Αφηρημένο

Ιστορικό

Η TLR9 αγωνιστής CpG όλο και περισσότερο εφαρμόζεται σε προκλινικές και κλινικές μελέτες ως μια θεραπευτική μέθοδο για την ενίσχυση της ανοσίας όγκου. Η κλινική εφαρμογή των CpG Φαίνεται, ωστόσο, λιγότερο επιτυχείς από αυτή που θα προβλέπεται από μελέτες σε ζώα. Ένας λόγος μπορεί να είναι οι διαφορετικές οδούς χορήγησης που εφαρμόζονται στις περισσότερες μελέτες του ποντικιού και κλινικές δοκιμές. Μελετήσαμε εάν η αποτελεσματικότητα του CpG ως ανοσοενισχυτικό σε ανοσοθεραπεία καρκίνου εξαρτάται από την οδό χορήγησης CpG, ιδίως όταν ο όγκος είναι καταστρέφεται

in situ

.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Σε τεχνικές καταστροφής situ όγκου είναι ελάχιστα επεμβατικές θεραπευτικές εναλλακτικές λύσεις για τη θεραπεία της (αποτεμνόμενο) συμπαγείς όγκους. Σε αντίθεση με χειρουργική εκτομή, η καταστροφή του όγκου οδηγεί στην επαγωγή της ασθενούς αλλά ογκο-ειδική ανοσία που μπορεί να ενισχυθεί με coapplication του CpG. Όπως και στην καταστροφή του όγκου situ με κρυοχειρουργική δημιουργεί μια στιγμιαία τοπική απελευθέρωση αντιγόνων, εφαρμόσαμε αυτό το μοντέλο για τη μελέτη της αποτελεσματικότητας των CpG για την ενίσχυση της αντικαρκινικής ανοσίας όταν χορηγείται μέσω διαφορετικών οδών: περινεοπλαστικό, ενδοφλέβια, και υποδόρια αλλά μακριά από τον όγκο. Δείχνουμε ότι περινεοπλασματικής χορήγηση είναι ανώτερη στην ενεργοποίηση των δενδριτικών κυττάρων, επαγωγή όγκου-ειδικά CTL, και μακράς διαρκείας προστασία όγκου. Αν και τα ανοίγματα από ενδοφλέβια και υποδόρια (στο μακρινό τόπο) που χρησιμοποιούνται συνήθως σε κλινικές δοκιμές, θα παρέχονται μόνο μερική προστασία ή ακόμη και απέτυχε να ενισχύσει αντικαρκινικές απαντήσεις όπως προκαλείται από κρυοχειρουργική και μόνο. ​​

Συμπεράσματα /Σημασία

χορήγηση CpG ενισχύει σε μεγάλο βαθμό την αποτελεσματικότητα της σε τεχνικές καταστροφής του όγκου επί τόπου, υπό τον όρο ότι CpG χορηγείται σε στενή γειτνίαση των απελευθερωμένων αντιγόνων. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη βοηθά να παρέχει κατευθύνσεις για να επωφεληθούν πλήρως από CpG, όπως το ανοσοποιητικό διεγερτικό σε κλινικό περιβάλλον

Παράθεση:. Nierkens S, den Brok ΜΗ, Roelofsen Τ, Wagenaars JAL, Figdor CG, Ruers TJ, et al . (2009) Οδός χορήγησης του TLR9 Αγωνιστή CpG Καθορίζει κριτικά την αποτελεσματικότητα του καρκίνου ανοσοθεραπεία σε ποντίκια. PLoS ONE 4 (12): e8368. doi: 10.1371 /journal.pone.0008368

Επιμέλεια: Roberto F. Speck, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Ζυρίχης, Ελβετία

Ελήφθη: 11 Οκτ του 2009? Αποδεκτές: 25 Νοεμβρίου του 2009? Δημοσιεύθηκε: 18 Δεκεμβρίου 2009

Copyright: © 2009 Nierkens et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα κατέστη δυνατή από τις επιχορηγήσεις της ολλανδικής Cancer Society (KWF-2003-2893, KWF-2.004 με 3.137, KWF-2005 – 3325). SN είναι ένας ερευνητής της ολλανδικής Cancer Society (KWF, Άμστερνταμ, Ολλανδία). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η χειρουργική εκτομή των συμπαγών όγκων προσφέρει γενικά την καλύτερη πιθανότητα ίασης σε ασθενείς με καρκίνο. Σε πολλές περιπτώσεις, ωστόσο καρκινικές βλάβες δεν είναι επιλέξιμες για την εκτομή και απαιτούν εναλλακτικές τεχνικές καταστροφής, όπως κρυοχειρουργική, ραδιοσυχνοτήτων ή κατάλυση με λέιζερ. Αυτές οι μέθοδοι προσφέρουν ελάχιστα επεμβατικές θεραπείες για ένα ευρύ φάσμα όγκων. Στην πραγματικότητα, ραδιοσυχνότητας βρέθηκε να παρέχει τοπικό έλεγχο του όγκου ισοδύναμη με εκτομή σε μια υποομάδα ασθενών [1], τονίζοντας ότι in situ όγκου τεχνικές καταστροφής γίνεται ολοένα και πιο επιτυχημένες θεραπευτικές μεθόδους.

Σε αντίθεση με χειρουργική εκτομή, in situ καταστροφή του όγκου παρέχει μία πηγή αντιγόνου διαθέσιμο για τα κύτταρα του ανοσοποιητικού. Η συμμετοχή του ανοσοποιητικού συστήματος κατά την εκκαθάριση των κυττάρων του όγκου είναι όλο και περισσότερο αντιληπτό [2]. κύτταρα παρουσίασης αντιγόνου (APC), όπως δενδριτικά κύτταρα (DC), είναι καλά εξοπλισμένο για να φαγοκυττάρωση θνήσκοντα κύτταρα και καρκινικά αντιγόνα διαδικασία για την παρουσίαση σε Τ λεμφοκύτταρα [3]. Πράγματι, πρόσφατα δεδομένα κατέδειξαν ότι DC στον όγκο λεμφογάγγλια παροχέτευσης αποκτήσουν αποτελεσματικά συντρίμμια όγκου μετά την καταστροφή του όγκου situ [4]. Δυστυχώς, αν και εκτομή του όγκου έχει συσχετιστεί με την εμφάνιση της ανοσολογικής ενεργοποίησης σε μερικούς ασθενείς [5], η έκφυση των μακρινών μικρομεταστάσεων υπονοεί ότι δεν ή αδύναμο συστημικό προστατευτικές ανοσοαποκρίσεις επάγονται.

Εφαρμόζοντας μια πρόσφατα αναπτύχθηκε μοντέλο ποντικού εμείς προηγουμένως έδειξαν ότι in situ καταστροφή όγκου μέσω κρυοχειρουργική ή ραδιοσυχνότητας εκτομή οδήγησε στην επαγωγή του ασθενή αλλά όγκου ειδική ανοσία [6], [7]. Αυτά τα αποτελέσματα υπονοείται ότι ο συνδυασμός του όγκου in situ καταστρεπτική τρόπους θεραπείας με ειδική ανοσολογική διέγερση θα μπορούσε να είναι μια στρατηγική για την ενίσχυση της κλινικής έκβασης για έναν αυξανόμενο αριθμό ασθενών με καρκίνο.

Σε αυτό το πλαίσιο, ο υποδοχέας ΤοΙΙ (TLR ) αγωνιστές έχουν μεγάλο ενδιαφέρον, όπως το ανοσοποιητικό επικουρικά. TLR είναι μία οικογένεια υποδοχέων αναγνώρισης παθογόνων που ενεργοποιούνται από την αναγνώριση των μοριακών μοντέλων παθογόνο που σχετίζεται εκφράζεται από μια διαφορετική ομάδα μολυσματικών μικροοργανισμών. Είναι ενδιαφέρον ότι η ανοσοδιεγερτική δραστικότητα των Βάκιλλος Calmette-Guerin (BCG), που χρησιμοποιούνται ήδη στη δεκαετία του 1970 για την τόνωση της κατά του όγκου ανοσίας [8], είναι τώρα γνωστό ότι είναι BCG DNA που προσδένεται σε TLR9 [9], [10]. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι DC εκφράζουν TLR9 και ενεργοποιούνται άμεσα μέσω σύνδεσης του TLR9 να μη μεθυλιωμένων μοτίβων CpG στο DNA [8]. DC ενεργοποίηση με CpG περιλαμβάνει μια καταρράκτη σηματοδότησης με αποκορύφωμα την ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής, π.χ. πυρηνικός παράγοντας-κΒ (NF-κΒ), μετέπειτα προς τα επάνω ρύθμιση συν-διεγερτικών μορίων και παραγωγή χημειοκινών και κυτοκινών (π.χ., IL-6, IL-12, TNF-α). Ως αποτέλεσμα, CpG-διεγερμένα DC επάγουν αποκρίσεις Th1 και είναι καθοριστικής σημασίας για την ενεργοποίηση των CD8

+ κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTL).

Πράγματι, έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι κατά του όγκου αποκρίσεις συνεργιστικά ενισχυμένη όταν CpG ήταν που χρησιμοποιείται ως ένα επικουρικό στην κρυο μοντέλο κατάλυσης. Συν-ένεση του CpG αύξησε το σχηματισμό των ογκο-ειδικών CD8

+ CTL και προστατευόμενων -100% των ποντικών από την επανεμφάνιση πρόκληση με κύτταρα όγκου σε αυτό το συγκεκριμένο μοντέλο [6]. Σε άλλα μοντέλα, CpG έχει αποδειχθεί αποτελεσματική στην πρόληψη της έκφυση του όγκου σε ένα προφυλακτικό περιβάλλον και επίσης εξαλειφθεί εγκατεστημένων όγκων σε ποντικούς [11], [12]. Η εφαρμογή των CpG σε κλινικές δοκιμές Φαίνεται όμως λιγότερο επιτυχείς από αυτή που θα προβλέπεται από μελέτες σε ζώα. Ένα κοινό επιχείρημα που χρησιμοποιείται είναι η διαφορική έκφραση του TLR9 στο DC ανάμεσα ποντίκια και στον άνθρωπο. TLR9 εκφράζεται άφθονα σε πλασμακυτταροειδή DC (PDC) από ποντικό και τον άνθρωπο, και σε ποντικού μυελοειδούς DC (MDC). Για την ανθρώπινη MDC, έκφρασης TLR9 είναι λιγότερο σαφής καθώς ορισμένες μελέτες ανέφεραν αδύναμη σε αρνητική έκφραση [13], [14], ενώ μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι η ανθρώπινη MDC δεν περιέχουν TLR9 πρωτεΐνη σε ποσότητες συγκρίσιμες με pDC [15]. Επιπλέον, η MDC και pDC φαίνεται να συνδέονται λειτουργικά και στα δύο είδη, όπως εντατική cross-talk μεταξύ των υποσυνόλων DC είναι απαραίτητη για CpG-επαγόμενη ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος τόσο στα ποντίκια όσο και στον άνθρωπο [16], [17].

Σημειώνεται ότι σε μελέτες για ποντικούς, που δείχνει τα πιο ισχυρά αποτελέσματα CpG, CpG παρέχεται μαζί με το αντιγόνο ή σε άμεση γειτνίαση με αντιγόνα όγκου [12], [18], [19], [20]. Επιπλέον, έχουμε πρόσφατα αναφερθεί ότι η συν-εντοπισμό του αντιγόνου και CpG εντός των διαμερισμάτων ενδοσωματιακής του DC στην ζωή συνδέεται στενά με την ικανότητα να cross-σήμερα αντιγόνου και την πρόκληση των επόμενων προστατευτικής ανοσίας μετά από εκτομή [21]. Σε κλινικές μελέτες η οδός χορήγησης CpG σπάνια με βάση την τοποθεσία του όγκου αλλά γενικά κατευθύνεται από τους κανονισμούς του προμηθευτή και /ή την ευκολία χορήγησης. Δεδομένου ότι αυτές οι διαφορές στις οδούς χορήγησης CpG μπορεί να έχει σημαντικές επιπτώσεις για την κλινική αποτελεσματικότητα του, συγκρίναμε την αποτελεσματικότητα των CpG χορηγείται μέσω διαφορετικών οδών σχέση με τη θέση της διαθεσιμότητας αντιγόνου σε ένα μοναδικό μοντέλο εκτομής ποντικού όγκου. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η ενδοφλέβια (ε.φ.) και υποδόρια (s.c.) οδούς χορήγησης CpG (εφαρμόζεται κυρίως σε ανθρώπινο ρύθμιση) είναι πολύ λιγότερο αποτελεσματική από περινεοπλασματικής ενέσεις (Ρ.Τ.) CpG. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η αποτυχία ή η επιτυχία της διοίκησης CpG εξαρτάται καθοριστικά από τη θέση του CpG διοίκησης σε σχέση με τη θέση του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ποντίκια και καρκινικά κύτταρα

C57BL /6N ποντίκια (ηλικίας 6-8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από την Charles River Wiga (Sulzfeld, Germany) και διατηρείται κάτω από ειδικές συνθήκες φράγμα παθογόνο-ελεύθερο στο Κεντρικό Εργαστήριο ζώων (Nijmegen, Ολλανδία). Πόσιμο νερό και τυπική σφαιρίδια εργαστήριο τροφίμων παρασχέθηκαν κατά βούληση και τα ποντίκια αφέθηκαν να ηρεμήσουν για τουλάχιστον 1 εβδομάδα πριν τυχαία ανάθεση σε συγκεκριμένες ομάδες θεραπείας. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τη φροντίδα των ζώων της Επιτροπής Πειράματα Nijmegen ζώων.

Η OVA-επιμολυσμένα ποντικού μελανώματος κυτταρική γραμμή B16F10 (B16OVA, κλώνος Μ.Ο.5) παρασχέθηκε ευγενώς από τον dr. Κ Ροκ [22] και καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο (ΜΕΜ, 5% εμβρυϊκό βόειο ορό (Greiner Bio-όνη), 100 U /ml πενικιλίνη G νατρίου και 100 μg ml στρεπτομυκίνη (Pen /Strep), ΜΕΜ πυρουβικό νάτριο /(1 mM), Ν &

2CO

3, ΜΕΜ βιταμίνες, ΜΕΜ μη-απαραίτητα αμινοξέα (όλα από την Invitrogen), 20 μΜ β-μερκαπτοαιθανόλη (β-μΕ)) συμπληρωμένο με 30 μg /ml υγρομυκίνης και 1 mg /ml G418. Η κυτταρική γραμμή B16F10 μελανώματος ελήφθη από την American Type Culture Collection και διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο.

Όγκου Μοντέλο και Cryosurgery

Tumor κύτταρα αιωρήθηκαν σε ένα μίγμα PBS και Matrigel (2:01 ) και 0.5 * 10

6 κυττάρων σε ένα συνολικό όγκο 50 μΙ ενέθηκαν sc στη σωστή μηριαίου οστού. Όταν διάμετροι των όγκων μετρήθηκαν μεταξύ 6-8 mm (γενικά κατά την ημέρα 9-10), τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες θεραπείας (μη επεξεργασμένα? NT, εκτομή κρυο? Κρυο). Cryo εκτομή πραγματοποιήθηκε υπό ισοφλουράνιο /O

2 /N

2O αναισθησία χρησιμοποιώντας ένα υγρό σύστημα κρυο άζωτο εκτομή (CS76, Frigitronics, Shelton, CT) του οποίου το άκρο ψύχεται από μια συνεχή ροή του κυκλοφορούντος υγρού αζώτου. Κατά τη διάρκεια 2 κύκλους θεραπείας κατάψυξης και απόψυξης ο όγκος ήταν μακροσκοπικά κατεψυγμένα, αφήνοντας περιβάλλοντα υγιή ιστό άθικτο. Για την παρακολούθηση της επαγωγής της μακράς διαρκείας προστασία των όγκων, τα ποντίκια επανα-προκλήθηκαν με 25 * 10

3 κύτταρα B16OVA 40 ημέρες μετά κρυο κατάλυση. Δύο μήνες αργότερα, τα ποντίκια που επέζησαν από το πρώτο όγκου εκ νέου πρόκληση έλαβε μια δεύτερη εκ νέου πρόκληση με 5 * 10

4 B16OVA ή Β16Ρ10 κύτταρα. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν όταν ο όγκος του όγκου ξεπέρασαν τα 1000 mm

3 ή όταν οι όγκοι του φρένου μέσω του φραγμού του δέρματος.

CpG 1668 ( «5-ΤΟΟΑΤΟΑΟΟΤΤΟΟΤΟΑΤΟΟΤ-3 ‘) με phosphorothioated ραχοκοκαλιά αγοράστηκε από την Sigma Genosys (Haverhill, ΗΝΩΜΈΝΟ ΒΑΣΊΛΕΙΟ). CpG εγχύθηκε σε PBS Ρ.Τ. (100 μg διαιρεμένη πάνω από 3 ενέσεις 10 μΙ που περιβάλλουν τον όγκο), ί.ν. (100 μg σε 100 μΙ), ή s.c. (100 μg εντός 30 μΙ στο αριστερό μηριαίο οστό του ποντικού, δηλαδή από την contra πλάγια πλευρά του ποντικού αναφέρεται στη θέση του όγκου). Οι ενέσεις διεξήχθησαν εντός 30 λεπτών μετά την εκτομή. Χρησιμοποιήσαμε CpG 1668, η οποία είναι ένας τύπος Β CpG, παρόμοιες με την κλινική βαθμού διαθέσιμες CpG που χρησιμοποιούνται σήμερα σε κλινικές δοκιμές.

Εμπλουτισμός και αναλύσεις των DC

Για την ανάλυση DC βιολογία, DC ήταν απομονώνονται από τα βουβωνικούς λεμφαδένες αποστράγγιση του όγκου. Οι λεμφαδένες αποκόπηκαν και πουρέ χρησιμοποιώντας βελόνες ή γυάλινες πλάκες και χωνεύεται σε κολλαγενάση τύπου II και DNase για 15 λεπτά. Μετά την προσθήκη του EDTA και επανα-αιώρησης, τα κύτταρα εφαρμόσθηκαν σε ένα φίλτρο για την απομάκρυνση υπολειμμάτων και DC εμπλουτίστηκαν με θετική επιλογή χρησιμοποιώντας αντι-CD 11 c-επισημασμένο (Ν418) μαγνητικά σφαιρίδια μικρο (Miltenyi Biotec BV).

Για μελετήσει τη μοίρα του αντιγόνου και CpG μετά κρυο εκτομή, οι όγκοι εγχύθηκαν με φθορισμό σημασμένο πρωτεΐνη ΟνΑ (OVA-Alexa488 ή OVA-Alexa647, 20 μg /20 μΙ) και Cy5-επισημασμένο CpG (CpG-Cy). κύτταρα CD11c-εμπλουτισμένα επωάστηκαν με Fc Block (CD16 /CD32? 2.4G2) και χρωματίστηκαν με αντι-CD 11 c (HL3), βιοτινυλιωμένο αντι-CD80 (1G10 /Β7) ή τους ελέγχους ισοτύπου και στρεπταβιδίνη-ΡΕ, όλα λαμβάνονται από BD Biosciences. Έκφραση του CD80 αναλύθηκε ωαρίων

+ και ωαρίων

– κύτταρα περίφραξη σε CD11c

+ κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (FACS Calibur, Becton Dickinson & amp? Co, San Jose, CA). Έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι η πρόσληψη του OVA μοντέλο αντιγόνου από μυελό οστών DC εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την υποδοχέα μαννόζης [23]. Ως εκ τούτου, επαναλάβαμε τα πειράματα μας με BSA-Alexa488 και καμία διαφορά στην πρόσληψη από τα DC in vivo παρατηρήθηκαν μεταξύ των δύο αντιγόνων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Εχ Vivo T

Παρακολούθηση Κυττάρων

Κύτταρα από οι σπλήνα και του όγκου αποστράγγιση λεμφαδένες διεγέρθηκαν για 5 ώρες με ΡΜΑ (0,5 μg /ml) /ιονομυκίνης (0.1 μg /ml) παρουσία του Brefeldin Α (10 μg /ml). Τα κύτταρα αναλύθηκαν για CD8 και ενδοκυτταρική έκφραση της ΙΡΝ-γ με χρήση κυτταρομετρίας ροής. Επιπλέον, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με αντι-CD3 ή πρωτεΐνης OVA για 96 ώρες για να αναλύσει την έκκριση της ΙΡΝ-γ σε υπερκείμενο. Η ΙΡΝ-γ ELISA διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (BD Biosciences).

αντιγονο-ειδικών CTL

Για να μελετηθεί η αποτελεσματικότητα της διοίκησης διαφορικού CpG για την επαγωγή αντιγονο-ειδική CTL, σπλήνες και όγκο λεμφαδένες παροχέτευσης απομονώθηκαν δέκα ημέρες μετά την εκτομή. Μικτή κυτταρικά εναιωρήματα των λεμφαδένων και της σπλήνας καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων σε πλήρες IMDM συμπληρωμένο με hIL2 (10 U /ml) και διεγέρθηκαν με ακτινοβολημένα κύτταρα (1600 rad) B16OVA (5 * 10

4 κύτταρα /φρεάτιο), ότι είχαν υποβληθεί σε θεραπεία για όλη τη νύχτα με r-IFN-γ (50 U /ml) για να ρυθμίζουν MHC παρουσίαση τάξης Ι. Την ημέρα 3-4 της καλλιέργειας, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα νεκρά συντρίμμια κυττάρων απομακρύνθηκε χρησιμοποιώντας μια βαθμίδα Ficoll. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​πλάκες 24-φρεατίων για 4-5 ημέρες. Για την οπτικοποίηση όγκου-ειδικά CTL, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο CD4 (L3T4) ή CD8 (53-6.7) και ΑΡΟ-συζευγμένο τετραμερή OVA Kb (Sanquin, Amsterdam, The Netherlands) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Στατιστικές αναλύσεις

τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ Τ ή μονόδρομη ANOVA δύο ουρών Student για πολλαπλές συγκρίσεις με Bonferroni ως post hoc test.

Αποτελέσματα

συσσώρευση ενεργοποιημένου αντιγόνου-Loaded κύτταρα ώριμα δενδριτικά σε λεμφαδένες εξαρτάται από την οδό της CpG

η πλήρωση των CD8

+ CTL εξαρτάται από το μοναδικό χαρακτηριστικό της DC να συλλάβει εξωκυττάρια αντιγόνα και τα παρουσιάζουν στο MHC τάξης I. η διαδικασία αυτή, γνωστή ως πολλαπλή παρουσίαση [24], μπορεί να ενισχυθεί σε μεγάλο βαθμό με την ενεργοποίηση των DC μέσω TLR9 [25]. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η επίδραση της διαδρομής χορήγησης CpG σε DC λειτουργία και κατά του όγκου αποκρίσεις μετά από κρυο κατάλυση.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, περιογκική ενέσεις CpG αυξήθηκε σημαντικά τον απόλυτο αριθμό των DC που συσσωρεύεται στο ο όγκος αποστράγγιση λεμφαδένα 2 ημέρες μετά την ένεση και στα δύο μη-επεξεργασμένα ποντίκια που φέρουν όγκο και σε ποντίκια υποβάλλονται σε κρυοχειρουργική. Η υποδόρια ένεση του CpG στο contra πλάγια πλευρά δεν επηρέασε τον αριθμό των DC. Είναι ενδιαφέρον, ί.ν. ενέσεις CpG αύξησε τη συσσώρευση των CD11c

+ DC στον όγκο-αποστράγγιση των λεμφαδένων μόνο όταν συνδυάζεται με κρυο εκτομή (Εικ. 1Α).

(α) απόλυτοι αριθμοί των CD11c

+ κύτταρα ο λεμφαδένες παροχέτευσης 2 ημέρες μετά την εκτομή. Ποντικοί που φέρουν όγκο αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (ΝΤ) ή υποβλήθηκαν σε κρυο εκτομή (κρυο). Επιπλέον, ορισμένες ομάδες ποντικιών έλαβαν CpG μέσω των υποδεικνυόμενων οδών. Παρενθέσεις δείχνουν σημαντικές διαφορές (p & lt? 0,05) μεταξύ υποδεικνύεται ομάδες (n = 4-6 /ομάδα, 2 παρόμοια πειράματα). (Β) Η πρόσληψη του αντιγόνου μετά από κρυο κατάλυση. OVA-Alexa488 εγχύθηκε σε όγκους B16OVA (6-9 mm) μόλις πριν την κρυο εκτομή για την παρακολούθηση της τύχης του αντιγόνου μετά την καταστροφή του όγκου επί τόπου. Τα ποντίκια επιπλέον αγωγή με CpG μέσω των υποδεικνύεται διαδρομές. Δύο ημέρες μετά την εκτομή, η πρόσληψη του αντιγόνου αναλύθηκε σε Οϋ11ο

+ κύτταρα εμπλουτίστηκαν από τις πισίνες του όγκου-αποστράγγιση των λεμφαδένων. Οι αριθμοί στους πίνακες δείχνουν το ποσοστό των OVA

+ όλων των CD11c

+ κύτταρα. Δεδομένα από έναν εκπρόσωπο του ποντικιού εμφανίζεται ανά ομάδα. (Γ) Ποσοτικές αναλύσεις επαναλήψεων των πειραμάτων, όπως φαίνεται στο (Β) (5 ποντικοί /ομάδα, αντιπροσωπευτικά από 2 πειράματα). (Δ) Η πρόσληψη του αντιγόνου και CpG από CD11c

+ κυττάρων παρακολουθούνται μετά την Ρ.Τ. και ί.ν. διοίκηση CpG-Cy5 και ενδονεοπλαστική έγχυση OVA-Alexa488. Τα δεδομένα από ένα αντιπροσωπευτικό ποντικού δείχνεται (η = 4 /ομάδα). (Ε) Η έκφραση του CD80 σε CD11c

+ κύτταρα φορτωμένα με αντιγόνο. * Υποδηλώνει σημαντικά διαφορετικές (ρ & lt? 0,05) από όλες τις άλλες ομάδες (η = 5 /ομάδα, 2 παρόμοια πειράματα)

Η

Antigen εσωτερικοποίηση και η κατάσταση ωρίμανση των DC είναι δύο σημαντικές απαιτήσεις για την επαγωγή. παραγωγική ειδικών για το αντιγόνο ανοσολογικών αποκρίσεων. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι το κρυο εκτομή σε συνδυασμό με την Ρ.Τ. CpG χορήγηση συνεργικά up-ρυθμίζει την έκφραση συν-διεγερτικών μορίων [26]. Για να μελετηθεί κατά πόσο η οδός χορήγησης CpG επηρεάζει διαφορικά την ικανότητα των DC να αναλάβουν αντιγόνο, OVA-Alexa-488 εγχύθηκε στον όγκο μόλις πριν από την εκτομή ως υποκατάστατος δείκτης για διαλυτά αντιγόνα που απελευθερώνονται ταχέως από τον όγκο εξής κρυοχειρουργική [ ,,,0],27]. Περινεοπλασματικής ταυτόχρονη έγχυση CpG με εκτομή αυξημένη συνεργικά την απορρόφηση του αντιγόνου από την αποστράγγιση των λεμφαδένων DC. Σε αντίθεση, τόσο ί.ν. και s.c. ενέσεις απέτυχε να αυξηθεί η πρόσληψή αντιγόνου σε είτε φέροντα όγκο μη επεξεργασμένα ποντίκια ή ποντίκια υποβάλλονται σε κρυοχειρουργική (Σχ. 1Β-C). Εφαρμόζοντας με φθορισμό σημασμένο CpG, βρήκαμε επιπλέον ότι η πλειοψηφία όλων των λεμφαδένων DC από ποντίκια που εκτέθηκαν σε CpG μέσω Ρ.Τ. ή ί.ν. ενέσεις είχε εσωτερικεύεται CpG. Το ποσό των CpG ανά DC ήταν ωστόσο πολύ υψηλότερο μετά την Ρ.Τ. χορήγηση (Σχ. 1 D) και το OVA

+ DC είχε αποκτήσει αυξημένα επίπεδα CpG σε σύγκριση με την ΟνΑ

+ DC από ποντικούς που έλαβαν ε.φ. ενέσεις CpG. Τέλος, s.c. και ί.ν. ενέσεις CpG μόνο ελαφρώς αυξημένη έκφραση CD80 σε αντιγόνο-φορτωμένο DC, ενώ Ρ.Τ. χορήγηση CpG ενισχύεται σημαντικά τα επίπεδα συν-διεγερτικών δεικτών (Σχ. 1Ε).

Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η Ρ.Τ. ενέσεις CpG αυξήσει σημαντικά τον αριθμό των αντιγόνου και CpG-φορτωμένο, CD80 εκφράζουν αποστράγγιση λεμφαδένα DC μετά κρυο κατάλυση in vivo. Χορήγηση CpG μέσω της ενδοφλέβιας Αποτελέσματα διαδρομή στη συσσώρευση λεμφογάγγλιο αποστράγγισης DC μετά εκτομή αλλά αυτά DC εμφανίζουν ελαφρά μόνο ενισχυμένα επίπεδα εσωτερικεύονται αντιγόνου και CD80-έκφραση όταν συγκρίνεται με κρυο εκτομή μόνο. Οι υποδόριες ενέσεις του CpG στο contra πλάγια πλευρά να κάνει την αύξηση του αριθμού των DC στην τοπική λεμφαδένα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), αλλά όχι στον όγκο-αποστράγγιση λεμφαδένα και αποτυγχάνουν να αυξηθεί η πρόσληψή αντιγόνου και έκφραση CD80.

Οδός CpG διοίκησης Καθορίζει Αστάρωμα CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα

Για να αποκτήσουν περαιτέρω πληροφορίες για τις συνέπειες της διαφορικής φαινοτύπων DC που προκαλείται από τη χορήγηση CpG μέσω διαφορετικών οδών in vivo οι σπλήνας και λεμφοκύτταρα από τον όγκο αποστράγγιση λεμφαδένες αναλύθηκαν. Παρατηρήσαμε ότι τα ποσοστά ΙΡΝ-γ

+ CD4

+ και ΙΡΝ-γ

+ CD8

+ Τ κυττάρων μετά μη-ειδική (Σχ. 2Α) ή ειδικές επαναδιέγερση (Σχ. 2Β), καθώς και η κυτταρικότητα των λεμφικών οργάνων (δεν φαίνονται) έχουν επηρεαστεί από την θέση της ένεσης CpG. ενέσεις περινεοπλασματικής CpG αυξημένη ΙΡΝ-γ

+ κυττάρων κυρίως στην ογκο-αποστράγγιση λεμφαδένων και επίσης ελαφρώς στο σπλήνα. Μετά ί.ν. εγχύσεις ο αριθμός των IFN-γ

+ κυττάρων αυξήθηκε κυρίως στο σπλήνα. CD8

+ IFN-γ

+ Τ κύτταρα ελαφρώς ενισχυμένη σε λεμφαδένα αποστράγγιση του φωτοαποδομημένο ιστοσελίδα. Υποδόριες ενέσεις CpG contra πλευρική του όγκου έκαναν δεν επηρεάζουν IFN-γ

Οι αριθμοί κυττάρων + Τ στον όγκο-αποστράγγιση των λεμφαδένων.

(Α) Τα ποσοστά της IFN-γ

+ Τ κύτταρα εντός η CD4

+ ή CD8

+ πληθυσμών μετά κρυο κατάλυση +/- CpG. B16-OVA ποντικούς που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με κρυο εκτομή σε συνδυασμό με τη χορήγηση CpG μέσω των υποδεικνυόμενων οδών. Επτά ημέρες μετά την εκτομή, σπλήνα, όγκο λεμφαδένες παροχέτευσης και μη αποστράγγιση λεμφαδένες απομονώθηκαν. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με ΡΜΑ /ιονομυκίνη και χρωματίστηκαν για CD8, CD4 και ΙΡΝ-γ. * Δείχνουν σημαντικές διαφορές (p & lt? 0,05) μεταξύ της ένδειξης της ομάδας CpG-θεραπεία και οι αφελείς και Cryo ομάδα. (Β) παραγωγή IFN-γ μετά από κρυο κατάλυση +/- CpG. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με ΟνΑ για 96 ώρες και ΙΡΝ-γ μετρήθηκε σε υπερκείμενο με ELISA. Τα μέσα επίπεδα της ε.φ. Cryo + CpG ομάδες και στα δύο όργανα είναι σημαντικά διαφορετική από όλες τις άλλες ομάδες (n = 6 /ομάδα, 2 πειράματα).

Η

Τέλος, απαρίθμηση των OVA ειδικών CD8

+ Τ κύτταρα 10 ημέρες μετά από κρυοχειρουργική επιβεβαίωσε η ανώτερη επαγωγή αντιγονο-ειδικών CTL όταν CpG χορηγήθηκε pt (3,1% ± 1,1 του συνόλου των CD8

+, Εικ. 3). Σε σχέση με κρυο εκτομή μόνο (0,7% ± 0,2), ούτε ε.φ. ούτε υποδορίως ενέσεις CpG απέδωσε μια σημαντική αύξηση στη CTL (1,5% ± 0,4? 0,60% ± 0,2). Η ίδια τάση, αν και δεν είναι σημαντική, βρέθηκε για CTL ειδικά για Β16 πεπτίδιο εγγενή όγκου TRP-2 (δεν φαίνεται).

(Α) Αντιπροσωπευτική διαγράμματα στιγμών CD8

+ OVA-Kb τετραμερές

+ κύτταρα των μεμονωμένων ποντικών. Ποντικοί που φέρουν όγκους B16OVA (6-9 mm) υποβλήθηκαν σε κρυο εκτομή μόνη ή έλαβαν επιπλέον ενέσεις CpG μέσω των υποδεικνυόμενων οδών. Δέκα ημέρες μετά την καταστροφή του όγκου, κύτταρα από σπλήνα και του όγκου αποστράγγιση λεμφαδένες απομονώθηκαν και επαναδιεγέρθηκαν με κύτταρα όγκου B16OVA γ-ακτινοβολημένα ΙΡΝ-γ-θεραπεία. Οι καλλιέργειες καθαρίζονται από ένα στάδιο Ficoll μετά από 3-4 ημέρες καλλιέργειας και την ημέρα 8-9 κύτταρα αναλύθηκαν για την παρουσία όγκο-ειδικών CTL χρησιμοποιώντας ΑΡΟ-επισημασμένο OVA-K

b τετραμερή. Τα κύτταρα CD8 περίφραξη σε

+ Τ κύτταρα. Δεδομένα από έναν εκπρόσωπο του ποντικιού ανά ομάδα εμφανίζεται. (Β) Ποσοτική ανάλυση των συλλογικών δεδομένων, όπως φαίνεται στο (Α) (μέσα επίπεδα από 2 ξεχωριστά πειράματα (4-6 ποντίκια ανά ομάδα /πείραμα)). * Υποδηλώνει σημαντικές διαφορές (p & lt? 0.05). Της υποδεικνυόμενη ομάδα σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες

Η

Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα έτσι δείχνουν ότι η βελτιωμένη φόρτωση και την ωρίμανση των DC μετά από Ρ.Τ. διοίκηση CpG συσχετίζεται με την παρατηρούμενη αύξηση της τοπικής ενεργοποίησης λεμφοκυττάρων.

περινεοπλασματικής CpG ενέσεις είναι Superior στην επαγωγή της Long-Term ανοσία κατά του όγκου

Τα παραπάνω στοιχεία δείχνουν ότι η θέση της ένεσης των CpG σε σχέση με η περιοχή αφαίρεσης του όγκου είναι ένας κρίσιμος καθοριστικός παράγοντας στην επαγωγή όγκου-ειδικές αποκρίσεις CTL. Για να διερευνηθεί περαιτέρω η σημασία της, τα ποντίκια που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με κρυο κατάλυσης και CpG δόθηκε είτε Ρ.Τ., s.c. ή ί.ν. Σαράντα ημέρες μετά την εκτομή, τα ποντίκια άνευ όγκου προκλήθηκαν με μια θανατηφόρο δόση των κυττάρων όγκου.

Cryosurgery συνδυασμό με Ρ.Τ. CpG διοικήσεις προστατεύεται -90% όλων των ποντικών, ενώ υποδορίως και ί.ν. ενέσεις CpG απέτυχε να βελτιώσει σημαντικά τις αποκρίσεις που προκαλούνται από κρυοχειρουργική μόνο (Σχ. 4Α). Αν και ενδοφλεβίως χορήγηση CpG απέτυχε να αυξήσει την επιβίωση, η ανάπτυξη του όγκου ήταν σημαντικά βραδύτερη από ό, τι στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με s.c. ενέσεις ή με κρυο κατάλυση μόνη της (Εικ. 4Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ε.φ. ενέσεις CpG μπορεί να επάγει αντικαρκινική αποκρίσεις που είναι σε θέση να περιορίσουν την ανάπτυξη του όγκου και παρατείνει την επιβίωση σε κάποιο βαθμό. Παρ ‘όλα αυτά, όταν οι ποντικοί έλαβαν θανατηφόρα όγκου προκλήσεις ενδοφλεβίως ενέσεις CpG προστατεύεται μόνο το 50% των ποντικών, ενώ στην περίπτωση του Ρ.Τ. ενέσεις CpG -90% των ποντικών επέζησε. CpG προεπεξεργασία των naive ποντικούς δεν παρέχει καμία προστασία έναντι θανατηφόρου προκλήσεις όγκου ανεξάρτητα από την οδό χορήγησης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier των ποντικών αφελή έναντι ποντικών που έχουν υποστεί επεξεργασία με μόνη Cryo εκτομή, ή σε συνδυασμό με την ταυτόχρονη χορήγηση CpG μέσω των υποδεικνυόμενων οδών. Εγκατεστημένων όγκων B16OVA επί του δεξιού μηριαίου οστού υποβλήθηκαν σε αγωγή με μόνη ή σε συνδυασμό με CpG διοικήσεων μέσω διαφορετικών οδών κρυο εκτομή: Ρ.Τ., ενδοφλεβίως, υποδορίως ή contra πλευρική του όγκου. Σαράντα ημέρες αργότερα, αφελή και χωρίς-όγκο ποντικών (8-13 ποντικοί ανά ομάδα) έλαβε υποδορίως εκ νέου πρόκληση με κύτταρα όγκου (25.000 B16OVA κύτταρα). μεγέθους (Β) των όγκων καθορίζονται κάθε 2-3 ημέρες μετά τη θεραπεία. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η χρονική στιγμή της χορήγησης CpG είναι κρίσιμης σημασίας για την αποτελεσματικότητα του Ρ.Τ. ενέσεις CpG όταν συνδυάζεται με εκτομή. Η μειωμένη αποτελεσματικότητα της ενδοφλέβιας χορηγείται CpG στις τρέχουσες πειράματα μπορεί συνεπώς σχετίζονται με την καθυστέρηση με την οποία CpG-ODN φθάσουν τα απελευθερώνονται αντιγόνα στη θέση αφαίρεσης. Ως εκ τούτου, CpG εγχύθηκε 1 ημέρα πριν, ταυτόχρονα με, ή 1 ημέρα μετά την εκτομή. Η χορήγηση του CpG 1 ημέρα πριν την εκτομή οδήγησε σε παρόμοια αποτελέσματα, όπως παρατηρείται για ενέσιμα CpG ταυτόχρονη με εκτομή (40-45% των ποντικών επέζησαν). Σε αντίθεση, η χορήγηση CpG 1 ημέρα μετά την εκτομή απέτυχε να ενισχύσει ανοσία κατά του όγκου, όπως επαγόμενη από την Cryo εκτομή μόνο (Εικ. 5). Η μειωμένη αποτελεσματικότητα της ενδοφλέβιας CpG διοικήσεις σε σύγκριση με Ρ.Τ. έτσι την έκθεση δεν οφείλεται σε χρονικές πτυχές.

εγκατεστημένων όγκων B16OVA υπέστησαν αγωγή με μόνη ή σε συνδυασμό με ενδοφλεβίως κρυο εκτομή CpG ταυτόχρονη χορήγηση με εκτομή, ή 1 ημέρα πριν ή μετά την κατάλυση. Σαράντα ημέρες αργότερα, αφελή και ποντίκια με αγωγή χωρίς-όγκο (7-10 ποντίκια ανά ομάδα) έλαβε υποδορίως εκ νέου πρόκληση με κύτταρα όγκου (25,000 – 50,000 B16OVA κύτταρα) για την αντίπλευρη πλευρά και η επιβίωση παρακολουθήθηκε. Εκπρόσωπος των 2 πειραμάτων παρουσιάζεται.

Η

Συζήτηση

Αν και μοντέλα ποντικών έχουν δείξει με σαφήνεια τις ισχυρές αντικαρκινικές επιδράσεις των CpG, κλινικά αποτελέσματα είναι μέχρι στιγμής απογοητευτική, με την πρόσφατη φάση 2 και 3 δοκιμές σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα να πέσει λόγω της αποτυχίας του sc διοίκηση CpG-ODN για τη βελτίωση της κλινικής έκβασης [28]. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι η οδός χορήγησης καθορίζει την αποτελεσματικότητα των CpG να διεγείρουν ανοσοαποκρίσεις μετά in situ καταστροφή του όγκου. χορήγηση περινεοπλασματικής CpG αυξάνει τους αριθμούς των ενεργοποιημένων, ώριμη, που φέρουν το αντιγόνο DC στον όγκο-αποστράγγιση λεμφαδένα και διεγείρει το σχηματισμό των ογκο-ειδικών CTL που οδηγεί σε ανώτερη αποκρίσεις μνήμης έναντι αντιγόνων όγκου. Υποδόριες ενέσεις CpG μακρινό από τον όγκο αποτυγχάνουν να ενισχύσει ανοσία κατά του όγκου. Επίσης, η συστηματική χορήγηση CpG μέσω ενδοφλέβιας ένεση παρέχει μόνο περιορισμένη προστασία (50%) σε σύγκριση με περινεοπλασματικής ένεση (προστασία 90%).

Εφαρμόζοντας μια νέα κλινικά σχετική σε μοντέλο καταστροφή situ όγκου, έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η αποτυχία ή την επιτυχία του CpG ως ανοσοενισχυτικό εμβόλιο εξαρτάται από το συν-εντοπισμό του αντιγόνου και CpG μέσα ενδοσωματιακής διαμερίσματα DC και ως εκ τούτου, σχετικά με το χρονοδιάγραμμα της διοίκησης CpG. Δενδριτικά κύτταρα ήταν σε θέση μόνο να cross-σήμερα αντιγόνα και να προωθήσουν την επαγωγή CTL σε συνθήκες όπου αντιγόνου και CpG συν-βρίσκονται εντός DC. Στην πραγματικότητα, Ρ.Τ. διοίκηση CpG 1 ημέρα πριν ή μετά την εκτομή του όγκου, αντί της ταυτόχρονης έγχυσης CpG, είχε ήδη σημαντικό αντίκτυπο στην αποτελεσματικότητα της [21]. Βάσει αυτών των ευρημάτων, στόχος μας ήταν να προσδιοριστεί η επίδραση της διαδρομής χορήγησης επί CpG σε αυτό το μοντέλο του συστήματος. Ενώ υποδορίως ενέσεις CpG μακρινό από τον όγκο αποτυγχάνουν να προβεί σε οποιαδήποτε αντικαρκινική ανοσία, ενδοφλεβίως διοίκηση CpG απέδωσε κάποιο όφελος επιβίωσης (όχι σημαντική) πάνω από μόνοι κρυο κατάλυσης. Αυτές οι διαφορές στην αποτελεσματικότητα των CpG δεν σχετίζονται με διαφορές στον προγραμματισμό, όπως διαφορετικό χρονοδιάγραμμα σχήματα για ενδοφλέβια διοίκηση CpG δεν βελτιωθεί η αποτελεσματικότητά του. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι τόσο ο χρόνος και η οδός χορήγησης CpG προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα της θεραπείας CpG και υποδηλώνουν ότι η διαθεσιμότητα των CpG σε χρόνο και τόπο σε (λεμφοειδή) ιστών είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην ανοσοενίσχυση του CpG.

έχει προηγουμένως υποτεθεί ότι το αποτέλεσμα της χορήγησης CpG-ODN μέσω ενός ειδικού οδός μπορεί να εξαρτάται από τον τύπο των κυττάρων που απαντώνται από το ODN σε μια συγκεκριμένη ανατομική θέση [29]. Τα κύτταρα που αποκρίνονται στους λεμφαδένες αποστράγγισης το σημείο της ένεσης μπορεί να ενεργοποιήσει ένα διαφορετικό μονοπάτι για TLR9 σηματοδότησης από κύτταρα στον σπλήνα. Σε συμφωνία με αυτή την υπόθεση είναι οι παρατηρήσεις που ενδονεοπλαστική [25], Ρ.Τ. [26], [30] ή ενδο-λεμφικό [31] χορήγηση CpG έδειξε την αναμενόμενη επίδραση Th1 προάγουν και ήταν εξαιρετικά αποτελεσματικό στη βελτίωση της Τ κυτταρικής ανοσίας. Αντιθέτως, συστημική (ί.ν. ή ε.π.) εφαρμογή των CpG είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή των Τ κυττάρων και όχι ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος [32], [33], [34]. Ανάλογες ενδείξεις, προερχόταν από ανθρώπινες δοκιμές στις οποίες υποδορίως διοικήσεις των αντιγόνο συν CpG προκάλεσε μια συστημική έκφραση Th1-όπως κυτταροκινών στον ορό, ενώ ενδοφλέβιες ενέσεις δεν προκάλεσαν τέτοια αποτελέσματα [35].

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι το DC που λαμβάνονται από τον όγκο-αποστράγγιση των λεμφαδένων μετά από ενδοφλέβια έκθεση CpG έχουν εσωτερικεύσει υποβέλτιστη επίπεδα αντιγόνου και αποτυγχάνουν να εκφράζουν υψηλά επίπεδα συν-διεγερτικών μορίων. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην ανικανότητα των εισερχόμενων DC για την εσωτερίκευση ή μεταφορά αντιγόνο μετά από προηγούμενη συνάντηση με CpG. Δεδομένου ότι τόσο κάτοικος DC και μεταναστεύουν DC απαιτούνται για την επαγωγή των παραγωγικών του CTL [36] αυτό μπορεί να περιορίσει την επαγωγή των λειτουργικών CTL. Επιπλέον, ήταν προηγουμένως δείξει ότι η ε.φ. χορήγηση επαγόμενη έκφραση του 2,3-διοξυγενάσης ινδολαμίνης (IDO) σε DC, ένα ένζυμο που συνδέεται με το ανοσοποιητικό ρύθμιση και τον σχηματισμό των ρυθμιστικών Τ κυττάρων (Treg), που οδηγεί σε καταστολή επέκταση των κυττάρων Τ και δραστικότητα CTL. Παρά το γεγονός ότι δεν είχαμε ερευνήσει τις ανοσοποιητικού ρυθμιστικές ιδιότητες της DC άμεσα, παρατηρήσαμε σημαντικά αυξημένο αριθμό CD4

+ Foxp3

+ Treg στο σπλήνα των ποντικών που έλαβαν ενδοφλεβίως με CpG (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Treg παρεμποδίζουν την επαγωγή αντικαρκινικής ανοσοαποκρίσεων και είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται μέσω πολλαπλών μηχανισμών [37]. Η παρατηρούμενη μη βέλτιστη ωρίμανση του DC στον όγκο λεμφογάγγλιο αποστράγγισης σε συνδυασμό με την επαγωγή του IDO εκφράζουν DC στο σπλήνα μετά από ί.ν. διοίκηση CpG μπορεί να εμποδίσει τη βέλτιστη ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος.

Η παρούσα μελέτη τονίζει ότι στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου CpG θα πρέπει να χορηγείται σε άμεση γειτνίαση των απελευθερωμένων αντιγόνα του όγκου. Σε κλινικές μελέτες CpG χορηγείται γενικά ανεξάρτητη από την απελευθέρωση αντιγόνου όγκου [38]. Από κλινική άποψη ότι είναι προτιμότερο να χορηγείται CpG σε μια εύκολα προσβάσιμη τοποθεσία και σε μεγάλες ποσότητες, σύμφωνα με το σκεπτικό ότι θα ταξιδέψει στη θέση του όγκου. Ωστόσο, δείχνουμε εδώ ότι ούτε υποδορίως χορήγηση σε ένα μακρινό τόπο ή ενδοφλεβίως ένεση αξιοποιήσει πλήρως την ικανότητα επικουρική CpG. Σύμφωνα με τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η συν-εντοπισμό του αντιγόνου και CpG ευνοεί ανοσία, ισχυρός ανοσοδιεγερτικές αποκρίσεις των CpG βρέθηκε επίσης σε ανθρώπους όταν αντιγόνο (αντιγόνο επιφανείας ανασυνδυασμένο ηπατίτιδας Β) και CpG (CPG 7909) συν-εγχυθεί [39]