Αφηρημένο

Ιστορικό

AP-4 ανήκει στο βασικό έλικα η θηλειά-έλικα λευκίνης φερμουάρ υποομάδα? ελέγχει την έκφραση του γονιδίου-στόχου, ρυθμίζει την ανάπτυξη, την ανάπτυξη και την κυτταρική απόπτωση και έχει ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση. προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι η AP-4 συχνά υπερεκφράζεται σε γαστρικών καρκίνων και μπορεί να σχετίζεται με την κακή πρόγνωση. Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να εξετάσει αν αποσιώπηση του AP-4 μπορεί να αλλάξει τα βιολογικά χαρακτηριστικά των γαστρικών καρκινικών κυττάρων.

Μέθοδοι

Δύο ειδικά τα siRNA στοχοθέτηση ΑΡ-4 σχεδιάστηκαν, συντέθηκαν και επιμολυσμένα σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και ανθρώπινα κανονικά κύτταρα βλεννογόνου. ΑΡ-4 έκφραση μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR και κηλίδος Western. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και χημειο-ευαισθησία ανιχνεύθηκαν με CCK-8 δοκιμασίας. δοκιμασία κυτταρικού κύκλου και δοκιμασία απόπτωσης διεξήχθησαν με κυτταρόμετρο ροής, και η σχετική έκφραση των ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου ανιχνεύθηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR και κηλίδος Western, η έκφραση των παραγόντων που εμπλέκονται στην οδό της απόπτωσης εξετάστηκαν σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης.

Αποτελέσματα

Η έκφραση του ΑΡ-4 σίγησε με την επιμόλυνση siRNAs και οι επιδράσεις της ΑΡ-4 knockdown διήρκεσε 24 έως 96 ώρες. Το siRNA μεσολάβηση αποσιώπηση του ΑΡ-4 κατέστειλε την κυτταρικό πολλαπλασιασμό, απόπτωση που επάγεται και ευαισθητοποιημένα καρκινικά κύτταρα σε αντικαρκινικά φάρμακα. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης του p21, p53 και κασπάση-9 αυξήθηκαν όταν ΑΡ-4 knockdown, αλλά η έκφραση της κυκλίνης D1, Bcl-2 και Bcl-x

L ανεστάλη. Αυτό δεν προκάλεσε τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου, όταν ΑΡ-4 νοκ ντάουν στον p53 ελάττωμα γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή Kato-ΙΙΙ.

Συμπεράσματα

Αυτά τα αποτελέσματα απεικονίζονται ότι η γονιδιακή σίγηση του AP-4 μπορεί αποτελεσματικά ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, η οποία προκλήθηκε απόπτωση και ευαισθητοποιημένα καρκινικά κύτταρα σε αντικαρκινικά φάρμακα in vitro, γεγονός που υποδηλώνει ότι η AP-4 siRNAs μεσολάβηση αποσιώπηση έχει πιθανή αξία στη θεραπεία του καρκίνου του ανθρώπινου γαστρικού

Παράθεση:. Liu Χ, Zhang Β, Guo Υ, Liang Q, Wu C, Wu L, et al. (2012) Down-κανονισμού του AP-4 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, Προκαλεί κυτταρικού κύκλου σύλληψης και προάγει την απόπτωση στα ανθρώπινα κύτταρα γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 7 (5): e37096. doi: 10.1371 /journal.pone.0037096

Επιμέλεια: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Ιούνη του 2011? Αποδεκτές: 18η Απριλίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: May 16, 2012 |

Copyright: © 2012 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αν και οι επίπτωσης και θνησιμότητας που συνδέονται με καρκίνο του στομάχου έχουν σταδιακά μειωθεί τα τελευταία χρόνια στις περισσότερες περιοχές του κόσμου [1], [2], γαστρικό καρκίνο παραμένει ένα παγκόσμιο πρόβλημα υγείας, και εξακολουθεί να είναι η πιο κοινή αιτία του σχετίζονται με τον καρκίνο θανάτων με μικρή βελτίωση της μακροχρόνιας επιβίωσης. Η πιο αποτελεσματική αντιμετώπιση του καρκίνου του στομάχου ήταν εντελώς χειρουργική αφαίρεση του νεοπλαστικού ιστού με D2 λεμφαδενεκτομή. Επιπλέον επικουρική χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία έχουν βοηθήσει να βελτιωθεί η πρόγνωση. Ακόμα κι έτσι, η 5-ετή επιβίωση παρέμεινε πολύ κακή [1], [3]. Περισσότεροι από ένα εκατομμύριο νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο, κυρίως στην Ανατολική Ασία, όπως η Ιαπωνία, η Κορέα και η Κίνα. Σε αυτές τις χώρες, γαστρικό καρκίνος παραμένει η πιο κοινή αιτία του σχετίζονται με τον καρκίνο θανάτους, και η ακριβής παθογένεση παραμένει άγνωστη [3].

Μεταγραφικοί παράγοντες είναι σημαντικοί ρυθμιστικά συστατικά [4]. Μπορούν ανήκε στην οικογένεια έλικας-βρόχου-έλικα και έπαιξε σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την διαφοροποίηση, προσδιορισμός κυτταρική γραμμή, η έκφραση του ενδοκυτταρικού γενετικών πληροφοριών, καθώς και άλλων βασικών διαδικασιών [5]. Ως μέλος της υποομάδας βασικού έλικας-βρόχου-έλικας λευκίνης φερμουάρ (bHLH-LZ) του bHLH πρωτεϊνών [6], ενεργοποιώντας πρωτεΐνη δέσμευσης ενισχυτή 4 (ΑΡ-4) αρχικά αναγνωρίστηκε ως κυτταρική πρωτεΐνη που δεσμεύεται στο ιό πιθήκου 40 (SV40) ενισχυτή και ενεργοποιείται το ιικό μεταγραφή όψιμων γονιδίων [7]. AP-4 είναι ένας πανταχού εκφραζόμενη παράγοντα μεταγραφής και μπορεί μεταγραφικού ελέγχου δικτύων κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαφοροποίησης με σχηματισμό ομοδιμερών και σύνδεση προς τη συμμετρική αλληλουχία DNA, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 είναι ένας συνδετήρας για ανοσοσφαιρίνη κάπα προαγωγού στοιχεία E-box, το οποίο μπορεί να εμπλέκεται σε ασθένειες ανοσοανεπάρκειας [13], [14]. Επιπλέον, σε αντίθεση με άλλες πρωτεΐνες HLH, ΑΡ-4 περιέχει δύο επιπλέον μοτίβα πρωτεΐνης διμερισμού που αποτελείται από λευκίνη επανάληψης στοιχείων LR1 και LR2. Ως εκ τούτου, ΑΡ-4 παρουσιάζει μια ειδική τριμερή δομή διμερισμό, υποδηλώνοντας ότι η AP-4 μπορεί να αλληλεπιδρά με μία ευρεία ποικιλία παραγόντων μεταγραφής [8], [14]. AP-4 ρυθμίζει την έκφραση ορισμένων γονιδίων [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Για παράδειγμα, ενεργοποιεί τη μεταγραφή του γονιδίου hMTIIA και συμμετέχει στη ρύθμιση της έκφρασης ανθρώπινης προεγκεφαλίνης [22], και μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην έκφραση της οικογένειας παγκρεατικών γονίδιο εξωκρινούς [23]. Πρόσφατα, η υπερέκφραση του ΑΡ-4 αναφέρθηκε στον καρκίνο του παχέος εντέρου, του καρκίνου του μαστού και του προστάτη [9], [18], [24].

παρεμβολή RNA (RNAi) είναι μια διαδικασία ειδικής αλληλουχίας μετα -transcriptional σίγηση του γονιδίου ξεκίνησε από δίκλωνο RNA [25], η οποία μπορεί να οδηγήσει στην αποσιώπηση ειδικών κυτταρικών γονιδίων και να προσφέρει μια ισχυρή προσέγγιση αντίστροφης γενετικής για την ανάλυση των λειτουργιών των γονιδίων τόσο in vitro όσο και in vivo [26]. Επί του παρόντος τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα γονιδιακής σίγησης μόρια νουκλεϊκών οξέων που βασίζεται ειδικής αλληλουχίας ήταν μικρά RNAs παρεμβολής [27], που ονομάζεται siRNAs, η οποία αποτελείται από συμμετρικές διπόλων του 19-21 ζεύγη βάσεων. [28] Η μέθοδος θα μπορούσε να αναστείλει siRNA έκφραση γονιδίου-στόχου με ειδικότητα, την αποτελεσματικότητα και την αντοχή [29].

αναφερθεί στο παρελθόν ότι η AP-4 υπερεκφράζεται σε καρκίνο του στομάχου και ότι μπορεί να σχετίζεται με την φτωχή πρόγνωση [30]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε περαιτέρω την λειτουργία AP-4 σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικό κύτταρο με παρεμβολή RNA.

Αποτελέσματα

Ειδικά siRNA που στοχεύει την έκφραση του ΑΡ-4 σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα και ανθρώπινα φυσιολογικό βλεννογόνο κύτταρα

για να αξιολογηθεί η επίδραση του siRNA μεσολάβηση σιωπή της γονιδιακής έκφρασης ΑΡ-4, τον έλεγχο siRNA και ΑΡ-4 ειδικές siRNAs επιμολύνθηκαν μέσα στα κύτταρα για 24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες και 96 h. Η αποτελεσματικότητα σε κάτω-ρύθμιση της έκφρασης του ΑΡ-4 γονίδιο που εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR και κηλίδος western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, ΑΡ-4 ειδικές siRNAs θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά την μεταγραφή του γονιδίου και μετάφρασης. Τα επίπεδα mRNA και η πρωτεΐνη του ΑΡ-4 μειώθηκαν με την ΑΡ-4 ομάδα διαμόλυνσης siRNA αλλά όχι στον έλεγχο siRNA (Σχήμα 1). Η siRNAs επαγόμενη καταστολή της ΑΡ-4 έκφραση θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ωστόσο, η αναλογία της αναστολής μειώθηκε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ο πιο αποτελεσματικός χρονικό σημείο ήταν μεταξύ 48 h έως 72 h σε καταστέλλει την έκφραση του ΑΡ-4. Τα σχετικά επίπεδα μεταγραφών mRNA μειώθηκε σημαντικά κατά σχεδόν 90% στην ομάδα siRNA-1, και 95% στην ομάδα siRNA-2. Υπήρξε στατιστική σημαντικότητα μεταξύ της ομάδας siRNAs και της ομάδας ελέγχου.

Τα διαφορετικά siRNAs επιμολύνθηκαν μέσα στα κύτταρα για 24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες, και 96 ώρες. Η έκφραση mRNA και πρωτεΐνης εξετάστηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR και κηλίδος Western. AP-4 ειδικές-siRNAs θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά την έκφραση του γονιδίου. Η επαγόμενη καταστολή της ΑΡ-4 έκφραση ξεκίνησε στις 24 ώρες, και ο λόγος αναστολής μειώθηκε μετά από 72 ώρες. Ο πιο αποτελεσματικός χρονικό σημείο ήταν 48 h και 72 h, τα σχετικά επίπεδα μεταγράφων mRNA μειώθηκε σημαντικά κατά σχεδόν 90%. Υπήρχε στατιστική σημαντικότητα μεταξύ AP-4 siRNAs ομάδες και ομάδες ελέγχου. (* Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01).

Η

κάτω ρύθμιση του ΑΡ-4 έκφραση ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ευαισθητοποιημένα ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα σε αντικαρκινικά φάρμακα

Για εξεταστεί το αποτέλεσμα του ΑΡ-4 ειδικές siRNAs επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και χημειο-ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων, 20 ηΜ ΑΡ-4 ειδικές siRNAs ή siRNA ελέγχου επιμολύνθηκαν και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με CCK-8 δοκιμασίας 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Βρήκαμε ότι knockdown ΑΡ-4 θα μπορούσε να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου SGC7901 και AGS (Σχήμα 2), αλλά όχι σε φυσιολογικό βλεννογόνο κυτταρική γραμμή GES-1 σε σύγκριση με την επιμόλυνση siRNA ελέγχου σε 48 ώρες (Σχήμα 2). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η AP-4 siRNAs εξασθένησε την κυτταρικό πολλαπλασιασμό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων in vitro. Επιπλέον, ερευνήθηκε ο ρόλος του ΑΡ-4 στην ρύθμιση της χημειο-ευαισθησία του ανθρώπινου γαστρικού καρκινικών κυττάρων. Συγκρίναμε την ευαισθησία φαρμάκου του ΑΡ-4 siRNAs με εκείνη του siRNA ελέγχου ή ψευδο κύτταρα και διαπίστωσε ότι οι σχετικοί ρυθμοί αναστολή της ΑΡ-4 ειδικές siRNAs ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη του ελέγχου siRNA ή ψευδο κυττάρων (ρ & lt? 0.0001) (Σχήμα 2 ). Επιπλέον, ΑΡ-4 siRNAs ενίσχυσε σημαντικά την ευαισθησία των κυττάρων σε ADR, 5-FU ή θεραπεία cis-plantinum σε δύο διαφορετικά δόσεις (Σχήμα 2), αυτά πρότειναν ότι τα κάτω ρύθμιση του ΑΡ-4 μπορεί να έχει ευεργετική επίδραση στην ευαισθησία της χημειοθεραπείας.

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και ανασταλτικές επιδράσεις των διαφόρων συγκέντρωση του 5-FU, ADR ή Cis-plantinum αξιολογήθηκαν με CCK-8 δοκιμασίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η AP-4 ειδικές-siRNAs θα μπορούσε να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι τα φυσιολογικά κύτταρα του βλεννογόνου (ρ & lt? 0,01) και την ενίσχυση των χημειο-ευαισθησίες των γαστρικών καρκινικών κυττάρων σε 5-FU, ADR ή Cis-plantinum ( p & lt? 0,0001). Υπήρχε στατιστική σημαντικότητα μεταξύ AP-4 siRNAs ομάδες και ομάδες ελέγχου (* p & lt? 0,05? * ρ & lt? 0,01)

Η

αποσιώπηση του AP-4 που προκαλείται από την έκφραση του κυτταρικού κύκλου σύλληψης και διαμορφώνεται η έκφραση. p53, p21 και κυκλίνη D1

Η επίδραση της ΑΡ-4 στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου διερευνήθηκε. Ανθρώπινα γαστρικό καρκίνο κύτταρα επιμολύνθηκαν με 20 siRNA ελέγχου ηΜ, και οι ΑΡ-4 ειδικές siRNAs για 48 ώρες, αντίστοιχα, που ακολουθείται από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου. Ενώ τα κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ελέγχου προχώρησε μέσω διαφορετικών φάσεων του κυτταρικού κύκλου, κύτταρα επιμολυσμένα με ΑΡ-4 ειδικές siRNAs εμφανίζεται σημαντικά υψηλότερη συχνότητα των κυττάρων στις φάσεις G0 /G1 (SGC7901 /siRNA-1: 68,81%? SGC7901 /siRNA-2: 68,97%? AGS /siRNA-1: 61,92%? AGS /siRNA-2: 63,67%) και μία χαμηλότερη συχνότητα των κυττάρων σε φάση S (SGC7901 /siRNA-1: 29,57%? SGC7901 /siRNA-2: 29,84%? AGS /siRNA-1: 24.36%? AGS /siRNA-2: 22,91%). Το ποσοστό των κυττάρων σε φάσεις G0 /G1 στο κύτταρο επιμολυσμένα με ΑΡ-4 siRNAs ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των mock κυττάρων (SGC7901: 54,65%? AGS: 48,44%) (ρ & lt? 0,05) ή να ελέγχουν siRNA (SGC7901 /έλεγχος siRNA: 52,18%? siRNA AGS /έλεγχος: 50.38%) (Σχήμα 3). Ως εκ τούτου, η επιμόλυνση με AP-4-ειδική siRNAs που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κυκλίνη κατά φάσεις Ο0 /Ο1.

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο, και η αναλογία των κυττάρων σε κάθε φάση του κύκλου κυττάρου αναλύθηκε. Στο γράφημα, η αναλογία των κυττάρων σε φάσεις G0 /G1 στο κύτταρο επιμολυσμένα με ΑΡ-4 siRNAs ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των mock κυττάρων ή ελέγχου siRNA. (* P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01).

Η

Το AP-4 ειδικές siRNAs που προκαλείται από μπλοκ του κυτταρικού κύκλου ερευνήθηκε περαιτέρω με την παρατήρηση των επιπτώσεων της ΑΡ-4 θεραπεία συγκεκριμένων siRNAs στη σχετική έκφραση των ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου: ογκοκατασταλτικό ρ53, την εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολέας κινάσης ρ21, και το G (1)-φάση-ειδική κυκλίνη D1, οι οποίες ήταν κρίσιμες ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα συλλέχθηκαν για PCR πραγματικού χρόνου και την ανάλυση ανοσοστυπώματος. Η επιμόλυνση με ΑΡ-4 ειδικές siRNAs μπορούσε πλειορύθμιση της έκφρασης του ρ53 και ρ21 πρωτεΐνης. Η ρυθμιστική επίδραση της ΑΡ-4 siRNAs ήταν μεγαλύτερη από εκείνη του siRNA ελέγχου (Σχήμα 4) (ρ & lt? 0,01). Όπως ήταν αναμενόμενο, η κυκλίνη D1 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου siRNA και ψευδο ομάδα (Εικόνα 4) (ρ & lt? 0,01). Αυτά τα δεδομένα υποστήριξαν περαιτέρω την υπόθεση ότι η αποσιώπηση της έκφρασης του ΑΡ-4 αλλοιωθεί την έκφραση άλλων ρυθμιστών κυτταρικού κύκλου, που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου και ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων γαστρικών καρκινικών κυττάρων

Αναστολή της ΑΡ-4 έκφραση μπορούσε επάνω -regulate την έκφραση του mRNA p53 και p21 και πρωτεΐνες, αλλά ρυθμίζουν προς τα κάτω την D1 κυκλίνης. (* P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01).

Η

Ανίχνευση της απόπτωσης και οι παράγοντες που εμπλέκονται στο μονοπάτι της απόπτωσης

Για να ποσοτικοποιηθεί η επίδραση του AP-4 ειδικές siRNAs στο απόπτωση σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα, Annexin-V και προσδιορισμούς χρώσης ΡΙ χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα βάφονται με Annexin V-FITC /ΡΙ και περιφραγμένη σε Κάτω Δεξιά (LR) και επάνω δεξιά (UR) τεταρτημόρια. Τα κύτταρα στο LR και UR θεωρήθηκαν πρώιμων αποπτωτικών (αννεξίνη

+ /ΡΙ

-) και αργά αποπτωτικών (αννεξίνη

+ /ΡΙ

+), αντίστοιχα. Κύτταρα σε LL (κάτω αριστερά) και UL (επάνω αριστερά) τεταρτημόρια θεωρήθηκαν ότι είναι ζωντανός και νεκρωτικές αντίστοιχα. Έκταση της απόπτωσης που εκφράζεται ως το άθροισμα των ποσοστών στο LR και UR τεταρτημόρια. Τα αποπτωτικά ποσοστά έδειξε στην Εικόνα 5. Τα επεξεργασμένα κύτταρα με AP-4 siRNAs έδειξε πιο αποπτωτικών κυττάρων (SGC7901 /siRNA-1: 14,0%? SGC7901 /siRNA-2: 11,5%? AGS /siRNA-1: 20,1%? AGS /siRNA-2: 23,6%) από ό, τι το siRNA αρνητική (SGC7901 /έλεγχος: 5,5%? siRNA AGS /έλεγχος: 6,7%) (p & lt? 0,05) και κενό (SGC7901: 4,2%? AGS: 4,9%) (p & lt? 0,05) . Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η AP-4 Ειδικοί siRNAs ήταν σε θέση να διεγείρει απόπτωση σε αυτά τα κύτταρα.

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με διπλό Annexin-V και ΡΙ. Το ποσοστό απόπτωσης των κυττάρων επιμολυσμένων με ΑΡ-4 siRNAs ήταν υψηλότερο από το siRNA ελέγχου (ρ & lt? 0,05) και mock κυττάρων (ρ & lt? 0,05). (* P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01).

Η

Επιπλέον, εξετάσαμε την έκφραση των παραγόντων που εμπλέκονται στο μονοπάτι της απόπτωσης με PCR πραγματικού χρόνου σε επίπεδο mRNA, όπως Bcl-2, Bcl -x

L, κασπάσης-9, κασπάσης-8 και Bax. Έδειξε ότι knockdown ΑΡ-4 θα μπορούσε να ρυθμίζουν την έκφραση της Baspase-9 σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικά κύτταρα, και η ρυθμιστική επίδραση του ΑΡ-4 siRNAs ήταν μεγαλύτερη από εκείνη του siRNA ελέγχου (Σχήμα 6) (ρ & lt? 0,01). Η έκφραση του Bcl-2 και Bcl-x

L μειώθηκαν σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA ή ψευδο ομάδα (Σχήμα 6) (ρ & lt? 0,01). Αυτά τα δεδομένα υποστήριξαν ακόμη ότι η αποσιώπηση του ΑΡ-4 έκφραση οδήγησε σε απόπτωση σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, η έκφραση της κασπάσης-8 και Bax ήταν διαφορετικές σε διαφορετικές κυτταρικές γραμμές μετά από διαμόλυνση. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, κασπάση-8 και Bax ήταν πάνω από έκφραση σε AGS κύτταρα. Σε SGC7901 κύτταρα, η έκφραση του Bax αυξηθεί, αλλά η έκφραση της κασπάσης-8 αυξήθηκε μόνο στην ομάδα siRNA-1. Σε siRNA-2 ομάδα, κασπάση-8 έκφραση δεν ήταν σημαντική προσβεβλημένο (Σχήμα 6).

Αναστολή της ΑΡ-4 έκφραση θα μπορούσε να ρυθμίζουν τη μεταγραφή της κασπάσης-9 αλλά ρυθμίζουν προς τα κάτω την Bcl-2 και Bcl-x

έκφραση L σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο, αλλά κασπάση-8 και την έκφραση Bax ήταν διαφορά σε διαφορετικές κυτταρικές γραμμές μετά από διαμόλυνση. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, κασπάση-8 και Bax ήταν πάνω από έκφραση σε AGS κύτταρα. Σε SGC7901 κύτταρα, Βαχ ήταν πάνω έκφραση, κασπάση-8 έκφραση επίσης πάνω ρυθμισμένα στην ομάδα siRNA-1, αλλά στην ομάδα siRNA-2, κασπάση-8 έκφραση δεν ήταν σημαντική επηρεάζονται. (* P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01).

Η

AP-4 αποσιώπηση θα μπορούσε να ρυθμίσει κυτταρική απόπτωση του κυτταρικού κύκλου και στις δύο p53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη-ήθη

Για να επαληθεύσετε αν η ρύθμιση προς τα πάνω της ρ53 σε ΑΡ-4 knockdown γαστρικών καρκινικών κυττάρων ήταν κρίσιμη στο ρόλο της διακοπής κύκλου κυττάρου, τα κύτταρα Kato-ΙΙΙ, ένα είδος p53 ελάττωμα γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η εξάρτηση του ΑΡ-4 knockdown επηρεάσει σε p53. Βρήκαμε ότι knockdown του ΑΡ-4 σε AGS με άγριου τύπου ρ53 ή SGC7901 με μεταλλαγμένο ρ53 θα μπορούσε να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου, αλλά το φαινόμενο αυτό δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα Kato-ΙΙΙ (Σχήμα 7), το ποσοστό των κυττάρων σε G0 /G1 φάσεις ήταν 57,82% (siRNA-1), 59,05% (siRNA-2), 59,59% (έλεγχος siRNA) και 59,06% (mock). Όσοι δήλωσαν ότι νοκ ντάουν AP-4 ίσως ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο μέσω της οδού p53-p21. πληθυσμός απόπτωση ανιχνεύθηκε επίσης σε κύτταρα Kato-ΙΙΙ με Annexin V-FITC και ΡΙ χρώση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ρυθμός της απόπτωσης των κυττάρων Kato-ΙΙΙ επιμολυσμένα με ΑΡ-4 siRNAs (siRNA-1: 7,9%? SiRNA-2: 9,2%) ήταν υψηλότερη από τον έλεγχο siRNA (3,3%) (ρ & lt? 0,05) και ψευδο κύτταρα (3,5%) (ρ & lt? 0,05), αλλά σε μικρότερο βαθμό από ό, τι για την ΕΕΑ (ρ & lt? 0,05) και SGC7901 κυττάρων (ρ & lt? 0,05), υποδεικνύοντας ότι φίμωση ΑΡ-4 θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα μέσω τόσο ρ53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη-τρόπους.

στο κελί Kato-ΙΙΙ, η έκφραση ΑΡ-4 προφανώς κάτω-ρυθμίζονται σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ωστόσο, η επαγωγή της διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης δεν παρατηρήθηκαν σε κύτταρα Kato III. Οι αναλογίες των κυττάρων σε G0 /G1, G2 /M φάσεις και S δεν ήταν σημαντική διαφορά μεταξύ AP-4 siRNAs ομάδες και ελέγχου ή ψευδο ομάδες. Ο ρυθμός απόπτωση κυττάρων Kato III-επιμολυσμένα με ΑΡ-4 siRNAs ήταν υψηλότερο από το siRNA ελέγχου (ρ & lt? 0,05) και mock κυττάρων (ρ & lt? 0,05). Ωστόσο, ο ρυθμός απόπτωσης σε κύτταρα Kato-ΙΙΙ με AP-4 αποσιώπηση ήταν χαμηλότερη από AGS και SGC7901 κύτταρα με ΑΡ-4 σίγηση (p & lt? 0,05)

Η

Συζήτηση

Gene. έκφρασης είναι ένα θεμελιώδες και άκρως συντηρημένες διαδικασία. Μεταγραφή, το πρώτο βήμα στη γονιδιακή έκφραση, εκτελείται με δομικά συντηρημένες DNA πολυμεράσες εξαρτώμενη RNA, που έχει σαν αποτέλεσμα τη σύνθεση ενός μορίου RNA από μία μήτρα DNA [31]. Οι μεταγραφικοί παράγοντες, μορφή μεταγραφής σύμπλεγμα έναρξης με RNA ΠΟΛΥΜΕΡΑΣ II, συμμετέχουν στη διαδικασία της έναρξης της μεταγραφής για τη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου. Μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στον μετασχηματισμό, ογκογένεση, την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση με ρύθμιση της μεταγραφής και ως εκ τούτου την έκφραση του γονιδίου [32], [33], [34]. παράγοντας μεταγραφής ΑΡ-4, που ανήκει στον ταχέως αυξανόμενη ομάδα των HLH πρωτεϊνών [8] εμπλέκεται στην διαφοροποίηση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [35], [36], [37], [38], [39], επηρεάζει γεγονότα του κυτταρικού κύκλου και απόπτωση, ρυθμίζει και ελέγχει κάποια γονιδιακή έκφραση [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι η ΑΡ-4 πάνω ρυθμισμένα σε καρκίνωμα παχέος εντέρου, του καρκίνου του μαστού και του καρκίνου του προστάτη [9], [18], [24]. Επιπλέον, AP-4 θετική έκφραση έδειξε μια κακή πρόγνωση που έχουν σημασία για πάνω από βαθμό, την κατάσταση του κόμβου ή το μέγεθος των ER + καρκίνο του μαστού, και μια πιθανή συσχέτιση με χημειο-ευαισθησία [40]. Σε μας μελετήσουμε προηγουμένως, έχουμε βρει ότι η έκφραση του ΑΡ-4 βρέθηκε να υπερεκφράζεται και συν-σχετίζεται με κακή πρόγνωση [30]. Μπορεί να είναι ένα μοριακό δείκτη για τη διάγνωση και την πρόγνωση του καρκίνου του στομάχου. Στην παρούσα μελέτη ,. Σχεδιάσαμε δύο συγκεκριμένα siRNAs ΑΡ-4 να αναστέλλει την έκφραση του γονιδίου ΑΡ-4 σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Είχαν καλά εδραιωμένη και επιμολύνονται σε κύτταρα για να οδηγήσει σε knock-down της έκφρασης του γονιδίου ΑΡ-4. Βρήκαμε ότι το πλέον ισχυρό χρονικό σημείο στην καταστολή της έκφρασης ΑΡ-4 σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα ήταν 48 ώρες και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Έτσι, επιλέξαμε το πρώτο για την εκτέλεση περαιτέρω τις σχετικές εξετάσεις.

Στο παρελθόν, έχει δείξει ότι μεταγραφικού παράγοντα AP-4, σε αντίθεση με άλλες πρωτεΐνες HLH, περιείχαν δύο διακριτές λευκίνη επανάληψης στοιχείων τα οποία επίσης άμεση διμερισμό και αφήστε το επιλεκτική σχηματισμός συμπλόκου πανταχού παρούσα πρωτεΐνη ΑΡ-4 [8], [41].

AP-4 θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της κυτταρικής λειτουργιών μέσω ρύθμισης των γονιδίων που εμπλέκονται στην παραγωγή ιικών [7], [16 ], [22], [42], [43], την κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση [9], [17], [23], [44], η ανοσολογική απόκριση [14], [41], [45], και την αγγειογένεση [21]. Peter Jung, et al βρήκαν ότι ΑΡ-4 θα μπορούσε να κωδικοποιεί ένα c-MYC-επαγώγιμο καταστολέα να αναστείλουν την έκφραση του p21 [9], και πιθανώς έπαιξε σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση της πολλαπλασιαστικής δραστικότητας του c-myc [10]. Επιπλέον, ΑΡ-4 επηρέασε την ευαισθησία στην απόπτωση με τη ρύθμιση της έκφρασης της κασπάσης-9 [17]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι τα κάτω ρύθμιση του AP-4 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων γαστρικών καρκινικών κυττάρων in vitro. Η αναλογία αναστολής πολλαπλασιασμού του ΑΡ-4 ειδικές siRNAs ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου ή ψευδο ομάδα.

Η χημειοθεραπεία είναι ένας σημαντική στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου, αλλά συχνά αποτυγχάνει εξαιτίας η αντίσταση σε αντικαρκινικά φάρμακα. Έχει αναφερθεί ότι η ΑΡ-4 θετική έκφραση πιθανώς συνδέεται με χημειο-ευαισθησία [40]. Στη συνέχεια ερευνήσαμε το ρόλο του ΑΡ-4 στην ρύθμιση της χημειο-ευαισθησία του ανθρώπινου γαστρικού καρκινικά κύτταρα και βρέθηκε ότι η αναστολή της ΑΡ-4 θα μπορούσε να ενισχύσει σημαντικά την ευαισθησία αυτών των κυττάρων σε ADR, 5-FU ή θεραπεία cis-plantinum, υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της ΑΡ-4 μπορεί να έχει ευεργετική επίδραση στην χημειο-ευαισθησία.

Επιπλέον, αποσιώπηση του ΑΡ-4, που προκαλείται από διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε φάσεις Ο0 /Ο1, ανάλυση μιας δυνητικής μηχανισμοί που διέπουν τις επιδράσεις της το AP-4 σίγηση σε αναστολή του πολλαπλασιασμού των ανθρωπίνων γαστρικού καρκίνου κυττάρων που χαρακτηρίζεται από την έκφραση των ρυθμιστικών συνδέονται με τον κύκλο του κυττάρου. Βρήκαμε ότι τα κάτω ρύθμιση του ΑΡ-4 ανέστειλε την έκφραση έκφραση της κυκλίνης D1, αλλά επάνω ρυθμισμένη την έκφραση της ρ53 και ρ21. ρ53 και ρ21 έχει υποτεθεί ότι είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό [46], [47], από την άλλη πλευρά, η κυκλίνη D1 προωθείται προόδου μέσω του G

φάσης 1-S του κυτταρικού κύκλου [48 ]. Down-ρυθμιζόμενη έκφραση του ΑΡ-4, p21 και p53 εν τω μεταξύ θα μπορούσε να κάνει τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου που προκαλείται νοκ ντάουν του AP-4 εξαφάνιση. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με ένα μοντέλο στο οποίο AP-4 επάγει την αναστολή του κυτταρικού κύκλου με τη ρύθμιση της έκφρασης των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, όπως ρ53, ρ21 και την κυκλίνη D1.

Η απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, είναι γνωστή να συμμετέχουν σε διάφορες βιολογικές διεργασίες από δύο κύριους αποπτωτικών οδών, μιτοχονδριακή (ενδογενές) οδού και του υποδοχέα θανάτου (εξωγενής) οδού [49]. Βρήκαμε ότι η αποσιώπηση της έκφρασης ΑΡ-4 trigged κυτταρικής απόπτωσης στο πείραμά μας, η οποία κατέδειξε ότι η ΑΡ-4 κατέστειλε την απόπτωση στα ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

Στο πείραμά μας, αυξάνοντας τα επίπεδα της κασπάσης-9 και κάτω ρύθμιση του Bcl-2 και Bcl-x

L ανιχνεύθηκαν σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικά κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η knockdown του ΑΡ-4 ενεργοποιούνται τόσο ενδογενών και εξωγενών οδών σε απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα. [49], [50]

Εν περιλήψει, τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η μεσολάβηση RNAi κάτω ρύθμιση παράγοντα μεταγραφής ΑΡ-4 ανέστειλε αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, που υποδεικνύεται διακοπή του κυτταρικού κύκλου, ενεργοποιείται απόπτωση και ενισχυμένη χημειο-ευαισθησία του ανθρώπινου γαστρικού καρκινικών κυττάρων με τη μειωμένη έκφραση της κυκλίνης D1, Bcl-2 και Bcl-x

L και ενεργοποιημένα p21, p53 και της έκφρασης της κασπάσης-9, η οποία πρότεινε ΑΡ-4 μπορεί να είναι ένα ογκογονίδιο που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση . Αν και ο ακριβής μηχανισμός αυτού του ρόλου πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω, το AP-4specific-siRNAs μπορεί να είναι πιθανών τιμών ως νέων θεραπευτικών παραγόντων για την ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Η κυτταρική γραμμή και κυτταρικής καλλιέργειας

Ανθρώπινο κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου AGS με άγριου τύπου ρ53, SGC7901 με μεταλλαγμένο p53 (που λαμβάνεται από το Πανεπιστήμιο Wuhan) και Κάτω-ΙΙΙ με τη διαγραφή του γονιδιώματος p53 (Zhiyan Bio Technology Co, Σαγκάη) καλλιεργήθηκαν σε μέσο ή RPMI1640 μέσο DMEM (Invitrogen) που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (Invitrogen), πενικιλλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Ειδικά siRNA και διαμόλυνση

Η αλληλουχία cDNA του ΑΡ-4 γονίδιο ελήφθη από Genbank ( NM_003223) και οι ακολουθίες στόχευσης των δύο 21-νουκλεοτιδίων διαφορετικά siRNAs σχεδιάστηκαν και συντεθεί χημικά (Qiagen Γερμανία). Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες ήταν ως εξής: siRNA-1, 5′-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 ‘(νοηματικό), και 5′-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3′ (antisense). siRNA-2, 5’-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 ‘(νοηματικό), και 5′-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3’ (antisense). Allstars αρνητικό siRNA ελέγχου (Qiagen Γερμανία) χρησιμοποιήθηκαν ως κωδικοποιημένο ελέγχου siRNA. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και τα siRNAs διαμολύνθηκαν σε κύτταρα καλλιέργειας με Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

Σύνολο εκχύλιση RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας RNAiso Plus (Takara, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα cDNA από ολικό RNA συντέθηκαν χρησιμοποιώντας PrimeScript® RT κιτ αντιδραστηρίου (Takara, Ιαπωνία). Η έκφραση του mRNA εκτιμήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου σε έναν ΑΒΙ StepOne Plus (Applied Biosystems, Σιγκαπούρη) με Fast SYBR Green PCR αντιδραστήρια. GAPDH εφαρμόστηκε ως εσωτερικού ελέγχου. Οι συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων ρυθμίστηκαν να καταλήξουν σε τελικό όγκο 20 μί, που περιείχε 2 μΐ αντίστροφης-μεταγράφεται προϊόν, 10 μΐ Fast SYBR® Πράσινης Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), και 0,5 μΐ 10 μΜ προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές. Η αντίδραση πραγματοποιείται με 45 κύκλους ενίσχυσης στους 95 ° C για 3 s και 60 ° C για 30 s. Οι ακόλουθοι εκκινητές σχεδιάστηκαν (Table.1). PCR εκκινητές σχεδιάστηκαν από Primer 5.0 και αναζήτησης Blast να ελέγξει ειδικότητα. Primer αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται στον Πίνακα 1. Τα αποτελέσματα υπολογίζονται με τη χρήση 2

-ΔΔCt μέθοδο.

Η

κηλίδας Western

Η πρωτεΐνη εκχυλίζεται με κιτ εκχύλισης πρωτεϊνών (Beyotime, Κίνα) σύμφωνα με την κατεύθυνση. Η πρωτεΐνη αραιώθηκε σε 3 μg /μl και διαχωρίστηκε με 10% SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (Millipore, USA), και στη συνέχεια μπλοκαρίστηκε σε 5% άπαχο γάλα σε σκόνη σε TBST για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-ΑΡ-4 αντίσωμα (Sigma-Aldrich, Σαγκάη, αραίωση 1:1000), αντι-ρ21 αντίσωμα (Sigma-Aldrich, Σαγκάη, αραίωση 1:1000), αντι-ρ53 αντίσωμα (Abcam, UK, αραίωση 1:500) και αντι-κυκλίνης D1 αντίσωμα (Abcam, UK, αραίωση 1:500) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά από τρεις φορές ξεπλένονται με TBST, η μεμβράνη επωάστηκε με υπεροξειδάση αρμορακίας συζευγμένη με δευτερογενή αντισώματα (αραίωση 1:2000, Boster, Κίνα) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το αποτέλεσμα ήταν ορατό με το σύστημα ανίχνευσης ECL κηλίδωση Western Plus σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντι-β-ακτίνης (αραίωση 1:1000, Boster, Κίνα) αντίσωμα που ενήργησε ως εσωτερικού ελέγχου.

Μέτρηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

Η επίδραση της αποσιώπησης AP-4 στην γαστρική πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης μετρήθηκε με Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8) (Beyotime, Κίνα), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, γαστρικό καρκίνο κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με 20 ηΜ siRNA ελέγχου, ΑΡ-4 ειδικές siRNAs. Μετά από 48 ώρες, 10 μΙ του CCK-8 αντιδραστήριο προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, Μετά από 1 ώρα επώασης στους 37 ° C, μετράται η απορρόφηση στα 450 nm. Τα σχετικά επίπεδα του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε κάθε ομάδα κυττάρων που υπολογίσθηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: R = (Α2-Α1) /A2 × 100% και Ρ = A1 /A2 × 100% όπου το R ήταν σχετικά ανασταλτική ρυθμό και Ρ ήταν σχετικά αναλογία πολλαπλασιασμό της κυτταρικής ανάπτυξης? A1was μέση τιμή απορρόφησης των επιμολυσμένων κυττάρων? και Α2 ήταν η μέση τιμή απορρόφησης του μη επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου χωρίς φαρμακευτική αγωγή. Όλα τα πειράματα έγιναν με 5 φρεάτια ανά πείραμα και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

κυτταρικού κύκλου Δοκιμασία

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και σταθεροποιήθηκαν σε 70% παγωμένης αιθανόλης όλη τη νύκτα, πλύθηκε με 1 × PBS, και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (50 μg /ml) σε 1 × PBS συμπληρωμένο με RNase (50 μg /ml) για 30 λεπτά. Οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για κάθε δείγμα, και οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με κυτταρόμετρο ροής (FACS CantoII, BD Bioscience, Η.Π.Α.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

δοκιμή χημειοθεραπείες ευαισθησία in vitro

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, CCK-8 δοκιμασία χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της επίδρασης του χημειο-ευαισθησία των γαστρικών καρκινικών κυττάρων σε αντικαρκινικά φάρμακα. Εν συντομία, έξι ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις του φαρμάκου κατά του όγκου (ADR, 5-FU ή cis-λευκόχρυσος) και επωάστηκαν για 48 ώρες. Σχετικά ποσοστό αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο που αναφέρονται παραπάνω.

Προσδιορισμός απόπτωσης με Annexin V-FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση

Για να εκτιμηθεί το ποσοστό της κυτταρικής απόπτωσης, απόπτωση ποσοτικοποιήθηκε με αννεξίνη-V-FITC και το ιωδιούχο προπίδιο διπλή χρώση χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης-ν /FITC κιτ (Antgene, Κίνα). Τα κύτταρα συλλέγονται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, πλύθηκε με ψυχρό PBS, και αιωρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης, και στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν 30 λεπτά στο σκοτάδι στους 4 ° C με Annexin V-FITC και ΡΙ σε φωσφορικό ρυθμιστικό και αναλύθηκαν στο κυτταρόμετρο ροής (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) μέσα σε 1 ώρα μετά από χρώση.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Διαφορά μεταξύ των ομάδων αναλύθηκε με μονόδρομη ANOVA και Student-Newman-Keuls (SNK) -q δοκιμή με τη χρήση SPSS 12.0 για το λογισμικό των Windows. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως * ρ & lt? 0,05 και ** p & lt?. 0.01

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Wu Ke, Shi Liang, Ντενγκ Meizhou, Li Hang και Li Wei για εξειδικευμένη τεχνική βοήθεια τους .