Αφηρημένο

Ιστορικό

Η χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του μαστού μεταξύ των ασιατικών γυναίκες σε σύγκριση με τις δυτικές χώρες έχει εν μέρει αποδοθεί σε σόγιας στην ασιατική διατροφής, που οδηγεί στις προσπάθειες για τον εντοπισμό των βιοενεργών συστατικών ότι είναι υπεύθυνοι. Σόγιας Bowman Birk αναστολέα Concentrate (BBIC) είναι ένας γνωστός ο καρκίνος προληπτικό παράγοντα τώρα σε κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Οι στόχοι της παρούσας εργασίας είναι να διαπιστωθεί η παρουσία και οριοθετούν το στο vitro δραστικότητα της λουνασίνης και ΒΒΙ βρέθηκαν σε BBIC, και να μελετήσουν βιοδιαθεσιμότητα τους μετά από στοματική χορήγηση σε ποντίκια και αρουραίους. Αναφέρουμε ότι η λουνασίνη και BBI είναι τα δύο κύρια βιοενεργά συστατικά του BBIC βασίζεται στην αναστολή του σχηματισμού εστιών, λουνασίνη είναι πιο αποτελεσματική από ό, τι BBI σε μια ισογραμμομοριακή βάση. BBI και σόγιας Kunitz Αναστολέας Θρυψίνης προστασία λουνασίνη από το

in vitro

πέψη με παγκρεατίνη. Η στοματική χορήγηση του

3Η-επισημασμένου λουνασίνης με λουνασίνη εμπλουτισμένο αποτελέσματα σόγιας σε 30% του πεπτιδίου φθάνοντας ιστούς-στόχους σε έναν ανέπαφο και βιοενεργό μορφή. Σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος γυμνών ποντικών μεταμοσχευμένων με ανθρώπινο καρκίνο του μαστού MDA-MB-231 κύτταρα, ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις λουνασίνης, στα 20 mg /kg και 4 mg /kg σωματικού βάρους, μείωση εμφάνισης όγκων κατά 49% και 33%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με με την ομάδα υπό αγωγή με όχημα. Σε αντίθεση, η έγχυση με ΒΒΙ στα 20 mg /kg σωματικού βάρους δεν παρουσιάζει καμία επίδραση στην εμφάνιση του όγκου. γενεά όγκου μειώνεται σημαντικά με τις δύο δόσεις του λουνασίνης, ενώ ΒΒΙ είναι αναποτελεσματική. Λουνασίνη αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και επάγει τον κυτταρικό θάνατο στα τμήματα των όγκων του μαστού.

Συμπεράσματα /Σημασία

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η λουνασίνη είναι στην πραγματικότητα η βιοδραστικών καρκίνου προληπτικό παράγοντα σε BBIC, και BBI προστατεύει απλά λουνασίνη από την πέψη όταν σόγια και άλλα τρόφιμα σπόρων τρώγονται από τους ανθρώπους

Παράθεση:. Hsieh CC, Hernández-Λεντέσμα Β, Jeong HJ, Πάρκο JH, de Lumen ΒΟ (2010) συμπληρωματικό ρόλο στην πρόληψη του καρκίνου: αναστολέα πρωτεάσης κάνει τον καρκίνο προληπτική Peptide λουνασίνη βιοδιαθέσιμη. PLoS ONE 5 (1): e8890. doi: 10.1371 /journal.pone.0008890

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 12 του Νοέμβρη, 2009? Αποδεκτές: 16η Δεκεμβρίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 26 Ιανουαρίου 2010

Copyright: © 2010 Hsieh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αριθμός σχεδίου 05B087 απονέμεται από το αμερικανικό Ινστιτούτο Έρευνας για τον Καρκίνο (https://www.aicr.org/site/PageServer). Αριθμός έργου W81XWH-04-1-0128 που χορηγείται από το Υπουργείο Άμυνας των Ηνωμένων Πολιτειών Congressionally Σκηνοθεσία Ιατρικό Ερευνητικό Πρόγραμμα (https://cdmrp.org). Έργο LUNAMICE 039.241 χορηγούνται από την Ευρωπαϊκή Επιτροπή και το Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας ισπανικά για την Marie-Curie μεταδιδακτορικός υπότροφος του BHL. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. BODL είναι συνιδρυτής της FilGen BioSciences, Inc ,. η οποία έχει την αποκλειστική άδεια να εμπορευματοποιήσει λουνασίνη τεχνολογία που καλύπτονται από διπλώματα ευρεσιτεχνίας που ανήκει από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στο Μπέρκλεϊ. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση με τον οδηγό για τους συγγραφείς (https://www.plosone.org/static/policies.action#sharing).

Εισαγωγή

ο καρκίνος του μαστού είναι η πιο συχνή κακοήθης όγκος μεταξύ των γυναικών και τις κύριες αιτίες θανάτου των γυναικών στις δυτικές χώρες [1]. Σε αντίθεση, η συχνότητα του καρκίνου του μαστού στις περισσότερες ασιατικές χώρες είναι περίπου 10% αυτό του γενικού πληθυσμού των ΗΠΑ και της Ευρώπης [2]. Από όλους τους περιβαλλοντικούς παράγοντες που είναι γνωστό ότι επηρεάζουν τον καρκίνο του μαστού, η διατροφή φαίνεται να είναι ένα από τα πιο σημαντικά. Ασίας δίαιτες είναι πλούσιες σε προϊόντα σόγιας περιέχουν παράγοντες που έχουν βρεθεί να παρέχουν σημαντική προστασία έναντι έναρξη, προώθηση ή /και εξέλιξη του καρκίνου του μαστού σε μοντέλα ζώων [3]. Το 1980, Troll και συνεργάτες πρότειναν την πιθανότητα ότι η πρωτεΐνη σόγιας μπορεί να έχει ένα ρόλο στην πρόληψη του καρκίνου του μαστού σε αρουραίους ακτινοβολημένα [4]. Τα πειράματα σε ζώα που πραγματοποιήθηκαν κατά την τελευταία δεκαετία έχουν επιβεβαιώσει τον καρκίνο του μαστού προληπτικό ρόλο της πρωτεΐνης σόγιας [2], [3]. Ειδικότερα, βιοενεργά πεπτίδια που απομονώνονται από σόγια, όπως λουνασίνης και του αναστολέα πρωτεάσης Bowman-Birk (ΒΒΙ) τώρα εντατικά μελετηθεί ως καρκίνος chemopreventive παράγοντες.

λουνασίνη είναι ένα νέο πεπτίδιο αρχικά προσδιορίζονται στην σόγια [5] και στη συνέχεια, απομονωμένος στο σιτάρι, το κριθάρι και άλλα σπέρματα [6] – [9]. Είναι ένα πεπτίδιο 43 αμινοξέων το οποίο έχει αποδειχτεί αποτελεσματικότητα σε κύτταρα θηλαστικών έναντι χημικά καρκινογόνα και ιικών ογκογονιδίων [10], [11]. Το πρώτο μοντέλο ποντικού επιβεβαίωσε την χημειοπροληπτική δραστικότητα της λουνασίνης κατά του καρκίνου του δέρματος που προκαλείται από ένα χημικό καρκινογόνο [10]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η λουνασίνη μπορεί να ασκήσει μια πολλά υποσχόμενη ρόλο ως προληπτικός παράγων εναντίον άλλων τύπων καρκίνου, όπως ο καρκίνος του μαστού.

ΒΒΙ είναι ένα πολυπεπτίδιο 71 αμινοξέων με την ικανότητα να αναστέλλουν τις πρωτεάσες σερίνης θρυψίνη και χυμοθρυψίνη. Η θρυψίνη ανασταλτική θέση του ΒΒΙ έχει συσχετιστεί με αρνητικές επιπτώσεις στην βιοδιαθεσιμότητα των διαιτητικών πρωτεϊνών, ενώ η περιοχή χυμοθρυψίνη έχει ενοχοποιηθεί σε καρκίνο χημειοπροληπτική επιδράσεις [12], [13]. Το υψηλό κόστος της διαδικασίας καθαρισμού ΒΒΙ έχει γίνει αναγκαία η χρήση ενός μη καθαρή μορφή του ΒΒΙ που ονομάζεται ΒΒΙ συμπύκνωμα (BBIC), που έχει αναφερθεί ότι εξασκεί χημειοπροληπτική δραστικότητα έναντι διαφόρων τύπων καρκίνου που προκαλείται από χημικά καρκινογόνα και ακτινοβολίες [14]. Αυτές οι μελέτες θεωρούν ότι η BBI είναι το κύριο συστατικό υπεύθυνο για χημειοπροληπτική δραστηριότητα BBIC, χωρίς να αξιολογεί την συνεισφορά των άλλων πεπτιδίων που περιέχονται στο BBIC για τον καρκίνο προληπτική δράση της.

από του στόματος χορήγηση έχει αναγνωριστεί ως εύλογο και οικονομικά αποδοτικό προσέγγιση για τη μείωση της νοσηρότητας και της θνησιμότητας του καρκίνου αναστέλλοντας προκαρκινικών γεγονότα πριν από την εμφάνιση της κλινικής νόσου [15]. Από λουνασίνης και BBI είναι πεπτίδια, είναι πολύ σημαντικό να διαπιστωθεί αν, από τη στιγμή προσλαμβάνεται από το στόμα, να επιβιώσει η πέψη και να απορροφηθούν, φθάνοντας τους ιστούς-στόχους και τα όργανα σε ένα άθικτο και βιοενεργών κατάσταση. Park και συνεργάτες διενεργείται

in vitro

μελέτες που αποδεικνύουν το ρόλο της ΒΒΙ στην προστασία λουνασίνης από πέψη όταν πρωτεΐνη σόγιας προφορικά καταναλώθηκε [16]. Ωστόσο, δεν υπάρχουν

in vivo

μελέτες που εξετάζουν τον ρόλο της BBI στην προστασία λουνασίνη από την πέψη στο γαστρεντερικό σωλήνα των ζώων.

Οι στόχοι της παρούσας εργασίας είναι να αξιολογήσει την παρουσία και

in vitro

δραστικότητα λουνασίνης και ΒΒΙ που περιέχονται σε BBIC και μελέτη βιοδιαθεσιμότητας τους μετά από στοματική χορήγηση σε ποντίκια και αρουραίους. Ένα μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος καρκίνου του μαστού επιλέχθηκε να οριοθετηθούν και να αξιολογήσει

in vivo

τις χημειοπροληπτικές ιδιότητες λουνασίνης και BBI ξεχωριστά και να διαφωτίσει τα μονοπάτια της καρκινογένεσης που εμπλέκονται στον καρκίνο του μαστού που επηρεάζονται από αυτά τα πεπτίδια.

Αποτελέσματα

λουνασίνη Υπάρχει Βιοδραστικών συστατικό του BBIC

για να προσδιοριστεί η σύνθεση του BBIC, το παρασκεύασμα αυτό υποβλήθηκε σε SDS-PAGE και Western-Blot για τον εντοπισμό λουνασίνης και BBI. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι και τα δύο πεπτίδια είναι παρόντα σε BBIC σε συγκεντρώσεις 360 και πρωτεΐνης 74,4 ng /μg, αντίστοιχα (Σχήμα 1Α). Οι δύο αντιπροσωπεύουν περίπου το 44% της συνολικής πρωτεΐνης του BBIC, υποδεικνύοντας ότι άλλες πρωτεΐνες είναι παρούσες και μπορεί να συμβάλει στις ιδιότητες αποδίδονται σε αυτό το παρασκεύασμα

Α:. Western Blot-του BBIC χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για ΒΒΙ και λουνασίνη . (1) Marker, (2) 6,25 μg πρωτεΐνης, (3) 12 μg πρωτεΐνης, (4) 25 μg πρωτεΐνης, (5) Πρότυπο ΒΒΙ (3 μg) ή πρότυπο λουνασίνης (200 ng). Β: Οι εστίες σχηματισμού ανασταλτική δραστικότητα σε DMBA-επαγόμενα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3. (Α) Το αυτοκίνητο-κατεργασμένα κύτταρα (β) θετικό μάρτυρα ή ϋΜΒΑ-επεξεργασμένα κύτταρα, (γ) BBIC (100 ηΜ λουνασίνης 1160 ηΜ ΒΒΙ), (δ) ΒΒΙ (100 ηΜ) από BBIC, (ε) λουνασίνης (100 ηΜ ) από BBIC, (στ) Πρότυπο BBI (100 ναυτικών μιλίων), (ζ) Συνθετικά λουνασίνη (100 ναυτικών μιλίων). Μπαρ με διαφορετικές πεζό γράμμα ονομασίες είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετική από κάθε άλλη (

P

& lt? 0.05, n = 6)

Η

ανασταλτική δράση Εστίες σχηματισμό BBIC περιέχει 1160 nM BBI. και 100 ηΜ λουνασίνης αναλύθηκε. BBIC καταστέλλεται σχηματισμός εστιών κατά 80% σε 7,12-διμεθυλβενζ [α] ανθρακένιο (DMBA) προκληθείσα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3, σε σύγκριση με τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα (Εικόνα 1Β-C). Λουνασίνης και BBI ατομικά καθαρίστηκαν από το BBIC και τις δραστηριότητές τους αναλύθηκαν. 100 ηΜ καθαρής λουνασίνης που απομονώνονται από BBIC μειωμένο σχηματισμό εστιών κατά 73% (Σχήμα 1 Β-Ε), το οποίο είναι πανομοιότυπο με αυτό που παρατηρήθηκε με 100 ηΜ συνθετικό λουνασίνης (Σχήμα 1Β-G). Καθαρό ΒΒΙ που απομονώνονται από το BBIC σε συγκέντρωση 100 nm μειώνεται σχηματισμός εστιών κατά 60% (Σχήμα 1 Β-D). Έτσι, η λουνασίνη ήταν πιο αποτελεσματικό από ΒΒΙ κατά 18% επί ισογραμμομοριακής βάσης, αλλά ΒΒΙ έχει επίσης μια χημειοπροληπτική επίδραση της δικής του, πιθανότατα λόγω της αναστολής της πρωτεολυτικής διαδικασιών που εμπλέκονται στην καρκινογένεση.

Αναστολείς Πρωτεάσης Soy Protect λουνασίνη από

In Vitro

πέψη

για να καθοριστεί ο ρόλος των διαφόρων αναστολέων πρωτεάσης που περιέχονται στη σόγια, όπως η BBI και Kunitz Αναστολέας Θρυψίνης (KTI), συνθετικά λουνασίνη υποβλήθηκε σε μια

in vitro

διαδικασία της πέψης με παγκρεατίνη. Λουνασίνης επωάστηκε με αυτό το παρασκεύασμα με την απουσία και την παρουσία του ΒΒΙ και KTI και αξιολογούνται με Western Blot-. Οι παραστάσεις μοτίβο (Σχήμα 2) ότι οι δύο αναστολείς πρωτεάσης προστατεύουν λουνασίνης από την πέψη, ακόμα και μετά από μετουσίωση με θερμική επεξεργασία. Περίπου 93% και 97% των λουνασίνης παραμένουν ανέπαφα μετά την διαδικασία της πέψης με την παρουσία άβραστος ΒΒΙ και KTI, αντίστοιχα. Παρόμοια ποσοστά λουνασίνης (98% και 84%) παρέμεινε ανέπαφο όταν αυτό το πεπτίδιο επωάστηκε με παγκρεατίνης παρουσία βρασμένο ΒΒΙ και KTI, αντίστοιχα. Λουνασίνη αντιστέκεται θερμική επεξεργασία [17], και είναι παρούσα σε διάφορα μεταποιημένα προϊόντα σόγιας που περιέχουν επίσης BBI [18]. Όλα αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η λουνασίνη θα είναι βιοδιαθέσιμο μετά από την κατάποση των προϊόντων αυτών, λόγω του προστατευτικού ρόλου των ΒΒΙ και άλλους αναστολείς πρωτεάσης σόγιας.

Οι άνω, ελαφρύτερα ζώνες είναι Coomassie Blue πρωτεΐνη λεκέδες και οι κάτω, πιό σκούρες ζώνες είναι Western blots. (Μ) Δείκτες, (1) λουνασίνης (600 ng) + παγκρεατίνη (600 ng) επωάστηκε επί 0 h στους 37 ° C, (2) λουνασίνης (600 ng) + παγκρεατίνη (600 ng) επωάστηκε για 1 ώρα στους 37 ° C , (3) λουνασίνης (600 ng) + ΒΒΙ (18000 ng, άβραστος) + παγκρεατίνη (600 ng) επωάστηκε για 1 ώρα στους 37 ° C, (4). Λουνασίνη (600 ng) + KTI (18.000 ng, άβραστος) + παγκρεατίνη (600 ng) επωάζεται για 1 ώρα στους 37 ° C, (5) λουνασίνη (600 ng) + BBI (18.000 ng, βραστά) + παγκρεατίνη (600 ng) επωάζονται για 1 ώρα στους 37 ° C, (6) λουνασίνης (600 ng) + KTI (18000 ng, βρασμένο) + παγκρεατίνη (600 ng) επωάστηκε για 1 ώρα στους 37 ° C, (7) ΒΒΙ (άβραστος), (8 ) KTI (άβραστος).

Η

λουνασίνη είναι βιοδιαθέσιμο Όταν στόμα σε ποντίκια και αρουραίους

Ποντίκια και αρουραίοι που χρησιμοποιούνται για να προσδιοριστεί αν το στόμα κατάποση λουνασίνη επιβιώνει της πέψης, καταλήγει στους ιστούς και παραμένει άθικτο και βιοδραστικών, όπως μετράται με ένα

in vivo

δοκιμασία. Στην πρώτη ομάδα πειραμάτων, CD-1 ποντικοί έλαβαν

3Η-σημασμένο συνθετικό λουνασίνης αναμιγνύεται με λουνασίνη-εμπλουτισμένο σόγια (LES) με καθετηριασμό. Λουνασίνης απορροφάται και διανέμεται σε διάφορους ιστούς που συλλέγονται, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που είναι στόχοι για τις πιο κοινές μορφές καρκίνου, όπως του πνεύμονα, του μαστικού αδένα και του προστάτη (Σχήμα 3Α). Είναι αξιοσημείωτο ότι η λουνασίνη είναι σε θέση να διαπεράσει το φράγμα αίματος-εγκεφάλου, που φτάνει στον εγκέφαλο. Στις 3 ώρες μετά καθετηριασμό, περίπου 30% της συνολικής του στόματος δόση λουνασίνης απορροφάται (Σχήμα S1)

Α:. Κατανομή

δραστικότητα 3Η-λουνασίνης σε διάφορους ιστούς και γαστρεντερικές περιεχόμενα των ποντικών μετά () 3 ώρες, () 6 ώρες, () 9 ώρες, () 12 ώρες και () 24 ώρες από του στόματος χορήγηση του LES. Οι ράβδοι σφάλματος εμφανίζεται για 3 h-αποτελέσματα. Β: Οι εστίες σχηματισμού ανασταλτική δραστικότητα σε DMBA-επαγόμενα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3. (Α) κύτταρα Όχημα-θεραπεία, (β) ϋΜΒΑ-κατεργασμένων κυττάρων, (γ) συνθετικά λουνασίνη, (δ) λουνασίνης που εξάγεται από το ήπαρ αρουραίων τροφοδοτείται δίαιτα ελέγχου, (ε) λουνασίνης που εξάγεται από το ήπαρ αρουραίων τροφοδοτείται LES δίαιτα. Μπαρ με διαφορετικές πεζό γράμμα ονομασίες είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετική από κάθε άλλη (

P

& lt? 0.05, n = 6).

Η

Από το

3Η-ραδιενέργειας δεν θα δείχνουν το μοριακό μέγεθος και βιοδραστικότητα λουνασίνης στους ιστούς, οι αρουραίοι τρέφονται διαιτητικές LES για 4 εβδομάδες, το αίμα και το ήπαρ συλλέχθηκαν και λουνασίνης εκχυλίστηκε, καθαρίστηκε και αναλύθηκε με Western κηλίδας. Λουνασίνη είναι παρόν στο αίμα του LES τρέφονται αρουραίους ως μονομερές σε συγκέντρωση 17,5 ng /ml. Ωστόσο, η λουνασίνη απομονωθεί από το ήπαρ του LES τρέφονται αρουραίους υφίσταται ως διμερές σε συγκέντρωση 3,1 μg /g του ήπατος (Εικόνα S2). Λουνασίνης (1 μΜ) που εξάγεται από το ήπαρ του LES τρέφονται αρουραίους καταστέλλει σχηματισμό εστιών όσο αποτελεσματικά ισομοριακή ποσότητα συνθετικού λουνασίνης (Σχήμα 3Β). Σε αντίθεση, η ταινία πρωτεΐνης ελέγχου που εξάγεται από LES-νηστικούς αρουραίους είναι αναποτελεσματική στην καταστολή του σχηματισμού εστιών.

λουνασίνη Μειώνει όγκων Επίπτωση και Παραγωγής

Για να εξεταστεί η

in vivo

αποτέλεσμα λουνασίνης και ΒΒΙ σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, MDA-MB-231 κύτταρα εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς μετά από 2 μήνες ενδοπεριτοναϊκή (ίρ) ένεση λουνασίνης και ΒΒΙ. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα βάρη σώματος παρατηρήθηκαν μεταξύ των τεσσάρων ομάδων (Σχήμα 4Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι η λουνασίνη ή θεραπείες ΒΒΙ έχει καμία παρενέργεια από τη γενική κατάσταση της υγείας. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με μελέτες που έχουν διεξαχθεί από την Johnson και συνεργάτες [19] οι οποίοι δεν ανέφεραν σημαντικές επιπτώσεις στο σωματικό βάρος μετά την καθημερινή καθετηριασμό της BBIC (500~2000 mg /kg /ημέρα) για έξι μήνες

Α.: Το σωματικό βάρος των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με (♦) PBS (έλεγχος), (□) 20 mg ΒΒΙ /kg σωματικού βάρους, (▴) 20 mg λουνασίνης /kg σωματικού βάρους, και (χ) 4 mg λουνασίνης /kg βάρους σώματος, και εγχύεται με 1 × 10

7 MDA-MB-231 κυττάρων στο πλευρό του 15-εβδομάδων γυμνούς ποντικούς. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τεσσάρων ομάδων. Β: Tumor συχνότητα σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με PBS, ΒΒΙ και δύο δόσεις του λουνασίνης. Λουνασίνης μειωμένος αριθμός ποντικών που εμφάνισαν όγκους και καθυστέρησε την εμφάνιση αυτών των όγκων του μαστού. C: παραγωγή όγκων σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με PBS, ΒΒΙ και δύο δόσεις του λουνασίνης. Χαμηλή δόση λουνασίνης (4 mg /kg βάρους σώματος) μείωσε σημαντικά την παραγωγή όγκου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (*

P

= 0,029). Τα δεδομένα παρουσιάζονται: μέση τιμή ± SEM (n = 8)

Η

Ο καρκίνος του μαστού συχνότητα εμφάνισης ποντίκια φαίνεται στο Σχήμα 4Β.. Σε επτά εβδομάδες μετά την ένεση των κυττάρων, 75% και 88% των ποντικών στον έλεγχο και ΒΒΙ-ομάδες, έδειξαν αντίστοιχα όγκους. Σε αντίθεση, συχνότητα εμφάνισης όγκου ήταν 38% και 50% σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με 20 mg /kg και 4 mg /kg λουνασίνη, αντίστοιχα. Έτσι, σε σύγκριση με τον έλεγχο, η συχνότητα εμφάνισης όγκου ήταν 49% και 33% χαμηλότερες στις ομάδες λουνασίνης που έλαβαν αντίστοιχα. Σε σύγκριση με την ομάδα ΒΒΙ, η συχνότητα εμφάνισης όγκου ήταν 57% χαμηλότερη σε 20 mg /kg και 43% χαμηλότερη στην kg λουνασίνης ομάδα 4 mg /θεραπεία. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με λουνασίνη παρουσίασαν επίσης καθυστέρηση στην εμφάνιση όγκων. Επιπλέον, η παραγωγή του όγκου, μειώθηκε στις δύο ομάδες ποντικών που έλαβαν θεραπεία με λουνασίνη, όντας σημαντικά χαμηλότερα σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με τη χαμηλότερη δόση της λουνασίνης, 70% και 69% χαμηλότερη σε σχέση με τον έλεγχο και την ομάδα ΒΒΙ αντίστοιχα (

P

= 0.029 έναντι ελέγχου) (Εικόνα 4C).

Ο ρυθμός ανάπτυξης και το τελικό μέγεθος των όγκων διέφερε μεταξύ των τεσσάρων ομάδων. Σημαντικές όγκοι εμφανίστηκαν στα ποντίκια ελέγχου μετά την ένεση των κυττάρων, ενώ τα μεγέθη των όγκων σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με 20 mg /kg και 4 mg /kg λουνασίνης μειώθηκαν κατά 23% και 34%, αντίστοιχα (Σχήμα 5Α). Στο τέλος του πειράματος, το βάρος των όγκων ήταν επίσης χαμηλότερη στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με τις δύο δόσεις της λουνασίνης σύγκριση με τους μάρτυρες-ομάδα (

P

= 0,2134, 0,1880, αντίστοιχα) και ΒΒΙ-ομάδα (

P

= 0,0909, 0,0569, αντίστοιχα) (Εικόνα 5Β)

Α:. ο όγκος του όγκου (mm

3) των όγκων του μαστού που προκαλείται από τη χορήγηση (♦) PBS (έλεγχος), ( □) 20 mg ΒΒΙ /kg σωματικού βάρους, (▴) 20 mg λουνασίνης /kg σωματικού βάρους και (χ) 4 mg /kg λουνασίνης. Β: όγκων του μαστού βάρους που προκαλείται από PBS (έλεγχος), 20 mg ΒΒΙ /kg σωματικού βάρους, 20 mg λουνασίνης /kg σωματικού βάρους (

P

= 0,2134 έναντι ομάδας ελέγχου και 0,0909 έναντι ομάδας ΒΒΙ) και 4 mg λουνασίνη /kg σωματικού βάρους (

P

= 0,1880 έναντι ομάδας ελέγχου και 0,0569 έναντι BBI-ομάδα). Τα δεδομένα παρουσιάζονται μέση τιμή ± SEM (n = 8).

Η

Ψηλαφίσιμοι και μη ψηλαφητών όγκων του μαστού συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ιστολογική ανάλυση και ανοσοχρώση. Μετά Η &? Ε χρώση (Σχήμα 6Α), τομές όγκων των ομάδων λουνασίνης αγωγή έδειξαν περιοχές καταστροφή όγκου αντικαθίσταται από αποπτωτικά και νεκρωτικά κύτταρα που δεν ήταν εμφανείς στον έλεγχο και ΒΒΙ-αγωγή ομάδες. Για να διαπιστωθεί μεγαλύτερη ειδικότητα για την αντιπολλαπλασιαστική απόκριση, τομές όγκων αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία για Ki-67 έκφραση, ένας δείκτης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [20]. θεραπεία λουνασίνης στα 20 mg /kg και 4 mg /kg μείωσε Ki-67 έκφραση κατά 34% (

P

= 0,0062) και 30% (

P

= 0,0158), αντιστοίχως, σε σύγκριση με η ομάδα ελέγχου (Σχήμα 6Β). Ωστόσο, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ της έκφρασης Ki-67 ελέγχου και ΒΒΙ-ομάδες. Επί τόπου δοκιμασία TUNEL διεξήχθη για να αξιολογηθεί η αποπτωτικό αποτέλεσμα λουνασίνης και θεραπείες ΒΒΙ (Σχήμα 6C). TUNEL θετικά αποπτωτικά κύτταρα βρέθηκαν σε όγκους από ζώα που υπέστησαν αγωγή με τις δύο δόσεις της λουνασίνης, αποκαλύπτοντας μια σημαντικά αυξημένη απόπτωση σε αυτές τις ομάδες θεραπείας σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

= 0,0088, 0,0141, αντίστοιχα). Λίγοι TUNEL θετικά κύτταρα βρέθηκαν σε όγκους από ζώα στην ΒΒΙ-ομάδα. Αυτά δείχνουν ότι οι όγκοι από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με λουνασίνη έχουν σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό του πολλαπλασιασμού και υψηλότερο δείκτη απόπτωσης σε σύγκριση με τον έλεγχο και τις ομάδες ΒΒΙ

Α:. Οι όγκοι συλλέχθηκαν σε 7 εβδομάδα μετά την ένεση κυττάρων καρκίνου του μαστού, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για την H & amp ? χρώση Ε. Αντιπροσωπευτικά εικόνες εμφανίζονται για Η &? Ε-χρωματισμένες τομές (άνω στήλη), ανοσοϊστοχημική χρώση για Ki-67 (μεσαία στήλη) και in situ TUNEL αποπτωτικών δεικτών (κάτω στήλη). Β: Ποσοστό έκφραση Ki-67 σε όγκους ποντικών. Ki-67 επισήμανση αποκάλυψε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων στην λουνασίνη ομάδες σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (*

P

= 0.0062 σε ομάδα υψηλού λουνασίνη? *

P

= 0,0158 στο χαμηλό ομάδα λουνασίνη). C: Ποσοστό αποπτωτικών κυττάρων σε όγκους ποντικών μετρήθηκαν με τη δοκιμασία TUNEL. Χρώση αποκάλυψαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα των αποπτωτικών κυττάρων όγκου σε λουνασίνης ομάδες έναντι ομάδας ελέγχου. (*

P

= 0,0088 σε ομάδα υψηλού λουνασίνη? 0,0141 στο χαμηλό ομάδα λουνασίνη). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται μέση τιμή ± SEM.

Η

Συζήτηση

Ο υψηλός επιπολασμός του καρκίνου του μαστού έχει παράσχει μια ισχυρή λογική για τον εντοπισμό νέων ενώσεων για χρήση ως προληπτική ή /και θεραπευτικούς παράγοντες. Επιδημιολογικές μελέτες, τα πειράματα και δοκιμές σε ανθρώπους έχουν δείξει αποδείξεις ότι οι άνθρωποι που καταναλώνουν μια δίαιτα σόγιας πλούσιο έχουν μικρότερη συχνότητα εμφάνισης και η θνησιμότητα από καρκίνο του μαστού, που οδηγεί σε έρευνες με διαφορετικές χημικές ενώσεις από σόγια που παρέχουν προστασία έναντι του καρκίνου του μαστού [21], [22]. Ημερήσια πρόσληψη αυτών αντικαρκινικές ενώσεις θα μπορούσε να συγκριθεί με μια προληπτική, μη τοξικό εκδοχή της χημειοθεραπείας που είναι ακίνδυνο για την φυσιολογία του φυσιολογικού ιστού και σταματά microtumours [23], [24]. Για την αξιολόγηση των δυνητικών κινδύνων και οφελών των φυτοχημικών για την ανθρώπινη υγεία, την κατανόηση της φυσιολογικής συμπεριφοράς των ενώσεων αυτών μετά από του στόματος κατάποση, καθώς και από τους απορρόφησης, της κατανομής, του μεταβολισμού και της απέκκρισης είναι απαραίτητη [15].

Η BBIC σόγιας είναι σε μεγάλο βαθμό ένα παρασκεύασμα που περιέχει το ΒΒΙ αναστολέας πρωτεάσης που έχει χρησιμοποιηθεί για να καταδείξει τις ιδιότητες χημειοπροληπτική αυτού του πεπτιδίου αποφεύγοντας το υψηλό κόστος του καθαρισμού του. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει την χημειοπροληπτική ρόλο του BBIC κατά διαφόρων τύπων καρκίνου που προκαλείται από χημικά καρκινογόνα και ακτινοβολίες [14], [25]. Αυτές οι μελέτες έχουν υποθέσει ότι η BBI είναι η κύρια βιοενεργά ένωση υπεύθυνη για χημειοπροληπτική δραστηριότητα BBIC, χωρίς να αξιολογεί την συμβολή της άλλες δευτερεύουσες πεπτιδίων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι BBIC περιέχει τόσο λουνασίνης και BBI που αντιπροσωπεύουν το 44% της συνολικής πρωτεΐνης. Η

δοκιμασία in vitro

εστίες δραστικότητα ανασταλτική του σχηματισμού δείχνει ότι η λουνασίνη εξασκεί 18% υψηλότερη δραστικότητα σε DMBA-επαγόμενα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 από ΒΒΙ σε ισομοριακή βάση. Ωστόσο, είναι σαφές ότι οι ανασταλτικές δραστηριότητες πρωτεάσης του ΒΒΙ και KTI είναι απαραίτητα για την προστασία λουνασίνης από

in vitro

πέψη με παγκρεατίνη.

In vivo πειράματα

, που εκτελείται με ποντίκια και αρουραίους τρέφονται LES, έχουν καταδείξει ότι η λουνασίνη, από του στόματος κατάποση, αντιστέκεται στην πέψη, απορροφάται και φθάνει στους ιστούς-στόχους και τα όργανα σε ένα άθικτο και βιοδραστικών κατάσταση. Πρόσφατα, έχει καταδειχθεί ότι η λουνασίνη είναι βιοδιαθέσιμο σε ανθρώπους τρέφονται προϊόντα πρωτεΐνης σόγιας, μια σημαντική προϋπόθεση για την αντικαρκινική του δυναμικού [26]. Έτσι, οι προστατευτικές ρόλοι των ΒΒΙ και KTI και ίσως και άλλα φυσικά πρωτεάσης παίζουν σημαντικό ρόλο στη λήψη λουνασίνης διαθέσιμα σε πρωτεΐνη σόγιας για να ασκήσει χημειοπροληπτική ιδιότητες. Η βιοδιαθεσιμότητα μετά από του στόματος χορήγηση ενός παράγοντα chemopreventive είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση των διαφόρων

in vivo

μηχανισμών που ευθύνονται για τον καρκίνο προληπτική δράση της [27].

Για να οριοθετηθούν το άτομο

in vivo

προληπτικές ιδιότητες κατά του καρκίνου του μαστού λουνασίνης και ΒΒΙ, κάθε πεπτίδιο εγχύθηκε χωριστά σε γυμνούς ποντικούς πριν και μετά την ένεση των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα. Στη μελέτη μας, αξιολογήθηκαν μία δόση BBI και δύο δόσεις λουνασίνης. Η χαμηλή δόση (4 mg /kg σωματικού βάρους) λουνασίνης αντιστοιχεί στην ημερήσια πρόσληψη πρωτεΐνης σόγιας θεωρούνται από το FDA για τη μείωση της καρδιαγγειακής νόσου, και επίσης σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης μας δείχνουν ότι το 30% των προσλαμβανόμενων λουνασίνης φθάσει το στόχο ιστούς. Η χρήση της υψηλότερης δόσης (20 mg /kg σωματικού βάρους) βασίζεται στο εύρημα ότι ενδοπεριτοναϊκώς διοίκηση της BBI σε αυτή τη δόση καταστέλλει σημαντικά ισχύ στις 3-μεθυλχολανθρενίου που προκαλείται από όγκους του πνεύμονα σε Α /J ποντίκια [28]. Αμφότερες οι δόσεις αυτών των πεπτιδίων φαίνεται να είναι καλά ανεκτό από τους ποντικούς, όπως αποδεικνύεται από την έλλειψη αλλαγής του σωματικού βάρους κατά την διάρκεια της περιόδου θεραπείας 15 εβδομάδων. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με λουνασίνη δείχνουν μείωση στη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του μαστού και καθυστέρηση στην εμφάνιση όγκων. γενεά όγκου αναστέλλεται επίσης σημαντικά στη χαμηλότερη δόση του λουνασίνης. Επιπλέον, ο όγκος και το βάρος των όγκων που παράγονται σε ομάδες λουνασίνη που έλαβαν οι χαμηλότερες σε σύγκριση με τον έλεγχο και την BBI-ομάδες. Δεν αναμένονται επιδράσεις στην ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού παρατηρείται όταν BBI χρησιμοποιήθηκε σε ποντίκια ξενομόσχευμα MDA-MB-231.

Για να κατανοήσουμε καλύτερα τους συγκεκριμένους μηχανισμούς με τους οποίους η λουνασίνη ασκεί την επίδρασή της στις MDA-MB-231 όγκους του μαστού, βιοδείκτες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απόπτωση που αποτελούν καλούς δείκτες του μεγέθους του όγκου σε μοντέλο ξενομοσχεύματος αξιολογήθηκαν [29], [30]. Η ιστολογική χρώση τομών που λαμβάνονται από όγκους λουνασίνης επεξεργασμένο δείχνει ότι οι τομείς καταστροφή όγκου αντικαθίσταται από αποπτωτικά και νεκρωτικά κύτταρα. θεραπεία λουνασίνης έχει επίσης ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης στους όγκους ΜϋΑ-ΜΒ-231. Αυτές οι επιδράσεις δεν παρατηρήθηκαν σε όγκους από τα ποντίκια BBI-θεραπεία.

έχουν Χημειοαποτρεπτική ιδιότητες λουνασίνης αποδείχθηκε

in vivo

σε προηγούμενες μελέτες. Στο πρώτο ζωικό μοντέλο, η λουνασίνη εφαρμόζεται τοπικά στα 250 mg /εβδομάδα καταστέλλει τον σχηματισμό του θηλώματος του δέρματος σε SENCAR ποντικούς υπό αγωγή με ΟΜΒΑ και δεκατετρανοϋλοφορβόλης-13-οξικό κατά 70% σε σύγκριση με τον έλεγχο. Όγκων πολλαπλότητα μειώνεται επίσης και η εμφάνιση έχει καθυστερήσει κατά 2 εβδομάδες σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με λουνασίνη σε σχέση με τον έλεγχο [10]. Αυτό είναι σύμφωνο με μια άλλη παρατήρηση ότι η λουνασίνη επιβραδύνει τον πολλαπλασιασμό των επιδερμικών κυττάρων σε δέρμα ποντικού εν απουσία και παρουσία του DMBA χρησιμοποιώντας μια μέθοδο

2Η

2O επισήμανσης για τη μέτρηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

in vivo

[31] . Όλα αυτά υποστηρίζουν τα ευρήματα μας ότι η λουνασίνη ενεργεί ως ο καρκίνος προληπτικό παράγοντα

in vivo

.

Κένεντι απέδειξε ότι BBI έχει σημαντική αντικαρκινική δράση chemopreventive τόσο

in vitro

και

in vivo

συστήματα βιολογικής δοκιμασίας [25]. Παρά το γεγονός ότι BBI έχει ένα ευρύ φάσμα του καρκίνου-προστατευτικές δραστηριότητες, τα αποτελέσματά της για τον καρκίνο του μαστού παραμένει περιορισμένη. ΒΒΙ έχει προηγουμένως αναλυθεί για βιοδραστικότητα έναντι των άλλων τύπων καρκίνου, όπως του βλεννογόνου του στόματος, του παχέος εντέρου, και καρκίνο του πνεύμονα [28], [32], [33]. Ωστόσο, κανένας

in vivo

μελέτες που αναφέρουν την επίδραση της BBI όπως ο καρκίνος του μαστού προληπτική πεπτίδιο έχουν δημοσιευθεί. Παρ ‘όλα αυτά, υπάρχουν κάποιες

in vitro

μελέτες που δείχνουν ότι η BBI μειώθηκε εξαρτάται από τα οιστρογόνα ανάπτυξης ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του μαστού [34] – [36]. Wan και συνεργάτες [37] κατέδειξε τις ανασταλτικές ιδιότητες ανάπτυξης του ΒΒΙ σε ανθρώπινα ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη σε γυμνούς ποντικούς. Τα αποτελέσματά μας χρησιμοποιώντας το μοντέλο ξενομοσχεύματος όπου λουνασίνης και BBI αξιολογήθηκαν ξεχωριστά δείχνουν ότι BBI παρουσιάζει πολύ μικρή χημειοπροληπτικές επίδραση έναντι του καρκίνου του μαστού. Οι περισσότερες μελέτες για να καθοριστεί εάν το είδος των καρκινικών κυττάρων και ειδικά μονοπάτια της καρκινογένεσης του μπορεί να είναι καθοριστικοί παράγοντες των ιδιοτήτων του καρκίνου χημειοπροληπτικές της BBI.

Εν ολίγοις, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η λουνασίνη και BBI είναι τα δύο κύρια βιοενεργά συστατικά της BBIC . Σε δοκιμασία σχηματισμού εστιών, λουνασίνη είναι περίπου 18% πιο αποτελεσματική από BBI. Ωστόσο, η

in vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος δείχνει ότι ενώ λουνασίνη εμφανίζουν σημαντική χημειοπροληπτικές και θεραπευτικά αποτελέσματα, BBI δείχνει πολύ λίγο. Σας προτείνω να εξηγήσουν τις παρατηρούμενες χημειοπροληπτικές ιδιότητες της σόγιας και άλλων σπόρων που περιέχει λουνασίνη, φυσικά αναστολείς της πρωτεάσης, όπως η BBI και KTI, προστατεύει κυρίως λουνασίνη από την πέψη, γεγονός που καθιστά βιοδιαθέσιμη. Αυτό το θέμα της συμπληρωματικότητας των φυσικών μορίων για την επίτευξη οφέλη για την υγεία των ανθρώπων είναι πιθανό αρκετά συχνή στη φύση και μιλά για την κατανάλωση ολόκληρων των τροφίμων και όχι μεμονωμένα στοιχεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Καθαρισμός της λουνασίνης και ΒΒΙ από BBIC

για την παρασκευή του BBIC, 50 g λεπτώς έδαφος σόγια εκχυλίσθηκαν με 1250 ml εξανίου στους 4 ° C για 24 ώρες και στη συνέχεια επανεκχυλίζεται με 1250 ml 60% αιθανόλης στους 55~ 60 ° C για 1 ώρα. Μετά την εκχύλιση, το ρΗ του διαλύματος ρυθμίστηκε στο 5.3, και το BBIC καταβυθίζεται με 2500 ml ακετόνης για 15 λεπτά. Το ίζημα διαλύθηκε σε 100 ml αποσταγμένου νερού, υποβλήθηκε σε διαπίδυση στους 4 ° C για 24 ώρες, και ξήρανση με ψύξη.

Διαχωρισμός λουνασίνης και ΒΒΙ από το BBIC διεξήχθη με χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων. Η στήλη (AG ΜΡ-1 Μ, 5.0 × 50 cm, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) εξισορροπήθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου 0,1 Μ αλατούχο (PBS, ρΗ 7.0). Πεντακόσια mg του BBIC διαλύεται σε 0,1 Μ PBS εφαρμόστηκαν στην στήλη και χρωματογραφικοί διαχωρισμοί εκτελέστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις ΝαΟΙ σε PBS στους 4 ° C σε ένα ρυθμό ροής 30 ml /h. Τα διαφορετικά κλάσματα που συλλέχθηκαν υποβλήθηκαν σε Western Blot-για την ανίχνευση της λουνασίνης και ΒΒΙ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Εν συντομία, SDS-PAGE διεξήχθη χρησιμοποιώντας 16.5% γέλες τρισ-τρικίνης (Bio-Rad). Οι πρωτεΐνες απορροφήθηκε πάνω σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και δεσμεύτηκαν σε 5% άπαχο ξηρό γάλα διαλυμένο σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα 1% Tween 20 (TBS-1T). Η μεμβράνη πλύθηκε με TBS-1T και επωάστηκαν με λουνασίνη πολυκλωνικό αντίσωμα (Zymed, Inc., South San Francisco, CA, USA), ή μονοκλωνικό αντίσωμα ΒΒΙ, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. David Brandon (USDA, WRRL, Albany, CA, ΗΠΑ). Μετά την πλύση, η μεμβράνη επωάστηκε για 1 ώρα με ραφανιδική υπεροξειδάση συζευγμένη δευτερογενή αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Η μεμβράνη ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας τον παράγοντα ανίχνευσης (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) και αμέσως αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας 667 Polaroid ταινίες. Οι εντάσεις των ζωνών ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό

Un-SCAN-IT gel

έκδοση 5.1 (Silk Scientific, Inc. Orem, UT, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). περιεχόμενο λουνασίνης και BBI υπολογίστηκαν με σύγκριση των εντάσεων μπάντα με εκείνα των γνωστών προτύπων λουνασίνης και BBI τρέξει κάτω από τις ίδιες συνθήκες.

Εστίες Δοκιμασία Σχηματισμού

Η δοκιμασία σχηματισμού εστιών διεξήχθη σύμφωνα με Reznikoff et al [38]. κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 500 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων, επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με λουνασίνη ή ΒΒΙ για 4 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1,5 μg /ml DMBA επί 20 ώρες. Μετά την πλύση με PBS, προστέθηκε φρέσκο ​​μέσο. Τα πεπτίδια προστέθηκαν και μέσο αλλάχθηκε κάθε εβδομάδα για 6 εβδομάδες. Στο τέλος του πειράματος, τα κύτταρα πλύθηκαν με 0,9% NaCl, σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, χρωματίστηκαν με Giemsa, και βαθμολογήθηκαν για μετασχηματισμένων εστιών. Ο αρνητικός μάρτυρας ήταν ένα σύνολο κυττάρων που δεν έλαβαν DMBA, ενώ ο θετικός έλεγχος αποτελείται από κύτταρα που προκαλούνται από DMBA, αλλά χωρίς θεραπεία.

In Vitro

και

In Vivo

βιοδιαθεσιμότητα μελέτες

In vitro

πέψη λουνασίνης διεξήχθη σύμφωνα με τη μέθοδο που δημοσιεύθηκε στις Ηνωμένες Πολιτείες Φαρμακοποιίας [39]. Συνθετικά λουνασίνης (American Peptide Company, Inc. Sunnyvale, CA, USA) (5 μg) επωάστηκε με τους αναστολείς της πρωτεάσης ΒΒΙ ή KTI (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) για 30 λεπτά στους 25 ° C. Παγκρεατίνη από χοίρειο πάγκρεας (Sigma) προστέθηκε (enzyme:protein αναλογία 1:10) και το διάλυμα επωάστηκε στους 37 ° C για 1 ώρα. ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Τρις-τρικίνης προστέθηκε στο τέλος της αντίδρασης και αμέσως διακόπηκε με τοποθέτηση των σωλήνων σε υδατόλουτρο για 5 λεπτά. Τα προϊόντα πέψης αναλύθηκαν με SDS-PAGE και Western Blot-ακολουθώντας το πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως.

Η βιοδιαθεσιμότητα μελέτες σε ποντίκια έγιναν στο North View Pacific Laboratories (Hercules, CA, USA), σύμφωνα με τη Φροντίδα των Ζώων και Χρήση Επιτροπή (ACUC) ανθρώπινη κατευθυντήριες γραμμές. CD-1 ποντίκια (ηλικίας 3-5 εβδομάδων) αγοράστηκαν από την Jackson Laboratories (Bar Harbor, ΜΕ, USA) και ρυθμισμένο σε δίαιτα AIN76A για μία εβδομάδα. Σαράντα ποντικοί (20 αρσενικά και 20 θηλυκά) νήστεψαν για 8 ώρες πριν από την από του στόματος χορήγηση με καθετηριασμό. Οι ποντικοί χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, μια ομάδα ελέγχου που λάμβανε 240 mg του σκευάσματος LES και μια ομάδα που λαμβάνει θεραπεία 240 mg του σκευάσματος LES συν 8 μθί

3Η-λουνασίνης (SibTech, Inc. Brookfield, CT, USA) σε 0.1 mL του διαλύματος σακχαρόζης 10%. Τέσσερα ποντίκια από κάθε ομάδα θυσιάστηκαν σε 3, 6, 9, 12 και 24 ώρες μετά την από του στόματος χορήγηση. Τα δείγματα ιστού συλλέχθηκαν και προετοιμάστηκαν για μέτρηση σπινθηρισμού με διαλυτοποίηση σε TS-2 διαλυτοποιητή ιστών (Research Products International Corp., Chicago, IL, USA) και προσθήκη 15% υπεροξείδιο του βενζολίου.