, USA) για μια ολονύκτια επώαση, και στη συνέχεια τοποθετείται σε ένα αρθρωτό θάλαμος επώασης (Ruskinn Works, YK) για 24 ώρες κάτω από υποξικές (1,0% O

2) ή ορθοξικές (21% O

2) συνθήκες, και τα δύο με 5% CO

2 στους 37 ° C. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για μεταγενέστερη προσδιορισμό των συγκεντρώσεων του ΤΟΡ-β1 και για δοκιμασία συν-καλλιέργεια. Όλα τα

in vitro

πειράματα επικύρωσης διεξήχθησαν τουλάχιστον εις τριπλούν.

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα (1 × 10

5 /καλά) απλώθηκαν σε καλυπτρίδες σε ένα πλάκα 24 φρεατίων για μία καλλιέργεια 24 ώρες. Ακολούθως, μονιμοποιήθηκαν σε ψυχρή μεθανόλη για 30 λεπτά για να διαπερατά με 0.5% TritonX-100 για άλλα 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές, μπλοκάρεται από 10% ορό κατσίκας σε PBS για 30 λεπτά, και επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινο ΤΟΡ-β1 αντίσωμα (Santa Cruz, USA) και αντίσωμα αντι-ανθρώπινου HIF-1α (Epitomics, USA) σε καταψύκτη στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Το πρωτογενές αντίσωμα ανιχνεύθηκε μέσω alexa488-συζευγμένο δεύτερο αντίσωμα (Invitrogen, USA) και Alexa fluor 594-συζευγμένο δεύτερο αντίσωμα (Invitrogen, USA) αντίστοιχα. Οι καλυπτρίδες εξετάσθηκαν υπό OLYMPUS μικροσκοπία φθορισμού.

RNA Εκχύλιση και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qPCR)

Κάθε μία από τις δύο κυτταρικές σειρές που περιγράφονται παραπάνω καλλιεργήθηκε σε τριπλά φρεάτια υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες , όπως περιγράφεται παραπάνω. Ολικό RNA απομονώθηκε από αμέσως ορθοξικές ή υποξικά κύτταρα στο τέλος του πειράματος, χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, USA). Ολικό RNA (5 ng) υπέστη αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας cDNA Reverse Transcription κιτ (Takara, Dalian, Κίνα), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. qPCR διεξήχθη σε SYBR Green ΡΟΚ Master Mix (Takara, Dalian, Κίνα). Διπλώστε τις αλλαγές στην έκφραση του κάθε TGF-β1 mRNA σε σχέση με GAPDH υπολογίστηκαν με βάση τον κύκλο κατωφλίου (Ct) και 2

-Δ

(ΔΟΙ), όπου ΔCt = Ct

στόχος – Ct

GAPDH και Δ (ΔΟΙ) = ΔCt

υποξία – ΔΟΙ

φυσιολογική οξυγόνωση. Οι εκκινητές ΤΟΡ-β1 ήταν: προς τα εμπρός, 5′-GCCAG AGTGG TTATC TTTTG ATG-3 ‘? αντιστραφεί, 5’-AGTGT GTTAT CCCTG CTGTC AC-3 ‘, και οι εκκινητές GAPDH ήταν: προς τα εμπρός, 5′-GGACC TGACC TGCCG TCTAG AA-3′? αντίστροφη, 5’-GGTGT CGCTG ΤΤ GAAGT CAGAG-3 ‘. qPCR διεξήχθη εις τριπλούν.

ένζυμο ανοσορροφητική δοκιμή (ELISA)

Η συγκέντρωση του ΤΟΡ-β1 στα υπερκείμενα καλλιέργειας και ορούς προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ELISA (eBioscience, San Diego, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Απομόνωση και καλλιέργεια Τ κυττάρων

PBMC από δότες που είχαν έμμεσα επισημασμένο με βιοτίνη αντίσωμα bocktail και αντι-βιοτίνης μικροσφαιρίδια. CD4

+ Τ κύτταρα διαχωρίστηκαν με αρνητική επιλογή σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Miltenyi Biotec, Germany). CD4

+ Τ κύτταρα απευθείας σημασμένα με CD25 Micro-Beads και CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα απομονώθηκαν με αρνητική επιλογή σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (καθαρότητα & gt? 95%? Miltenyi Biotec, Γερμανία) . Τα υπερκείμενα συλλέγονται από καλλιεργημένα κύτταρα AGS υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες αραιώθηκαν με φρέσκο ​​μέσο AIMV (1:03), που ονομάζεται νορμοξικές μεσαίες και υποξικές μέσο, ​​αντίστοιχα. Ένα σύνολο 1,0 × 10

6 /ml CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα διεγέρθηκαν με αντι-CD3 /CD28 σφαιρίδια επικαλυμμένα (1:05? Invitrogen, USA) ± IL-2 (200 U /ml? Peprotech) για 72 ώρες σε μέσο (μέσο ελέγχου ελεύθερο ορού ΑΙΜ-V), ορθοξικές μέσο ή υποξικό μέσο. Σε μερικά πειράματα, ανασυνδυασμένο ανθρώπινο TGF-β1 (2 ng /ml? Κ &? D Systems, USA) και ΤΟΡ-β1 αναστολέα κινάσης υποδοχέα LY-364947. (5 μΜ? Merck, Germany) προστέθηκαν στις καλλιέργειες

κυτταρομετρίας ροής

ανάλυση Φαινότυπος των Tregs πραγματοποιήθηκε με BD FACS AriaII κυτταρόμετρο ροής (BD, ΗΠΑ). Εν συντομία, τα κύτταρα επισημάνθηκαν με CD4-FITC και Foxp3-ΡΕ (eBioscience, San Diego, CA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για να αναλυθεί η επικράτηση των Tregs, CD4

+ Foxp3

+ Τ κύτταρα αξιολογήθηκαν μετά gating επί CD4

+ Τ κύτταρα και εκφράστηκαν ως ένα ποσοστό της συνολικής CD4

+ Τ κύτταρα.

Στατιστική Ανάλυση

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε SPSS 17.0 για Windows. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA, Mann-Whitney U test ή χ

2 δοκιμή, όπου ενδείκνυται. Η συσχέτιση εξετάστηκε από συσχέτισης Pearson. Αθροιστική χρόνος επιβίωσης υπολογίστηκε μέσω Kaplan-Meier και αναλύθηκαν μέσω του τεστ log-rank. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

HIF-1α και Foxp3 Έκφραση σε γαστρικός καρκίνος ιστοί

Μετά την ιστολογική επιβεβαίωση της γαστρικής καρκίνος (Εικ. 1Α, επάνω αριστερή και προς τα κάτω αριστερά), ερευνήσαμε την έκφραση του HIF-1α και Foxp3 με ανοσοϊστοχημεία σε 99 ασθενείς. HIF-1α με χαμηλή έκφραση (Εικ. 1Α, άνω) και υψηλή έκφραση (Εικ. 1Α, κάτω) βρέθηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων στο περιθώριο του όγκου, και μόνο πυρηνική χρώση HIF-1α βαθμολογήθηκε. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι, σε ορισμένες περιπτώσεις, τα λεμφοκύτταρα επίσης έδειξαν ισχυρή έκφραση του HIF-1α. Foxp3 με χαμηλή έκφραση (Εικ. 1Α, επάνω δεξιά) και υψηλή έκφραση (Εικ. 1Α, κάτω δεξιά) παρατηρήθηκε στον πυρήνα των λεμφοκυττάρων, τα περισσότερα εκ των οποίων βρίσκονται στο περιθώριο του όγκου.

( Α) Foxp3 και έκφραση του HIF-1α σε γαστρικό δείγματα καρκίνου (σειριακές τομές) προσδιορίστηκαν με η &? Ε και χρώση ανοσοϊστοχημείας. Αντιπροσωπευτικά Η &? Ε χρώση (επάνω αριστερά και κάτω αριστερά) και εικόνες από όγκους που εκφράζουν μικρά (άνω και επάνω δεξιά) ή μεγάλα (προς τα κάτω και κάτω δεξιά) τα ποσά του HIF-1α και Foxp3, αντίστοιχα. (Β) Τα ιστογράμματα έδειξε ότι η έκφραση του HIF-1α (αριστερά) ή Foxp3 (δεξιά) είναι σημαντικά υψηλότερη σε μεταστατικό όγκο από ό, τι σε μη μεταστατικό όγκο. ανάλυση (C) Kaplan-Meier διεξήχθη για να συγκρίνει τη συνολική επιβίωση μεταξύ των ασθενών με υψηλή και χαμηλή έκφραση του Foxp3 (αριστερά), καθώς και θετική και αρνητική έκφραση του HIF-1α (δεξιά). Αρχικό μεγεθύνσεις: × 100? × 400 (ένθετα)? Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. *

P

& lt?. 0.001

Η

Στη συνέχεια, οι εκφράσεις του HIF-1α και Foxp3 σε καρκινικούς ιστούς συγκρίθηκαν σε ασθενείς με μη μεταστατικό (n = 52) και μεταστατικό (n = 47) γαστρικό καρκίνο. Τόσο η μέση βαθμολογία του HIF-1α και ο αριθμός των Foxp3

+ κύτταρα στο μεταστατικό ασθενείς ήταν υψηλότερη από ό, τι σε μη μεταστατικό ασθενείς (HIF-1α, 7,69 ± 0,45 έναντι 5,41 ± 0,40,

P

& lt? 0.001 , Σχήμα 1Β, αριστερά?. Foxp3, 14,61 ± 1,01 έναντι 8,07 ± 0,95,

P

& lt? 0.001, Εικόνα 1Β, δεξιά)

Σχέση μεταξύ OS και HIF-1α ή Foxp3.. στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς

από την τελευταία παρακολούθηση, 50, 99 (50,5%) των ασθενών ήταν ζωντανοί, με διάμεση παρακολούθηση 64 μήνες (εύρος 57-70), ενώ 49 είχαν πεθάνει από τη νόσο , με διάμεσο χρόνο μέχρι τον θάνατο 28 μήνες (εύρος 4-64). Για να αποσαφηνιστεί η σχέση μεταξύ της έκφρασης του HIF-1α ή Foxp3 και OS, HIF-1α κατηγοριοποιήθηκε ως αρνητικός (η = 34? Βαθμολογίες ≤4) ή θετικό (n = 65? Βαθμολογίες & gt? 4), ενώ Foxp3 κατηγοριοποιήθηκε ως χαμηλή (n = 51F) ή υψηλής (n = 48) χρησιμοποιώντας την διάμεση τιμή (8,6 κύτταρα /HPF) ως αποκοπής. Στη μελέτη μας, OS σε Foxp3-χαμηλής ομάδας ήταν σημαντικά υψηλότερο σε σχέση με Foxp3-υψηλή ομάδα (

P

= 0.017, Σχ. 1C, αριστερά), ενώ HIF-1α-αρνητική ομάδα ήταν σημαντικά υψηλότερο από το HIF -1α-θετική ομάδα (

P

= 0,009, Σχ.1 Γ, δεξιά).

σύνδεσης μεταξύ HIF-1α ή Foxp3 και κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά

Η συσχέτιση μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά και η έκφραση του HIF-1α ή Foxp3 στη συνέχεια αξιολογήθηκε (Πίνακας 1). Δεν βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ HIF-1α ή έκφραση Foxp3 και ηλικία ή το φύλο των ασθενών, καθώς και το μέγεθος του όγκου. Ωστόσο, υπήρχε μια αύξηση στο θετικό ρυθμό HIF-1α με βάθος εισβολή όγκου (

P =

0.013). Μια παρόμοια τάση βρέθηκε επίσης μεταξύ της έκφρασης του HIF-1α (

P

& lt? 0.001) ή Foxp3 (

P

= 0,008) και το στάδιο του όγκου. Επιπλέον, μια σημαντική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ λεμφαδένα μετάσταση και την έκφραση του HIF-1α (

P

= 0,029) ή Foxp3 (

P

& lt? 0.001).

Η

Σχέσεις μεταξύ HIF-1α και Foxp3 ή ΤΟΡ-β1 σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς

το προαναφερθέν ανοσοϊστοχημικές το αποτέλεσμα έδειξε ότι ο αριθμός των Foxp3

+ κυττάρων ήταν σημαντική θετική συσχέτιση με το σκορ του HIF-1α σε ασθενείς με μετάσταση

(r = 0,772

,

P

& lt? 0,001? Σχ. 2Α, αριστερά), αλλά όχι σε ασθενείς χωρίς μετάσταση (

r =

0.461,

P

= 0.001? Σχ. 2Α, δεξιά). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική χρώση διπλό για την αξιολόγηση της παρουσίας συνέκφραση μεταξύ HIF-1α και Foxp3 ή ΤΟΡ-β1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Foxp3

+ κύτταρα συγκεντρώνουν κυρίως στις θέσεις κοντά στην περιοχή υποξικά όγκου με υψηλή HIF-1α έκφραση (Σχ. 2Β). Επιπλέον, τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα υψηλής HIF-1α ήταν υψηλή έκφραση του TGF-β1 (Εικ. 2C).

(Α) Η συσχέτιση του HIF-1α και Foxp3 σε μεταστατικό (αριστερά) και μη μεταστατικό όγκο (δεξιά) , όπως προσδιορίζεται με χρώση χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. (Β) Διπλή χρώση του HIF-1α (καφέ, πυρήνας των καρκινικών κυττάρων) και Foxp3 (κόκκινο, πυρήνας του λεμφοκύτταρα). Κόκκινα βέλη υποδεικνύονται τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν υψηλά HIF-1α και μπλε βέλη Foxp3

+ κύτταρα. (C) Διπλή χρώση του HIF-1α (καφέ, πυρήνας των καρκινικών κυττάρων) και ΤΟΡ-β1 (κόκκινο, κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων). Ερυθρά βέλη υποδεικνύονται καρκινικά κύτταρα συν-εκφράζουν υψηλά HIF-1α και ΤΟΡ-β1, και μπλε βέλη για υψηλής HIF-1α. Αρχική μεγέθυνση × 200.

Η

Κυκλοφορούν Tregs και TGF-β1 σε προ-χειρουργική επέμβαση και μετά την χειρουργική επέμβαση ασθενείς

Για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ Tregs και τη συγκέντρωση των TGF-β1 στην ορού, CD4

+ Foxp3

+ Τ κύτταρα αναλύθηκαν σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου μέσω κυτταρομετρίας ροής (Σχ. 3Α). Η συχνότητα των Tregs πριν το χειρουργείο ήταν υψηλότερες από ότι μετά από τη χειρουργική επέμβαση (9,84 ± 0,40% έναντι 8,47 ± 0,33%,

P

& lt? 0.001, Σχήμα 3Β.). Οι συγκεντρώσεις ΤΟΡ-β1 μετά την επέμβαση μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με εκείνες πριν την εγχείρηση (6431,95 ± 629,24 έναντι 7581,56 ± 556,45 pg /ml,

P

= 0.005, Σχ. 3C). Μια θετική συσχέτιση μεταξύ της συχνότητας Treg και συγκέντρωση TGF-β1 βρέθηκε στον ορό πριν από τη λειτουργία (

r

= 0,454,

P

= 0.044, Σχ. 3D).

( Α) Αντιπροσωπευτική οικόπεδα έδειξε την συχνότητα των κυττάρων CD4

+ Foxp3

+ Τ κύτταρα πριν και 10 ημέρες μετά την επέμβαση στο περιφερικό αίμα του γαστρικού ασθενή με καρκίνο, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. (Β) Ένα ιστόγραμμα έδειξε την συχνότητα των κυττάρων CD4

+ Foxp3

+ Τ κυττάρων στο περιφερικό αίμα ασθενών με γαστρικό καρκίνο πριν και 10 ημέρες μετά την επέμβαση. (C) Ένα ιστόγραμμα έδειξε την συγκέντρωση του ΤΟΡ-β1 στο περιφερικό αίμα ασθενών με γαστρικό καρκίνο πριν και 10 ημέρες μετά την επέμβαση. (D) Συσχέτιση του CD4

+ Foxp3

+ Τ κύτταρα συχνότητα και τη συγκέντρωση TGF-β1 στο περιφερικό αίμα 20 ασθενών με γαστρικό καρκίνο πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. *

P

& lt?. 0.001

Η

TGF-β1 είναι ιδιαίτερα Προς τα πάνω ρυθμισμένη στο γαστρικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές κάτω από υποξία

Για να προσδιορίσετε αν η υποξία επάγει την έκκριση ΤΟΡ β1 σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα, τα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 μελετήθηκε σε δύο κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, AGS και BGC823, κάτω από υποξικές ή ορθοξικές συνθήκες. Η έκφραση του mRNA του TGF-β1 υπό υποξία ήταν αυξημένη σε σύγκριση με ορθοξικές συνθήκες (Εικ. 4Α). Συνεπής με qPCR, τα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 σε υπερκείμενο καλλιέργειας έδειξαν παρόμοια αποτελέσματα (Σχ. 4Β). Περαιτέρω, οι εκφράσεις του ΤΟΡ-β1 και HIF-1α ανιχνεύθηκαν επίσης με ανοσοφθορισμό, και τα αποτελέσματα έδειξαν αυξημένη ΤΟΡ-β1 και την έκφραση του HIF-1α κάτω από υποξικές συνθήκες σε σύγκριση με εκείνη της υπό ορθοξικές συνθήκες (Εικ. 4, C).

. (Α) Ένα ιστόγραμμα έδειξαν την έκφραση του mRNA του TGF-β1 σε κυτταρικές γραμμές AGS και BGC823. (Β) Ένα ιστόγραμμα έδειξε επίπεδο ΤΟΡ-β1 στο υπερκείμενο καλλιέργειας των δύο κυτταρικών γραμμών. (Γ) ανοσοφθορισμού διπλή χρώση έδειξε ΤΟΡ-β1 και την έκφραση του HIF-1α στις δύο κυτταρικές σειρές. Alexa fluor594 (πυρηνική κόκκινο), alexa488 (indocarbocyanin πράσινο) και DAPI (πυρηνικά αντικηλίδωση μπλε). Αρχική μεγέθυνση χ 200. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. * P & lt?. 0.001

Η

Η υποξία αυξάνει την ικανότητα πρόκλησης Tregs μέσω TGF-β1 σε γαστρικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές

Για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι η υποξία που προκαλείται από TGF-β1 συμβάλλει στην αύξηση των Tregs, κυκλοφορούντων CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα από υγιή άτομα υποβλήθηκαν σε αγωγή με υπερκείμενα από κύτταρα κάτω από διαφορετικές συνθήκες. Τα οικόπεδα dot έδειξαν διαφορετικά μέσα επάγει την έκφραση του Foxp3 σε CD4

+ Τ κύτταρα (Σχ. 5Α). Η έκφραση Foxp3 των Τ κυττάρων σε νορμοξικά μέσο, ​​υποξική μεσαίες και ανασυνδυασμένο ανθρώπινο TGF-β1 μέσον ήταν όλα αυξημένα σε σύγκριση με το μέσο ελέγχου (

P

& lt? 0.001). Επιπλέον, η έκφραση Foxp3 στο υποξικό μέσο ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι στην ορθοξικές μέσο (13,04 ± 0,74% έναντι 6,76 ± 0,35%,

P

& lt? 0.001, σχήμα 5Β.). Περαιτέρω, όπως LY-364947 προστέθηκε σε κάθε είδους μέσο, ​​η έκφραση Foxp3 μειώθηκε φανερά (

P

& lt?. 0,001, σχήμα 5C).

(Α) Εκπρόσωπος οικόπεδα έδειξε Foxp3 έκφρασης σε CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με διαφορετικά μέσα για 72 ώρες. Τα υπερκείμενα των κυττάρων AGS καλλιεργηθεί υπό ορθοξικές ή υποξικές κατάσταση κλήθηκαν νορμοξικές μεσαίες και υποξικές μέσου, αντίστοιχα, ενώ μέσο ΑΙΜ-V με ή χωρίς ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ΤΟΡ-β1 (reTGF-β1) ονομάστηκε reTGF-β1 μέσο και μέσο ελέγχου, αντίστοιχα . (Β) Ένα ιστόγραμμα έδειξε Foxp3 έκφραση σε CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με διαφορετικά μέσα. (Γ) Ένα ιστόγραμμα έδειξε ότι ο TGF-β1 αναστολέα της κινάσης του υποδοχέα LY-364947 (TGF-β1 In) αφαιρεί εν μέρει την indution των Foxp3 στα CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικά μέσα. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. *

P

& lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

Κατά την τελευταία δεκαετία, οι αναδυόμενες ενδείξεις πρότεινε ότι Tregs συμβάλει στη δημιουργία όγκων αλλοιώνοντας την αντικαρκινική ανοσοποιητικό απάντηση, ή ακόμα και την τόνωση της μετάστασης άμεσα [18], [19]. Αποδεικτικά στοιχεία που λαμβάνονται κατά τα τελευταία χρόνια έδειξαν αυξημένες συχνότητες εντός του όγκου Tregs σε καρκίνο του στομάχου, τα οποία έχουν συνδεθεί με δυσμενείς κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και φτωχή πρόγνωση [20], [21], [22]. Συνεπής με αυτά τα προηγουμένως αναφερθέντα αποτελέσματα, η μελέτη μας παρείχε αποδείξεις ότι η συχνότητα των ογκο-διηθητικά Tregs αυξήθηκε με την πάροδο της στάδια όγκου. Επιπλέον, Tregs παρέχεται επίσης ένα παράγοντα πρόγνωση για μετα-χειρουργική του γαστρικού καρκίνου. Επιπλέον, επιβεβαίωσε ότι οι αριθμοί των Tregs στο μεταστατικό καρκίνο του στομάχου είναι σημαντικά υψηλότερο σε σχέση με μη μεταστατικό καρκίνο του στομάχου. Τα παραπάνω αποτελέσματα στηρίζει με την έννοια που Tregs μπορούν να συμβάλλουν στην εξέλιξη της νόσου, μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για τον καρκίνο του στομάχου. Εμείς έτσι το επόμενο προσπάθησαν να διερευνήσουν τον υποκείμενο μηχανισμό διαμεσολάβησης εμπλουτισμό Treg στον καρκίνο του στομάχου.

όγκων υποξία αναγνωρίζεται ευρέως ως βασικός παράγοντας με αποτέλεσμα την αντίσταση θεραπεία και κακή πρόγνωση για καρκίνο του στομάχου [6], [16], [ ,,,0],23]. HIF-1α, ως κύριο μοριακή υπογραφή για υποξία, είναι ο κύριος ρυθμιστής κατάντη της υποξικής απόκριση σε κύτταρα όγκου [24]. Τα αποτελέσματα από τη μελέτη μας έδειξε ότι η HIF-1α συσχετίστηκε με κακοήθη κατηγορία συμπεριφοράς, συμπεριλαμβανομένου του βάθους της εισβολής, λέμφο μετάσταση στους λεμφαδένες και την προώθηση το στάδιο του όγκου. Εντυπωσιακά, ασθενείς με γαστρικό καρκίνο με υψηλά HIF-1α είχε φτωχότερη επιβίωση από εκείνους με χαμηλή HIF-1α, η οποία ενίσχυσε περαιτέρω την πρότασή μας που HIF-1α, ή μάλλον υποξία, συνδέεται με την εξέλιξη του καρκίνου του στομάχου.

έχει από μακρού αναγνωρισθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα προστατεύονται από το ανοσοποιητικό βλάβες σε μικροπεριβάλλοντα υποξίας όγκου? Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί παραμένουν ακόμα υπό έλεγχο [25]. Όσο για σήμερα, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το αν υπάρχει σχέση μεταξύ της υποξίας και Treg ανοσοκαταστολή σε όγκους. Αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν μελετήσει υποξική ρύθμιση των Tregs, με αντικρουόμενα αποτελέσματα. Ben-Shoshan

et al.

[26] ανέφεραν ότι η υποξία αυξάνει τον αριθμό και την κατασταλτική ιδιότητες των Tregs να υπαγορεύσει ένα αντι-φλεγμονώδη πρόγραμμα. Wei

et al.

[7] επιβεβαίωσε επίσης ότι η υποξία αυξάνει την ικανότητα του πολύμορφου γλοιοβλαστώματος να επάγει Tregs, και ως εκ τούτου παίζει ένα ρόλο κλειδί σε όγκο ανοσολογική καταστολή. Ωστόσο, Dang et al. [27] διαπίστωσε ότι HIF-1α αναστέλλει Treg διαφοροποίηση στοχεύοντας Foxp3 πρωτεΐνης για την υποβάθμιση. Στη μελέτη μας, παρουσιάσαμε μια έντονα θετική συσχέτιση μεταξύ του αριθμού Tregs και την έκφραση του HIF-1α, γεγονός που υποδηλώνει ότι η υποξία μπορεί να συμβάλει στην Tregs διείσδυση σε γαστρικό καρκίνο. Αξίζει να σημειωθεί ότι, στις μελέτες μας, οι περισσότεροι Tregs βρίσκονταν στην περιοχή κοντά στα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν ΗΙΡ-1α. Έτσι, απαιτείται περαιτέρω διευκρίνιση του αν υποξία σχετίζεται μόρια που απελευθερώνονται από τα καρκινικά κύτταρα να συμβάλει στον εμπλουτισμό των Tregs σε γαστρικό καρκίνο.

Αν και οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στον εμπλουτισμό των Tregs σε όγκους δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή, Είμαστε και άλλοι ερευνητές έχουν δείξει πρόσφατα ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να χρησιμεύσουν ως πηγή του ΤΟΡ-β1, η οποία απαιτείται για την επαγωγή και διατήρηση των Tregs

in vitro

και

in vivo

[28], [29], [30]. Στην παρούσα μελέτη, η συχνότητα των Tregs και ΤΟΡ-β1 σε κυκλοφορία πριν από την επέμβαση ήταν υψηλότερη από ότι μετά από τη χειρουργική επέμβαση, και οι δύο παράμετροι έδειξαν θετική συσχέτιση, υποδηλώνοντας ότι προέρχεται από όγκο ΤΟΡ-β1 μπορεί να συμβάλει στην αύξηση των Tregs του γαστρικού του καρκίνου.

η υποξία, ένα κοινό χαρακτηριστικό των καρκίνων, μπορεί να προκαλέσει τα καρκινικά κύτταρα με τη μυστική ανοσοκατασταλτικές κυτοκίνες, συμπεριλαμβανομένων TGF-β1 [7], [31]. Τα αποτελέσματα από τη μελέτη μας απέδειξε περισσότερα κύτταρα υψηλής ΤΟΡ-β1 ήταν καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν ΗΙΡ-1α σε όγκους. Ένα

in vitro

μελέτη έδειξε η έκφραση του ΤΟΡ-β1 αυξήθηκε σε μεγαλύτερο βαθμό σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα κάτω από υποξικές καλλιέργεια, η οποία είναι επίσης συνεπής με προαναφερθείσες μελέτες. Με βάση τα ευρήματά μας, υποθέσαμε ότι τα καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν ΤΟΡ-β1 να επάγει την παραγωγή των Tregs σε γαστρικό καρκίνο. Για να ελέγξετε την υπόθεσή μας, απομονωμένες CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα από υγιή άτομα καλλιεργήθηκαν σε αραιωμένα υπερκείμενα των κυττάρων του όγκου κάτω από διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση Foxp3 των Τ κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε υποξικά μέσο ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε νορμοξικά μέσο. Επιπλέον, η προσθήκη επιπλέον ανασυνδυασμένο ανθρώπινο TGF-β1 αυξήθηκε σημαντικά έκφραση Foxp3, ενώ η προσθήκη LY-364947, ένας αναστολέας του υποδοχέα ΤΟΡ-β1, η μειωμένη έκφραση Foxp3. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα δημιουργήσει μια άμεση σχέση μεταξύ υποξία, TGF-β1 και Tregs σε γαστρικό καρκίνο.

Ωστόσο, προκαταρκτική μελέτη μας έδειξε επίσης ότι ο TGF-β1 ήταν αναλλοίωτη με σταθεροποιητή HIF-1α, χλωριούχο κοβάλτιο (CoCl

2), ή HIF-1α αναστολέα, 2-μεθοξυοιστραδιόλη (2ME2) ​​σε AGS και BGC823, αν και η HIF-1α αυξήθηκε από υποξία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα ευρήματα πρότειναν ότι HIF-1α μπορεί να είναι μη συνδεδεμένα με την επαγωγή του ΤΟΡ-β1 σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα υπό υποξία, η οποία είναι συνεπής με προηγούμενη μελέτη [32]. Επιπλέον, η παραγωγή των Tregs δεν θα μπορούσε να αποκοπεί τελείως από το κλείδωμα του ΤΟΡ-β1, υποδεικνύοντας ότι και άλλες κυτοκίνες ή πορείες μπορεί επίσης να εμπλέκονται. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα δεν είναι η μόνη πηγή των κυτοκινών εντός του μικροπεριβάλλοντος του όγκου. Έτσι, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να επιβεβαιώσουν τον υποκείμενο μηχανισμό της συσσώρευσης Treg στον καρκίνο του στομάχου.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η υποξία ενισχύει την ικανότητα του γαστρικού καρκίνου, προκειμένου να αποφύγει το ανοσοποιητικό επιτήρησης από up-ρυθμίζουν την έκφραση της TGF-β1, διεγείροντας έτσι Tregs σε όγκους. Περαιτέρω, τα δεδομένα μας παρείχε επίσης ενδείξεις για την ύπαρξη των ενδοκυτταρικών cross-talk μεταξύ καρκινικών κυττάρων και Tregs, που θα μπορούσαν να ρυθμίζουν αντικαρκινικές ανοσοαπαντήσεις.