Αφηρημένο

Η κινάση Nek11 είναι ένας πιθανός μεσολαβητής της απόκρισης βλάβες στο DNA των οποίων η έκφραση υπερεκφράζεται σε καρκίνους του παχέος εντέρου πρώιμο στάδιο (CRCs). Εδώ, με τη χρήση μεσολάβηση RNAi εξάντληση, εξετάσαμε το ρόλο της Nek11 σε HCT116 WT και ρ53-ηυΙΙ κύτταρα CRC εκτίθεται σε ιοντίζουσα ακτινοβολία (IR) ή το χημειοθεραπευτικό φάρμακο, ιρινοτεκάνη. Έχουμε αποδείξει ότι η εξάντληση των Nek11 εμποδίζει την G2 /M σύλληψης που προκαλούνται από αυτά γονοτοξικούς παράγοντες και προωθεί ρ53-εξαρτώμενη απόπτωση τόσο με την παρουσία και απουσία της βλάβης του DNA. Είναι ενδιαφέρον ότι, η εξάντληση Nek11 οδήγησε επίσης σε μακροπρόθεσμη απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων που ήταν ανεξάρτητη από ρ53 και επιδεινώνονται μετά από έκθεση IR. κύτταρα CRC εκφράζουν τέσσερις παραλλαγές ματίσματος του Nek11 (L /S /C /D). Αυτά είναι κυρίως κυτταροπλασματική, αλλά υφίστανται πυρηνοκυτταροπλασματικής παλινδρόμηση με τη μεσολάβηση δίπλα σήματα πυρηνικής εισαγωγής και εξαγωγής στον C-τερματικό μη-καταλυτική περιοχή. Σε κύτταρα HCT116, Nek11S κυρίως έχει να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην αντιμετώπιση βλαβών του DNA. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι Nek11 συμβάλλει στην απόκριση των κυττάρων CRC σε γονοτοξικούς παράγοντες και είναι απαραίτητη για την επιβίωση, είτε με ή χωρίς έκθεση σε βλάβη του DNA

Παράθεση:. Sabir SR, Sahota ΝΚ, Jones GDD, Fry AM (2015) Απώλεια Nek11 Αποτρέπει G2 /M σύλληψης και προάγει κυτταρικό θάνατο σε HCT116 καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα που εκτίθενται σε Θεραπευτικές παράγοντες βλάβης του DNA. PLoS ONE 10 (10): e0140975. doi: 10.1371 /journal.pone.0140975

Επιμέλεια: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Γαλλία

Ελήφθη: 15 Αυγούστου 2014? Αποδεκτές: 3η Οκτωβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 26 Οκτωβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Sabir et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις σε AMF από το Wellcome Trust (082.828? https://www.wellcome.ac.uk), Cancer Research UK (. C1420 /A9363? https://www.cancerresearchuk.org), Σύνδεσμος για τη Διεθνή Έρευνα του Καρκίνου (AICR 13 έως 0042? https://www.aicr.org.uk), και διδακτορικό Δίπλωμα υποτροφία από το Πανεπιστήμιο του Leicester (http : //www.le.ac.uk). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος στον Δυτικό κόσμο. Σημερινό πρότυπο φροντίδας για τους ασθενείς CRC μετά από χειρουργική επέμβαση περιλαμβάνει συνδυασμούς χημειοθεραπείας που συνήθως περιλαμβάνουν παράγοντες βλάβης του DNA. Για παράδειγμα, πολλοί ασθενείς λαμβάνουν FOLFIRI ως θεραπεία πρώτης γραμμής, σε συνδυασμό του φολινικού οξέος, 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και η ιρινοτεκάνη [1]. 5-FU είναι ένα ανάλογο πυριμιδίνης ότι η σύνθεση μπλοκ DNA μέσω αναστολής της πολυμεράσης DNA, ενώ φολινικό οξύ ενισχύει την επίδραση της 5-FU με αναστολή θυμιδυλική συνθάση. Η ιρινοτεκάνη είναι ένας αναστολέας της τοποϊσομεράσης Ι που προκαλεί μονής αλυσίδας του DNA, τα οποία συνήθως μετατρέπεται στη συνέχεια σε δίκλωνα σπασίματα (DSBs). Αυτά ενεργοποιούν το σημείο ελέγχου βλάβης του DNA και να προκαλέσει τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου στην G1 /S ή G2 /M.

Η απάντηση βλάβες στο DNA (DDR) είναι ένα πολύπλοκο δίκτυο των κυτταρικών διεργασιών που οδηγούν σε πολλαπλά αποτελέσματα συμπεριλαμβανομένης της επισκευής του DNA , διακοπή του κυτταρικού κύκλου, γήρανση και την απόπτωση [2, 3]. Το συγκεκριμένο αποτέλεσμα καθορίζεται από πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένου του επιπέδου και του τύπου της βλάβης, και την ακεραιότητα των διαφορετικών οδών ΑΑΕ. Η επιτυχία του ϋΝΑ βλαπτικούς παράγοντες στη θεραπεία του καρκίνου βασίζεται στην αυξημένη ευαισθησία των ταχέως ποδηλασία καρκινικά κύτταρα που έχουν αποδυναμωθεί οδούς DDR. Αυτές οι διαφορές στα φυσιολογικά κύτταρα παρέχουν το θεραπευτικό παράθυρο που απαιτείται για την αποτελεσματικότητα. Ωστόσο, η τρέχουσα επιλογή αυτών των παραγόντων με βάση κυρίως τον τύπο του όγκου συνδέεται με σημαντική τοξικότητα και την καλύτερη κατανόηση του τι παράγοντες που υπαγορεύουν την απάντηση σε αυτά τα φάρμακα, θα οδηγήσει σε πιο εκλεπτυσμένη και εξατομικευμένες θεραπείες.

Τα μονοπάτια DDR ξεκίνησε μέσω της ενεργοποίησης των ΑΤΜ ή ATR σε απάντηση DSBs, στασιμότητα πιρούνια αναπαραγωγή ή αλλαγές στη δομή της χρωματίνης που συνδέονται με προσαγωγές DNA [2, 3]. Για να ξεκινήσει η διακοπή του κυτταρικού κύκλου, αυτές οι κινάσες φωσφορυλιώνουν κατάντη στόχους συμπεριλαμβανομένων Chk1, Chk2 και p53. Φωσφορυλίωση του p53 οδηγεί σε σταθεροποίηση του και αυξημένη έκφραση του στόχου της μεταγραφής του, p21. Chk1 και Chk2 φωσφορυλιώνει και απενεργοποιούν το φωσφατάση Cdc25 μέσω της προώθησης της υποβάθμισης του ή κυτταροπλασματική μεσεγγύηση. Μαζί, αυξημένη έκφραση του ρ21 και απώλεια της λειτουργίας του Cdc25 μπλοκάρουν την ενεργοποίηση των CDK είναι αναγκαία για G1 /S και G2 /M μεταπτώσεων. Ωστόσο, αυτό αντιπροσωπεύει μια μικρή εικόνα του τι είναι τώρα κατανοητό ότι είναι εξαιρετικά πολύπλοκες διαδρομές που περιλαμβάνουν πολλές άλλες ενζυμικές, ρυθμιστικά και δομικά στοιχεία.

Ένα σύνολο των πρωτεϊνών που έχουν αρχίσει να εμφανίζονται ως σημαντικοί ρυθμιστές της DDR είναι η NIMA που σχετίζονται με, ή ΝΕΚ, οικογένεια πρωτεϊνική κινάση [4]. Αυτή η οικογένεια αποτελείται από έντεκα μέλη εκ των οποίων τουλάχιστον τέσσερα, Nek1, Nek8, Nek10 και Nek11, έχουν υποψιαστεί ρόλους στην DDR [5-10]. Nek11 ήταν η πρώτη από αυτές να εμπλέκονται όταν δραστικότητα κινάσης του βρέθηκε να είναι αυξημένα στα κύτταρα που εκτίθενται σε παράγοντες βλάβης του DNA και τους αναστολείς αντιγραφής [9]. Επιπλέον, αυτή η δραστηριότητα χάνεται κατά την προσθήκη του αναστολέα /ATR ATM, καφεΐνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι Nek11 ενεργεί κατάντη του ΑΤΜ ή ATR. Πιο πρόσφατες μηχανιστικές μελέτες αποκάλυψαν ότι Nek11 ενεργοποιείται μέσω φωσφορυλίωσης σε Ser-273 με Chk1 κατά την έκθεση των κυττάρων σε ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) [7]. Ενεργοποιημένος Nek11 είναι ικανό να φωσφορυλιώσει cdc25A σε τοποθεσίες εντός phosphodegron που προάγει την πρόσληψη του β-TrCP. Αυτό, με τη σειρά του, οδηγεί σε διαμεσολαβείται από ουβικουϊτίνη αποικοδόμηση του cdc25A και διακοπή του κυτταρικού κύκλου [11-13]. Ωστόσο, άλλοι έχουν υποστηρίξει ότι η φωσφορυλίωση εξαρτώμενη αποδόμηση της Cdc25 διαμεσολαβείται από εναλλακτικές κινάσες, όπως κινάσης καζεΐνης 1 [14, 15]. Παρ ‘όλα αυτά, Nek11 έχει επίσης αναφερθεί να είναι μια δυνητικά σχετική βιοδείκτης του καρκίνου και αυξημένα έκφραση Nek11 ανιχνεύθηκε σε ένα σύνολο παχέος αδενωμάτων [16]. Ως εκ τούτου, έθεσε ως στόχο να ελέγξετε αν Nek11 απαιτείται για την ανταπόκριση των κυττάρων CRC σε κλινικά σχετικές παράγοντες βλάβης του DNA, καθώς και να ζητήσουν πρόσθετα αποδεικτικά στοιχεία για ένα ρόλο για Nek11 στην DDR.

Αποτελέσματα

Nek11 απαιτείται για IR-επαγόμενη G2 /M σύλληψη των κυττάρων HCT116

για να διερευνήσουν πώς Nek11 θα μπορούσε να συνεισφέρει στα κύτταρα DDR της CRC, ένα πρωτόκολλο διαπιστώθηκε ότι επέτρεψε την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου που πρέπει να παρακολουθούνται με κυτταρομετρία ροής μετά από Nek11 εξάντληση και IR έκθεσης (Εικόνα 1Α). Nek11 εξαντλήθηκε χρησιμοποιώντας μία από δύο ξεχωριστές siRNAs με την αποτελεσματικότητα αυτών των ολιγονουκλεοτιδίων επιβεβαιώθηκε μετά 72 ώρες την επιμόλυνση με RT-PCR και κηλίδας Western (S1A και S1B Εικ). Χρησιμοποιώντας ένα εύρος δόσεων IR, προσδιορίστηκε ότι η κυτταρική σειρά HCT116 CRC εμφάνισε μια σημαντική αύξηση στην G2 /M κλάσμα 16 ώρες μετά την έκθεση με 10 Gy IR (S1c Εικ). Ως εκ τούτου, σε αυτά τα πειράματα, τα κύτταρα πρώτα διαμολύνονται με τον έλεγχο (GL2 λουσιφεράση) ή Nek11 siRNAs και στη συνέχεια, μετά από 56 ώρες, ήταν είτε χωρίς θεραπεία είτε εκτέθηκαν σε 10 Gy IR. Μετά από περαιτέρω 16 ώρες, συλλέχθηκαν για ανάλυση με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) -με βάση κυτταρομετρία ροής (σχήμα 1Β και 1C, S1D, S1E, S2A και S2B σχήματα).

Α. Σχηματική αναπαράσταση της χρονικής πορείας για θεραπείες κυττάρων. 24 ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA ολιγονουκλεοτίδια. 56 ώρες αργότερα, τα κύτταρα είτε ήταν μη επεξεργασμένα είτε ακτινοβολημένα (± IR). Στη συνέχεια συλλέγονται και σταθερές για κυτταρομετρία ροής ΡΙ-βάση μετά από άλλες 16 ώρες. B & amp? Γ Ακολουθώντας το πρωτόκολλο που περιγράφεται στο Α, HCT116 WT και ρ53-ηυΙΙ κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNAs όπως υποδεικνύεται και αφεθεί χωρίς θεραπεία (Β) ή κατεργασία με 10 Gy IR (C), πριν από την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Κατανομή των κυττάρων σύμφωνα με κυτταρομετρία ροής προφίλ υποδεικνύεται (2Ν, G1? 2η-4η, S? 4n, G2 /M). D-G. Ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν ποσοστό ποδηλασία HCT116 WT (D, E) και p53-null κύτταρα (F, G) σε G2 /M. Η-Κ. Ιστογράμματα δείχνουν το ποσοστό όλων των κυττάρων HCT116 WT (Η, Ι) και ρ53-ηυΙΙ (J, K) με υπο-2n DNA. Τα ιστογράμματα στη Δανία έχουν ληφθεί από τα δεδομένα φαίνεται στο Β και Γ

Οι σ

τιμές υπολογίζονται σε σχέση με siGL2.

Η

Χρησιμοποιώντας αυτό το πρωτόκολλο, δεν έχει παρατηρηθεί σημαντική μεταβολή στο κλάσμα της ποδηλασίας κυττάρων στην φάση G2 /M του κυτταρικού κύκλου μετά την εξάντληση Nek11 χωρίς IR (~ 30%? Σχήμα 1D). Ωστόσο, μετά την έκθεση IR, τα κύτταρα εξαντλούνται από Nek11 παρουσίασαν σημαντική μείωση στο κλάσμα G2 /M σε σύγκριση με κύτταρα εξαντλούνται με ολιγονουκλεοτίδια ελέγχου, με siNek11-2 προκαλώντας επιστροφή στο βασικό επίπεδο G2 /M κυττάρων (Σχήμα 1 Ε). Σημειώνουμε ότι siNek11-2 έδωσε μια πιο ισχυρή από ό, τι knockdown siNek11-1 με RT-PCR και στυπώματος Western. Για να εξεταστεί ο ρόλος της ρ53 σε αυτήν την απόκριση, η ίδια πειραματική προσέγγιση εφαρμόστηκε σε ισογονιδιακά HCT116 ρ53-ηυΙΙ (ρ53

– /-) κύτταρα. Εξάντληση των Nek11 μόνη της είχε και πάλι καμία σημαντική επίδραση στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου στην απουσία IR, ενώ υπήρξε μια σημαντική μείωση στην G2 /M σύλληψη στην ανταπόκριση στη θεραπεία IR ακόλουθη εξάντληση Nek11 (Σχήμα 1F και 1G). Ωστόσο, στην περίπτωση αυτή, ούτε siRNA προκάλεσε μια πλήρη επιστροφή στα βασικά επίπεδα των G2 /M κυττάρων υποδηλώνοντας ότι η απώλεια της G2 /M σημείο ελέγχου ελέγχου με την απουσία του Nek11 είναι εν μέρει ρ53-εξαρτώμενη.

Καθώς επιτρέποντας τη διανομή του κυτταρικού κύκλου για να καθοριστεί, η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε την παρουσία του κυτταρικού θανάτου, όπως υποδεικνύεται από το υπο-2n αιχμής. Σύγκριση του ποσοστού σε αυτό το κλάσμα (σε σχέση με όλα τα κύτταρα στο δείγμα) αποκάλυψε μία μέτρια αύξηση σε κυτταρικό θάνατο μετά από εξάντληση Nek11 χωρίς IR, αν και η σημασία (ρ & lt? 0,05) επετεύχθη μόνο με ένα ολιγονουκλεοτίδιο (Εικ 1 Η). Ωστόσο, ο κυτταρικός θάνατος αυξήθηκε σε μεγαλύτερο βαθμό στην Nek11 εξαντλημένο δείγματα μετά από έκθεση IR γεγονός που υποδηλώνει ότι η συνδυασμένη θεραπεία ενισχυμένη κυτταρικό θάνατο (Σχ 1θ). Αντιθέτως, υπήρχε μόνο μία μικρή αύξηση στην υπο-2n πληθυσμό HCT116 ρ53-ηυΙΙ κύτταρα μετά από εξάντληση Nek11 πριν την έκθεση IR και, αν και υπήρχαν περισσότερα κύτταρα στην υπο-2n κλάσμα μετά από έκθεση IR, δεν υπήρχε μια συνεπής αύξηση την εξάντληση Nek11 (Σχ 1J και 1K). Ως εκ τούτου, καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι η επαγωγή του κυτταρικού θανάτου που προκύπτει από τη συνδυασμένη απώλεια Nek11 και η έκθεση IR εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από p53.

Nek11 απαιτείται για να αποτρέψει την απόπτωση και την προώθηση της μακροπρόθεσμης επιβίωσης των κυττάρων

Όπως PI-based κυτταρομετρία ροής έδειξε κυτταρικό θάνατο μετά από Nek11 εξάντληση, με ή χωρίς έκθεση σε IR, αποφασίσαμε να μετρήσει ειδικά απόπτωση. Για το σκοπό αυτό, το ίδιο πρωτόκολλο ακολουθήθηκε όπως προηγουμένως εκτός από το ότι κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση χρώσης αννεξίνης V με βάση τη μέτρηση της απώλειας της μεμβράνης πλάσματος φωσφολιπιδίων ασυμμετρία που προκύπτει κατά τη διάρκεια της απόπτωσης. Η εξάντληση των Nek11 χωρίς έκθεση IR οδήγησε σε μια αύξηση ~ 2-3 φορές σε απόπτωση σε κύτταρα HCT116 WT επιβεβαιώνοντας ότι Nek11 προάγει επιβίωση εν απουσία της βλάβης του DNA (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, ενώ η έκθεση σε μόνος 10 Gy IR δεν αύξησε το ποσοστό των κυττάρων HCT116 WT υφίστανται απόπτωση, υπήρξε μια αύξηση στην αποπτωτική κλάσμα εξής συνδυασμένα εξάντληση Nek11 και την έκθεση σε σύγκριση με IR εξάντληση Nek11 μόνο (Σχήμα 2Β). Στα HCT116 κύτταρα ρ53-ηυΙΙ, εξάντληση Nek11 μόνο του δεν προκάλεσε σημαντική αύξηση στην απόπτωση, ενώ υπήρχε μόνο μία μικρή αύξηση στην απόπτωση σε κύτταρα HCT116 ρ53-ηυΙΙ όταν εξάντληση Nek11 συνδυάστηκε με IR (Σχήμα 2C και 2D). Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με αυτά που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας χρώση ΡΙ-based και δείχνουν ότι η απώλεια του Nek11 οδηγεί σε ρ53-εξαρτώμενη επαγωγή της απόπτωσης που επιτείνεται από την έκθεση IR.

Α-D. Ακολουθώντας το πρωτόκολλο που περιγράφεται στο Σχήμα 1Α, HCT116 WT (Α, Β) και ρ53-ηυΙΙ κύτταρα (C, D) επιμολύνθηκαν με siRNAs όπως υποδεικνύεται, πριν από την ακτινοβόληση και την ανάλυση από τη ροή αννεξίνη V-based κυτταρομετρία. Ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό όλων των κυττάρων σε απόπτωση.

σ

τιμές είναι σχετικές με siGL2. Ε HCT116 WT και ρ53-ηυΙΙ κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNAs όπως υποδεικνύεται και μετά 56 ώρες κατεργάζεται ± 2 Gy IR. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από άλλες 16 ώρες και επιστρώθηκαν για κλωνογόνο δοκιμασίες (50 κύτταρα ανά πλάκα για siGL2, 500 κύτταρα ανά πλάκα για άλλες θεραπείες). Οι αποικίες βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. ΣΤ Αποικίες από Ε μετρήθηκαν και% επιβίωση προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. G. HCT116 ρ53-ηυΙΙ κύτταρα επιμολύνθηκαν με είτε siGL2 ή siNek11-2 και μετά 56 ωρών για κάθε αριστερά χωρίς αγωγή ή ακτινοβοληθεί. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν 48 ώρες μετά IR και χρωματίστηκαν με αντίσωμα α-τουμπουλίνης (πράσινο). Το DNA βάφονται με Hoechst να τηρεί την πυρηνική μορφολογία. Κλίμακα μπαρ, 10 um. H. Ιστόγραμμα αντιπροσωπεύει το ποσοστό των κυττάρων που εμφανίζουν πολλαπλά πυρήνες ακολουθώντας τις επεξεργασίες που αναφέρονται, όπως περιγράφεται στο G. 500 κύτταρα μετρήθηκαν ανά δείγμα και το μέσο ποσοστό των πολυπυρηνικών κυττάρων προσδιορίστηκε σε δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για εξετάζει μακροχρόνια επιβίωση, κλωνογόνων δοκιμασίες διεξήχθησαν κατά την οποία τα κύτταρα εξαντλούνται με έλεγχο ή Nek11 siRNAs για 56 ώρες και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε μια χαμηλότερη δόση (2 Gy) του IR πριν από την επίστρωση έξω 16 ώρες αργότερα. Μετά από δύο εβδομάδες, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν και μετρήθηκαν (Σχ 2Ε και 2F). Πρώτα απ ‘όλα, αυτό αποδεικνύει ότι ακόμη και σε δείγματα ελέγχου εξαντληθεί, αυτή η δόση του IR ήταν επαρκής για να προκαλέσει σημαντικά μειωμένο (~ 3-φορές) τον αριθμό των αποικιών όχι μόνο στα κύτταρα HCT116 WT, αλλά και το HCT116 ρ53-ηυΙΙ κύτταρα. Ως εκ τούτου, αν και IR δεν προκαλεί ουσιαστική κυτταρικό θάνατο ή απόπτωση σε σύντομους χρόνους μετά την έκθεση, δεν προκαλεί μακροπρόθεσμη απώλεια της επιβίωσης που απαντάται σε μια ρ53-ανεξάρτητο τρόπο. Είναι ενδιαφέρον ότι, η εξάντληση του Nek11 μόνος είχε επίσης ένα έντονα δηλητηριώδη επίδραση επί της επιβίωσης με ένα 5-πλάσια μείωση στον αριθμό των αποικιών σε κύτταρα HCT116 WT. Και πάλι, μια παρόμοια μείωση στον αριθμό των αποικιών παρατηρήθηκε με τα κύτταρα HCT116 ρ53-ηυΙΙ. Ο συνδυασμός της εξάντλησης Nek11 και έκθεση IR οδήγησε στην μεγαλύτερη απώλεια βιωσιμότητας με ~ 10 φορές μείωση στον αριθμό των αποικιών τόσο στο HCT116 WT και ρ53-ηυΙΙ κύτταρα. Συνεπώς, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η μακροχρόνια επιβίωση των κυττάρων HCT116 μειώνεται δραματικά σε απόκριση σε έκθεση IR, εξάντληση Nek11 ή ένα συνδυασμό και των δύο. Επιπλέον, αυτές οι απαντήσεις δεν εξαρτώνται από ρ53, που δείχνει ότι οι πορείες θανάτου p53-ανεξάρτητη ενεργοποιηθεί.

Για να εξεταστεί κατά πόσον η μακροχρόνια απώλεια της κυτταρικής επιβίωσης μετά από τις θεραπείες αυτές θα μπορούσαν να προκύψουν από την μιτωτική καταστροφή, παρωδία ή Nek11- εξαντλημένα κύτταρα HCT116 ήταν είτε χωρίς θεραπεία ή εκτεθεί σε IR και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν για μικροσκοπική ανάλυση μετά από άλλες 48 ώρες. Η παρουσία μεγάλων πολυπύρηνων ενδεικτική απέτυχε μιτωτικής διαιρέσεων (δηλαδή μιτωτική καταστροφή) παρατηρήθηκαν σε απόκριση είτε εξάντληση Nek11 ή IR έκθεσης (Σχήμα 2G). Ωστόσο, η ποσοτικοποίηση των πολυπύρηνων αποκάλυψε ότι η εξάντληση των Nek11 μόνος οδήγησε σε μια σχετικά μικρή συχνότητα μιτωτικών καταστροφή, ενώ παρατηρήθηκε ένα σημαντικά υψηλότερη συχνότητα σε ανταπόκριση στη θεραπεία IR μόνο (Σχήμα 2Η). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και στις δύο WT και p53-null κύτταρα εκτός από το ότι μιτωτική καταστροφή σε απάντηση IR ήταν ακόμη πιο έντονη στα p53-null κύτταρα σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [17, 18]. Τα υψηλά επίπεδα της μιτωτικής καταστροφής που προκαλείται από IR και μόνο δείχνουν ότι αυτή είναι μια σημαντική αιτία της μειωμένης βιωσιμότητα φαίνεται στα κλωνογενείς δοκιμασίες. Ωστόσο, τα χαμηλότερα επίπεδα της μιτωτικής καταστροφής που προκαλείται από την εξάντληση των Nek11 μόνη της μάλλον συνηγορούν υπέρ των εναλλακτικών μηχανισμών του μειωμένου σχηματισμού αποικιών, όπως η ζημιά που προκαλείται από τη γήρανση.

Nek11 μεσολαβεί G2 /M σύλληψης σε κύτταρα HCT116 που έλαβαν θεραπεία με ιρινοτεκάνη

CRC ασθενείς συχνά λαμβάνουν ιρινοτεκάνη, έναν αναστολέα τοποϊσομεράσης Ι, ως μέρος της χημειοθεραπείας τους. PI-based κυτταρομετρία ροής επιβεβαίωσε ότι τα κύτταρα HCT116 επιδεικνύουν μία απόκριση δόσης στην παρούσα βλάβης του DNA παράγοντα, με μια συσσώρευση κυττάρων σε G2 /M μετά από 24 ώρες θεραπείας (Εικ S3A). Ως εκ τούτου, ένα πρωτόκολλο χρησιμοποιήθηκε που μας επέτρεψε να συγκρίνει την απόκριση του HCT116 WT και ρ53-ηυΙΙ κύτταρα να ιρινοτεκάνη με εκείνη που παρατηρείται για IR. Σε αυτή την περίπτωση, τα κύτταρα εξαντλούνται από Nek11 για 52 ώρες πριν από την προσθήκη του ιρινοτεκάνη στα 5 μΜ. Μετά περαιτέρω 20 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση με κυτταρομετρία ροής (σχήμα 3Α-3C και S2C και S2D Εικ). Πρώτον, αυτό έδειξε ότι, όπως και με IR, τη συσσώρευση των κυττάρων HCT116 WT σε G2 /M σε απόκριση ιρινοτεκάνη κατεστάλη εξής εξάντληση Nek11 (Σχ 3D και 3Ε και Σχ S3b). Ομοίως, ιρινοτεκάνη προκάλεσε μια G2 /M συλλήψεως HCT116 κύτταρα ρ53-ηυΙΙ που εν μέρει καταστέλλεται με εξάντληση Nek11 (Σχ 3F και 3G και S3C Εικ). Όσον αφορά την έκθεση IR, παρατηρήσαμε ότι η εξάντληση Nek11 μόνη προκάλεσε μία μέτρια στάθμη του κυτταρικού θανάτου, αλλά αυτό ενισχύθηκε σε συνδυασμό με ιρινοτεκάνη σε κύτταρα HCT116 WT (σχήμα 3η και 3θ). Σε αντίθεση, παρατηρήθηκε μια μικρότερη και λιγότερο σταθερό επίπεδο κυτταρικού θανάτου στα HCT116 κύτταρα ρ53-null παρακάτω Nek11 εξάντληση είτε με είτε χωρίς ιρινοτεκάνη (Σχήμα 3J και 3K). Ως εκ τούτου, συμπεραίνουμε ότι η ιρινοτεκάνη επάγει επίσης μία Nek11 εξαρτώμενη G2 /M σύλληψης που εξαρτάται εν μέρει από την κατάσταση της ρ53 σε κύτταρα HCT116 και ότι η ιρινοτεκάνη αυξήσεις κυτταρικό θάνατο όταν συνδυάζεται με εξάντληση Nek11 με έναν τρόπο που είναι p53-εξαρτώμενη. Ως εκ τούτου, Nek11 είναι πιθανό να διαδραματίσει έναν παρόμοιο ρόλο στην απόκριση των HCT116 κυττάρων με IR και ιρινοτεκάνη.

Α. Σχηματική αναπαράσταση της χρονικής πορείας για θεραπείες κυττάρων. 24 ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA ολιγονουκλεοτίδια. 52 ώρες αργότερα, τα κύτταρα είτε μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με 5 μΜ ιρινοτεκάνη. Στη συνέχεια συλλέγονται και σταθερές για κυτταρομετρία ροής ΡΙ-βάση μετά από άλλες 20 ώρες. B & amp? Γ Ακολουθώντας το πρωτόκολλο που περιγράφεται στο Α, HCT116 WT και ρ53-ηυΙΙ κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNAs όπως υποδεικνύεται και αφεθεί χωρίς θεραπεία (Β) ή κατεργασμένα με ιρινοτεκάνη (C), πριν από την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Κατανομή των κυττάρων σύμφωνα με κυτταρομετρία ροής προφίλ υποδεικνύεται (2Ν, G1? 2η-4η, S? 4n, G2 /M). D-G. Ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν ποσοστό ποδηλασία HCT116 WT (D, E) και p53-null κύτταρα (F, G) σε G2 /M. Η-Κ. Ιστογράμματα δείχνουν το ποσοστό των HCT116 WT (Η, Ι) και p53-null κυττάρων με υπο-2n DNA (J, K). Τα ιστογράμματα στη Δανία με βάση τα στοιχεία στο Β και Γ

σ

τιμές είναι σχετικές με siGL2.

Η

Αναγνώριση τέσσερις παραλλαγές Nek11 ματίσματος που υποβάλλονται πυρηνοκυτταροπλασματικής παλινδρόμηση

ο πρώτος χαρακτηρισμός της ανθρώπινης Nek11 περιγράφονται δύο παραλλαγές ματίσματος, μια μακρά έκδοση των 74 kDa, που ονομάζεται Nek11L, και μια σύντομη εκδοχή των 54 kDa, που ονομάζεται Nek11S [9]. Μέσα από την ανάλυση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης, εντοπίσαμε δύο υποθετικές παραλλαγές ματίσματος που ονομάζεται Nek11C και Nek11D, με προβλεπόμενη μεγέθη των 56 και 69 kDa, αντίστοιχα. Και οι τέσσερις παραλλαγές έχουν ταυτόσημο Ν-τερματική αλληλουχία των 466 υπολειμμάτων που περιλαμβάνει την καταλυτική περιοχή και δύο προβλεπόμενες συσπειρωμένης πηνία. Nek11S και Nek11C τερματίσει αμέσως μετά, αν και με διαφορετικές αλληλουχίες. Nek11L και Nek11D έχουν πιο εκτεταμένη C-άκρα, αρχικά μοιράζονται ένα επιπλέον πανομοιότυπα ~ 50 υπολείμματα πριν τελειώνει με εναλλακτικές αλληλουχίες (Σχήμα 4Α). Για να προσδιοριστεί εάν αυτές οι παραλλαγές είχαν ξεχωριστές ιδιότητες, δημιουργήσαμε πρώτα κύτταρα U2OS που εκφράζεται σταθερά GFP-tagged εκδόσεις της κάθε παραλλαγής Nek11. Αυτά τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τους σκοπούς του υποκυτταρικού μελέτες εντοπισμού, ενώ έχει αποδειχθεί ότι η εξάντληση Nek11 διαταράσσει την DDR σε αυτά τα κύτταρα [7]. Εμείς που παράγεται επίσης μια κυτταρική γραμμή U2OS εκφράζει ένα (KD) έκδοση «κινάση-νεκρή» της Nek11L με μετάλλαξη σε δύο βασικά καταλυτικά υπολείμματα (K61R /D158A) για να διαπιστωθεί αν εντοπισμός μπορεί να είναι δραστηριότητα που εξαρτάται.

Α. Σχηματική αναπαράσταση των τεσσάρων ισομορφών πρωτεΐνης Nek11. Η διαφορετική Ο-άκρα υποδεικνύονται και διακεκομμένες γραμμές υποδεικνύουν τις θέσεις στις οποίες αποκλίνουν οι πρωτεΐνες. Οι θέσεις του τομέα κινάσης, συσπειρωμένης πηνία, αριθμούς υπολείμματος και προβλεπόμενα μοριακά βάρη υποδεικνύονται. B. Κυτταρολύματα από U2OS: GFP-Nek11 σταθερές κυτταρικές σειρές ή γονικά κύτταρα U2OS αναλύθηκαν με SDS-PAGE και κηλίδωση Western με αντισώματα εναντίον Nek11, GFP και α-τουμπουλίνης. κύτταρα C. U2OS διαμολύνθηκαν με κατασκευάσματα που υποδεικνύονται και, μετά από 20 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία ± MG132 για 4 ώρες. Τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν με κηλίδα Western με αντισώματα υποδεικνύεται. M.wts. (KDa) υποδεικνύονται στα αριστερά σε Β και C. D. μόνο GFP και GFP-Nek11 κυτταρικές γραμμές όπως υποδεικνύεται υποβλήθηκαν σε θεραπεία ± LMB για 3 ώρες πριν από καθήλωση και χρώση με αντισώματα GFP. Ράβδοι κλίμακας, ανάλυση 5 μm.

Η

Western blot αποκάλυψε ότι η παραλλαγή GFP-Nek11D εκφράστηκε σε πολύ μειωμένα επίπεδα σε σύγκριση με τις άλλες παραλλαγές σε σταθερές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Β). Η επώαση με τον αναστολέα πρωτεασώματος, MG132, οδήγησαν σε επιλεκτική αυξητική ρύθμιση αυτής της ισομορφής που υποδηλώνει ότι η παραλλαγή Nek11D είναι μοναδική μεταξύ αυτών των τεσσάρων παραλλαγών σε κατέχουν αλληλουχίες που στοχεύουν για αποδόμηση διαμεσολαβείται από ουβικουϊτίνη, πιθανώς σε μοναδικές Ο-άκρο της (Σχήμα 4C). μικροσκοπία ανοσοφθορισμού απεκάλυψε ότι ενώ οι ισομορφές Nek11L και Nek11D περιορίζονταν στο κυτταρόπλασμα, Nek11S και Nek11C ανιχνεύθηκαν τόσο στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα (Εικόνα 4D). Κινάσης-νεκρό Nek11L περιορίστηκε στο κυτόπλασμα, όπως η πρωτεΐνη άγριου τύπου. Όπως αναφέρθηκε Nek11 να εντοπίζεται σε πυρηνίσκους [19], αξιολογήσαμε κατά πόσο οι παραλλαγές θα μπορούσαν λεωφορείο μεταξύ του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα. Αναστολή της πυρηνικής εξαγωγής με τον αναστολέα Crm1, leptomycin Β (ΕΜΒ), προκάλεσε τα τέσσερα Nek11 παραλλαγές να συσσωρεύεται στον πυρήνα, έστω και χωρίς εμφανή συγκέντρωση στην πυρηνίσκους. Κινάσης-νεκρό Nek11L υποβλήθηκαν επίσης πυρηνοκυτταροπλασματικής παλινδρόμηση δείχνει ότι αυτό δεν εξαρτάται από την ενζυματική δραστηριότητα του.

Αναγνώριση των ακολουθιών που ρυθμίζουν πυρηνοκυτταροπλασματικής παλινδρόμηση των Nek11

Για να χαρτογραφηθούν οι περιοχές της πρωτεΐνης που απαιτείται για την πυρηνική εισαγωγή και εξαγωγής, αναλύσαμε τον εντοπισμό μιας σειράς μεταλλαγμάτων κολόβωσης Nek11 (Σχήμα 5Α). Το Ν-τερματικό καταλυτικό τομέα μόνο (κατάλοιπα 1-287) που εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και δεν το έκανε λεωφορείο. Σε αντίθεση, το Ο-τερματικό μη-καταλυτική περιοχή της Nek11L (υπολείμματα 288-645) ήταν κυτταροπλασματική απουσία LMB αλλά συγκεντρώνεται στον πυρήνα με LMB. Αυτό δείχνει ότι περιέχει μοτίβα απαραίτητες για πυρηνοκυτταροπλασματικής παλινδρόμηση (Σχήμα 5Β και 5Γ). Ως κανονική αλληλουχίες πυρηνικού εντοπισμού και εξαγωγής δεν ήταν παρόντες, δημιουργήσαμε πέντε επιπλέον δομές που εκπροσωπούν C-τερματικούς ακρωτηριασμούς των Nek11L (Σχήμα 5Α και 5D). Ένα μόρφωμα που περιλαμβάνει την καταλυτική περιοχή και τα δύο μοτίβα συσπειρωμένης σπείρας (κατάλοιπα 1-388), ήταν πυρηνική ανεξάρτητα από θεραπεία LMB, ενώ ένα εκτεταμένο κατασκεύασμα που περιλαμβάνει τα υπολείμματα 1-541 συμπεριφέρθηκαν σαν πρωτεΐνη πλήρους μήκους είναι κυτταροπλασματική σε μη επεξεργασμένα κύτταρα και τα πυρηνικά με LMB ( Σχήμα 5Ε). Ένα μόρφωμα που αντιπροσώπευε την περιοχή συντηρημένη μεταξύ των τεσσάρων Nek11 παραλλαγές, 1-466, παρουσίασαν μια πιο ισότιμη πυρηνικά κυτταρόπλασμα κατανομή θυμίζει το S και C παραλλαγών τερματίσει σύντομα μετά από αυτό το σημείο. Παρόμοιες με αυτές τις παραλλαγές, αυτό το κατασκεύασμα συγκεντρώνεται στον πυρήνα μετά από τη θεραπεία LMB. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι οι περιοχές σπειραμάτων περιέχουν αλληλουχίες που είναι απαραίτητες για την πυρηνική εισαγωγή, ενώ η περιοχή μεταξύ των υπολοίπων 388 και 465 περιέχει αλληλουχίες που είναι απαραίτητες για την πυρηνική εξαγωγή.

Α. Σχηματική αναπαράσταση της GFP-Nek11L κατασκευάσματα που χρησιμοποιούνται για την εξέταση υποκυτταρικό εντοπισμό. Κυρίαρχο εντοπισμού για να κυτταρόπλασμα (C), πυρήνα (Ν) ή ίση κατανομή (C /N) ± θεραπεία LMB ενδείκνυται. Β κηλίδες Western με GFP και α-τουμπουλίνης αντισωμάτων των προϊόντων της λύσης που παρασκευάζονται από κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα U2OS για 24 ώρες με τα κατασκευάσματα Nek11L υποδεικνύεται. τομέας κινάσης περιλαμβάνει υπολείμματα 1-287 και C-τερματικό πεδίο περιλαμβάνει υπολείμματα 288-645. Οι Μ WTS (kDa) υποδεικνύονται στα αριστερά. κύτταρα C. U2OS διαμολύνθηκαν με κατασκευάσματα που υποδεικνύονται και, μετά από 24 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία ± LMB για 3 ώρες πριν από καθήλωση και χρώση με αντισώματα GFP. D & amp? κηλίδες και ανοσοφθορισμού χρώση E. Western πραγματοποιήθηκε όπως στο Β και C, αντίστοιχα, με τα κατασκευάσματα υποδεικνύεται. Κλίμακα μπαρ, 5 μm.

Η

Nek11S διαδραματίζει καίριο ρόλο στο DNA βλάβη που προκαλείται G2 /M σύλληψης σε κύτταρα HCT116

Για να καθοριστεί εάν οι τέσσερις Nek11 παραλλαγές ματίσματος που εκφράζονται σε HCT116 κύτταρα, καθώς επίσης και τρεις άλλες κυτταρικές γραμμές CRC (ΗΤ29, SW480 και SW620), ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε με ισομορφή-ειδικούς εκκινητές (S4A και S4B Εικ). Αυτές εντοπίστηκαν mRNA για κάθε παραλλαγή σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές, με Nek11L και Nek11C με συνέπεια να είναι η περισσότερο και λιγότερο άφθονα, αντίστοιχα (Εικ S4C). Στη συνέχεια συγκρίνεται αφθονία τους σε αυτές τις κυτταρικές σειρές CRC σε σχέση με εκείνο στο αθανατοποιημένη γραμμή ανθρωπίνων Κολονοκύτταρο, HCEC. Αυτό έδειξε αξιοσημείωτη μεταβολή με αυξημένη Nek11S σε ΗΤ29 και αυξημένη Nek11C στο SW620 (S4D σχήμα). Σε αντίθετη περίπτωση, τα επίπεδα της κάθε παραλλαγής ήταν είτε παρόμοια ή μειωμένη σε σύγκριση με τα κύτταρα HCEC.

Για να δοκιμαστεί η συμβολή αυτών των παραλλαγών ματίσματος στην DDR σε κύτταρα HCT116, επικυρώθηκαν δύο σύνολα siRNAs, μια που συν-εξαντλείται τόσο οι πλέον ισομορφές, Nek11L και Nek11D, και ένα που καταστρέφει επιλεκτικά Nek11S (S4E σχήμα). Αυτά στη συνέχεια εφαρμόζονται σε HCT116 WT και τα κύτταρα ρ53-ηυΙΙ χρησιμοποιώντας τα πρωτόκολλα που περιγράφηκαν νωρίτερα για την ανάλυση των απαντήσεων σε IR και ιρινοτεκάνη με PI-based κυτταρομετρία ροής (S5 Εικ). Σε κύτταρα HCT116 WT, υπήρξε μια μέτρια μείωση της G2 /M του πληθυσμού κατά την εξάντληση του Nek11L /D σε απάντηση IR, αλλά όχι σε απόκριση προς την ιρινοτεκάνη. Αντίθετα, υπήρξε μια σημαντική μείωση του G2 /M του πληθυσμού σε απόκριση προς τις δύο θεραπείες την εξάντληση του Nek11S (Σχήμα 6Α-6C, S2E και S2F Εικ). Στην HCT116 ρ53-ηυΙΙ κύτταρα, μια μικρή αλλά σημαντική μείωση της G2 /M του πληθυσμού παρατηρήθηκε την εξάντληση /D Nek11L σε απόκριση ιρινοτεκάνη αλλά όχι IR, ενώ εξάντληση Nek11S οδήγησε σε σημαντική μείωση σε απόκριση σε αμφότερες τις επεξεργασίες (Σχ 6D -6F). Όσο για εξάντληση της συνολικής Nek11, ήταν αξιοσημείωτο ότι το κλάσμα των G2 /M κυττάρων επέστρεψαν στα βασικά επίπεδα μετά από εξάντληση του Nek11S σε WT, αλλά όχι ρ53-ηυΙΙ κύτταρα. Ως εκ τούτου, αν και η σχετική αποτελεσματικότητα εξάντληση μπορεί να ποικίλει, τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι τουλάχιστον Nek11S διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση προκαλούμενη βλάβη του DNA G2 /M σύλληψης σε κύτταρα HCT116, επιβεβαιώνοντας ότι αυτή η απόκριση είναι μερικώς ρ53-εξαρτώμενη.

AL. Χρησιμοποιώντας τα πρωτόκολλα που περιγράφονται στο Σχήμα 1Α για ακτινοβόληση και σχήμα 3Α για θεραπεία με ιρινοτεκάνη, HCT116 WT (AC, GI) και τα κύτταρα HCT116 ρ53-ηυΙΙ (DF, JL) επιμολύνθηκαν με siRNA ολιγονουκλεοτίδια να συν-καταστρέφουν Nek11L και Nek11D (L /D ), ή καταστρέφουν Nek11S ή λουσιφεράσης (siGL2). Ιστογράμματα δείχνουν το ποσοστό των κυττάρων ποδηλασία σε G2 /M (Α-Ρ) και του συνόλου των κυττάρων με υπο-2n DNA (G-L).

σ

τιμές είναι σχετικές με siGL2 για κάθε θεραπεία.

Η

Από την εξέταση του υπο-2n πληθυσμού μέσω κυτταρομετρίας ροής PI-based αποκάλυψε ότι η εξάντληση των Nek11S, αλλά δεν Nek11L /D, είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση στον κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα HCT116 WT εκτέθηκαν σε IR ή ιρινοτεκάνη (Σχήμα 6G-6θ). Η εξάντληση των Nek11S, αλλά όχι Nek11L /D, οδήγησε επίσης σε σημαντικά επίπεδα κυτταρικού θανάτου σε ρ53-ηυΙΙ κύτταρα εκτίθενται σε IR ή ιρινοτεκάνη (Σχ 6J-6L). Αυτό το τελευταίο αποτέλεσμα ήταν μη αναμενόμενο δεδομένης της προηγούμενες παρατηρήσεις ότι ο θάνατος κυττάρου σε Nek11-εξαντλημένα κύτταρα που εκτίθενται σε αυτές τις θεραπείες είναι ρ53-εξαρτώμενη. Ωστόσο, η εξάντληση των Nek11S οδήγησε επίσης σε σημαντική αύξηση του κυτταρικού θανάτου σε περίπτωση απουσίας του γενοτοξική θεραπείας σε p53-null κύτταρα που υποδηλώνει ότι αυτό δεν ήταν μια συγκεκριμένη απάντηση σε εξωγενή βλάβη του DNA.

Συζήτηση

Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν ότι η δραστικότητα κινάσης του Nek11 διεγείρεται σε κύτταρα HeLa που εκτίθενται σε παράγοντες βλάβης του DNA και τους αναστολείς αντιγραφής [9]. Επιπλέον, Nek11 ταυτοποιήθηκε σε μια οθόνη για τα γονίδια που απαιτούνται για την G2 /M σύλληψης σε κύτταρα που εκτίθενται σε U2OS IR, με Nek11 προώθηση αποδόμηση cdc25A κατάντη της Chk1 [7]. Εδώ, δείχνουμε ότι η απώλεια του Nek11 καταργεί G2 /M σύλληψης και μειώνει την επιβίωση των κυττάρων σε κύτταρα HCT116 CRC εκτεθεί είτε IR ή χημειοθεραπευτικού παράγοντα, ιρινοτεκάνη. Επιπλέον, δείχνουμε ότι Nek11 υφίσταται πυρηνοκυτταροπλασματικής παλινδρόμηση με τρόπο που θυμίζει άλλες πρωτεΐνες ΑΑΕ. Αυτές οι ιδέες παρέχουν περαιτέρω ενδείξεις ότι Nek11 είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής του G2 /M DNA ανταπόκριση των ζημιών καθώς και να απαιτείται για την επιβίωση των κυττάρων CRC.

Τα φυσιολογικά κύτταρα εκτίθενται σε σύλληψη βλάβες του DNA κυρίως στην G1 /S μετάβαση . Ωστόσο, αυτή η οδοφράγματος είναι συχνά λείπει από τα καρκινικά κύτταρα που έχουν χάσει είτε p53 ή Rb. Αυτά τα κύτταρα είναι επομένως περισσότερο βαθμό από τα G2 /M σημείο ελέγχου όταν εκτίθενται σε παράγοντες βλάβης του DNA. Οι μελέτες μας αποκάλυψαν ότι ενώ η έκθεση των HCT116 κυττάρων τόσο IR και ιρινοτεκάνη οδήγησε σε σημαντική αύξηση του G2 Μ κλάσμα /, συνάδει με την ενεργοποίηση του G2 /M σημείο ελέγχου, το κλάσμα αυτό μειώθηκε σημαντικά μετά την αφαίρεση των Nek11. Στα κύτταρα WT, εξάντληση Nek11 μείωσε το G2 /M κλάσμα προς το επίπεδο αναφοράς που υπάρχει σε ένα πληθυσμό ποδηλασίας υποστηρίζουν έναν πιθανό ρόλο για Nek11 στην G2 /M σημείο ελέγχου σε κύτταρα HCT116. Ωστόσο, στις ρ53-ηυΙΙ κύτταρα, το G2 /M κλάσμα, αν και σημαντικά μειωμένη, παρέμεινε πάνω από την αρχική τιμή. Αυτό υποδηλώνει ότι Nek11 επιβάλλει όχι μόνο μια ανεξάρτητη της ρ53 G2 /M σύλληψης μετά από βλάβη του DNA, αλλά, επιπλέον, εμποδίζει ρ53-εξαρτώμενη απώλεια G2 κύτταρα /M (σχήμα 7).

Αυτό το σχηματικό μοντέλο απεικονίζει την προτείνει ρόλους Nek11 στην απόκριση των κυττάρων CRC σε παράγοντες οι οποίοι διαταράσσουν την ακεραιότητα του DNA είτε μέσω της άμεσης βλάβης του DNA ή στασιμότητα αντιγραφή. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι Nek11 βρίσκεται κατάντη του ATM /ATR και Chk1 και δρα για την πρόληψη μιτωτική πρόοδο μέσω της προώθησης της υποβάθμισης της cdc25A. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ότι σε κύτταρα CRC, Nek11 απαιτείται όχι μόνο να εξασφαλιστεί G2 /M σύλληψης, αλλά και για την προστασία έναντι ρ53-εξαρτώμενη απόπτωση. Αποτυχία του G2 /M σημείο ελέγχου μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο σε ένα ρ53-ανεξάρτητο τρόπο εν μέρει μέσω μιτωτικής καταστροφής.

Η

Σύμφωνα με αυτό, παρατηρήσαμε μία μέτρια αύξηση στον αριθμό των κυττάρων στην υπο -2Ν κλάσμα, ενδεικτικό της θνήσκοντα κύτταρα, στα Nek11-εξαντλημένο WT κύτταρα εκτίθενται σε IR ή ιρινοτεκάνης που δεν παρατηρήθηκε με τα ρ53-ηυΙΙ κύτταρα. Παρομοίως, ειδική ανάλυση του αποπτωτικού κλάσματος με δοκιμασία αννεξίνης V αποκάλυψε ότι ένα μικρό κλάσμα του Nek11 εξαντλημένο WT, αλλά όχι p53-null, κύτταρα που εκτέθηκαν σε IR ή ιρινοτεκάνη τέθηκε απόπτωση. Ως εκ τούτου, σε περίπτωση απουσίας του Nek11, μερικά κύτταρα HCT116 εκτέθηκαν σε εξωγενή βλάβη του DNA υποβάλλονται σε ρ53-εξαρτώμενη απόπτωση, ενώ άλλα πιθανώς εισέλθει εκ νέου στον κυτταρικό κύκλο σε ρ53-ανεξάρτητο τρόπο. Λόγω της παρουσίας του επιδιορθώθηκε DNA, η πιθανότητα είναι ότι αυτά τα τελευταία κύτταρα εισάγετε μια παρεκκλίνουσα μίτωση που προωθεί περαιτέρω γενετικές βλάβες που οδηγούν σε θάνατο, είτε σε μίτωση ή κατά τη διάρκεια της μετέπειτα εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου.

Όταν μακροπρόθεσμες απαντήσεις επιβίωση ήταν B & amp?