Abstract

σαν απλούς παράγοντες, ΑΒΤ-263 και ΑΒΤ-737 (ΑΒΤ), μοριακή ανταγωνιστές της οικογένειας Bcl-2, συνδέονται στενά με Bcl-2, Bcl-xL και Bcl-w, αλλά να μην MCL-1, και επάγει απόπτωση μόνο σε περιορισμένες κυτταρικών τύπων. Η ένωση 2-δεοξυγλυκόζη (2DG), σε αντίθεση, μερικώς μπλοκ γλυκόλυση, επιβραδύνοντας την ανάπτυξη των κυττάρων, αλλά σπάνια προκαλούν κυτταρικό θάνατο. Ενίεται σε ζώο, 2DG συσσωρεύεται κυρίως σε όγκους, αλλά δεν βλάπτει άλλους ιστούς. Ωστόσο, όταν τα κύτταρα που ήταν ιδιαίτερα ανθεκτικό σε ΑΒΤ υποβλήθηκαν προ-αγωγή με 2DG για 3 ώρες, ΑΒΤ έγινε ένας ισχυρός επαγωγέας απόπτωσης, απελευθερώνοντας ταχέως το κυτόχρωμα c από τα μιτοχόνδρια και ενεργοποίηση των κασπασών σε υπομικρογραμμομοριακές συγκεντρώσεις σε ένα Bak /Βαχ-εξαρτώμενο τρόπο. Bak κανονικά απορροφάται σε σύμπλοκα με Mcl-1 και Bcl-XL. 2DG πριμοδοτεί κύτταρα παρεμβαίνοντας με Bak-Mcl-1 ένωση, καθιστώντας ευκολότερο για ABT να διαχωρίσουν Bak από Bcl-XL, απελευθερώνοντας Bak για να επάγει απόπτωση. Ένα εξαιρετικά ενεργός μεταφορέας γλυκόζης και Προσφοράς, ως αντιπρόσωπος του μιτοχονδριακού βρόχο ενίσχυσης σήματος αποπτωτικά, είναι απαραίτητες για την αποτελεσματική επαγωγή απόπτωσης σε αυτό το σύστημα. Αυτή η θεραπεία συνδυασμού των ποντικών με καρκίνο που φέρουν ήταν πολύ αποτελεσματική έναντι ξενομοσχεύματος όγκου από μη-ορμονικής ιδιαίτερα μεταστάσεις χημειο-ανθεκτικού ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι η θεραπεία συνδυασμού μπορεί να παρέχει μια ασφαλή και αποτελεσματική εναλλακτική λύση για genotoxin που βασίζονται θεραπείες για καρκίνο.

Παράθεση: Yamaguchi R, Janssen Ε, Perkins G, Ellisman Μ, Kitada S, Reed JC (2011) αποτελεσματική εξάλειψη των καρκινικών κυττάρων από δεοξυγλυκόζη-ABT-263/737 θεραπεία συνδυασμού. PLoS ONE 6 (9): e24102. doi: 10.1371 /journal.pone.0024102

Επιμέλεια: Αντρέι Λ Gartel, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Απρίλη 2011? Αποδεκτές: 31 Ιουλ 2011? Δημοσιεύθηκε: 19 Σεπτέμβρη του 2011

Copyright: © 2011 Yamaguchi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. EJ λάβει Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) /National Cancer Institute Grant CA138617, ME έλαβε ΝΙΗ χορηγήσει P41RR004050, και JCR έλαβε CA113318, CA055164 και CA081534. Μερικές από τις εργασίες που περιγράφονται εδώ διεξήχθη χρησιμοποιώντας τις εγκαταστάσεις του Εθνικού Κέντρου για την Μικροσκοπία και Imaging Research του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια στο Σαν Ντιέγκο, που υποστηρίζεται από το ΝΙΗ NCRR μέσω του αριθμού επιχορήγηση P41RR004050 για μένα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

2-δεοξυ-D-γλυκόζη είναι ένα μόριο γλυκόζης το οποίο έχει την 2-υδροξυλίου αντικαθίσταται με υδρογόνο. 2DG μεταφέρεται κατά μήκος της μεμβράνης του πλάσματος από ένα μεταφορέα γλυκόζης [1]. Μόλις στο κυτοσόλιο, 2DG φωσφορυλιώνεται από εξοκινάση II και των προϊόντων της, 2-δεοξυγλυκόζη 6-φωσφορικό άλας, είναι παγιδευμένος στο κυτοσόλιο και γίνεται ένας αναστολέας της εξοκινάσες, ακριβώς όπως η γλυκόζη μετατρέπεται 6-φωσφορικής γλυκόζης και γίνεται ένας αναστολέας της εξοκινασών. Ωστόσο, όπως 6-φωσφορική γλυκόζη υδρολύεται από γλυκόζη 6-φωσφατάση πολύ γρήγορα, παράγοντας NADPH και παραγωγής ενέργειας, ομόλογό του, 2-δεοξυγλυκόζη 6-φωσφορικό άλας, είναι μια φτωχότερη υπόστρωμα γλυκόζης 6-φωσφατάση. Κατά συνέπεια 2-δεοξυγλυκόζη 6-φωσφορικής συσσωρεύεται στο κυτοσόλιο, αναστέλλοντας εξοκινάσες και μειώνοντας κυτταρικά επίπεδα ενέργειας. Εκτιμάται ότι η ενδοκυτταρική ημιζωή του 2-δεοξυγλυκόζης 6-φωσφορικής είναι περίπου 50 λεπτά σε καρκινικά κύτταρα [2]. Έτσι 2DG δρα ως αναστολέας της γλυκολυτικής οδού.

Τα πιο αργούς ρυθμούς υδρόλυσης της 2-δεοξυγλυκόζης 6-φωσφορικής επιτρέπουν την πρόσληψη γλυκόζης που πρέπει να μετρηθεί σε ζωντανά ζώα από

18F-φθοριο-2-δεοξυγλυκόζης βάση Τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (FDG-PET). Οι πρόσφατες εξελίξεις στην FDG-PET έδειξε σαφώς πολύ υψηλότερα ποσοστά των δραστηριοτήτων γλυκόζης μεταφορέα in vivo, από σχεδόν όλα τα στερεά καρκινώματα σε σύγκριση με φυσιολογικούς υγιείς ιστούς, επιβεβαιώνοντας την Φαινόμενο Warburg [1]. FDG-PET έχει γίνει επίσης ένα πολύ ευαίσθητο τρόπο για την ανίχνευση όγκων σε πολύ πρώιμο στάδιο, π.χ., πρώιμο στάδιο ασυμπτωματική καρκίνο του παγκρέατος. Από 2DG συσσωρεύεται κατά κύριο λόγο στα καρκινικά κύτταρα και μερικώς αναστέλλει πολύ αξιοποιούνται γλυκόλυση στα κύτταρα αυτά, η χορήγηση του 2DG είναι ένας ασφαλής και αποτελεσματικός τρόπος επιβράδυνση της ανάπτυξης του καρκίνου [1]. Ωστόσο, η κυτταροστατική δραστηριότητα των 2DG είναι γενικά βραχύβια, διαρκεί μόνο περίπου μια εβδομάδα [3]. Έτσι 2DG έχει δοκιμαστεί σε συνδυασμό με άλλα χημειοθεραπευτικά, αλλά και πάλι με ανάμεικτα αποτελέσματα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, θα μπορούσε να μειώσει την αποτελεσματικότητα άλλων θεραπειών [4]. Ένας λόγος για μειωμένη αποτελεσματικότητα σε αυτές τις συνδυαστικές θεραπείες μπορεί να είναι ότι σε ορισμένα κύτταρα, 2DG ενεργοποιεί ένα που μοιάζει με ινσουλίνη υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα (IGFR), η οποία θα μπορούσε να ενεργοποιήσει την οδό ΡΙ3Κ-mTOR-ΑΚΤ προ-επιβίωσης [5], [6].

Διάφορα φάρμακα που στοχεύουν Bcl-2 και Mcl-1 έχουν ελεγχθεί για τις ικανότητές τους να επάγουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα [7]. Το πιο σημαντικό από αυτά είναι τα Bcl-2 ανταγωνιστές ΑΒΤ-737 και ΑΒΤ-263 [8], [9]. ΑΒΤ-737 συνδέεται ειδικώς και με υψηλή συνάφεια προς το Bcl-2 οικογένειας πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των Bcl-2, Bcl-xL και Bcl-w, αλλά όχι να Mcl-1. ΑΒΤ-737 τροποποιήθηκε σε τρεις τοποθεσίες για τη δημιουργία ΑΒΤ-263 για βελτιωμένη από του στόματος βιοδιαθεσιμότητα χωρίς την απώλεια του συγγένεια με τον οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών [9]. Ως ένα ενιαίο μέσο, ​​ωστόσο, ΑΒΤ-263/737 (ΑΒΤ) επάγει απόπτωση μόνο σε περιορισμένες τύπους όγκων, όπως τα λεμφώματα και κάποια μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [8], [9], [10]. Ο λόγος για ποικίλες ευαισθησίες προς ABT δεν είναι απολύτως σαφής.

Η απόπτωση προχωρά τυπικά είτε από την ενδογενή οδό, στην οποία το κυτόχρωμα c απελευθερώνεται από μιτοχόνδρια σε Βαχ /Bak-εξαρτώμενο τρόπο, ενεργοποιώντας apoptosomes στο κυτταρόπλασμα, ή της εξωτερικής οδού, στην οποία οι κασπάσες ενεργοποιούνται άμεσα καθοδικά των υποδοχέων θανάτου (ανασκόπηση από Salvesen & amp? Riedl [11]). Συχνά υπάρχει cross-talk μεταξύ αυτών των δύο οδών. Επειδή ABT δεσμεύει μιτοχονδριακών πρωτεϊνών, ΑΒΤ-επαγόμενη απόπτωση πιστεύεται ότι συμβαίνει μέσω της ενδογενούς οδού, αλλά δεν ξέρουμε πώς ακριβώς γίνεται αυτό.

Το κρίσιμο βήμα στην ενδογενή οδό της απόπτωσης είναι όταν το κυτόχρωμα c είναι απελευθερώνεται από μιτοχόνδρια επειδή μόλις το κυτόχρωμα c απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα, διεγείρει το σχηματισμό apoptosomes, ο δήμιος του θανάτου. Για το λόγο αυτό, η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c συχνά ονομάζεται το σημείο χωρίς επιστροφή [12]. Μέχρι πριν από μερικά χρόνια, θεωρήθηκε ότι το ασβέστιο ενεργοποιούμενη μετάπτωση διαπερατότητας μιτοχόνδρια πόρους (ΜΡΤΡ) μπορεί να απαιτείται για την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c κατά τη διάρκεια της ενδογενούς οδού της απόπτωσης. Ωστόσο, φάνηκε ότι tBid προκαλούμενη απελευθέρωση κυτοχρώματος c και επακόλουθη απόπτωση θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί με την απουσία του VDAC [13] και την κυκλοφιλίνη Α [14], [15], δύο βασικά συστατικά του ΜΡΤΡ (ανασκόπηση στο Yamaguchi & amp? Perkins [16]). Αντ ‘αυτού, η επικρατούσα δόγμα είναι ότι η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c γίνεται μέσω των μιτοχονδρίων τους πόρους της εξωτερικής μεμβράνης (MOMPs). Παρά το γεγονός ότι ΜΟΜΡ είναι μια καλά εδραιωμένη αντίληψη, την ύπαρξή του παραμένει υποθετική, διότι σε αντίθεση με την πυρηνική πόρους ή ΜΡΤΡ, δεν υπάρχουν εικόνες ΕΜ της MOMPs. Ομοίως, MOMPs δεν έχουν απομονωθεί ως βιολογική οντότητα. Έτσι, δεν είναι γνωστό εάν Bak ή Βαχ διαμένουν σε MOMPs. Η πιο λεπτομερής ανάλυση του σχηματισμού ΜΟΜΡ κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, προήλθε από τη μελέτη κυστίδια λιπιδίων συναρμολογούνται με μιτοχονδριακές πρωτεϊνών της εξωτερικής μεμβράνης. Σε αυτές τις μελέτες, tBid ενεργοποιούμενη Bax χρησιμοποιήθηκε για να διεγείρει τη συναρμολόγηση ΜΟΜΡ επί των κυστιδίων [17], διεγείροντας την απελευθέρωση των πρωτεϊνών τόσο μεγάλο όσο 2000 kDa [18] μέσω των πόρων με διάμετρο από 25-100 nm [19]. Αν MOMPs σε μιτοχόνδρια είναι περίπου το ίδιο μέγεθος, θα περίμενε κανείς να τους δει τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (ΕΜ), αλλά δεν έχουν απεικονισθεί. Έτσι, η ύπαρξη του MOMPs παραμένει υποθετικός. Παρ ‘όλα αυτά, από μια μηχανιστική άποψη, η ύπαρξη MOMPs αποτελείται εν όλω ή εν μέρει από Bax και Bak έχει νόημα.

ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες, όπως tBid, bims ονομάζονται «ενεργοποιητές» επειδή αλληλεπιδρούν άμεσα με Bax ή Bak, αλλάζοντας τη διαμόρφωσή τους και την επαγωγή ολιγομερισμού, με άλλα λόγια «ενεργοποίησης» τους, που οδηγεί σε απελευθέρωση κυτοχρώματος ο και απόπτωση. Πιο πρόσφατα ευρήματα, ωστόσο, δείχνουν ένα άλλο σενάριο στο οποίο λαμβάνει χώρα απόπτωση απουσία των πρωτεϊνών ενεργοποιητή. Πρώτον, Huang και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι το Bak κανονικά απορροφάται από Mcl-1 και Bcl-xL, Bak και πρέπει να απελευθερωθούν από τόσο πριν όσο μπορεί να σχηματίσει ολιγομερή [20]. Η ιδέα ότι αδρανοποιεί κάποια αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών χωρίς τη βοήθεια από κάποιο ενεργοποιητή μπορεί να διεγείρει απόπτωση, δεν είναι χωρίς διαμάχη [21], [22]. Είμαστε υπέρ της ιδέας επειδή Χουάνγκ και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι αδρανοποιεί τόσο Bcl-xL και Mcl-1 ήταν αρκετά για να επάγει απόπτωση σε προσφορά και Bim ΠΜΑ νοκ-άουτ [23], και Hayashi και οι συνεργάτες του βρήκαν το ίδιο σε κύτταρα με έλλειψη αιμοπεταλίων Προσφοράς και Bim [24 ].

Αν υποθέσουμε ότι Bim και προσφοράς δεν εμπλέκονται στην ABT-επαγόμενη απόπτωση, μπορούμε να υποθέσουμε λόγους για ποικίλες ευαισθησίες για ΑΒΤ-737. Από ΑΒΤ-737 δεσμεύεται με Bcl-xL, αυτό αδρανοποιώντας, αλλά δεν δεσμεύεται με Mcl-1, εάν υπάρχουν λιγότερα πρωτεΐνες Mcl-1 του παρόντος, τότε η αποτελεσματικότητα της ΑΒΤ-737 πρέπει να αυξηθεί. Πράγματι, Χουάνγκ και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι με τη μείωση Mcl-1 από κύτταρα HeLa με siRNA, έγιναν ευαίσθητα στην ABT-737 [25]. Πολλές ομάδες ανέφεραν επίσης αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας καρκινικών κυττάρων σε ΑΒΤ-737 και τα επίπεδα έκφρασης Mcl-1 σε πολλούς τύπους καρκίνου (βλέπε Πληροφορίες S1). Ωστόσο, υπάρχουν και εξαιρέσεις? HL-60 ανθρώπινα κύτταρα λευχαιμίας promyerlocytic εκφράζουν ευλόγως μεγάλων ποσοτήτων Mcl-1, αλλά είναι παρ ‘όλα αυτά, ευαίσθητα σε ΑΒΤ-737 [26]. Έτσι, πώς ABT-737 επάγει απόπτωση σε ορισμένες καρκινικά κύτταρα και όχι σε άλλα, παραμένει ελάχιστα κατανοητή.

Έχουμε ξεκινήσει το έργο αυτό, ώστε να αναζητήσετε παράγοντες που μπορούν να αυξήσουν την αποτελεσματικότητα της ABT. Όταν συν-θεραπεία ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών με ABT και φάρμακα που παρεμβαίνουν με καρκίνο ειδικό κυτταρικό μεταβολισμό, βρήκαμε ότι 2DG προεπεξεργασία βελτιωθεί κατά πολύ η αποτελεσματικότητα της ΑΒΤ χωρίς να βλάπτουν τα υγιή κύτταρα. Δείχνουμε ότι 2DG-ABT προκαλεί απόπτωση χωρίς να μεταβάλλει τα επίπεδα Mcl-1 σε ΑΒΤ-ανθεκτικά κύτταρα. Όταν τα καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε ΑΒΤ είναι προ-αγωγή με 2DG, τα επίπεδα πρωτεΐνης του Mcl-1 παραμένουν οι ίδιες, αλλά Bak-Mcl-1 ένωση έχει χαθεί, για ευαισθητοποίηση κυττάρων ΑΒΤ-επαγόμενη απόπτωση. Πώς θεραπεία 2DG των καρκινικών κυττάρων διαταράσσει Bak-Mcl-1 δεν είναι γνωστή. Έτσι, ο καρκίνος ευαισθησία των κυττάρων στην ABT φαίνεται να καθορίζεται όχι μόνο από τα επίπεδα της πρωτεΐνης των Mcl-1, αλλά και από το πόσο Bak διαχωρίζεται από την ένωση της με Mcl-1.

Αποτελέσματα

2DG-ABT προκαλεί αποτελεσματικά την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων

Εφαρμοσμένη ως μονοθεραπεία, 30 nM της ΑΒΤ-737 σκοτώθηκαν 90% της RS (4? 11) μη-Hodgkin λέμφωμα κυττάρων Β κύτταρα σε 9 ώρες ( Σχ. 1α). Ωστόσο, μια 1-ώρα προ-επώαση των RS (4? 11) κύτταρα με 5 έως 10 mM 2DG σε μέσο που περιέχει 10 mM γλυκόζη αύξησε την αποτελεσματικότητα της ΑΒΤ δραματικά, σκοτώνοντας το 90% των κυττάρων με μόλις 3 ηΜ ΑΒΤ-737. 2DG μόνη δεν προκαλούν κυτταρικό θάνατο κατά τη διάρκεια της επώασης των 10 ωρών. Όταν δοκιμάστηκε για την ενεργοποίηση της κασπάσης, διαπιστώθηκε ότι τόσο λίγο όσο 1 ηΜ ΑΒΤ-737 θα μπορούσε να ενεργοποιήσει κασπάσες σε 3 ώρες για όσο διάστημα τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με 2DG για 3 ώρες. Αριθ ενεργοποίηση της κασπάσης πέρα ​​από το υπόβαθρο παρατηρήθηκε σε κύτταρα που επωάστηκαν μόνο του με 2DG. Έτσι, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι 2DG ευαισθητοποιεί RS (4? 11) κύτταρα να ΑΒΤ-επαγόμενη απόπτωση. Επαναλάβαμε το πείραμα χρησιμοποιώντας διάφορες συγκεντρώσεις του ΑΒΤ-263 και μετρήθηκαν τα κύτταρα με trypan-blue χρωστικής και να στείλει για νεκρά κύτταρα 24 ώρες μετά την προσθήκη ΑΒΤ (Εικ. S1a). Το αποτέλεσμα έδειξε επίσης μία συνεργική δράση 2DG και ΑΒΤ

a, RS (4? 11). Κύτταρα προ-επεξεργασία με 20 mM φρουκτόζη ή 0-10 mM 2-δεοξυ-D-γλυκόζη σε κανονικό μέσο RPMI που περιέχει 12 mM γλυκόζη, επί 1 ώρα πριν από την προσθήκη του ΑΒΤ-737 σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. 9 ώρες αργότερα, τα κύτταρα αναλύθηκαν με FACS για Annexin-V θετικότητα. Chi Square κριτήριο της ανεξαρτησίας για δύο μεταβλητές, 2DG και ABT, ήταν P (x ~

1

2 & gt? 193,35) = 0.000000. Δεδομένου ότι ο συνδυασμός ήταν σαφώς καλύτερα από τα αναμενόμενα αξίες, η στατιστική δείχνει συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ 2DG και ΑΒΤ-737. b, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε προ-θεραπεία για 1 ώρα με ή χωρίς 10 mM δεοξυγλυκόζης σε ϋΜΕΜ που περιέχει 12 mM γλυκόζη, πριν την προσθήκη ΑΒΤ-737. Έξι ώρες αργότερα, τα κύτταρα αναλύθηκαν με FACS για χρώση Annexin-V. c, HeLa κύτταρα προ-θεραπεία για 3 ώρες με 2DG πριν από την προσθήκη του ΑΒΤ-737. Τα κύτταρα αναλύθηκαν για δραστικότητα κασπάσης σε 3 ώρες μετά την ΑΒΤ-737 προσθήκης. d, HeLa, PPC-1 και MCF-7 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 mM 2DG για 3 ώρες πριν από την προσθήκη 1 μΜ ΑΒΤ-263 για την ολονύκτια επώαση. Trypan blue-αρνητικό (βιώσιμα) κύτταρα μετρήθηκαν και απεικονίζονται γραφικά (μέση τιμή ± std dev? N = 3). e, συνδυασμένη θεραπεία μειώνει κλωνογόνο επιβίωση των κυττάρων PPC-1. κύτταρα PPC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο μία φορά για 24 ώρες με 5 mM 2DG, 1 μΜ ΑΒΤ-263, και τα δύο, ή αφέθηκαν χωρίς θεραπεία. 250-1000 κύτταρα απλώθηκαν ανά mm πιάτο 30, και 12 ημέρες αργότερα, επιζών αποικίες κυττάρων χρωματίζονται.

Η

Στη συνέχεια, ελέγξαμε εάν 2DG θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει ABT-ανθεκτικά κύτταρα του όγκου να ΑΒΤ-737 ή ABT -263. Τα αρχικά πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση HeLa κύτταρα καρκίνου του τραχήλου. Τα κύτταρα HeLa προ-θεραπεία για 1 ώρα με 2DG πριν από την προσθήκη του ΑΒΤ-737. Εννέα ώρες μετά την προσθήκη 1 μΜ του ΑΒΤ-737, περίπου 35% των κυττάρων HeLa που είχαν προ-αγωγή με 2DG, ήταν αννεξίνης V-θετικά (σχ. 1β). Αυτό το ποσοστό του κυτταρικού θανάτου ήταν συγκρίσιμη με εκείνη που παρατηρήθηκε μετά από την επεξεργασία των κυττάρων HeLa με 1 μΜ σταυροσπορίνη (STS), ένα πολύ γνωστό επαγωγέα απόπτωσης σε κύτταρα HeLa Σε ένα άλλο σύνολο πειραμάτων, όταν τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε προ-αγωγή επί 3 ώρες με 10 mM 2DG σε ένα μέσο που περιέχει 25 mM γλυκόζη, ισχυρή ενεργοποίηση της κασπάσης παρατηρήθηκε μέσα σε 3 ώρες σε συγκεντρώσεις ΑΒΤ-737 τόσο χαμηλές όσο 0.1 μΜ (Σχ. 1γ). Χωρίς 2DG προ-θεραπεία, ακόμη και 10 μΜ ΑΒΤ-737 δεν θα μπορούσε να ενεργοποιήσει κασπάσες κατά την ίδια περίοδο. Αυτό το πείραμα επίσης επαναλήφθηκε χρησιμοποιώντας ΑΒΤ-263 και βαθμολόγησης νεκρά κύτταρα με ενσωμάτωση trypan-blue χρωστικής (Εικ. S1b). Και πάλι, έδειξε ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα του ΑΒΤ-263 και 2DG. ΑΒΤ-737 και ΑΒΤ-263 συγκρίθηκαν side-by-side με χρήση τριών ωρών 2DG-προεπεξεργασία των κυττάρων HeLa. ΑΒΤ-263 ήταν ελαφρώς καλύτερη από ΑΒΤ-737 στην επαγωγή της απόπτωσης (Σχ. S2a).

Προϋποθέσεις 2DG-ABT απόπτωση που επάγεται

Κινητικές και μελέτες δόσης-απόκρισης με κύτταρα HeLa έδειξε τα ακόλουθα : (i) την παρουσία γλυκόζης στο μέσο είναι απαραίτητο για 2DG-ABT προκαλούμενη απόπτωση (Σχ S2B.), και το βέλτιστο μοριακό λόγο για επαγωγή απόπτωσης με 2DG: γλυκόζη είναι κατά 0,4 έως 1,0? (Ii) 2DG θα πρέπει να προστεθούν 3 έως 4 ώρες πριν από την προσθήκη του ΑΒΤ (Εικ S2C & amp? Δ.)? και (iii) την ενεργοποίηση της κασπάσης παρατηρείται μέσα σε 3 ώρες από την προσθήκη ΑΒΤ. Αυτές οι συνθήκες μπορεί να αντανακλά τη σταθερότητα της ΑΒΤ-263/737 διάλυμα (περίπου 4 ώρες [9]), καθώς και η φύση των ενδοκυτταρικών σημάτων που παράγονται από 2DG? θα πρέπει να λάβει 3 έως 4 ώρες για 2DG να παράγει ένα αρκετά ισχυρό σήμα για να είναι αποτελεσματική. Υπό αυτές τις συνθήκες, η μείωση της συγκέντρωσης κυτταρικής ΑΤΡ είναι πολύ μικρή (Σχ. 5α), γεγονός που υποδηλώνει ότι ανεπάρκεια ΑΤΡ δεν παρέχει μία εξήγηση για την βελτίωση της ευαισθησίας στην ΑΒΤ-737 και ΑΒΤ-263.

όλα τα επόμενα πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες: Προσθέστε 5-10 mM 2DG να κυτταρική καλλιέργεια. Τρεις ώρες αργότερα, προσθέστε 1-3 μΜ ABT. Δοκιμασία για την αποδέσμευση c δραστηριότητα κασπάσης και κυτόχρωμα από μιτοχόνδρια τρεις ώρες μετά ΑΒΤ-θεραπεία. Έξι ώρες μετά την ΑΒΤ-θεραπεία, δοκιμασία για χρώση Annexin V. 24 ώρες αργότερα, μετρούν τα βιώσιμα κύτταρα με trypan δοκιμασία αποκλεισμού μπλε βαφής. Η απόκριση στο πρωτόκολλο κυμαινόταν από κυτταρική γραμμή σε κυτταρική γραμμή. Μεταξύ των καρκινικών κυττάρων που ανταποκρίθηκαν καλά ήταν μαστού καρκινική κυτταρική γραμμή MCF-7 και ορμόνη ανθεκτικών καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή PPC-1. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, πάνω από το 95% των κυττάρων είχαν εξαλειφθεί μέσα σε 24 ώρες από την θεραπεία συνδυασμού (Σχ. 1 d). Μια ενιαία εφαρμογή πράκτορας της 2DG προκάλεσε κάποια θανάτου (31,3% για HeLa, κανένας παρατηρείται σε MCF-7, και 21,5% για τη ΔΕΗ-1). Δεδομένου ότι όλα τα κύτταρα έχουν ποικίλες ποσότητες γλυκογόνου, όπως είναι αποθηκευμένα πηγή γλυκόζης, τα ποσοστά κυτταρικού θανάτου με 2DG εξαρτιόταν από την προηγούμενη ιστορία των καλλιεργημένων συνθήκες σε μεγάλο βαθμό. Καλλιεργημένα κύτταρα κανονικά ξεπεραστούν 2DG επαγόμενη ανάπτυξη σύλληψης και να αρχίσει να αυξάνεται σε 24-48 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Περαιτέρω, όταν 2DG εγχύθηκε σε ποντικούς καρκίνο που φέρουν, δεν προκαλεί υποχώρηση του όγκου, αλλά καθυστερεί την ανάπτυξη του όγκου κατά 5-6 ημέρες. Μετά από αυτή την μικρή καθυστέρηση, οι όγκοι άρχισαν να αναπτύσσονται. Άλλες ομάδες είχαν κάνει παρόμοιες παρατηρήσεις [4]. Ο λόγος για την επίκτητη αντοχή στην 2DG δεν είναι γνωστή. Ως μονοθεραπεία, η επίδραση της ΑΒΤ-263 ήταν επίσης οριακή (13,7% για HeLa, 3,1% για τα MCF-7 και 36,7% για τη ΔΕΗ-1). Τα αποτελέσματα του 2DG-ΑΒΤ συνδυασμός υπερέβησαν κατά πολύ τα πρόσθετα αποτελέσματα της 2DG και ΑΒΤ και στις τρεις κυτταρικές σειρές (HeLa αναμένεται βιώσιμων κυττάρων 59%, παρατηρήθηκε 25%, MCF7 αναμένεται βιώσιμων κυττάρων 115%, παρατηρήθηκε 3,8%, και ppc1 αναμένεται βιώσιμα κύτταρα 49,7 %, παρατηρήθηκε 3,9%). Η Κλωνογόνος κυττάρων δοκιμασία επιβίωσης έδειξε επίσης ότι πάνω από το 95% των κυττάρων ΔΕΗ-1 απομακρύνθηκαν από μία μόνο θεραπεία, ενώ οι αιτήσεις μοναδικός παράγοντας της ΑΒΤ ή 2DG ήταν σε μεγάλο βαθμό αναποτελεσματικές (Εικ. 1ε). Δεδομένου ότι η ρ53 είναι ανενεργή σε ορισμένες από τις γραμμές υψηλής απόκρισης όγκου συμπεριλαμβανομένων PPC-1 [27], [28], [29], καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ο συνδυασμός επαγόμενη απόπτωση είναι ρ53-ανεξάρτητη. Οι πιθανοί λόγοι για ποικίλες απαντήσεις θα συζητηθεί αργότερα.

Για να καταλάβουμε τι ακριβώς μοριακά γεγονότα λαμβάνουν χώρα όταν ABT προστίθεται 2DG επεξεργασμένα κύτταρα, αποφασίσαμε πρώτα να διερευνήσει τι είδους απόπτωση που επάγεται από το συνδυασμός 2DG και ΑΒΤ.

Συνδυαστική θεραπεία με 2DG και ΑΒΤ επάγει απόπτωση μέσω της εσωτερικής οδού

έχει αναφερθεί ότι η εφαρμογή των 10 ηΜ ΑΒΤ-737 για μόλις 2 ώρες προκαλεί την μιτοχονδριακή της εξωτερικής μεμβράνης για διάρρηξη σε κύτταρα χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας (CLL) [30]. Αυτό δεν είναι ένα φυσιολογικό φαινόμενο σε απόπτωση. Κυτόχρωμα c συνήθως απελευθερώνονται μέσω των μιτοχονδρίων τους πόρους της εξωτερικής μεμβράνης σε τακτικό τρόπο [31]. Η καταστροφή των μιτοχονδρίων λαμβάνει χώρα λίγο μετά την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τις δραστηριότητες της πλήρως ενεργοποιηθεί μηχανημάτων κυτταρικό θάνατο. Όταν εξετάσαμε κύτταρα HeLa που έλαβαν το συνδυασμό 2DG-ABT χρησιμοποιώντας ΕΜ, ρήξη των μιτοχονδριακών εξωτερικών μεμβρανών δεν ανιχνεύθηκε (Εικ. 2α). Σε ΑΒΤ-επεξεργασμένα κύτταρα, ωστόσο, ελαφρά βράχυνση των μιτοχονδρίων παρατηρήθηκαν (Σχήμα 2β & amp?. Γ)? από 0.717 +/- 0,05 μm για το μη επεξεργασμένο με 0.530 +/- 0,05 μm για την ABT μόνο, 0.553 +/- 0,06 μm για 2DG + ABT, και ελαφρά επιμήκυνση των μιτοχονδρίων σε 2DG-κατεργασμένων κυττάρων στο 0,844 +/- 0,05 μm. Υποθέτουμε ότι εφόσον Bcl-xL και Bcl-w είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην μιτοχονδριακή σύντηξη /σχάσης [32], ΑΒΤ μπορεί να ανασταλεί δραστηριότητές τους. Όσο για την επιμήκυνση των μιτοχονδρίων κάτω 2DG, μπορεί να έχει δημιούργησαν αυξημένη ζήτηση για μιτοχονδριακή αναπνοή, και να ανταποκριθεί το βάρος, τα μιτοχόνδρια μπορούν να έχουν γίνει πλέον. Ακόμα κι αν 2DG και ΑΒΤ είχε αντίθετα αποτελέσματα επί του μήκους των μιτοχονδρίων, και οι δύο επηρέασαν τα φυσιολογίες των μιτοχονδρίων. Ακόμα κι αν μερικές εικάζει ότι τα μηχανήματα σύντηξης μιτοχόνδρια /σχάσης μπορεί επίσης να παίζουν ρόλο στην απόπτωση, η ιδέα παραμένει αμφιλεγόμενη [33].

κύτταρα HeLa έλαβαν θεραπεία είτε με 10 mM 2DG για 6 ώρες, 1 μΜ ΑΒΤ-263 για 3 ώρες, ή 2DG για 3 ώρες πριν από την προσθήκη ΑΒΤ-263 για επιπλέον 3 ώρες, ή αφέθηκαν χωρίς θεραπεία. ένα, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν για ηλεκτρονική μικροσκοπία (βλέπε μέθοδο). Τρία κύτταρα από κάθε ομάδα θεραπείας εξετάστηκαν προσεκτικά για το μήκος των μιτοχονδρίων. Δεν παρατηρήσαμε ένα μόνο παράδειγμα από ρήξη μιτοχονδριακών outermembranes. b, Από κάθε κύτταρο, ένα ελάχιστο 12 μιτοχόνδρια επελέγησαν τυχαία για μέτρηση. γ, Μέση μήκη των μιτοχονδρίων έγινε μικρότερη με θεραπείες που περιέχουν ABT-263 (μέση τιμή +/- std dev). Από ΑΒΤ-263/737 δεσμεύεται με Bcl-2 μελών της οικογένειας, τα οποία είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην μιτοχονδριακή σύντηξη /σχάσης, ΑΒΤ μπορεί να έχει μεταβληθεί η ισορροπία της μιτοχονδριακής σύντηξης /σχάσης στην πλευρά σχάσης (p = 0.0001, 95% διάστημα εμπιστοσύνης αυτής της διαφοράς:. από 14,5407 να 37,2513? unpaired t-test)

η

Για να προσδιοριστεί εάν 2DG-ΑΒΤ-επαγόμενη απόπτωση είναι μέσω της ενδογενούς οδού, χρησιμοποιήσαμε άγριου τύπου (wt) ινοβλάστες εμβρύου ποντικού (ΠΜΑ) και Bax /Bak διπλό νοκ-άουτ (ϋΚΟ) ΠΜΑ. Αυτά τα κύτταρα ϋΚΟ στερούνται την ενδογενή οδό. Σε ΠΜΑ άγριου τύπου προ-αγωγή με 2DG, την ενεργοποίηση της κασπάσης προκλήθηκε μέσα σε 3 ώρες από προσθήκη ΑΒΤ (Εικ. 3α). Ωστόσο, δεν υπήρξε ταχεία ενεργοποίηση της κασπάσης σε Bak /Βαχ ϋΚΟ ΠΜΑ. Ως εκ τούτου, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι 2DG-ΑΒΤ-επαγόμενη απόπτωση λαμβάνει χώρα από τον Bak /Βαχ εξαρτώμενη εσωτερικής οδού (βλέπε επίσης Εικ. S5A).

a, Wt, και Βαχ /Bak ϋΚΟ MEFs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 mM 2DG για 3 ώρες πριν από την προσθήκη του 3 μΜ ΑΒΤ-263 για 3 ώρες. 3 ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για αναλύσεις δραστικότητας κασπάσης. (Βλέπε επίσης Εικ. S5A). β, τα κύτταρα ΗΤ1080 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 2DG για 3 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 1 μΜ STS ή αντι-Fas (CD95) αντίσωμα σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις (μg /ml). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 3 ώρες μετά, και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα κασπάσης. Είναι ενδιαφέρον, 2DG φαίνεται να έχουν παρέμβει με Fas απόπτωση. Σε επαναλαμβανόμενα πειράματα, παρατηρήσαμε με συνέπεια χαμηλότερα ποσοστά ενεργοποίηση της κασπάσης σε προ-επεξεργασμένα κύτταρα 2DG, αλλά οι βαθμοί της ανασταλτικής δράσης κυμαίνεται από πείραμα σε πείραμα. Δεν είμαστε σίγουροι για την αιτία του. c, για τις πρώτες 3 ώρες, τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 mM 2DG ή αφεθεί χωρίς θεραπεία και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΜ z-VAD, 1 μΜ ΑΒΤ-737, δύο, ή ούτε για 3 επιπλέον ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για το DNA (κόκκινο) και κυτόχρωμα c (πράσινο) και εξετάστηκαν για απώλεια της χρώσης κυτόχρωμα c, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Bar δείχνει 100 μm. Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες φαίνεται στο Σχ. S3. Αυτό το γράφημα δείχνει το ποσοστό των κυττάρων με απώλεια της χρώσης κυτοχρώματος c. Η θεραπεία συνδυασμού είχαν υψηλότερα ποσοστά κυττάρων με απελευθερώνονται κυτοχρώματος c (p = 0,008 με μη ζευγαρωμένο t-test). d, Cells κατεργάστηκε όπως στο γ κλασματοποιήθηκαν και κυτοσολικά κλάσματα αναλύθηκαν με western blots.

Η

Για να ελεγχθεί αν 2DG ευαισθητοποιεί επίσης κύτταρα όγκου στην εξωγενή οδό της απόπτωσης, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα ΗΤ1080, στα οποία υπάρχει δεν είναι cross talk μεταξύ των ενδογενών και εξωγενών οδών [34]. Προ-επεξεργασία των ΗΤ1080 κυττάρων με 2DG για 3 ώρες δεν ενίσχυσε Fas απόπτωση αλλά μείωσε την ενεργοποίηση της κασπάσης (Σχ. 3β). Έτσι, 2DG δεν ενισχύουν την εξωγενή οδό.

2DG-ABT προκαλεί την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c μέσω της κασπάσης-εξαρτώμενο μηχανισμό

Ένα κρίσιμο βήμα στην ενδογενή οδό είναι η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια . Όταν 1 μΜ ΑΒΤ-737 εφαρμόστηκε σε κύτταρα HeLa τα οποία είχαν προ-αγωγή με 2DG για 3 ώρες, παρατηρήσαμε την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c σε πάνω από 30% των κυττάρων εντός των επόμενων 3 ωρών, αλλά όχι σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ή κύτταρα θεραπεία είτε με 2DG ή ΑΒΤ μόνο (Σχ. 3c και το Σχ. S3).

σε κανονική μιτοχόνδρια εξαρτώμενη μορφές απόπτωσης όπως staurosporine-, ετοποσόδη- ή κυτταρικό θάνατο υν επαγόμενη, την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια εμφανίζεται ανάντι ενεργοποίηση της κασπάσης και μπορεί να προχωρήσει υπό την παρουσία αναστολέων κασπάσης [35], [36]. Αντίθετα, κατά τη διάρκεια της απόπτωσης των υποδοχέων που επάγεται θάνατος, κασπάσες ενεργοποιούνται από αυτούς τους υποδοχείς μπορεί επίσης να διασπάσει την πρωτεΐνη Bid, παράγοντας κολοβωμένη Bid (tBid), με tBid τότε επαγωγή Bak /Βαχ ολιγομερισμό και το σχηματισμό πόρων στις μιτοχονδριακές εξωτερικές μεμβράνες, μέσω του οποίου το κυτόχρωμα γ διαφεύγει. Έτσι, ένας αναστολέας παν-κασπάσης όπως z-VAD απελευθέρωσης c μπλοκ θανάτου του υποδοχέα που επάγεται από το κυτόχρωμα μιτοχόνδρια. Βρήκαμε ότι 2DG-ABT απελευθέρωσης επαγόμενη κυτοχρώματος c επίσης αποκλειστεί από z-VAD όταν προστίθεται συγχρόνως με ABT (Εικ 3c & amp?. Δ., Σχ S2), όμως έδειξε ότι η 2DG-ABT απόπτωση που επάγεται είναι Βαχ /Bak- εξαρτώμενος. Αυτό αίνιγμα θα μπορούσε να εξηγηθεί από ένα βρόχο ενίσχυσης Bid εξαρτώμενη στο οποίο μια μικρή ποσότητα του κυτοχρώματος c απελευθερώνεται από ΑΒΤ μπορούσε να ενεργοποιήσει έναν καταρράκτη των κασπασών (όπως κασπάσες 9,3,6 και 8) στο κυτταρόπλασμα, διασπά Bid να δημιουργήσει tBid , με tBid με τη σειρά της ενεργοποιεί Bak /Bax και προκαλώντας την περαιτέρω απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια [37], [38].

τα αποτελέσματα της εξάντλησης προσφορά για 2DG-ABT-επαγόμενη απόπτωση

Ερευνήσαμε αν η υποτιθέμενη βρόχος ενισχύσεως Bid-based παίζει ένα ρόλο στην 2DG-ΑΒΤ-επαγόμενη απόπτωση. Κατ ‘αρχάς, θα καθοριστεί αν Προσφοράς διασπάται κατά τη διάρκεια 2DG-ABT επαγόμενη απόπτωση. Σε αμφότερα τα κύτταρα HeLa και PPC-1, 2DG προεπεξεργασίας που ακολουθείται από την προσθήκη 1 μΜ ΑΒΤ-263/737 επαγόμενη απελευθέρωση κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια σε 3 ώρες. Στους δύο τύπους κυττάρων, η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c έχει αποκλειστεί από z-VAD-fmk. Με τη γραμμή PPC-1, σχεδόν το 100% των κυττάρων απελευθερώνονται κυτόχρωμα c, προκαλώντας σχεδόν 100% απόπτωσης. Με κύτταρα HeLa, η αναλογία των κυττάρων που εμφανίζουν απελευθέρωση κυτοχρώματος c εντός των πρώτων τριών ωρών ήταν περίπου 30% (Σχ. 3c). Περικομμένο tBid παρατηρήθηκε 3 ώρες μετά την προσθήκη της ΑΒΤ σε PPC-1 και κύτταρα HeLa (Σχ. 4α, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). tBid απουσίαζε σε κύτταρα κατεργασμένα με 2DG μόνο. Όταν z-VAD-fmk προστέθηκε με ABT, η διάσπαση της προσφοράς έχει αποκλειστεί.

α, προσφορά ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια 2DG-ABT επαγόμενη απόπτωση. Western blots των προϊόντων λύσης PPC-1 κυττάρων σε επεξεργασία με 10 mM 2DG για 0-6 ώρες (αριστερό πάνελ), είτε με 1 μΜ μόνος ΑΒΤ-263 ή ΑΒΤ-263 + 10 μΜ Ζ-VAD για τις τελευταίες 3 ώρες (δεξί πάνελ) , ανιχνεύθηκαν με αντι-tBid αντίσωμα (άνω πάνελ), αντίσωμα αντι-OPA1 (μεσαία πλαίσια), και αντι-άλφα-τουμπουλίνες (κάτω πάνελ). Σημείωση: η απώλεια Opa-1-L χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης για αναδιαμορφωμένο μιτοχονδριακή ακρολοφίες κατά τη διάρκεια απελευθέρωσης του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια [34]. β, Τα αποτελέσματα της εξάντλησης προσφορά για 2DG-AB-επαγόμενη απόπτωση. Εισαγωγή: κηλίδες Western των προϊόντων λύσης κυττάρου PPC-1, ψευδο-επιμολυσμένα (αριστερή λωρίδα) ή επιμολυσμένα με Bid siRNA (δεξιά λωρίδα). Προσφορά (+) και προσφοράς (-) κύτταρα PPC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με είτε 2DG, ΑΒΤ-263 (1 μΜ), και οι δύο, 10 μΜ ΑΒΤ-263, ή αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία επί 24 ώρες. Τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν και η αύξηση /μείωση κατά τη διάρκεια των αριθμών εισόδου απεικονίστηκαν γραφικά. c, Σε κύτταρα PPC-1 είτε προεπεξεργασία με 2DG για 3 ώρες ή χωρίς προεπεξεργασία, τότε 1 μΜ ΑΒΤ-263 ή 1 μΜ STS προστέθηκε για τρεις ώρες, και κυτοσολικά κλάσματα αναλύθηκαν με western blots. Σε παράλληλα πειράματα, Bid-εξαντλημένο κύτταρα PPC-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το συνδυασμό 2DG και ΑΒΤ-263 ή με STS και αναλύθηκαν (ορίζεται ως kd Bid, τελευταία 2 λωρίδες). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 3 ώρες μετά την ABT επεξεργασία /STS, και κυτοσολικά κλάσματα αναλύθηκαν με κηλίδες Western.

Η

Για να προσδιορίσετε ποια είναι η επίδραση, αν υπάρχει, προσφορά έχει για 2DG-ABT-επαγόμενη απόπτωση, έχουμε εξαντληθεί η προσφορά πρωτεΐνης με siRNA. 2DG-ABT-επαγόμενη απόπτωση σε μεγάλο βαθμό μπλοκαριστεί στο Bid-εξαντλημένα κύτταρα ΔΕΗ-1. εξάντληση Bid αύξησε τα ποσοστά των βιώσιμων κυττάρων με ~ 8 φορές (ρ & lt? 0,0077? unpaired t-test) (Εικ 4β.). Οι ποσότητες του απελευθερώνονται κυτόχρωμα c συσχετίζεται με αποπτωτικά συντελεστές (Εικ. 4γ). Έτσι, ο βρόχος ενισχύσεως Bid εξαρτώμενη απαιτείται για την αποτελεσματική 2DG-ABT επαγόμενη απόπτωση. εξάντληση προσφοράς είχε μια παρόμοια επίδραση επί της απόπτωσης που επάγεται από 10 μΜ ΑΒΤ-263, αλλά η επίδραση ήταν λιγότερο επί STS-επαγόμενη απόπτωση (τα δεδομένα δεν δείχνονται και Σχ 4b & amp?. γ). Τέλος, προσφορά KO ΠΜΑ εμφανίζεται επίσης μειωμένη ευαισθησία στο 2DG-ABT θεραπείες (Εικ. S5A). Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η προσφορά διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην 2DG-ABT-επαγόμενη απόπτωση.

Αναζήτηση για 2DG τελεστές

Από 2DG-ABT συνδυασμό επαγόμενη απόπτωση Bax /Bak-εξαρτώμενη, εξετάσαμε το επιδράσεις της 2DG για Bax και Bak κατά τη διάρκεια της προ-επώαση τριών ωρών. Μερικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες υποξίας ή σε μέσα γλυκόζης-εξαντλημένο για παρατεταμένες περιόδους, ευαισθητοποιηθεί σε απόπτωση [39], [40], [41]. Αν και δεν υπάρχει καθολική δείκτης για κυτταρική ευαισθησία στην απόπτωση, Bax είναι γνωστό ότι μετατοπίζονται στον μιτοχόνδρια πριν από απόπτωση και νέκρωση σε ορισμένες περιπτώσεις [41]. Βαχ μετατόπιση φαίνεται επίσης να είναι ένα ξεχωριστό βήμα, και όχι απαραίτητα ταυτόχρονα με την ενεργοποίηση του [42]. Ωστόσο, σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με 2DG μόνο, Βαχ μετατόπιση δεν ήταν επάγεται για τουλάχιστον 16 ώρες (Εικ. S4A). Έτσι, σε αντίθεση με τα κύτταρα καλλιεργούνται σε μέσα γλυκόζης-εξαντλημένο, Bax μετατόπιση δεν λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της περιόδου προ-επώασης 2DG. Επιπλέον Βαχ knockout Οι MEF ανταποκρίθηκαν στην θεραπεία 2DG-ΑΒΤ-συνδυασμού (Σχ. S5A), υποδηλώνοντας ότι Bax δεν μπορεί να παίξει κρίσιμο ρόλο στην εκκίνηση των καρκινικών κυττάρων με 2DG. Φυσικά, σε περίπτωση απουσίας του Bak, Βαχ ήδη είναι σε μιτοχόνδρια, παίζει το ρόλο του Bak, Βαχ και μπορεί να ενεργοποιηθεί από ένα διαφορετικό μηχανισμό όταν βρίσκεται σε μιτοχόνδρια [43].

Επειδή 2DG μπορεί να επηρεάσει γλυκοζυλίωση, 2DG-θεραπεία μπορεί να προκαλέσει ER στρες. Πράγματι, η έκφραση του δείκτη ER στρες, Grp74, παρατηρήθηκε σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με 2DG για 2 έως 4 ώρες (Εικ. 5b και η Εικ. S4b). Υποθέσαμε ότι εάν 2DG ενεργεί μέσω ER στρες, μπορεί να είμαστε σε θέση να ευαισθητοποιούν κύτταρα HeLa για ΑΒΤ-επαγόμενη απόπτωση με προ-κατεργασία τους με άλλους επαγωγείς ER στρες, όπως η θαψιγαργίνη. Ωστόσο, αυτό δεν ήταν η περίπτωση (Σχ. S4C). Έτσι, 2DG φαίνεται να ευαισθητοποιήσουν καρκινικά κύτταρα να Bcl-2 ανταγωνιστών μέσω μηχανισμών που δεν εξαρτώνται από την γλυκόζη-εξάντληση ή ER στρες.

α, η επίδραση της 2DG σε κυτταρικό επίπεδο ATP. Οι ποσότητες της ΑΤΡ μετρήθηκαν κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας HeLa κυττάρων με 10 mM 2DG σε παρουσία 25 mM γλυκόζης σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό. β, προφίλ πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια 2DG επώαση των κυττάρων HeLa. Τα δείγματα ελήφθησαν από κύτταρα HeLa αντιμετωπίζονται όπως στο α, και διάφορες περιεκτικότητες σε πρωτεΐνες προ- και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών αναλύθηκαν με στυπώματα Western. Σε αυτό το πείραμα, βλέπουμε αυξήσεις των Bcl-xL για την πρώτη ώρα. Όταν το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές, τα επίπεδα Bcl-xL παρέμεινε η ίδια. c, τα επίπεδα Mcl-1 παρέμεινε αμετάβλητη κατά την διάρκεια 2DG-ΑΒΤ-επαγόμενη απόπτωση. κύτταρα PPC-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 mM 2DG για 6 ώρες, 1 μΜ ΑΒΤ-263 για 3 ώρες, ή 10 mM 2DG για 6 ώρες εκ των οποίων τις τελευταίες 3 ώρες επωάστηκαν με 1 μΜ ΑΒΤ-263. d, Bak και Mcl-1 δεν συν-ιζήματος σε 2DG επεξεργασμένα κύτταρα. κύτταρα PPC-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο c. Bak και Mcl-1 ανοσοκαταβυθίστηκαν με ειδικά αντισώματα συζευγμένα με την πρωτεΐνη G-Sepharose και το συγκαταβυθισμένο πρωτεΐνες αναλύθηκαν με στυπώματα Western. Αριστερό Άνω πάνελ, Bak συν-ιζήματα, Δεξιά Άνω πάνελ, Mcl-1 συν-ιζήματα, και το αριστερό κάτω πάνελ, πρωτεΐνης G-Sepharose ιζημάτων. Για τεχνικούς λόγους, δεν θα μπορούσαμε να ανοσοκαθιζάνει Bcl-xL και να αναλύσει το περιεχόμενό της.

Η

2DG διαταράσσει Bak-Mcl-1 ένωση, πρωτευόντων κυττάρων για ΑΒΤ-επαγόμενη απόπτωση

Έχει ανέφεραν ότι η καλλιέργεια των κυττάρων σε μέσο γλυκόζης-εξαντλημένο ή παρουσία 2DG για παρατεταμένο χρονικό διάστημα (24 ώρες ή περισσότερο), θα μπορούσε να μειώσει κυτταρικές συγκεντρώσεις ΑΤΡ και προνομιακή διάφορα κύτταρα για απόπτωση [39], [40], [44].