Αφηρημένο

ομοιοκυτίου D10 (HoxD10) παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των εμβρυϊκών κυττάρων και την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού. προηγούμενη έκθεση μας έδειξαν ότι η ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα δέσμευσης πρωτεΐνης-3 (IGFBP3) ρυθμιζόταν από HoxD10 σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα? Ωστόσο, οι λειτουργικές ρόλοι και των υποκείμενων μηχανισμών IGFBP3 σε γαστρικό καρκίνο παραμένουν ασαφείς. Εδώ, βρήκαμε ότι η έκφραση της IGFBP3 ήταν προς τα πάνω ρυθμισμένη μετά έκτοπη έκφραση της HoxD10 σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα. προσδιορισμός χρωματίνης ανοσοκατακρήμνισης έδειξε ότι HoxD10 δεσμεύεται σε τρεις πιθανές περιοχές του υποκινητή IGFBP3. Εξωγενείς HoxD10 ενισχύεται σημαντικά τη δραστικότητα της λουσιφεράσης που περιέχουν αυτές τις περιοχές πρόσδεσης σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Περαιτέρω δεδομένα έδειξαν ότι όλες αυτές οι θέσεις δέσμευσης είχαν δεσμευτική Hox στοιχείο «TTAT». Ανοσοϊστοχημική χρώση αποκάλυψε αποτελέσματα ότι η έκφραση IGFBP3 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε 86 γαστρικά αδενοκαρκινώματα ιστούς σε σχέση με γειτονικά μη-καρκινικούς ιστούς τους (ρ 60271512≥60593623T0.062T1+T21248T3+T4744727N0.045N0+N1351619N2+N3513516M 0.267M0834835M1330Histological grade0.331I + II241212III623923Table 1. Φύλο, ηλικία και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά και τα αποτελέσματα ανοσοϊστοχημείας των δειγμάτων γαστρικού ιστού του όγκου.

CSV Λήψη CSV

Αναλύσαμε περαιτέρω τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του IGFBP3 και τη συνολική επιβίωση του καρκίνου του στομάχου ασθενείς. Υψηλότερη έκφραση της IGFBP3 συσχετίστηκε με μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης στα 5 χρόνια παρακολούθησης (p = 0,011, Kaplan-Meier επιβίωσης Log-rank test) (Σχήμα 4C).

Νοκ ντάουν του γονιδίου IGFBP3 προωθεί γαστρικό καρκίνο κυττάρων μετανάστευση και εισβολή

Για να αξιολογηθεί ο λειτουργικός ρόλος του IGFBP3 σε γαστρικό καρκίνο, διερευνήσαμε την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή μετά knockdowning IGFBP3 in vitro. IGFBP3 επιλεκτικά knockdowned με παρεμβολή RNA σε BGC823 και SGC7901 κύτταρα (Σχήμα 5Α και 5Β), το οποίο είχε ένα σχετικά υψηλό επίπεδο ενδογενούς IGFBP3 σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών γαστρικού (Σχήμα S3 σε S1 File). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αποσιώπηση έκφραση του IGFBP3 σημαντικά ενισχυμένη κυτταρική μετανάστευση τόσο σε επικοινωνούντα δοκιμασίες μετανάστευσης (Σχήμα 5C και 5D) και δοκιμή μηδέν (Σχήμα S4 στο S1 File), σε σύγκριση με εκείνη του αρνητικού μάρτυρα siRNA. Επιπλέον, knockdowning IGFBP3 εμφανίζεται μια σημαντικά υψηλότερη δραστικότητα κυτταρικής εισβολής στις δοκιμασίες transwell (Σχήμα 5Ε και 5F).

Η έκφραση της IGFBP3 στην BGC823 και SGC7901 κύτταρα ανιχνεύθηκαν με συμβατική RT-PCR (Α) και κηλίδωση Western (Β) μετά από επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα siRNA (Ne-si) ή IGFBP3 siRNA (Ι3-σι) . Οι τιμές πυκνότητας εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με αρνητικές τιμές siRNA ελέγχου ρυθμίζεται σύμφωνα με 1. (Γ) Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με τροποποιημένο Boyden φρεατίων δοκιμασίες θαλάμους. Μετά από επώαση για 16 ώρες, τα κύτταρα που μετανάστευσαν στο κάτω μέρος της μεμβράνης βάφτηκαν με DAPI. (Δ) Ο μέσος αριθμός των ορατών μεταναστευτικών κυττάρων μετρήθηκε σε πέντε τυχαία πεδία υψηλής ισχύος. Αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. ** Υποδεικνύει ρ & lt? 0,01. (Ε) BD Matrigel επικαλυμμένα θάλαμοι χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των κυττάρων εισβολής. Εισβολή κύτταρα στο κάτω μέρος της μεμβράνης βάφτηκαν με διάλυμα κύτταρο λεκέ. (F) Εισβολή κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης και ανιχνεύονται σε αναγνώστη μικροπλάκας (560 nm). ** Υποδεικνύει ρ & lt? 0,01.

Η

IGFBP3 ρυθμίζει τις εκφράσεις της ΜΜΡ14, υΡΑ και uPAR

Για να καταλάβω τους πιθανούς μηχανισμούς για το πώς IGFBP3 ρυθμίζουν την εισβολής του γαστρικού καρκίνου κύτταρα, εξετάσαμε τα επίπεδα του mRNA της ΜΜΡ2 /ΜΜΡ7 /ΜΜΡ9 /ΜΜΡ14, TIMP1 /Timp2, υΡΑ και ο υποδοχέας της uPAR, τα οποία όλα είναι εισβολή παράγοντες που συνδέονται, ιδιαίτερα σε καρκίνο του στομάχου. Μετά από παροδικά επιμολυσμένα με IGFBP3 siRNA για 72 ώρες σε BGC823 και SGC7901 κύτταρα, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της ΜΜΡ14, υΡΑ και uPAR αυξηθεί, ενώ καμία σημαντική αλλαγή του ΜΜΡ2, ΜΜΡ7, ΜΜΡ9 ή TIMP1 /Timp2 παρατηρήθηκε (Σχήμα 6Α). E-cadherin, β-κατενίνης και πολύπλοκο /β-κατενίνης E-cadherin εξήχθησαν χρησιμοποιώντας διαφορετικά λύματα, τα επίπεδά τους δεν είχε καμία ουσιαστική αλλαγή μετά την φίμωση IGFBP3 στο BGC823 κύτταρα (Σχήμα S5 στο S1 αρχείου). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι IGFBP3 αναστέλλει την εισβολή των γαστρικών καρκινικών κυττάρων μέσω, τουλάχιστον εν μέρει, ρύθμιση των εκφράσεων του ΜΜΡ14, υΡΑ και uPAR (Σχήμα 6Β).

MMPs (Α) (2,7,9, 14), TIMPs (1,2), υΡΑ και uPAR σε BGC823 και SGC7901 κύτταρα ανιχνεύθηκαν με συμβατική RT-PCR μετά επιμολύνθηκαν με αρνητικό έλεγχο siRNA (Ne-σι) ή IGFBP3 siRNA (I3-σι). (Β) Η συστηματική κατανόηση των οδών για τη ρύθμιση HoxD10-IGFBP3 του γαστρικού μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή.

Η

Συζήτηση

Hox υπεροικογένεια είναι μια ομάδα σημαντικών μεταγραφικών παραγόντων που θα μπορούσαν να ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων embronic [29,30]. Επιπλέον, η παρεκκλίνουσα έκφραση του Ηοχ παίζει επίσης κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη των διαφόρων τύπων καρκίνου [31]. πρωτεΐνες hox έχουν ένα μεγάλο μετέπειτα κανονιστικού δικτύου και να ασκούν τα καθήκοντά τους, κυρίως μέσω αυτών των γονιδίων-στόχων [5]. ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο έχει διεξαχθεί για τη διαλογή των κατάντη γονίδια της HoxD10 κατά την ανάπτυξη του νωτιαίου μυελού και σε γαστρικό καρκίνο κυττάρων [4,32]. Εμείς και άλλοι έχουν αποκαλύψει ένα IGFBP3 γονίδιο κοινό στόχο, το οποίο έχει αναφερθεί ότι χρησιμεύουν ως καταστολέας όγκου [10].

Οι μελέτες μας παρέχονται πρώτα στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι HoxD10 συνδέει άμεσα τον προαγωγό IGFBP3 για να ενεργοποιήσετε την έκφραση του IGFBP3 στο γαστρικό καρκίνο κύτταρα. πρωτεΐνη HoxD10 θα μπορούσαν να προσληφθούν στη συγκεκριμένη περιοχή του υποκινητή του γονιδίου IGFBP3, υποδεικνύοντας ότι HoxD10 θα μπορούσε να συνδεθεί άμεσα με το γονίδιο IGFBP3. Η δραστικότητα λουσιφεράσης με άγρια, ενώ δεν είναι μεταλλαγμένο, HBS3, HBS4 ή HBS5 ήταν σημαντικά αυξημένη από υπερέκφραση HoxD10, γεγονός που υποδηλώνει ότι HBS3 (TCTTTTTATT), HBS4 (ATTTGCTATT) και HBS5 (CTTTATTATT) ήταν τρεις λειτουργικές θέσεις πρόσδεσης HoxD10 στην περιοχή προαγωγού του IGFBP3. Όπως αναμενόταν, το επίπεδο έκφρασης της IGFBP3 mRNA και πρωτεΐνης ρυθμίζεται αυξητικά με αναγκαστική έκφραση HoxD10 σε διαφορετικές κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου [4]. Μελέτες έχουν δείξει ότι Hox πρωτεΐνες έχουν κάποια στοιχεία πρόσδεσης πυρήνα συναίνεση, συμπεριλαμβανομένων TTAT, TAAT, και TTAC [7]. Σημείο μετάλλαξη με «TTAT» σε «TTCT» ή «TCTT» σε «TATT» στην περιοχή προαγωγού του IGFBP3 στην παρούσα μελέτη υποδεικνύουν ότι «TTAT» ή «TATT» είναι σημαντικές θέσεις σύνδεσης για HoxD10. πρωτεΐνες hox θα μπορούσε να ρυθμίσει άμεσα τη διαδικασία μεταγραφής των κατάντη γονιδίων στόχων ως μονομερή ή ομοδιμερή [33]. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.