Abstract

Η ακτινοβολία και προκαλούν βλάβη στο DNA χημειοθεραπευτικούς παράγοντες χρησιμοποιούνται συνήθως σε αντικαρκινικές θεραπείες. Οι ακόλουθες βλάβες στο DNA επίπεδα FOXM1 πρωτεΐνη συχνά αυξημένα. Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να διερευνήσει το δυνητικό ρόλο του FOXM1 στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από βλάβη του DNA. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μετά καταστολή FOXM1 υποβλήθηκαν στη δοξορουβικίνη ή θεραπεία γ-ακτινοβολία. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι FOXM1 μειορρύθμιση με σταθερή ή παροδική εξουδετέρωση χρησιμοποιώντας RNAi ή με θεραπεία με αναστολείς πρωτεασώματος που στοχεύουν FOXM1 έντονα ευαισθητοποιημένα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα διαφορετικής προέλευσης να βλάβη του DNA που προκαλείται από απόπτωση. Δείξαμε ότι FOXM1 καταστέλλει την ενεργοποίηση των προ-αποπτωτικών JNK και θετικά ρυθμίζει αντι-αποπτωτική Bcl-2, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση JNK και Bcl-2 προς τα κάτω ρύθμιση θα μπορούσε να μεσολαβήσει ευαισθησία στην απόπτωση που επάγεται παράγοντα προκαλούν βλάβη στο DNA μετά τη στόχευση FOXM1. Από FOXM1 εκφράζεται ευρέως σε καρκίνους του ανθρώπου, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν περαιτέρω το γεγονός ότι είναι μια έγκυρη στόχος για συνδυαστική αντικαρκινική θεραπεία

Παράθεση:. Halasi Μ, Gartel AL (2012) Καταστολή κύτταρα FOXM1 ευαισθητοποιεί τα Ανθρώπινα καρκίνου κυττάρων θανάτου που επάγεται από βλάβη του DNA. PLoS ONE 7 (2): e31761. doi: 10.1371 /journal.pone.0031761

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, Κίνα

Ελήφθη: 14 Σεπ 2011? Αποδεκτές: 18 του Ιανουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 του Φεβρουαρίου του 2012

Copyright: © 2012 Halasi, Gartel. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) χορηγεί 1RO1CA1294414 και 1R21CA134615 με το Δρ Gartel. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γ-ακτινοβολία και προκαλούν βλάβη στο DNA χημειοθεραπευτικών φαρμάκων διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην αντικαρκινική θεραπεία λόγω της ικανότητάς τους να επάγουν DNA δίκλωνα σπασίματα που οδηγούν σε θάνατο των καρκινικών κυττάρων [1]. Επειδή τα καρκινικά κύτταρα συχνά καθίστανται ανθεκτικά σε παράγοντες που βλάπτουν το DNA, είναι σημαντικό να προσδιοριστούν οι μηχανισμοί φαρμακευτικής αντίστασης. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι σε απάντηση IR, ετοποσίδη, δαουνορουβικίνη ή δοξορουβικίνη θεραπεία αυξάνει επίπεδο πρωτεΐνης FOXM1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο [2] – [4]. FOXM1 θεωρείται ότι είναι ένας κύριος ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου [5], [6] με τον έλεγχο της έκφρασης των γονιδίων που είναι ζωτικής σημασίας για G1 /S και G2 /M εξέλιξη [7]. FOXM1 εκφράζεται άφθονα σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων [8] – [11], υποδηλώνοντας ότι η στόχευση FOXM1 θα μπορούσε να είναι μια θεραπευτική στρατηγική έναντι ανθρώπινων κακοηθειών [12], [13]. FOXM1 έχει ενοχοποιηθεί στην οδό απόκρισης βλάβη του DNA, για παράδειγμα γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA, ΧΚΧΧ1 και BRCA2 ταυτοποιήθηκαν ως άμεση μεταγραφική στόχοι FOXM1 [2]. Επιπλέον, ο ρόλος του FOXM1 σε απόκριση προς βλάβη του DNA έχει διερευνηθεί στο πλαίσιο των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων με άγριου τύπου ρ53 [2], [11], [14], [15]. Ωστόσο, ογκοκατασταλτικό ρ53 βρέθηκε να είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του FOXM1 και βλάβη του DNA απορυθμίζεται σημαντικά το επίπεδο του FOXM1 εν απουσία ρ53 [3], [4]. Κατά συνέπεια, υποθέσαμε ότι προκαλούν βλάβη στο DNA χημειοθεραπευτικούς παράγοντες μπορεί να μην είναι τόσο αποτελεσματική με την απουσία της ρ53, όπως σταθεροποιούν επίπεδο πρωτεΐνης FOXM1 οδηγώντας σε προστασία έναντι βλάβη του DNA που προκαλείται από απόπτωση. Δεδομένου FOXM1 είναι δυνητικά ογκογόνο παράγοντα μεταγραφής και συμμετέχει επίσης στην εισβολή και την αγγειογένεση [16] – [24], θεραπεία όγκων όπου ρ53 μεταλλάσσεται ή αδρανοποιείται με παράγοντες προκαλούν βλάβη στο DNA μπορεί να είναι επιζήμια για τους ασθενείς. Η ομάδα μας έχει ήδη αναφερθεί ότι η καταστολή του FOXM1 από θειαζολίου αντιβιοτικά [25] – [28] και από τους αναστολείς πρωτεασώματος [29] συσχετίζεται με το βαθμό απόπτωσης υποδηλώνοντας ότι FOXM1 μπορεί να δρα ως δυνητικός αναστολέας της απόπτωσης [25] – [27]. Επιπλέον, έχει δειχθεί προσφάτως ότι καρκινικά κύτταρα του μαστού με αυξημένα επίπεδα FOXM1 έγινε επηρεάζεται από Herceptin, paclitaxel [30] και σισπλατίνη [11]. Ως εκ τούτου, είναι προφανές ότι θα μπορούσε να FOXM1 αναστέλλουν την απόπτωση που επάγεται από διάφορα αντικαρκινικά φάρμακα

c-Jun Ν-τερματικές κινάσες (JNKs? Επίσης γνωστό ως στρες πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται, SAPKs). Ανταποκρίνονται σε διαφορετικές εξωκυτταρικά ερεθίσματα και τις περιβαλλοντικές τάσεις [31]. Το μονοπάτι σηματοδότησης ΙΝΚ ρυθμίζει πολλές κυτταρικές διεργασίες, όπως πολλαπλασιασμό, επιβίωση, απόπτωση και διαφοροποίηση [32]. FOXM1 έχει δειχθεί ότι μεταγραφικά ενεργοποιούν JNK1 να ελέγχει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και εισβολή [18]. Ωστόσο, η έκβαση της ενεργοποίησης ΙΝΚ καθορίζεται από τη διάρκεια της JNK σηματοδότησης [33], [34]. ενεργοποίηση Βραχυπρόθεσμες JNK συνδέεται με τον πολλαπλασιασμό, ενώ παρατεταμένη ενεργοποίηση της JNK συνήθως οδηγεί σε απόπτωση [33], [34]. Β-κυττάρου λέμφωμα 2 (Bcl-2) είναι ένα αντιαποπτωτικό μέλος της οικογένειας Bcl-2 [35], [36]. Bcl-2 έχει έναν κεντρικό ρόλο στην ενδογενή αποπτωτικό μονοπάτι που ενεργεί ως φύλακας των μιτοχονδρίων μέσω αναστολής της ενεργοποίησης Βαχ [35], [37]. Εξαναγκασμένη υπερέκφραση του Bcl-2 σε αρκετές καλλιεργημένες κυτταρικές σειρές που ανατίθενται αντίσταση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και ακτινοβολία [35].

Σε αυτή τη μελέτη, εξετάσαμε αν FOXM1 παίζει ένα ρόλο στον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από βλάβη του DNA στα ανθρώπινα καρκινικά κυτταρικές σειρές με μεταλλαγμένο ρ53. Έχουμε αποδείξει ότι η σταθερή ή παροδική εξουδετέρωση του FOXM1 χρησιμοποιώντας RNAi αυξάνει την ευαισθησία των διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων σε παράγοντες που βλάπτουν το DNA συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας doxorubicin και γ-ακτινοβολία. Επιπλέον, δείχνουμε ότι ο συνδυασμός των αναστολέων πρωτεασώματος που αναστέλλουν FOXM1 με παράγοντες προκαλούν βλάβη στο DNA επάγει πολύ ισχυρή απόπτωση. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση JNK και Bcl-2 προς τα κάτω ρύθμιση μπορεί να ευθύνεται για την αυξημένη κυτταρικό θάνατο μετά καταστολή της FOXM1 σε συνδυασμό με βλάβη του DNA.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας, χημικές ενώσεις και θεραπείες

ΜΙΑ PaCa-2 παγκρεατικού (ATCC), Hep3B ήπατος (ATCC), HCT 116 και HCT 116 shp53 κόλον [38] ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου αναπτύχθηκαν σε μέσο DMEM (Invitrogen). MDA-MB-231 (ATCC) ανθρώπινου μαστού καρκινική κυτταρική γραμμή αναπτύχθηκε σε μέσο RPMI (Invitrogen). Τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Atlanta Biologicals) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (GIBCO) και τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2. Σταθερές κυτταρικές σειρές (Σχ. 1) χρησιμοποιώντας την ATCC λαμβάνεται γονικά κύτταρα δημιουργήθηκαν με μεταγωγή του ελέγχου και λεντοϊού σωματίδια FOXM1 shRNA (Sigma) που ακολουθείται από επιλογή με πουρομυκίνη (Sigma). Η δοξορουβικίνη (Fisher Scientific), θειοστρεπτόνη (Sigma), bortezomib (VELCADE) (Millenium Pharmaceuticals) και SP600125 αναστολέα JNK (A.G. Scientific) διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (Fisher Scientific). Η ακτινοβόληση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα

137Caesium γ-πηγή (JL Shepherd μοντέλο 6810? JL Shepherd, San Fernando, CA). Σε μια δόση των 8 και 10 Gy

(Α) HCT 116 p53 καλά και ανεπάρκεια ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου με FOXM1 knockdown υποβλήθηκαν σε αγωγή με δοξορουβικίνη (DOXO) όπως υποδεικνύεται. Ανοσοκηλίδωση για FOXM1, ρ53, διασπασμένη κασπάση 3, PARP και β-ακτίνης ως μάρτυς φόρτωση διεξήχθη 24 ώρες μετά την αγωγή. (Β) ΜΙΑ PaCa-2 φορέα ελέγχου και FOXM1 knockdown παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις doxorubicin. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την αγωγή κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν για FOXM1, διασπασμένη κασπάση 3, PARP και β-ακτίνη ως έλεγχος φόρτωσης. (C) MDA-MB-231 φορέα ελέγχου και FOXM1 καρκινικά κύτταρα του μαστού knockdown υποβλήθηκαν σε αγωγή με δοξορουβικίνη όπως υποδεικνύεται. ανάλυση ανοσοστυπώματος εκτελέστηκε για FOXM1, διασπασμένη κασπάση-3 και β-ακτίνης ως έλεγχος φόρτωσης 48 ώρες μετά τη θεραπεία. (D) Hep3B φορέα ελέγχου και FOXM1 knockdown ηπατικά καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις doxorubicin. Κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν για FOXM1, διασπασμένη κασπάση-3 και β-ακτίνης ως έλεγχος φόρτωσης 24 ώρες μετά τη θεραπεία. (Ε) καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος ΜΙΑ PaCa-2 μορφομετατράπηκαν με τον έλεγχο και την FOXM1 siRNA για 48 ώρες, και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την ανοσοκηλίδωση κατεργασία διεξήχθη με FOXM1, διασπασμένη κασπάση-3 και β-ακτίνη αντισώματα. (F) κύτταρα καρκίνου του μαστού MDA-MB-231 μορφομετατράπηκαν με τον έλεγχο και την FOXM1 siRNA για 48 ώρες, έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις doxorubicin. Σαράντα οκτώ ώρες μετά τη θεραπεία κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν για FOXM1, διασπασμένη κασπάση-3 και β-ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης.

Η

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και επεξεργασία για ανοσοστύπωση όπως περιγράφεται στην αναφ. [27] με αντισώματα ειδικά για FOXM1 (το πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι FOXM1 περιγράφηκε προηγουμένως [45]), ρ53 (Santa Cruz), διασπασμένη κασπάση-3 (κυτταρική σηματοδότηση), PARP-1/2 (Santa Cruz), Total και φωσφο-SAPK /JNK (Cell Signaling), Bcl-2 (Santa Cruz), Bcl-xL (σηματοδότηση κυττάρων) και β-ακτίνης (Sigma). Η ποσοτικοποίηση έγινε με το λογισμικό Image J (ΝΙΗ). Σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης κανονικοποιήθηκαν με τα αντίστοιχα επίπεδα της ακτίνης.

Επιμόλυνση και siRNA

ελέγχου (AACAGUCGCGUUUGCGACUGGUU) μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) και siRNA ειδικά για FOXM1 (GGACCACUUUCCCUACUUUUU) συνετέθησαν από τη Sigma. 50 ηΜ siRNA διπόλων επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Σύνολο εκχύλιση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου (qRT) -PCR

Για την εξαγωγή ολικού RNA κύτταρα συλλέχθηκαν με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη με τη χρήση του ΑΒΙ 7900 HT (Applied Biosystems) της μηχανής. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: ανθρώπινη Bcl-2 (Sense, 5′-TGG GAT GCC ΤΤΤ GTG GAA CT-3 ‘? Antisense, 5′-GAG ACA GCC AGG AGA ΑΑΤ CAA AC-3′) [46] και την ανθρώπινη κυκλοφιλίνη (Sense, 5’-GCA GAC AAG GTC CCA ΑΑΟ ACA G-3 ‘? Αντινόημα, 5′-CAC ΚΔ GAC ACA ΤΑΑ ACC CTG G-3’). [25]

Η κυτταρομετρία ροής – ιωδιούχου προπιδίου χρώση

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται και συλλέχθηκαν με τρυψινοποίηση. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένη αιθανόλη 95%. Μετά την σταθεροποίηση, τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /ml) (Invitrogen) σε PBS /RNAse Α /Triton Χ-100 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

δοκιμασία σχηματισμού αποικίας

1 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 100 mm δίσκους εις διπλούν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται για 24 ώρες. Οι αποικίες αφέθηκαν να σχηματίσουν για 10 ημέρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με το Microsoft Excel με τη χρήση του Student

t

δοκιμή (two-tailed).

P

τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Νοκ ντάουν της FOXM1 ευαισθητοποιεί ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα σε παράγοντες προκαλούν βλάβη στο DNA

Πρώτον, ισογονιδιακές HCT 116 p53 καλά και με ανεπάρκεια ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου με FOXM1 knockdown υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις doxorubicin (DOXO) και ο κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε με ανοσοστύπωση για δείκτες απόπτωσης συμπεριλαμβανομένης διασπασμένη κασπάση-3 και PARP (Εικ. 1Α ). Εξόντωση FOXM1 βελτιωμένη ευαισθησία του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα στη δοξορουβικίνη απόπτωση ανεξάρτητα από το καθεστώς ρ53. p53 καλά κύτταρα με FOXM1 νοκ ντάουν υποβλήθηκαν σε ισχυρότερη απόπτωσης σε σύγκριση με ανεπαρκή ομολόγους p53 τους. Αυτή η παρατήρηση θα μπορούσε να εξηγηθεί από την παρουσία του ρ53-εξαρτώμενη σηματοδότηση αποπτωτικά στις ρ53-καλά κύτταρα, αλλά όχι στα ρ53-ελλειπή κύτταρα μετά από βλάβη του DNA.

Περίπου το 50% των ανθρώπινων όγκων φιλοξενούν μεταλλαγμένες ή αδρανοποιημένο p53? Κατά συνέπεια, η ρ53-εξαρτώμενη οδό αποπτωτικά δεν μπορεί να αξιοποιηθεί για την εξάλειψη των καρκινικών κυττάρων μετά από αντικαρκινική θεραπεία [39]. Για να ερευνηθεί ο πιθανός ρόλος των FOXM1 σε βλάβη του DNA που προκαλείται από απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές με μεταλλαγμένο ρ53, οι οποίες είναι συνήθως πιο ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία από καρκινικές κυτταρικές γραμμές με άγριου τύπου ρ53, ΜΙΑ PaCa-2 φορέα ελέγχου και FOXM1 knockdown ανθρώπινο παγκρεατικό καρκίνο κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν το μεταλλαγμένο ρ53 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις δοξορουβικίνης και ανοσοκηλίδωση πραγματοποιήθηκε για FOXM1, διασπασμένη κασπάση-3 και PARP (Εικ. 1Β). Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες [2] – [4], [11], [14], [40], παρατηρήσαμε επίσης ότι μετά βλάβη του DNA επίπεδο πρωτεΐνης FOXM1 είναι αυξημένα. Αλλά το πιο σημαντικό, βρήκαμε ότι η απουσία FOXM1 ευαισθητοποιημένων καρκινικών κυττάρων σε κυτταρικό θάνατο που επάγεται από δοξορουβικίνη (Σχ. 1 Β) όπως ανιχνεύεται με τη διάσπαση της κασπάσης-3 και PARP. Για να βεβαιωθείτε ότι το φαινόμενο αυτό δεν είναι κυτταρική γραμμή ειδική, MDA-MB-231 ανθρώπινου μαστού (ρ53-μεταλλαγμένο) (Σχ. 1C) και Hep3B ανθρώπινου ήπατος (ρ53-ηυΙΙ) (Σχ. 1D) φορέα ελέγχου και FOXM1 knockdown καρκινικά κύτταρα ήσαν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις δοξορουβικίνης. Η ανάλυση στυπώματος Western της διασπασμένης κασπάσης-3 έδειξε ότι η εξουδετέρωση του FOXM1 επίσης ευαισθητοποιημένων κυττάρων του μαστού και καρκίνου του ήπατος στη δοξορουβικίνη επαγόμενη απόπτωση.

Επιπλέον, ελέγξαμε εάν παροδική knockdown των αποτελεσμάτων FOXM1 σε αυξημένη απόπτωση μετά βλάβη του DNA. Για την επίτευξη επαρκούς παροδική νοκ ντάουν της FOXM1 χρησιμοποιήσαμε μικρά RNAs παρεμβολής (siRNAs) έναντι FOXM1. ΜΙΑ PaCa-2 παγκρεατικού (Εικ. 1 Ε) και MDA-MB-231 στήθους ελέγχου (Εικ. 1 F) και FOXM1 knockdown καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις ντοξορουμπικίνης. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα με παροδική FOXM1 knockdown ήταν περισσότερο επιρρεπή σε απόπτωση μετά βλάβη του DNA όπως ανιχνεύεται με ανοσοαποτύπωση για διασπασμένης κασπάσης-3, υποστηρίζοντας περαιτέρω την ιδέα ότι FOXM1 θα μπορούσαν να παίξουν ένα ρόλο στην βλάβη του DNA που προκαλείται από απόπτωση.

για να επιβεβαιώσει αυτό το αποτέλεσμα, ΜΙΑ PaCa-2 και MDA-MB-231 φορέα ελέγχου και FOXM1 νοκ ντάουν κύτταρα υποβλήθηκαν σε ιονίζουσα ακτινοβολία. γ-ακτινοβολία προκάλεσε επίσης ισχυρή απόπτωση όπως ανιχνεύεται από τη διάσπαση της κασπάσης-3 σε FOXM1 knockdown κυττάρων (Σχ. 2Α, Β). Επιπλέον, για να εκτιμηθεί ποσοτικά ο βαθμός κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από γ-ακτινοβολία ΜΙΑ PaCa-2 και MDA-MB-231 φορέα ελέγχου και FOXM1 knockdown κύτταρα γ-ακτινοβολήθηκαν με διαφορετικές δόσεις, συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο. Η έκταση της απόπτωσης μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (Σχ. 2C, D). Και οι δύο παγκρέατος και του μαστού FOXM1 νοκ ντάουν κύτταρα παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε κυτταρικό θάνατο μετά από θεραπεία σε σύγκριση με τα ακτινοβολημένα ομολόγους ελέγχου. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι καταστολή FOXM1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να γίνουν πιο επιρρεπή σε κυτταρικό θάνατο που επάγεται από παράγοντες που βλάπτουν το DNA.

(Α) ΜΙΑ PaCa-2 ελέγχου και FOXM1 knockdown παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ήταν γ- ακτινοβολείται με 8 και 10 Gy. Εβδομήντα δύο ώρες μετά τα κύτταρα συλλέχθηκαν ακτινοβολία και ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με αντισώματα για FOXM1 και διασπασμένη κασπάση-3. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) έλεγχος MDA-MB-231 και FOXM1 καρκινικά κύτταρα του μαστού knockdown υποβλήθηκαν σε γ-ακτινοβολία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την ακτινοβόληση τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ανοσοαποτύπωση πραγματοποιήθηκε για FOXM1, διασπασμένη κασπάση-3 και β-ακτίνης ως έλεγχος φόρτωσης. (C-D) Βαθμός κυτταρικού θανάτου αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο σε ΜΙΑ PaCa-2 παγκρεατικού και MDA-MB-231 ελέγχου του μαστού και FOXM1 knockdown καρκινικά κύτταρα, αντίστοιχα, 48 ώρες μετά την γ-ακτινοβόληση. Γράφημα δείχνει ποσοτικοποίηση ως ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο κύτταρα ελέγχου φορέα, ± SD ενός αντιπροσωπευτικού τριπλούν (C) ή διπλές (D) πείραμα.

Η

Η θεραπεία με αναστολείς πρωτεασώματος ευαισθητοποιεί ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα στην απόπτωση που επάγεται από βλάβη του DNA

η ομάδα μας έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι θειαζόλη αντιβιοτικά θειοστρεπτόνη και Siomycin Α είναι ισχυροί αναστολείς της FOXM1 [25] – [28] και δρουν ως αναστολείς πρωτεασώματος [29]. Επιπλέον, έχουμε αποδείξει ότι γνωστών αναστολέων πρωτεασώματος, όπως bortezomib (VELCADE) και MG132 στοχεύουν επίσης FOXM1 [29]. Προς τα κάτω ρύθμιση του FOXM1 είναι ένα από τα μέσα, με τα οποία οι αναστολείς πρωτεασώματος μπορεί να επάγουν κυτταρικό θάνατο in vitro και in vivo [27], [29], [41], αλλά υπάρχουν φυσικά διάφορες δυνητικές FOXM1-ανεξάρτητοι μηχανισμοί του πρωτεασώματος που προκαλείται από αναστολέα κυτταρικό θάνατο που εμείς δεν συζητάμε σε αυτή τη μελέτη. Για να δοκιμαστεί αναστολείς /πρωτεασώματος FOXM1 μαζί με παράγοντες προκαλούν βλάβη στο DNA, ΜΙΑ PaCa-2 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικής γραμμής υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το συνδυασμό της doxorubicin και bortezomib (Bor) (Σχ. 3Α) ή θειοστρεπτόνη (Thio) (Εικ. 3Β), αντίστοιχα . Βρήκαμε ότι οι αναστολείς του FOXM1, θειοστρεπτόνη και bortezomib κατασταλεί έκφραση FOXM1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) [27], [29] και σε συνδυασμό με doxorubicin επέδειξαν ισχυρότερη διάσπαση της κασπάσης-3 ή PARP σε σύγκριση με τις θεραπείες με φάρμακα σαν απλούς παράγοντες. Επιπλέον, ΜΙΑ PaCa-2 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα γ-ακτινοβολημένα μαζί με την θεραπεία του θειοστρεπτόνη ή bortezomib (Σχ. 3C). Η ανάλυση στυπώματος Western για διασπασμένης κασπάσης-3 έδειξε ότι ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα στο συνδυασμό γ-ακτινοβολία και θειοστρεπτόνης ή bortezomib, αντίστοιχα, από ό, τι σε μεμονωμένους φαρμακευτική αγωγή.

(Α) παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 υπέστησαν κατεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις doxorubicin και bortezomib (Bor) μόνη ή σε συνδυασμό. 24 ώρες μετά την αγωγή κυτταρολύματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με διασπασμένης κασπάσης-3, PARP και β-ακτίνη αντισώματα. (Β) ΜΙΑ PaCa-2 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δοξορουβικίνη και θειοστρεπτόνη (Thio) μόνη ή σε συνδυασμό με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με αντισώματα ειδικά για διασπασμένης κασπάσης-3 και β-ακτίνης ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Ο καρκίνος του παγκρέατος κυτταρική γραμμή ΜΙΑ PaCa-2 εκτέθηκε σε γ-ακτινοβολία και αγωγή σε συνδυασμό με θειοστρεπτόνη ή bortezomib για 24 ώρες. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη για διασπασμένης κασπάσης-3 και β-ακτίνης ως έλεγχος φόρτωσης. (D) MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού υποβλήθηκαν σε αγωγή με δοξορουβικίνη σε συνδυασμό με θειοστρεπτόνη ή βορτεζομίμπη όπως υποδεικνύεται για 24 ώρες. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση με αντισώματα ειδικά για διασπασμένης κασπάσης-3 και β-ακτίνης ως έλεγχος φόρτωσης. (Ε) Hep3B κύτταρα καρκίνου του ήπατος υποβλήθηκαν σε αγωγή με δοξορουβικίνη και θειοστρεπτόνη μόνα τους ή σε συνδυασμό όπως υποδεικνύεται για 24 ώρες. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με αντισώματα ειδικά για διασπασμένης κασπάσης-3 και β-ακτίνης ως έλεγχος φόρτωσης. (F) καρκίνος του μαστού κυτταρική γραμμή MDA-MB-231 υποβλήθηκε σε γ-ακτινοβολία και αγωγή σε συνδυασμό με θειοστρεπτόνη ή bortezomib για 24 ώρες. ανάλυση ανοσοστυπώματος εκτελέστηκε με διασπασμένης κασπάσης-3 και β-ακτίνη αντισώματα. (G-Η) 1 × 10

5 ΜΙΑ PaCa-2 (G) ή MDA-MB-231 (H) ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα επιστρώθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται για 24 ώρες. 10 ημέρες μετά την κατεργασία κύτταρα βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και οι αντιπροσωπευτικές πλάκες φαίνονται. Γράφημα δείχνει την ποσοτικοποίηση ± SD των διπλών πειραμάτων (*,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,01? ***,

P

& lt? 0.001).

Η

Για να επαληθευθούν περαιτέρω αυτό το φαινόμενο, MDA-MB-231 στήθους και Hep3B κύτταρα καρκίνου του ήπατος υποβλήθηκαν σε αγωγή με δοξορουβικίνη (Σχ. 3D, Ε) ή ακτινοβολημένα (Σχ. 3F) σε συνδυασμό με θειοστρεπτόνης ή βορτεζομίμπη, αντίστοιχα. Ανάλυση διασπασμένη κασπάση 3 έκφραση με κηλίδα western αποκάλυψε ότι ο συνδυασμός των παραγόντων που προκαλούν βλάβη του DNA με αναστολείς /πρωτεασώματος FOXM1 οδήγησε σε αυξημένη απόπτωση στα κύτταρα του μαστού και του καρκίνου του ήπατος σε σύγκριση με θεραπεία μόνο με φάρμακα. Δεδομένου ότι η θεραπεία με παράγοντες προκαλούν βλάβη στο DNA σε συνδυασμό με αναστολείς της FOXM1 /πρωτεασώματος επάγεται όπως σημειώνονται απόπτωση, το αποτέλεσμα του συνδυασμού τους εξετάστηκε επίσης στη μακροπρόθεσμη επιβίωση εκτελώντας κλωνογονική δοκιμασία. ΜΙΑ PaCa-2 και MDA-MB-231 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με γ-ακτινοβολία, μαζί με θειοστρεπτόνη ή βορτεζομίμπης και την ικανότητα σχηματισμού αποικιών εκτιμήθηκε 10 ημέρες αργότερα (Σχ. 3G, Η). Βρήκαμε ότι ο συνδυασμός του γ-ακτινοβολία και αναστολείς FOXM1 /πρωτεασώματος ανέστειλε σημαντικά το σχηματισμό αποικιών που δημιουργούν πολύ λιγότερο αριθμός των αποικιών σε σύγκριση με μεμονωμένες φαρμακευτική αγωγή. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο συνδυασμός των συνήθως χρησιμοποιούμενων προκαλούν βλάβη στο DNA χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και αναστολείς /πρωτεασώματος FOXM1 θα μπορούσε να θεωρηθεί ως μια στρατηγική θεραπείας προκειμένου να βελτιωθεί η θεραπευτική ανταπόκριση σε διάφορες θεραπείες για τον καρκίνο.

Ευαισθησία στο DNA- βλάβης μετά από καταστολή της FOXM1 αποδίδεται εν μέρει στην ενεργοποίηση JNK και Bcl-2 προς τα κάτω ρύθμιση

είναι μια ενδιαφέρουσα γεγονός ότι FOXM1, ένα γνωστό ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου, μπορεί να αναστέλλει βλάβη του DNA που προκαλείται από απόπτωση. Προκειμένου να διευκρινιστεί ο πιθανός υποκείμενος μηχανισμός που στράφηκε προς την οδό σηματοδότησης JNK, επειδή έχει εμπλακεί στην αντιμετώπιση ποικίλων ερεθισμάτων συμπεριλαμβανομένων διαφόρων ερεθισμάτων αποπτωτικά [32]. Έχει αναφερθεί ότι γ-ακτινοβολία οδηγεί σε ενεργοποίηση JNK, η οποία μεσολαβεί προκαλούμενη από ακτινοβολία απόπτωση [33], [42] – [44]. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της DNA-ζημιά στην ενεργοποίηση των JNK παρουσία ή απουσία FOXM1, ΜΙΑ PaCa-2 φορέα ελέγχου και FOXM1 knockdown παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ήταν γ-ακτινοβολημένα και ανοσοστυπώθηκαν για φωσφο-SAPK /JNK (Σχ. 4Α) . Παρατηρήσαμε ότι σε κύτταρα FOXM1-knockdown η επαγωγή κυτταρικού θανάτου μετά γ-ακτινοβολία συνοδεύτηκε από αυξημένη φωσφορυλίωση της JNK, προτείνοντας ότι FOXM1 μπορεί να αναστέλλει την ενεργοποίηση του JNK παρουσία βλάβη του DNA. Προκειμένου να διερευνηθεί ο πιθανός ρόλος των JNK ενεργοποίησης στην απόπτωση που επάγεται από το DNA-βλάβης σε FOXM1 knockdown κυττάρων, ΜΙΑ PaCa-2 παγκρεατικού και MDA-MB-231 FOXM1 μαστού knockdown καρκινικά κύτταρα γ-ακτινοβολήθηκαν με την παρουσία του ειδικού αναστολέα JNK , SP600125 (Σχ. 4Β-Ε). Η ανάλυση στυπώματος Western για διασπασμένης κασπάσης-3 έδειξε ότι η επαγωγή της απόπτωσης με ακτινοβολία εξασθένησε με κατεργασία με τον αναστολέα JNK, προτείνοντας ότι η ενεργοποίηση JNK είναι εν μέρει υπεύθυνη για τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο μετά από βλάβη του DNA.

(Α) ΜΙΑ έλεγχος PaCa-2 και FOXM1 knockdown παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα γ-ακτινοβολήθηκαν με τις υποδεικνυόμενες δόσεις. Εβδομήντα δύο ώρες μετά τα κύτταρα συλλέχθηκαν ακτινοβολία και ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με αντισώματα ειδικά για Phospho /Σύνολο-SAPK /JNK και διασπασμένη κασπάση-3. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) ΜΙΑ PaCa-2 FOXM1 knockdown παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα προεπωάστηκαν για 1 ώρα με 10 μΜ του αναστολέα JNK, SP600125 και ακολούθως γ-ακτινοβολήθηκαν όπως υποδεικνύεται. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την ακτινοβόληση τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ανοσοκηλίδωση διεξήχθη για διασπασμένη κασπάση-3 και β-ακτίνης ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Οι γραφικές παραστάσεις δείχνουν μέσες τιμές ± SEM των τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. (D) MDA-MB-231 FOXM1 καρκινικά κύτταρα του μαστού knockdown προεπωάστηκαν για 1 ώρα με 10 μΜ του αναστολέα JNK, SP600125 και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε γ-ακτινοβολία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις. Εβδομήντα δύο ώρες μετά τα κύτταρα συλλέχθηκαν ακτινοβολία και ανοσοστύπωση πραγματοποιήθηκε με διασπασμένης κασπάσης-3 και β-ακτίνη αντισώματα. (Ε) Οι γραφικές παραστάσεις δείχνουν μέσες τιμές ± SEM από δύο ανεξάρτητα πειράματα. (F) του παγκρέατος MIA ελέγχου PaCa-2 και FOXM1 knockdown καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε ιοντίζουσα ακτινοβολία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις. Τριάντα έξι ώρες μετά την ακτινοβόληση τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με αντισώματα ειδικά για Bcl-2 και Bcl-XL. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (G) του μαστού MDA-MB-231 ελέγχου και FOXM1 knockdown καρκινικά κύτταρα γ-ακτινοβολήθηκαν όπως υποδεικνύεται. Εβδομήντα δύο ώρες μετά τα κύτταρα συλλέχθηκαν ακτινοβολία και ανοσοκηλίδωση διεξήχθη για Bcl-2. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (H) MIA ελέγχου PaCa-2 και FOXM1 knockdown παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα συλλέχθηκαν για εκχύλιση του RNA. Ποσοτική RT-PCR διεξήχθη με Bcl-2 και κυκλοφιλίνη εκκινητές. Η γραφική παράσταση καταδεικνύει μέσες τιμές ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Ι) Για την εξαγωγή RNA MDA-MB-231 ελέγχου και FOXM1 καρκινικά κύτταρα του μαστού knockdown συλλέχθηκαν. Χρησιμοποιώντας Bcl-2 και cyclophlin εκκινητές qRT-PCR. Το γράφημα δείχνει μέσες τιμές ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Επίσης κοίταξε για επιπλέον μηχανισμοί που θα μπορούσαν να συμμετέχουν στην ευαισθητοποίηση σε βλάβη του DNA σε απουσία FOXM1. Η οικογένεια Bcl-2 πρωτεϊνών είναι ένας από τους κύριους ρυθμιστές της απόπτωσης [35] – [37]. Bcl-2 είναι περισσότερο γνωστή για την πρόληψη της απόπτωσης από διέπουν την ακεραιότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης [35] – [37]. Bcl-2 βρέθηκε επίσης να προσδώσει αντίσταση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και ακτινοβολία σε διάφορες κυτταρικές γραμμές [35]. Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως της Bcl-2 και Bcl-xL έκφραση μετά γ-ακτινοβολία αποκάλυψε ότι Bcl-2 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε FOXM1 knockdown του παγκρέατος και του μαστού καρκινικά κύτταρα (Σχ. 4F, G), ενώ το επίπεδο της πρωτεΐνης Bcl-xL παρέμεινε αμετάβλητη (Σχ. 4F ). Για να εξεταστεί αν Bcl-2 είναι ένας μεταγραφικός στόχος του FOXM1, η έκφραση του mRNA Bcl-2 εκτιμήθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου (qRT) -PCR τον έλεγχο των φορέων και FOXM1 knockdown κυττάρων του παγκρέατος και του καρκίνου του μαστού. FOXM1 knockdown οδήγησε σε μείωση 30-40% σε Bcl-2 έκφραση mRNA (Σχ. 4Η, Ι), γεγονός που υποδηλώνει ότι FOXM1 μεταγραφικά up-ρυθμίζει Bcl-2. Οι μελλοντικές πειράματα που απαιτούνται για να καθοριστεί εάν Bcl-2 είναι ένας άμεσος στόχος του FOXM1. Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι η καταστολή της FOXM1 μπορούσε επίσης να ευαισθητοποιούν ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα σε βλάβη του DNA μέσω Bcl-2 προς τα κάτω ρύθμιση.

Εν περιλήψει, αποδείξαμε ότι FOXM1 καταστολή με σταθερή ή παροδική εξουδετέρωση χρησιμοποιώντας RNAi (Εικ. 1, 2 ) ή με κατεργασία με αναστολείς FOXM1 /πρωτεασώματος (Εικ. 3) ευαισθητοποιεί ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα διαφορετικής προέλευσης στην απόπτωση που επάγεται από παράγοντες που προκαλούν βλάβη στο DNA, συμπεριλαμβανομένων doxorubicin και γ-ακτινοβολία. Η επίδραση του ενδογενούς knockdown FOXM1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα σε απόπτωση μετά από δοξορουβικίνη και την επεξεργασία γ-ακτινοβολία δεν έχει ποτέ διερευνηθεί προηγουμένως. ενεργοποίηση JNK και Bcl-2 προς τα κάτω ρύθμιση, ως αποτέλεσμα της FOXM1 knockdown μπορεί να εξηγήσει την αντίσταση του FOXM1 καλά κυττάρων σε απόπτωση μετά βλάβη του DNA. Συνολικά, τα ευρήματα μας σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές [11], [14] επιβεβαιώνουν ότι η στόχευση FOXM1 σε συνδυασμό με φάρμακα προκαλούν βλάβη στο DNA ή με γ-ακτινοβολία θα μπορούσε να είναι μια πολύτιμη θεραπευτική προσέγγιση έναντι διαφόρων τύπων καρκίνου στον άνθρωπο. Επειδή ορισμένα από τα αναστολέων FOXM1 /πρωτεασώματος όπως bortezomib βρίσκονται ήδη σε κλινική πρακτική, τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν επίσης ότι η χορήγηση χρησιμοποιούνται συνήθως προκαλούν βλάβη στο DNA χημειοθεραπευτικών παραγόντων σε συνδυασμό με αναστολείς FOXM1 /πρωτεασώματος ή με άλλους πιθανούς αναστολείς FOXM1 πρέπει να δικαιολογείται σοβαρά υπόψη προκειμένου να βελτιωθεί η θεραπευτική έκβαση.

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον Δρ Veronique Nogueira (Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο) για τη βοήθειά της για να πραγματοποιήσει τις μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω τον Δρ Τζέσικα J. Gierut (Harvard Medical School) για την ανάγνωση του χειρογράφου και για τα πολύτιμα σχόλιά της.