Αφηρημένο

χημειοαντίσταση στη θεραπεία του καρκίνου αποτελεί δυσμενή προγνωστικό παράγοντα σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Αύξηση του ενδοκυτταρικού επιπέδου ασβεστίου στο ανθεκτικά σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) sublines οδηγεί στην ευαισθητοποίηση των MDR sublines σε κυτταρικό θάνατο. Έχουμε αποδείξει ότι μια μυκητιασική πρωτεΐνη από

Ganoderma Microsporum

, GMI, εξυψώνει το ενδοκυτταρικό επίπεδο του ασβεστίου και μειώνει την ανάπτυξη των MDR δευτερεύουσα γρα μέσω αυτοφαγία και την απόπτωση, ανεξάρτητα από το p-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) υπερέκφραση σε ποντίκια ξενομόσχευμα όγκων. Επιπλέον, εξετάσαμε τους ρόλους αυτοφαγία στο θάνατο των MDR Α549 sublines καρκίνο του πνεύμονα με GMI, θαψιγαργίνη (TG) και τουνικαμυκίνη (ΤΜ)

in vitro

. Η κυτταροτοξικότητα του TG αναστάλθηκε από υπερέκφραση P-gp. Ωστόσο, TM που προκαλείται από το θάνατο του MDR sublines ήταν ανεξάρτητη από το επίπεδο P-gp. Συνδυασμοί των TG και TM είτε με docetaxel ή βινκριστίνη δεν έδειξε επιπλέον κυτταροτοξικά αποτελέσματα για MDR sublines. TG- και TM-απόπτωση των MDR sublines αποδείχθηκε σε δοκιμασία αννεξίνης-V και κηλίδα Western και καταπιεσμένη από αναστολέας παν-κασπάσης (Ζ-VAD-FMK). Η θεραπεία της MDR sublines με TG και TM επαυξημένης επίσης αυτοφαγία με τη συσσώρευση των πρωτεϊνών LC3-ΙΙ, κατανομή της ρ62 και το σχηματισμό των όξινων φυσαλιδώδους οργανίδια (Avós). Αναστολή της ATG5 από shRNA σίγασης μειωθεί σημαντικά αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο, αλλά δεν απόπτωση μετά TG ή θεραπεία TM. θεραπεία GMI ανέστειλε την φωσφορυλίωση της Akt /S473 και p70S6K /T389. Είναι ενδιαφέρον ότι η φωσφορυλίωση της ERK δεν συσχετίστηκε με GMI-επαγόμενη αυτοφαγία. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η αυτοφαγία παίζει ρόλο προ-θανάτου στη απέκτησε MDR και προς τα πάνω ρύθμιση αυτοφαγία από GMI μέσω Akt /mTOR αναστολή παρέχει μια πιθανή στρατηγική για την αντιμετώπιση MDR στη θεραπεία των καρκίνων του πνεύμονα

Παράθεση:. Chiu LY, Χου ME, Γιανγκ ΤΥ, Hsin IL, Ko JL, Tsai KJ, et al. (2015) Ανοσορρυθμιστικά Πρωτεΐνη από

Ganoderma Microsporum

Προκαλεί Pro-Θάνατος Autophagy μέσω Akt-mTOR-p70S6K Διαδρομή Αναστολή σε πολλαπλά φάρμακα ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 10 (5): e0125774. doi: 10.1371 /journal.pone.0125774

Ακαδημαϊκό Συντάκτης: Vladimir Τραΐκοβιτς, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο του Βελιγραδίου, Σερβία

Ελήφθη: 18 του Ιουνίου του 2014? Αποδεκτές: 26 Μαρ 2015? Δημοσιεύθηκε: May 6, 2015

Copyright: © 2015 Chiu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC-100 – 2320-B-040-005) και το Υπουργείο Επιστήμης και τεχνολογία, την Ταϊβάν (MOST-103-2320-B-040-015). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο κοινή κακοήθεια μεταξύ των ανδρών και των γυναικών. Παρά το γεγονός ότι η χημειοθεραπεία είναι η προτεινόμενη θεραπεία για προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), οι περισσότεροι ασθενείς αναπτύσσουν διασταυρούμενη αντοχή σε μια ποικιλία χημειοθεραπευτικών φαρμάκων (αντίσταση πολλαπλών φαρμάκων, MDR) [1]. Ρ-γλυκοπρωτεΐνη (P-gp), το προϊόν του ανθρώπινου

MDR-1 γονίδιο

, είναι ένα μέλος της μεγάλης ΑΤΡ-σύνδεσης οικογένεια κασέτα πρωτεϊνών μεμβράνης [2]. P-gp, εάν υπερεκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα, μπορεί να αντλήσει αντικαρκινικά φάρμακα έξω από τα κύτταρα. MDR είναι ένα κρίσιμο πρόβλημα στην χημειοθεραπεία. Τα νέα φάρμακα και τις στρατηγικές που απαιτούνται για να ξεπεραστεί MDR να αποκτήσουν καλύτερη πρόγνωση. Για να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας, η χρήση των κινεζικών φυτικά φάρμακα όπως MDR παράγοντες αναστροφής [3], MDR διαμορφωτές της ΑΤΡ-δέσμευσης μεταφορείς κασέτας [4] και λύσεις nanomedical για την παράκαμψη MDR έχει συζητηθεί εκτενώς [5].

Τόσο η docetaxel (DOC) [6] και βινκριστίνη (VCR) [7] οι τουμπουλίνη παράγοντες πρόσδεσης (TBA) που έχουν εφαρμοστεί κλινικά σε διάφορα σχήματα χημειοθεραπείας του καρκίνου. Ωστόσο, είναι ικανά να επάγουν MDR. Χρησιμοποιήσαμε DOC και το βίντεο ως παράγοντες επιλογής για τη θεραπεία Α549 κύτταρα NSCLC. Κάτω από συνεχή έκθεση, αρκετές DOC και VCR φάρμακο ανθεκτικά υποσειρές ελήφθησαν για περαιτέρω έρευνα. Σε προηγούμενη μελέτη, ανέφερε ότι όταν συνδυάζεται με DOC ή VCR, τρία L-τύπου αποκλειστές διαύλων ασβεστίου, βεραπαμίλη (VER), νιφεδιπίνη και διλτιαζέμη, αντίστροφη MDR με διαφορετικές αποτελεσματικότητες στην Γιατροί και βίντεο-ανθεκτικά sublines ανεξάρτητα από τα επίπεδα έκφρασης της εκροής μεταφορείς [8]. Ως εκ τούτου, είναι λογικό να υποθέσουμε ότι η δραστηριότητα αναστολέα διαύλου ασβεστίου συνδέεται με αντιστροφή της MDR ικανότητα. Συσσωρευμένα δεδομένα έχουν δείξει ότι η θεραπεία TBA οδηγεί σε διαταραχή της ομοιόστασης ασβεστίου [9]. Έτσι, το χαμηλό επίπεδο της πισίνας ενδοκυτταρικό ασβέστιο μπορεί να επιτρέψει MDR-θετικά κύτταρα για να διατηρηθεί ελεύθερη ρίζα βλάβης που προκαλείται σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες αγνώστων. Στο σύνολό τους, αλλοίωση των ενδοκυττάριων επιπέδων ασβεστίου ([Ca

2 +]

cyt) σε TBA ανθεκτικά sublines καρκίνο του πνεύμονα μπορεί να διαμορφώνει χημειοαντίσταση και ([Ca

2 +]

cyt) μεσολάβηση μονοπατιών είναι πιθανοί στόχοι για την υπέρβαση MDR.

το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) είναι ένα ενδοκυτταρικό χώρισμα αποθήκευσης ασβεστίου που παίζει ένα ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης ασβεστίου κυτταρικής [10]. Διαταραχές στην ομοιόσταση του ER επηρεάζουν πρωτεΐνη αναδίπλωση για να δημιουργήσει την απάντηση πρωτεΐνη ξεδιπλώνονται (UPR), που ονομάζεται επίσης το στρες ER [11]. ER στρες μπορεί να εξασφαλιστεί με φαρμακευτικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων θαψιγαργίνη (TG) [12] και τουνικαμυκίνη (TM) [13]. Όταν τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με TG, [Ca

2 +]

αυξήσεις cyt [14] για να δημιουργήσει autophagy [15] και την απόπτωση [16]. Η θεραπεία με TM οδηγεί στην επαγωγή της ER στρες με την αύξηση της [Ca

2 +]

cyt και συνδέεται επίσης με την απόπτωση [17] και αυτοφαγία [15,16]. Τρεις στρεσογόνους ER, TM, διθειοθρεϊτόλη (DTT) και πρωτεοσώματος αναστολέα MG132, έχουν δοκιμαστεί σε ινοβλάστες εμβρύου ποντικού (ΠΜΑ) και βρέθηκε να επάγει autophagy ρυθμίζοντας αρνητικά στόχου θηλαστικού Akt /ραπαμυκίνης (mTOR) οδού [18]. Ωστόσο, σαφείς ενδείξεις ενός μηχανισμού με τον οποίο αυτοφαγία ρυθμίζει τον κυτταρικό θάνατο σε καρκίνους MDR εξακολουθεί να απουσιάζει.

προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι ταξινομηθεί ως απόπτωση, νέκρωση ή αυτοφαγία [19,20]. Τα αποπτωτικά μονοπάτια περιλαμβάνουν αυτά που είναι εξωγενή και εκείνων που είναι εγγενή. Κάθε οδός συγκλίνει επί ασπαρτικών πρωτεασών κυστεΐνης-ειδικό γνωστή ως κασπάσες (έναρξη 8, 9, 10 και δήμιος 3, 6, 7) [20]. Αυτές οι κασπάσες διασπούν και να ενεργοποιήσετε κατάντη αποπτωτικών πρωτεϊνών, ρυθμίζοντας έτσι τον κυτταρικό θάνατο. Η απόπτωση είναι ένα σημαντικό αποτέλεσμα της αγωγής αντικαρκινικού φαρμάκου. Autophagy έχει επίσης μελετηθεί εκτενώς στη θεραπεία του καρκίνου. Autophagy ελέγχεται από μια ομάδα πρωτεϊνών που σχετίζονται με το γονίδιο εξελικτικώς διατηρημένη autophagy (ATG πρωτεΐνες) σε μια διαδικασία που περιλαμβάνει: (i) επαγωγή ή την έναρξη που συσχετίζεται με το σχηματισμό του phagophore? (Ii) πυρήνων? (Iii) η επιμήκυνση, Atg12-Atg5 και LC3 /Atg8 ελέγχεται κρίσιμο βήμα στη διαμόρφωση των αυτοφαγοσώματα? και (iv) ωρίμανση και αποικοδόμηση, στην οποία οι αυτοφαγοσώματα συντήκονται με ενδοσώματα-λυσοσώματα για να σχηματίσουν autolysosomes με αποικοδόμηση των αυλού περιεχομένων [21]. Το κατάλληλο επίπεδο αυτοφαγία που ενθαρρύνει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων έχει συζητηθεί στο πλαίσιο του ρόλου προ-επιβίωσης των αυτοφαγία σε εδραιωμένους όγκους [22,23]. Autophagy έχει προταθεί ως στόχος για την επαγωγή θανάτου καρκινικών κυττάρων [24,25] και η αναστολή της autophagy έχει βρεθεί να βελτιωθούν τα αποτελέσματα στη θεραπεία του καρκίνου [26]. Ωστόσο, επίμονο στρες μπορεί να προωθήσει την εκτεταμένη αυτοφαγία, που οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο. Ως εκ τούτου, και οι δύο αυτοφαγικά αναστολή [27] και επαγωγή έχουν εξεταστεί σε θεραπευτικές στρατηγικές [24] και έχουν εφαρμοστεί σε θεραπείες κατά του καρκίνου. Είτε αυτοφαγία παίζει ένα προ-θανάτου ή ρόλου προ-επιβίωσης μετά από χημειοθεραπεία που προκαλείται από την αντίσταση παραμένει ασαφής. Περαιτέρω έρευνα χρειάζεται για να επιλύσετε αυτό το ζήτημα και να διαχειριστούν καλύτερα αποκτήσει χημειοαντίσταση.

Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μυκήτων ανοσοτροποποιητικά, GMI, κλωνοποιήθηκε από

Ganoderma Microsporum

και καθαρός, έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζουν ανασταλτική επίδραση στην EGF που προκαλείται από τη μετανάστευση και την εισβολή [28]. Αυτή η πρωτεΐνη ρυθμίζει προς τα κάτω αλφα-επαγόμενη έκφραση του παράγοντα νέκρωσης όγκου του μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 9 μέσω του NF-κΒ μονοπάτι [29] και επάγει autophagy μέσω ενός μονοπατιού σηματοδότησης ασβεστίου με μεσολάβηση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα Α549 [30]. Η στοματική χορήγηση του GMI έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου και επάγουν αυτοφαγία σε γυμνούς ποντικούς με ξενομόσχευμα όγκου των κυττάρων Α549 [30]. Επιπλέον, autophagosome συσσώρευση έχει δειχθεί ότι επάγει αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο μέσω Akt μονοπάτι /mTOR σε GMI επεξεργασμένο μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα [31]. Για την περαιτέρω ελέγξετε τη λειτουργία των όγκων του GMI στο χημειοαντίσταση, ξενομοσχεύτηκε όγκοι των ζώων της docetaxel ανθεκτικά Α549 υπογραμμή υποβλήθηκαν σε θεραπεία με GMI και αναλύθηκαν. Εμείς χαρακτηρίζονται περαιτέρω τους ρόλους της απόπτωσης και αυτοφαγία σε MDR με σύγκριση των αποτελεσμάτων των δυο κλασικών επαγωγέων ER στρες, TG και TM, με GMI σε docetaxel- και βινκριστίνη-επιλεγμένα Α549 sublines καρκίνο του πνεύμονα.

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε τα αποτελέσματα και τους περιορισμούς της αυτοφαγία στο θάνατο του MDR sublines με στρεσογόνους παράγοντες ER, TG και TM, καθώς και ένα νέο στρεσογόνο, GMI, για την καλύτερη κατανόηση των ρόλων της απόπτωσης και αυτοφαγία στη θεραπεία του καρκίνου αντι-MDR. GMI που προκαλείται Akt /mTOR αναστολή οδού στην αυτοφαγία που σχετίζεται με κυτταρικό θάνατο, προτείνεται ως μέθοδος για την παράκαμψη MDR.

Υλικά και Μέθοδοι

Φάρμακα και χημικές ουσίες

λήφθηκε

DOC από την Aventis Pharmaceuticals Inc. (Bridgewater, NJ). VCR, VER, χλωροκίνη και ΤΜ ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Z-VAD-FMK αγοράστηκε από την Bachem (Torrance, CA). TG αγοράστηκε από Tocris Βιοεπιστημών (Μπρίστολ, Ηνωμένο Βασίλειο) και U0126 αγοράστηκε από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ). GMI, που κατασκευάζεται από την Mycomagic Βιοτεχνολογία Co, Ltd (Ταϊπέι, Ταϊβάν), δημιουργήθηκε και βελτιώνεται από το

Ganoderma Microsporum

[28].

Flow-τρεις δοκιμασία

Περίπου 2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε VER σε φρέσκο ​​μέσο για 2 ώρες. Μετά από αυτό, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε DOC, VCR ή GMI. Στο τέλος της περιόδου έκθεσης, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε ρυθμισμένο διάλυμα άλατος Hank (HBSS) με 3 μΜ Flow-τρεις (Invitrogen). Μετά τη χρώση, τα κύτταρα πλύθηκαν με HBSS δύο φορές, τοποθετήθηκαν σε HBSS που περιέχει 5% FBS, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

κυτταρικές σειρές και δοκιμασία κυτταροτοξικότητας (ΜΤΤ δοκιμασία)

κύτταρα Α549 ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος ήταν διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Τα ανθεκτικά DOC και VCR sublines καθιερώθηκαν από γονικά κύτταρα με σταδιακό τρόπο με έκθεση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις DOC ή VCR. Εν συντομία, για το DOC υπογραμμή, κύτταρα Α549 σε χαμηλή κυτταρική πυκνότητα σπάρθηκαν σε 10-cm τριβλίο Petri και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,5 ηΜ DOC μέχρι τα επιζώντα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε προφανές αποικία. Η επιλεγμένη αποικία ενισχύθηκε με την παρουσία 0.5 ηΜ DOC μέχρι συρροή πριν από την δόση του φαρμάκου αυξήθηκε σε πολλαπλάσια του δύο για τον επόμενο γύρο επιλογής. Η ανθεκτική DOC υπογραμμή διατηρείται σε 16 nM DOC είχε συμβολίζεται Α549 /D16. Μια παρόμοια ονομασία, Α549 /V16, δόθηκε σε ένα βίντεο σταθερά ανθεκτική υπογραμμή. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις του DOC, VCR ή GMI σε φρέσκο ​​μέσο για 48 ώρες. ευαισθησίες των ναρκωτικών σε DOC, βίντεο και GMI καθορίστηκαν με ΜΤΤ χρωματομετρική δοκιμασία. Τα λεπτομερή βήματα του προσδιορισμού ΜΤΤ έχουν περιγραφεί προηγουμένως [8]. Οι μέσες τιμές υπολογίστηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

ανάλυση Western blot

Οι σχετικές διαδικασίες έχουν περιγραφεί σε προηγούμενη έκθεση [8]. Οι πρωτεΐνες αντέδρασαν με ένα από τα ακόλουθα: αντι-LC3A (# 4599), αντι-LC3B (# 3868), αντι-PARP (# 5625), αντι-GADD153 (# 2895), αντι-GRP78 (# 3177), αντι -τ-Akt (# 9272), αντι-ρ-Akt Ser473 (# 9271), αντι-ρ-ΕΚΚ (# 4370), αντι-ρ-p70S6K Thr389 (# 9234) αγοράστηκε από την Cell Signaling (Danvers, ΜΑ), αντι-Ρ62 (GTX100685) που λαμβάνεται από GeneTex (Irvine, CA) ή μονοκλωνικό αντι-β-ακτίνης (Sigma, AC-40). Ανοσοϊστοχημεία (IHC) διεξήχθη με πολυκλωνικό αντι P-gp, που ακολουθείται από αντι-κατσίκας IgG (Santa Cruz Biotechnology) συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας. Αιματοξυλίνη χρησιμοποιήθηκε για αντιχρωματισμός.

Annexin V δοκιμασία

Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε ρυθμιστικό σύνδεσης με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και αννεξίνης V (FITC Annexin V ανίχνευσης απόπτωσης Kit 1, BD Biosciences, San Jose, CA), που ακολουθείται από ανάλυση με κυτταρομετρία ροής.

Μέτρηση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης με JC-1 Δοκιμασία

Χρησιμοποιήσαμε JC-1 (5 ‘, 6,6 «-tetrachloro-1,1 ‘, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ιωδίδιο) και ένα μιτοχονδριακό δυναμικό διασπαστή μεμβράνης, CCCP (καρβονυλ κυανιούχου 3-χλωροφαινυλυδραζόνη), για τη μελέτη της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (JC-1? Molecular Probes, Eugene, Ή). Πολωμένο μιτοχόνδρια εμφανίζονται ως κόκκινα και εκπολωμένο μιτοχόνδρια ως πράσινο. Η απόπτωση φαίνεται από μια αύξηση στο πράσινο αναλογία έντασης /κόκκινο φθορισμό. Για κάθε δείγμα, κύτταρα (5 × 10

5 κύτταρα /ml) εναιωρήθηκαν σε 1 ml ρυθμιστικό διάλυμα PBS και JC-1 (τελική συγκέντρωση, 2,5 μg /ml) προστέθηκε στο δείγμα, το οποίο επωάστηκε για 10 λεπτά στους 37 ° C. Τα βαμμένα κύτταρα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 400 χ g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε προσεκτικά. Το σφαιρίδιο στη συνέχεια πλύθηκε με 1-2 ml PBS. Τα κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρίας ροής (BD FACSCalibur).

Ανίχνευση και ποσοτικοποίηση των όξινων φυσαλιδώδους οργανίδια (Avos)

Τα λεπτομερή βήματα της ανάλυσης AVO έχουν περιγραφεί προηγουμένως [30]. Εν συντομία, μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν με HBSS δύο φορές, που ακολουθείται από χρώση με 1 g /ml πορτοκαλί της ακριδίνης (Sigma, Α 6014) και αραίωση σε HBSS που περιέχει 5% FBS για 15 λεπτά. Μετά τη χρώση, τα κύτταρα πλύθηκαν με HBSS και εναιωρήθηκαν σε HBSS που περιέχει 5% FBS. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού κόκκινο φίλτρο. Για την ποσοτικοποίηση του σχηματισμού AVO, πορτοκαλί ακριδίνης χρωματισμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με HBSS, επαναιωρήθηκαν σε HBSS που περιέχει 5% FBS και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής και το λογισμικό CellQuest.

ATG5 σίγηση από shRNA εκφράζοντας φακοϊό

μόλυνση λεντοϊών του Α549 /D16 και sublines Α549 /V16 πραγματοποιήθηκε σε σταθερά ενσωματώσει και να εκφράσουν σύντομο RNA φουρκέτας (shRNA) ακολουθίες στόχευσης ATG5 mRNA. Τα λεπτομερή βήματα του lentivirus παραγωγής έχουν περιγραφεί προηγουμένως [30].

Ζωικό μοντέλο των όγκων ξενομοσχεύματος

Για

in vivo

δοκιμασία ανάπτυξης όγκου, 4-εβδομάδων αρσενικών ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια (NOD.CB17-Prkdcscid /IcrCrlBltw) αγοράστηκαν από BioLASCO Ταϊβάν Co., Ltd. (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Πειραματικές διαδικασίες και το χειρισμό διεξήχθησαν σύμφωνα με τις διεθνείς οδηγίες για εργαστηριακές μελέτες σε ζώα. Η παρούσα μελέτη εγκρίθηκε από το Ιατρικό Πανεπιστήμιο Επιτροπής Φροντίδα Ζώων Chung Shan (Αριθμός Άδειας: 1238) και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Για τη δημιουργία ξενομοσχευμάτων Α549 όγκων, τα ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως με 5 χ 10

κύτταρα 6 Α549 /D16 (100 μΙ) συν 100 μΙ Matrigel (BD Biosciences, 354234). Έξι ζώα στη συνέχεια διαιρέθηκαν τυχαία σε δύο ομάδες αποτελούμενες από τρία ζώα το καθένα. Επτά ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων, οι ποντικοί στην ομάδα PBS υποβλήθηκαν σε αγωγή με 100 μΐ PBS με καθετηριασμό άπαξ ημερησίως και χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Η ομάδα GMI χορηγήθηκε GMI (160 μg ανά ποντικό αραιωμένο σε 100 μΙ PBS) με καθετηριασμό μία φορά ημερησίως. Τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν κάθε 3 ημέρες ξεκινώντας από την 16η ημέρα μετά την ένεση των κυττάρων και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε από τον τύπο: 0,5 χ μεγαλύτερη διάμετρο (mm) χ μικρής διαμέτρου

2 (mm). Λόγω του μεγέθους του όγκου μεταβλητότητα και το μικρό μέγεθος των ομάδων, μία μη παραμετρική δοκιμή Mann-Whitney U test εφαρμόστηκε με ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Μετά θανατώθηκαν τα ζώα, τα βάρη των όγκων μετρήθηκαν σε μικροζυγό και τα προϊόντα λύσης του όγκου (10-50 μg) αναλύθηκαν σε κηλιδώσεις Western χρησιμοποιώντας ιστό Protein ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης (FIVEphoton Biochemicals, San Diego, CA) για την παρασκευή των πρωτεϊνών.

η στατιστική ανάλυση

Όλες οι τιμές παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Τα δεδομένα συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων με τη χρήση t-test και * ρ & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Χαμηλά επίπεδα ενδοκυτταρικού ασβεστίου ([Ca

2 +]

cyt) από τα χημειοθεραπεία κύτταρα Α549 απορυθμίζεται από συνδυασμό TBA και θεραπεία βεραπαμίλη ή GMI

Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι η MDR του Α549 /D16 υποσειρά διαμεσολαβείται από ABC μεταφορέων (τυπικό MDR) και MDR του Α549 /V16 υπογραμμή διαμεσολαβείται από μη-ABC μεταφορέα-σχετιζόμενους παράγοντες (άτυπα MDR) [8]. P-gp απορυθμίζεται σε Α549 /D16 δευτερεύουσα γρα ή και προς τα κάτω σε Α549 /V16 υπογραμμή. Και οι δύο sublines εμφανίζουν διασταυρούμενη αντοχή σε DOC και VCR. Υποθέσαμε ότι ο μηχανισμός των αποκλειστές διαύλων ασβεστίου τύπου L στην αναστροφή της ευαισθησίας ΤΒΑ ανθεκτικών κυττάρων φαρμάκου συνδέεται με τη μεταβολή της ενδοκυτταρικής ομοιόστασης ασβεστίου. Για τον προσδιορισμό περαιτέρω τα επίπεδα ενδοκυτταρικού ασβεστίου ([Ca

2 +]

CYT) των γονικών καρκινικών κυττάρων και πολυανθεκτική υποσειρές, Fluo-τρεις χρησίμευσε ως φθορίζοντα δείκτη του ενδοκυτταρικού ασβεστίου επί κυτταρομετρία ροής. Επιπλέον, η μεταβολή της [Ca

2 +]

cyt παρακάτω συνδυασμένη VER και θεραπεία TBA προσδιορίστηκε. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι [Ca

2 +]

cyt της πολυανθεκτικής, P-gp υπερεκφράζουν, Α549 /υπογραμμή D16 (Σχήμα 1Α) διατηρείται όπως αποδεικνύεται από ένα χαμηλότερο επίπεδο φθορισμού από τα γονικά κύτταρα Α549. Είναι ενδιαφέρον ότι, στην χημειοθεραπεία και P-gp μειωτικά Α549 /V16 υπογραμμή κάτω [Ca

2 +]

cyt διατηρήθηκε επίσης (Σχήμα 1Β). Τα δεδομένα έδειξαν ότι [Ca

2 +]

cyt σε χημειοθεραπεία sublines είναι χαμηλότερη από ό, τι σε γονικά κύτταρα Α549. Όταν τα κύτταρα Α549 /D16 (Σχήμα 1 C) και της Α549 /V16 (Σχήμα 1 D) υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με VER ακολουθούμενη από ΤΒΑ, το επίπεδο της ανιχνεύεται φθορισμός αυξήθηκε σημαντικά, υπονοώντας ότι η [Ca

2 +]

cyt από χημειοθεραπεία sublines είναι αυξημένα όταν VER εκ νέου ευαισθητοποίηση χημειοθεραπεία κύτταρα εκτίθενται σε TBA κυτταροτοξικότητα. Προς τα πάνω ρύθμιση [Ca

2 +]

CYT από συνδυασμό VER και TBA θεραπείες ήταν ανεξάρτητη από το επίπεδο της έκφρασης της P-gp. Για να δοκιμαστεί η επίδραση του GMI στις [Ca

2 +]

cyt, αμφότερα υποσειρές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GMI (1,2 μΜ) για 24 ώρες ή 48 ώρες που ακολουθείται από ανάλυση σε δοκιμασία Fluo-τρεις. Το σήμα φθορισμού σε GMI-αγωγή Α549 /D16 υπογραμμή αυξήθηκε μετά από 24 ώρες (Σχ 1Ε) και αυξήθηκε περαιτέρω μετά από 48 ώρες θεραπείας GMI (Σχήμα 1 G) Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε υπογραμμή Α549 /V16 σε επεξεργασία με GMI για 24 ώρες (Σχ 1F ) και 48 h (Σχήμα 1). Τα δεδομένα που υποστηρίζονται υπόθεση μας ότι τα αυξημένα [Ca

2 +]

cyt διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη χημειοθεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα ευαισθητοποίηση σε θάνατο. Επιπλέον, GMI είναι σε θέση να προκαλέσει [Ca

2 +]

cyt ανύψωση MDR sublines.

Για να εξετάσει την [Ca

2 +]

cyt, η φθορίζουσα χρωστική Fluo -3AM επωάστηκε με (Α) γονικών Α549 και Α549 κύτταρα /D16, (Β) γονική Α549 και Α549 /V16 κυττάρων για 30 λεπτά. Λεπτή γραμμή αντιπροσωπεύει φόντο φθορισμού χωρίς Fluo-τρεις επώασης. Παχιά γραμμή αντιπροσωπεύει το φθορισμό μετριέται με κυτταρομετρία ροής. Για τη μέτρηση VER διαμόρφωση της [Ca

2 +]

cyt, (Γ) Α549 /D16 κύτταρα και (D) Α549 κύτταρα /V16 προ-αγωγή με VER (10 μΜ) για 2 ώρες που ακολουθείται από DOC ( 16 ηΜ) και VCR (16 ηΜ) θεραπεία για 48 ώρες, αντίστοιχα. Η [Ca

2 +]

cyt των κυττάρων Α549 /D16 σε επεξεργασία με GMI (1,2 μΜ) για 24 ώρες (Ε) ή 48 ώρες (G) έχουν αυξητικά. Η [Ca

2 +]

cyt των κυττάρων Α549 /V16 σε επεξεργασία με GMI (1,2 μΜ) για 24 ώρες (F) ή 48 ώρες (H) επίσης αυξητικά. Μετά fluo-3 ΑΜ επώαση, τα κύτταρα έγιναν ορατά με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. Η μέτρηση του αριθμού των κυττάρων (Count) υποδεικνύεται με τον Υ-άξονα και την ένταση Fluo-τρεις (FL 1-Η) υποδεικνύεται από τον άξονα Χ.

Η

GMI αναστέλλει P-gp υπερεκφράζουν την ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς ξενομοσχεύματος μοντέλο

Προηγουμένως, έχει δειχθεί ότι μετά από προθεραπεία με το χηλικοποιητή ασβεστίου ΒΑΡΤΑ-ΑΜ, GMI-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο φράσσεται. Προφανώς, GMI διεγείρει θανάτου από καρκίνο του πνεύμονα μέσω ενός μονοπατιού σηματοδότησης εξαρτώμενο από ασβέστιο [30]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε την ευαισθησία στη χημειοθεραπεία καρκινικών κυττάρων στη θεραπεία GMI επί δοκιμασία ΜΤΤ (Σχήμα 2Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο Α549 /D16 και Α549 /V16 sublines ανταποκρίνεται σε GMI (0,3 έως 1,2 μΜ) σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Οι ευαισθησίες GMI του Α549, Α549 /D16 και κύτταρα Α549 /V16 με υπολογίζεται IC

50 παρατίθενται στον Πίνακα 1. Επιπλέον, οι ποντικοί εμβολιάστηκαν υποδορίως με Α549 /D16 υπογραμμή που εκφράζουν υψηλά P-gp. Τα βάρη του όγκου σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με PBS ή GMI φαίνεται στο σχήμα 2Β. Σε σύγκριση με την ομάδα ποντικών χορηγήθηκε PBS, η ανάπτυξη των όγκων στην ομάδα GMI ήταν ανέστειλε σημαντικά. Αν και υπολογίζεται ο όγκος του όγκου ήταν συγκρίσιμη με Ρ1 και Ρ3, σημαντική νέκρωση του Ρ2 όγκου κατέληξε στο μικρότερο μέγεθος του όγκου ανακτηθεί Ρ2. Για να διασφαλιστεί ο πολλαπλασιασμός των εμφυτευμένων καρκινικών κυττάρων, δοκιμάσαμε την αποτελεσματικότητα GMI όταν οι όγκοι έφθασαν έναν όγκο 200 mm

3 κατά την 40ή ημέρα μετά την εμφύτευση (Εικ 2C). Η επίδραση κατά των όγκων των GMI δεν περιορίζεται σε μεγάλους όγκους.

(Α) Ανάλυση των αποτελεσμάτων του GMI (0.3, 0.6, 0.9 και 1.2 μΜ) επί της βιωσιμότητας των κυττάρων σε Α549, Α549 /D16 και Α549 /κύτταρα V16 σε δοκιμασία ΜΤΤ. (Β) Επτά ημέρες μετά την εμφύτευση Α549 /D16 κυττάρων, τα ποντίκια στην ομάδα PBS υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS ή με καθετηριασμό GMI άπαξ ημερησίως. Τα μεγέθη των όγκων της ομάδας PBS και η ομάδα GMI μετρήθηκαν μετά τα ποντίκια θυσιάστηκαν την ημέρα 64. (C) ποντικοί έλαβαν υποδόρια ένεση για εμφύτευση Α549 /D16 κύτταρο. Όταν ο όγκος του όγκου έφθασε 200 mm

3 κατά την ημέρα 40, οι ποντικοί στην ομάδα PBS υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS ή με καθετηριασμό GMI άπαξ ημερησίως. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. μια μη παραμετρική Mann-Whitney U εφαρμόστηκε με ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. (Ε) Τα επίπεδα της C-PARP, LC3A και LC3B σε έξι όγκους ξενομοσχεύματος προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western με τη στατιστική ανάλυση των LC3A-ΙΙ και εκφράσεις LC3B-II. (Δ) Εκπρόσωπος αποτελέσματα ανοσοχρώση της P-gp σε όγκους πνεύμονα Α549, Α549 /D16 αγωγή με PBS (Ρ1) και Α549 /D16 αντιμετωπίζονται με GMI (G1) ελήφθησαν από την IHC.

Η

η απόπτωση με τη μεσολάβηση διάσπαση πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP-1) με Capase-3 παρήγαγε μια 89 kDa ο-τελικό θραύσμα (c-PARP, που περιέχει την καταλυτική περιοχή), η οποία χρησίμευσε ως το μοριακό δείκτη σε ανοσοστυπώματα. Για να διαλευκανθεί ο ER στρες ρυθμιζόμενων αυτοφαγία, σχετιζόμενης με τους μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη ελαφριά αλυσίδα (LC3) πρωτεΐνη αναλύθηκε. LC3 έχει τρεις ισομορφές (LC3A, LC3B και LC3C) [32] εκ των οποίων εξετάστηκαν LC3A και LC3B. Οι GMI-αγωγή όγκων εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του c-PARP, LC3A-ΙΙ και πρωτεΐνες LC3B-ΙΙ, υποδεικνύοντας υψηλότερο αυτοφαγικά και αποπτωτικών δραστηριότητες σε σχέση με τα PBS-αγωγή όγκων ελέγχου (Εικόνα 2D). Για να αποδειχθεί υψηλό P-gp έκφραση στους όγκους ξενομοσχεύματος, IHC της Ρ-gp εφαρμόστηκε στα αντιπροσωπευτικά όγκους του Ρ1, G1 και γονικά κύτταρα Α549 (Εικόνα 2Ε). Οι όγκοι Ρ1 και G1 έδειξε ισχυρή έκφραση Ρ-σρ σε αντίθεση με τους όγκους των κυττάρων Α549. Τα δεδομένα από αυτά τα πειράματα του όγκου τα ποντίκια ξενομόσχευμα απέδειξε ότι GMI αναστέλλει την ανάπτυξη των P-gp υπερεκφράζουν χημειοθεραπεία κύτταρα και επάγει την απόπτωση και την αυτοφαγία.

Η απόπτωση και η αυτοφαγία διαφορικά ενισχύεται από το GMI, TG και TM σε MDR sublines καρκίνο του πνεύμονα

για να προσδιοριστεί εάν τα αποτελέσματα της GMI, TG και TM στην απόπτωση και την αυτοφαγία είναι δοσοεξαρτώμενη, θα αντιμετωπίζονται MDR sublines με διαφορετικές συγκεντρώσεις GMI, TG και TM που ακολουθείται από τον χαρακτηρισμό των μοριακών δεικτών σε ανοσοστυπώματα. Ένα από τα συστατικά του ER στρες με τη μεσολάβηση της οδού απόπτωσης είναι C /EBP ομόλογη πρωτεΐνη (CHOP), επίσης γνωστή ως arrest- ανάπτυξη και DNA βλάβη που επάγεται γονίδιο 153 (GADD153). Μια άλλη μεσολάβηση ER στρες πρωτεΐνη είναι GRP78, επίσης γνωστή ως Bip [11]. ER σχετίζονται με το στρες και οι πρωτεΐνες GADD153 GRP78 ανιχνεύθηκαν στο Α549 /D16 (Σχήμα 3Α) και Α549 /V16 (Σχήμα 3Β) μετά από θεραπεία sublines GMI. Η απόπτωση με τη μεσολάβηση της πρωτεΐνης c-PARP ρυθμίζεται αυξητικά μετά τη θεραπεία GMI, όπως ήταν οι αυτοφαγικά δείκτες LC3A-II και πρωτεΐνες LC3B-II.

(Α) κύτταρα Α549 /D16 (2 × 10

5 κύτταρα) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις GMI για 48 ώρες. Επίπεδα GADD153, GRP78, c-PARP, LC3A-Ι, LC3B-Ι, LC3A-ΙΙ, LC3B-ΙΙ και Ρ62 ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. Παρόμοιες συνθήκες εφαρμόστηκαν σε κύτταρα (Β) Α549 /V16 σε επεξεργασία με GMI. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων πρωτεΐνης σε Α549 /D16 υπογραμμή και (Δ) Α549 /V16 υπογραμμή που προκαλείται από TG. (Ε) κύτταρα Α549 /D16 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις ΤΜ για 48 ώρες. Παρόμοιες συνθήκες εφαρμόστηκαν σε (F) κύτταρα Α549 /V16. (G και H) Και οι δύο sublines υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναγραφόμενη συγκέντρωση GMI με την παρουσίας ή της απουσίας της χλωροκίνη. Η έκφραση της β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

GADD153 πρωτεΐνη δεν ανιχνεύθηκε σε Α549 /D16 υπογραμμή (Σχήμα 3C), αλλά προκλήθηκε με TG στο Α549 /V16 υπογραμμή (Σχήμα 3D). Οι πρωτεΐνες της GRP78 μπορούσε να ανιχνευθεί ασθενώς με μεγαλύτερο χρόνο έκθεσης (Σχήμα 3C). Βρέθηκαν σε σημαντικά υψηλότερες ποσότητες σε Α549 /V16 υπογραμμή (Σχήμα 3D) επί ανοσοστυπώματος. Υπήρξε μια επαγωγή δοσο-εξαρτώμενη των GADD153 από ΤΜ στο Α549 /D16 (Σχήμα 3Ε) και το Α549 /V16 (Σχήμα 3F) υποσειρές. Τα επίπεδα των πρωτεϊνών c-ΡΑΚΡ συντονίζονται καλά με τα επίπεδα πρωτεΐνης GADD153 στις δύο υποσειρές (Σχήμα 3D, 3Ε, και 3F). Τα δεδομένα μας έδειξαν επίσης ότι LC3A-ΙΙ εκφράζεται στο Α549 /D16 υπογραμμή και αυξάνει μετά 200 θεραπεία ηΜ TG, ενώ το επίπεδο της LC3B-ΙΙ δεν αυξάνει ακόμη και υπό υψηλή δόση (200 ηΜ) θεραπεία TG (Σχήμα 3C) και ένα μεγαλύτερο χρόνο έκθεσης για ανοσοαποτύπωση. Είναι ενδιαφέρον ότι, υπό επιλογή TBA, τόσο Α549 /D16 και sublines Α549 /V16 έδειξαν χαμηλά επίπεδα έκφρασης LC3B-ΙΙ (Σχήμα 3Α, 3C, 3Ε, 3Β, 3D και 3F, 0 ηΜ, αντίστοιχα). TG και TM ενίσχυσε την συσσώρευση των πρωτεϊνών LC3-ΙΙ σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε Α549 /V16 MDR υπογραμμή αλλά όχι σε Α549 /D16 υποσειρά, η οποία εξέφρασε υψηλά επίπεδα της Ρ-gp μετά από αγωγή TG (Σχήμα 3C). Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν ρ62, ο δείκτης autophagy ροή που αποικοδομείται σε autolysosomes [33], παρακολουθήθηκε σε MDR υποσειρές μετά από θεραπεία GMI, η έκφρασή της δεν ήταν μειωμένη όταν LC3-ΙΙ αυξηθεί (σχήμα 3Α και 3Β). Σε αντίθεση, τα επίπεδα της πρωτεΐνης του ρ62 μειωθεί σε TG (Σχήμα 3D) και ΤΜ-αγωγή sublines (Σχ 3Ε και 3F). Ο σχηματισμός της LC3-ΙΙ και σημαντική διάσπαση του ρ62 δείχνουν την έναρξη και την ολοκλήρωση της αυτοφαγικά ροή παρακάτω TG και θεραπεία TM σε MDR sublines (Σχήμα 3D, 3Ε και 3F). Στην προηγούμενη έκθεσή μας, αποδείξαμε ότι GMI που προκαλείται autophagosome συσσώρευση οδηγεί σε αυτοφαγικά θάνατο σε κύτταρα Α549 [31]. Αυτό μπορεί να εξηγήσει τη σταθερή στάθμη του Ρ62 σε GMI-αγωγή sublines (Εικ 3Α και 3Β). Δοκιμάσαμε περαιτέρω αν η GMI επαγόμενη ροή αυτοφαγικά μπορεί να παρατηρηθεί με έναν αναστολέα λυσοσωματικής, χλωροκίνη που ανέστειλε την ενδογενή κύκλου εργασιών LC3-II [24]. Όταν σε σύγκριση με τη θεραπεία GMI, σημαντική συσσώρευση των πρωτεϊνών LC3A-II σε sublines που συν-θεραπεία με χλωροκίνη καταδείχθηκαν (Σχήμα 3G και 3Η). Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν ότι GMI επάγεται αυτοφαγικά ροή σε καρκινικά κύτταρα MDR. Από τα αποτελέσματα αυτά, αυξάνεται το άγχος ER προωθεί τις εκφράσεις της αυτοφαγία και την απόπτωση ρυθμίζεται πρωτεϊνών σε MDR sublines. Τα δεδομένα έδειξαν ότι τα πτυχία της απόπτωσης και αυτοφαγία εξαρτώνται από τις συγκεντρώσεις GMI, TG και TM. GMI προκαλεί ER στρες, απόπτωση και αυτοφαγία στο MDR sublines παρόμοια με TG και TM δραστηριότητες, αλλά με διαφορετική αποτελεσματικότητα.

TM και TG προκαλέσουν το θάνατο των MDR sublines καρκίνο του πνεύμονα, αλλά η αποτελεσματικότητα TG περιορίζεται από την P-gp υπερέκφραση

Θα εξεταστεί περαιτέρω τη ρύθμιση της ανάπτυξης και των δύο sublines MDR από TG και TM σε δοκιμασία ΜΤΤ. Για τα γονικά κύτταρα Α549, υπήρχε περίπου 32% επιβίωση των κυττάρων μετά από θεραπεία με 200 ηΜ TG. Η κυτταροτοξικότητα ενισχύεται όταν τα κύτταρα Α549 συν-επεξεργάζονται με TG και DOC (16 ηΜ), με αποτέλεσμα την επιβίωση των κυττάρων κατά 19% στα 200 nm TG. Η βιωσιμότητα της υπογραμμής Α549 /D16 δεν επηρεάστηκε από TG ή TG ταυτόχρονης θεραπείας με DOC (Σχήμα 4Α). Σε αντίθεση, όταν τα κύτταρα Α549 /V16 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TG (200 ηΜ), 41% των κυττάρων επιβίωσαν (Εικόνα 4Β). Συνδυασμός βίντεο (16 nM) και TG δεν είχε καμία πρόσθετη κυτταροτοξική επίδραση στη δευτερεύουσα γρα Α549 /V16. Έχει αναφερθεί ότι TG είναι ένα υπόστρωμα της Ρ-gp [29]. Ως εκ τούτου, εφαρμόσαμε αναστολέας της P-gp, VER, για να καθορίσει εάν η κυτταροτοξικότητα των TG μπορεί να ανακτηθεί στο Α549 /D16 υπογραμμή. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όταν προστέθηκε 4 μΜ VER, η βιωσιμότητα των Α549 /D16 υπογραμμή μειώθηκε στο 42% στα 200 nm TG (Σχήμα 4Ε).

(Α) Η γονική Α549 και Α549 /κυττάρων D16 (2 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις TG με DOC (16 ηΜ) ή χωρίς DOC για 48 ώρες για μετρήσεις ευαισθησίας φαρμάκου. Παρόμοιες συνθήκες εφαρμόστηκαν σε (Β) Α549 και Α549 /V16 κυττάρων με VCR (16 ηΜ). (Γ) Η γονική Α549 και Α549 /D16 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις ΤΜ με DOC ή χωρίς DOC για 48 ώρες για μετρήσεις ευαισθησίας φαρμάκου. Παρόμοιες συνθήκες εφαρμόστηκαν σε (D) Α549 και Α549 /V16. (Ε) κύτταρα Α549 /D16 προ-αγωγή με VER (0, 0,5, 1, 2 και 4 μΜ) για 2 ώρες που ακολουθείται από διάφορες συγκεντρώσεις TG επί 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε σε δοκιμασία ΜΤΤ.

Η

Τα γονικά κύτταρα Α549 ήταν επίσης ευαίσθητα σε ΤΜ κυτταροτοξικότητα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Όταν τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΜ (2.5 μΜ), περίπου το 33% επέζησε. Όταν DOC συνδυάστηκε με ΤΜ, το 18% των γονικών κυττάρων Α549 παρέμεινε. Η υπογραμμή Α549 /D16 απάντησε επίσης να TM κυτταροτοξικότητα αλλά με μικρότερη ευαισθησία από ό, τι τα γονικά κύτταρα. DOC της ταυτόχρονης θεραπείας με ΤΜ δεν έδειξαν επιπλέον κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα Α549 /D16 (Σχήμα 4C). Η υπογραμμή Α549 /V16 ήταν λιγότερο ευαίσθητη σε ΤΜ από την υπογραμμή Α549 /D16 με 70% επιζώντα κύτταρα σε 2,5 μΜ ΤΜ. Ταυτόχρονης θεραπείας με VCR δεν είχε καμία σημαντική επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 /V16 (Σχήμα 4D). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι τα μητρικά κύτταρα Α549 ευαισθητοποιημένο σε TG /TM με επιπλέον κυτταροτοξικότητες όταν DOC ή VCR συνδυάζεται με TG ή TM. Ωστόσο, Α549 /D16 και Α549 /V16 sublines είναι λιγότερο ευαίσθητες σε ΤΜ από γονικά κύτταρα. Οι ευαισθησίες φαρμάκου της Α549, Α549 /D16 και κύτταρα Α549 /V16 να TG και TM με υπολογίζεται IC

50 παρατίθενται στον Πίνακα 1. Από την ανάλυση των δεδομένων, μόνο η Α549 /κυττάρων V16 ήταν πιο ευαίσθητα σε TG από γονική Τα κύτταρα Α549 (Εικόνα 4Β). Οι sublines MDR ήταν αναίσθητη σε TG (Σχήμα 4Α) και λιγότερο ευαίσθητα στην TM, σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα Α549 (Εικόνα 4C και 4D).

Ποσοτικοποίηση των TG- και TM-επαγόμενη απόπτωση και αυτοφαγία

Εκτός από την εξέταση των πρωτεϊνικών δεικτών απόπτωσης, χρησιμοποιήσαμε JC-1 και Annexin-V δοκιμασία για την ποσοτικοποίηση της απόπτωσης σε TG και TM-αγωγή υποσειρές.