Αφηρημένο

Κανονισμός της γονιδιακής έκφρασης είναι ένα από τα πολλά ρόλους που προτείνονται για το στρες που προκαλείται από νουκλεοτίδιο diadenosine τετραφωσφορικό ( ap

4Α). Εξετάσαμε αυτό απ ‘ευθείας από μια συγκριτική RNA-Seq ανάλυση του KBM-7 κύτταρα χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας και κυττάρων ΚΒΜ-7 στην οποία το

NUDT2

Ap

γονίδιο 4Α υδρολάσης είχε διακοπεί (κύτταρα NuKO), προκαλώντας μια αύξηση 175-φορές στην ενδοκυτταρική Ap

4Α. 6288 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια εντοπίστηκαν με

P

& lt? 0.05. Από αυτά, 980 ήταν μέχρι ρυθμιζόμενα και 705 κάτω-ρυθμίζονται σε κύτταρα NuKO με πολλαπλή μεταβολή ≥ 2. Ingenuity

® Διαδρομή Ανάλυση (IPA

®) για να εκχωρήσετε αυτά τα γονίδια σε γνωστές κανονικών μονοπατιών και λειτουργική δικτύων. Πορείες που σχετίζονται με τις αποκρίσεις της ιντερφερόνης, υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων και φλεγμονή σημειωθούν ιδιαίτερα στην κάτω ρυθμισμένα σύνολο γονιδίων ενώ λειτουργίες που συνδέονται με αντιγόνα MHC τάξης II ήταν η σημαντικότερη από τις up-ρυθμιζόμενα γονίδια, τα οποία διαφορετικά έδειξε μικρή οργάνωση σε σοβαρές λειτουργικές σειρές γονιδίων. Η τρυπτοφάνη καταβολισμός επίσης έντονα κάτω ρύθμισης ως ήταν πολυάριθμα γονίδια είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε προαγωγή όγκων σε άλλα συστήματα, με ρόλους στην επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση, τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετάσταση. Αντιστρόφως, ορισμένα προ-αποπτωτικά γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω. Σημαντικές ανάντη παράγοντες προβλέπεται από το IPA

® για τη γονιδιακή ρύθμιση προς τα κάτω που περιλαμβάνονται NFκB, STAT1 /2, IRF3 /4 και το SP1 αλλά δεν έχουμε μεγάλες παράγοντες που ελέγχουν την γονιδιακή ρύθμιση προς τα πάνω εντοπίστηκαν. Οι πιθανοί μηχανισμοί για την ρύθμιση των γονιδίων που προκαλείται από Ap

4Α και /ή

NUDT2

διακοπή περιλαμβάνουν δέσμευση του Απ

4Α στην HINT1 συν-καταστολέα, αυτοκρινείς ενεργοποίηση πουρινοϋποδοχέων από Ap

4Α, χρωματίνης αναδιαμόρφωση, επιπτώσεις της απώλειας NUDT2 στη σταθερότητα μεταγραφής, και η αναστολή της ΑΤΡ-εξαρτώμενη ρυθμιστικούς παράγοντες όπως πρωτεϊνικές κινάσες από την ΑΡ

4Α. Υπάρχοντα στοιχεία ευνοεί τον τελευταίο από αυτά ως το πιο πιθανό μηχανισμό. Ανεξάρτητα, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η πρωτεΐνη NUDT2 μπορούσε να είναι ένας νέος στόχος καρκίνος χημειοθεραπευτικούς, με την αναστολή της εν δυνάμει ασκώντας ισχυρές επιδράσεις κατά του όγκου μέσω πολλαπλών οδών που περιλαμβάνουν μετάσταση, εισβολή, ανοσοκαταστολή και την απόπτωση

Παράθεση:. Marriott AS, Vasieva O, Fang Υ, Copeland NA, McLennan AG, Jones NJ (2016)

NUDT2

Διακοπής Ανυψώνει Diadenosine τετραφωσφορεστέρα (ΑΠ

4Α) και γονίδια που ρυθμίζει προς τα κάτω ανοσολογική απάντηση και Καρκίνου Προώθηση. PLoS ONE 11 (5): e0154674. doi: 10.1371 /journal.pone.0154674

Επιμέλεια: Francisco J. Esteban, Πανεπιστήμιο της Χαέν, Ισπανία

Ελήφθη: ένατης Δεκεμβρίου 2015? Αποδεκτές: 18 του Απρίλη 2016? Δημοσιεύθηκε: 4η Μαΐου, 2016

Copyright: © 2016 Marriott et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η ανέλυσε τα στοιχεία που βρίσκονται εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. Επιπλέον, όλα τα αρχεία δεδομένων είναι διαθέσιμα από το ArrayExpress (αριθμός ένταξης E-mtab-4104) της βάσης δεδομένων

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το North West Cancer Research (https://www.nwcr.org) χορηγούν αριθμούς CR968 με AGM, NJJ και NAC? CR891 για να NAC? και τον αριθμό NWCR ερευνητική υποτροφία BR879 για να NAC (www.nwcr.org). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Nudix υδρολάσες ρυθμίζουν τα επίπεδα μιας ευρείας ποικιλίας των κανονικών και τροποποιημένων νουκλεοτιδίων και ορισμένες μη νουκλεοτιδικών φωσφορυλιωμένη υποστρώματα καθώς συμμετέχουν σε βασικές διαδικασίες όπως mRNA εκπωμάτιση [1, 2]. Ένα από τα καλύτερα μελετημένα είναι NUDT2 θηλαστικών. Το ένζυμο αυτό έχει απομονωθεί από πολλές πηγές [3, 4] και κύριο υπόστρωμα της πιστεύεται ότι είναι diadenosine 5 ‘, 5’ » –

P

1,

P

4-τετραφωσφορεστέρα (ΑΠ

4Α). Σε ζωικά κύτταρα, Ap

4Α μπορεί να συντεθεί από τα περισσότερα συνθετάσες αμινοακυλ-tRNA, λιγάσες DNA, λουσιφεράση πυγολαμπίδας και ακυλο-CoA συνθετάσες ενώ ένα ευρύτερο φάσμα των ενζύμων είναι σε θέση να το κάνει σε φυτά, μύκητες και βακτήρια [5-7 ]. Σύνθεση συνήθως περιλαμβάνει τη μεταφορά του ΑΜΡ από ακυλο-AMP ή αντίδραση ενζύμου-AMP ενδιάμεσο σε ένα ATP δέκτη. Μπορεί επίσης να αποικοδομούνται από έναν αριθμό ενζύμων επιπλέον προς NUDT2, συμπεριλαμβανομένων FHIT [8], aprataxin [9] και μη-ειδικής φωσφοδιεστερασών [3]. Ωστόσο, NUDT2 πιστεύεται ότι είναι κυρίως υπεύθυνη για τη διατήρηση του χαμηλού επιπέδου της ενδοκυτταρικής Απ

4Α [10-12].

Η αύξηση της ΑΠ

4Α που προκύπτουν από την ενεργοποίηση της σύνθεσης, η αναστολή της υποβάθμισης ή και τα δύο έχουν εμπλακεί σε αρκετές ενδοκυτταρικές διεργασίες. Γονοτοξικότητα, θερμικές και άλλες πιέσεις οδηγούν σε αυξημένη Ap

4Α [13-17] και έτσι Ap

4Α έχει ενοχοποιηθεί στη ρύθμιση της αντιγραφής του DNA μετά από βλάβη του DNA και στην προώθηση της απόπτωσης [17-19]. Ap

4Α μπορεί επίσης να αυξηθεί σε απάντηση στις εξωτερικές συνδέτες και θα λειτουργεί ως ενδοκυτταρικός δεύτερος αγγελιοφόρος [20-22]. Επίσης, λειτουργεί ως ένα εξωκυτταρικό αγγελιαφόρος μέσω της αλληλεπίδρασής της με έναν αριθμό υποδοχέων P2-τύπου [23]. Ap

4Α είναι επίσης ένας συνδέτης για έναν αριθμό πρωτεϊνών που περιλαμβάνει ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο που περιέχει DNA πολυμεράσης-α [24, 25], πρωτεΐνες κινάσες [26-28], ουρακίλη-ϋΝΑ γλυκοζυλάση [29], chaperones πρωτεΐνη [30] , ο καταστολέας όγκων HINT1 [31], 5′-νουκλεοτιδάση II [32], πρωτεΐνες τομέα CBS [33, 34] και CFIm25 [35], αλλά στις περισσότερες περιπτώσεις η σημασία αυτής της συνδέσεως δεν είναι σαφής. Ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, ωστόσο, είναι η πιθανότητα ότι Ap

4Α μπορεί να δρα ως μεταγραφικός ρυθμιστής. Έχει προταθεί ότι ένα αυξημένο επίπεδο της ΑΠ

4Α επάγεται σε μαστοκύτταρα από εξωτερικούς παράγοντες ενεργοποιεί την έκφραση ενός υποσυνόλου γονιδίων ελέγχεται από τους παράγοντες MITF και USF2 μεταγραφή με σύνδεση προς και εκτοπίζοντας την ανασταλτική πρωτεΐνη HINT1 από αυτούς τους παράγοντες [ ,,,0],10, 31, 36].

για να καθοριστεί αν μεταγραφική ρύθμιση από Ap

4Α περιορίζεται σε σχετικά λίγα γονίδια ή είναι περισσότερο διαδεδομένη, έχουμε αναλύσει τον μεταγραφικό ενός παραγώγου νοκ-άουτ του KBM- 7 χρόνια μυελοειδή λευχαιμία κυττάρων (CML) γραμμή [37] στην οποία το ενδοκυτταρικό ποσοστό της ΑΠ

4Α έχει αυξηθεί 175 φορές με διάσπαση του

NUDT2

γονίδιο (ΚΒΜ-7-NuKO, αναφέρεται εφεξής ως NuKO). Αυτά τα κύτταρα παρουσιάζουν βαθιές αλλαγές στην έκφραση του γονιδίου σε σύγκριση με το μητρικό KBM-7 κυτταρική γραμμή με συνολικά 6288 σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια (βαθμούς με) προσδιορίζονται. Εφευρετικότητα

® Διαδρομή Ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να τονίσει τα δίκτυα γονιδίων και μεταβολικών και οδών σηματοδότησης που επηρεάζονται, αποκαλύπτοντας τα κάτω ρύθμιση της ιντερφερόνης, φλεγμονώδεις και έμφυτο ανοσοποιητικό απαντήσεις και up-ρύθμιση των διαδικασιών που αφορούν MHC τάξης ΙΙ αντιγόνων. Επιπλέον, πολλές από τις πιο έντονα επηρεαστεί γονίδια έχουν ρόλους στην προώθηση μετάσταση και εισβολή καρκίνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι NUDT2 μπορεί να προσφέρει μία νέα, πλειοτροπική στόχος για τη χημειοθεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells

το KBM-7 αναφοράς κλώνος Β (προϊόν αρ. P00174E07) και το παράγωγο KBM-7-NuKO (P01289H04), στην οποία το

NUDT2

γονίδιο έχει αδρανοποιηθεί με ρετροϊικό εισαγωγή του γονιδίου-παγίδα [ ,,,0],38] ελήφθησαν από Haplogen και διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% (ν /ν) CO

2 /αέρα στο Isocoves τροποποιημένο μέσο Eagle (ΙΜΕΜ, Sigma) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) Εμβρυϊκό Βόειο ορό ( Sigma), 2 mM L-γλουταμίνη (Sigma) και 100 μg mL

-1 πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (Sigma).

Μέτρηση της ΑΠ

4Α και παράγωγα

Το επίπεδο ενδοκυτταρικών Ap

4Α σε ΚΒΜ-7 και NuKO κύτταρα λογαριθμικής φάσης προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως χρησιμοποιώντας μία ευαίσθητη δοκιμασία λουμινομετρικές με ελαφρές τροποποιήσεις για χρήση με κύτταρα εναιώρημα [17, 39]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν από εναιώρημα με φυγοκέντρηση στις 500

g

για 5 λεπτά και χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση νουκλεοτιδίων. Ap

4Α μετρήθηκε επίσης στο υπερκείμενο μέσο ανάπτυξης από αυτά τα κύτταρα, το οποίο διηθήθηκε μέσω ενός φίλτρου 0,2 μm Millipore, αποπρωτεϊνωμένο με 10% TCA και στη συνέχεια αναλύθηκαν ως ανωτέρω. ADP-ριβοσυλιωμένων παράγωγα Ap

4Α (ADPR-Ap

4Α) διαχωρίστηκαν με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής και προσδιορίζονται και προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17].

αναλύσεις αναστολής της ανάπτυξης

τα κύτταρα (2 χ 10

5) σπάρθηκαν σε 25 cm

2 φιάλες που περιέχουν 7 mL μέσου ανάπτυξης. Προστέθηκαν Χημικοί παράγοντες όπως δηλώνεται και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 96 ώρες στους 37 ° C μετά το οποίο οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 500

g

για 5 λεπτά, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο, ​​και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αιμοκυτταρόμετρο. Μέσες μετρήσεις κανονικοποιήθηκαν προς το πλήθος των κυττάρων του μη επεξεργασμένου καλλιέργειας

RNA-Seq ανάλυση:. CDNA βιβλιοθήκη προετοιμασία και αλληλούχιση

Τρία ανεξάρτητα δείγματα ολικού RNA παρασκευάστηκαν από τόσο ΚΒΜ-7 και NuKO κύτταρα. Εκχύλιση RNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα κιτ Qiagen RNeasy μίνι με QIAshredder, και η ποσότητα και η ποιότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν Nanodrop και Agilent Bioanalyzer. Για καθεμία από τις έξι δείγματα, 10 μg RNA ήταν ϋΝάση χρησιμοποιώντας ένα Ambion TURBO DNA-

δωρεάν download ™ κιτ και στη συνέχεια καθαρίζεται χρησιμοποιώντας σφαιρίδια AMPure XP. 2 μg του επεξεργασμένου με ϋΝάση ολικού RNA στη συνέχεια υποβλήθηκε σε εξάντληση rRNA χρησιμοποιώντας το ριβο-Zero Gold (ανθρώπου /ποντικού /αρουραίο) κιτ και καθαρίστηκαν πάλι με χάντρες Ampure XP. Επιτυχής εξάντληση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας φθορόμετρο qubit και Agilent 2100 Bioanalyzer και όλο το απεμπλουτισμένο RNA χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή της βιβλιοθήκης RNA-Seq χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο v2 ScriptSeq. Μετά από 15 κύκλους ενίσχυσης οι βιβλιοθήκες καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας σφαιρίδια Ampure XP. Κάθε βιβλιοθήκη ποσοτικά με τη χρήση qubit και αξιολογείται η κατανομή του μεγέθους χρησιμοποιώντας την Agilent 2100 Bioanalyzer. Οι τελικές βιβλιοθήκες συνενώθηκαν σε ισομοριακές ποσότητες χρησιμοποιώντας τα δεδομένα qubit και Bioanalyzer. Η ποσότητα και η ποιότητα της κάθε πισίνας εκτιμήθηκε με την Bioanalyzer και με qPCR χρησιμοποιώντας το κιτ ΚΑΠΑ Βιβλιοθήκη Ποσοτικοποίηση για Illumina πλατφόρμες για μια Roche LC480II Light Cycler σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η μήτρα DNA μετουσιώθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται στον οδηγό χρήσης Illumina CBOT και φορτώνονται σε συγκέντρωση 21:00. Αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε σε μία λωρίδα της Illumina HiSeq 2000 με την έκδοση 3 χημεία παραγωγή 2 × 100 bp σε συνδυασμό τέλος διαβάζει. ποιοτικού ελέγχου διατηρήθηκε με 1% PhiX ακίδα-in.

βιοπληροφορική ανάλυση του RNA-Seq δεδομένων

Basecalling και de-πολυπλεξίας των δεικτών έχει ως εξής για κάθε βιβλιοθήκη δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση CASAVA 1.8. 2 (Illumina). Raw αρχεία fastq υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας Cutadapt 1.2.1 [40] με την επιλογή «-Ο 3» που να αφαιρέσει τις αλληλουχίες προσαρμογέα από 3 bp ή περισσότερο. Διαβάζει περαιτέρω στολισμένα με χρήση Δρεπανοκυτταρική 1.200 για να αφαιρέσετε χαμηλής ποιότητας βάσεις και τελικά διαβάζει & lt? 10 bp αφαιρέθηκαν. Η TopHat2 aligner έκδοση 2.0.10 [41] χρησιμοποιήθηκε για να ευθυγραμμιστεί η στολισμένα R1-R2 διαβάσετε ζεύγη στο συγκρότημα του ανθρώπινου γονιδιώματος αναφοράς GRCh38, το οποίο περιέχει 64.253 γονίδια. Προεπιλεγμένες παράμετροι χρησιμοποιήθηκαν εκτός από την επιλογή του τύπου βιβλιοθήκη, η οποία είχε οριστεί σε «FR-secondstrand» για όλα τα δείγματα, όπως το κιτ που χρησιμοποιείται παράγεται ένα δεύτερο σκέλος τύπου βιβλιοθήκης (R1 αναμένεται να χαρτογραφήσει στο σκέλος 5 ‘→ 3’ και R2 σχετικά με την 3 ‘→ 5’ κλώνου). Διαβάζει την ευθυγράμμιση με την αναφορά σε περισσότερες από μία θέσεις απορρίφθηκαν και οι τιμές FKPM (τεμάχια ανά kilobase μεταγραφή ανά εκατομμύριο διαβάζει χαρτογραφηθεί) υπολογίζεται. ανάλυση γονιδιακής έκφρασης Διαφορική διεξήχθη στο περιβάλλον R χρησιμοποιώντας το πακέτο Edger [42]. Τα δεδομένα μέτρησης ομαλοποιήθηκαν σε όλη βιβλιοθήκες χρησιμοποιώντας τα τεμαχισμένα Μέση M-τιμές μέθοδο (TMM) σε Edger με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους. παράμετροι διασποράς Tagwise εκτιμήθηκαν και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για τον log

2ΕΜ (log

2 φορές αλλαγή) την εκτίμηση και τον έλεγχο σε Edger με τη χρήση του λόγου πιθανοφάνειας (τεστ LR) [43].

P

αξίες που σχετίζονται με log

2ΕΜ προσαρμόστηκαν για πολλαπλές δοκιμές με τη χρήση του Discovery Rate (FDR) προσέγγιση Λάθος [44]. Σημαντικές βαθμούς με ορίστηκαν ως αυτά με FDR προσαρμοσμένο

P

αξία & lt? 0.05. Όλα τα αρχικά δεδομένα RNA-Seq που παράγεται σε αυτή τη μελέτη έχουν υποβληθεί στη βάση δεδομένων EMBL-EBI ArrayExpress υπό τον αριθμό πρόσβασης E-mtab-4104.

RT-PCR ανάλυση των επιλεγμένων γονιδίων

εκχύλιση RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Qiagen RNeasy μίνι με QIAshredder και cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ σύνθεσης cDNA Bioline Tetro, τόσο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το cDNA στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας Maxima SYBR Green κύριο μείγμα (Thermo) και ένα σύστημα Real Time PCR StepOnePlus ™ (Applied Biosystems). Οι εκκινητές ελήφθησαν από τη Sigma και παρατίθενται στον Πίνακα S1. Η 2

-ΔΔCt μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων μεταγραφής χρησιμοποιώντας το γονίδιο καθαριότητας GAPDH για την ομαλοποίηση των δεδομένων [45].

Διαδρομή ανάλυση

Τα γονίδια που δείχνει ≥ 2 φορές σε απότομη ανωφέρεια ή προς τα κάτω ρύθμιση με FDR προσαρμοσμένο

P

αξία & lt? 0.05 αναλύθηκαν με τη χρήση του QIAGEN Ingenuity

® λογισμικό Διαδρομή Ανάλυση (IPA

®, QIAGEN, Redwood City, https://www.ingenuity.com) με σκοπό να τους τοποθετεί σε διαφορετικά λειτουργικά δίκτυα. IPA

® χρησιμοποιεί το με το χέρι σε επιμέλεια της Γνωσιακής Βάσης της Ingenuity®, το οποίο περιέχει πληροφορίες από διάφορες γονίδιο και την έκφραση της πρωτεΐνης, την αλληλεπίδραση και τις βάσεις δεδομένων σχολιασμού όπως άθικτο, δεσμεύουν και MIPS, καθώς και από τη δημοσιευμένη βιβλιογραφία [46]. Χρησιμοποιήσαμε επίσης ΙΡΑ για τον εντοπισμό λειτουργικά συνδεδεμένα γονίδια που αντιστοιχούν σε συγκεκριμένες κανονικών μονοπατιών που ήταν πιο σημαντικές με τα στοιχεία που από μια συλλογή 200 επιμελήθηκε μεταβολικών, κύτταρο καταρράκτη σηματοδότησης και την ασθένεια που σχετίζεται με οδούς. ακριβής δοκιμασία του Fisher της ανεξαρτησίας χρησιμοποιήθηκε για να υπολογίσει την πιθανότητα ότι η σχέση μεταξύ των γονιδίων στο σύνολο δεδομένων και την κανονική πορεία μπορεί να εξηγηθεί μόνο από την τύχη. Τέλος, χρησιμοποιήσαμε την ανάντη ανάλυση ρυθμιστή ΙΡΑ να εντοπιστούν οι παράγοντες που μπορεί να ελέγχει τα γονίδια και τα μονοπάτια τονίζεται από την ανάλυση του δικτύου για την παροχή ελέγξιμες υποθέσεις για τη ρύθμιση της γονιδιακής από Ap

4Α.

Αποτελέσματα

επίπεδο Απ

4Α στο KBM-7-NuKO κύτταρα

Η μητρική KBM-7 γραμμή χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή περιέχει το

BCR-ABL1

γονίδιο σύντηξης και πιθανώς την αδρανοποίηση μεταλλάξεις στο

TP53

και

Notch1

, αλλά στερείται τα άλλα κοινές γενετικές ανωμαλίες που βρέθηκαν σε μυελοειδή κακοήθειες [38]. Εκφράζει την πλειοψηφία των σχολιασμένη πρωτεϊνών από ένα ευρύ φάσμα των οδών σηματοδότησης, καθιστώντας το κατάλληλο κυτταρική γραμμή για τη μελέτη αυτή. Η πλήρης απουσία NUDT2 πρωτεΐνης από το NuKO

NUDT2

συντριβέντων επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western (Σχήμα 1). Η σταθερή κατάσταση συγκέντρωσης της ενδοκυτταρικής Απ

4Α σε μη τεταμένη κύτταρα θηλαστικών είναι συνήθως στο εύρος 0.1-1.0 pmol /10

6 κύτταρα (0,05-0,5 μΜ), το ακριβές ποσό είναι το είδος και τον τύπο του κυττάρου εξαρτάται [17, 47]. Συνδεθείτε φάσης κύτταρα KBM-7 είχε ένα επίπεδο 0,21 ± 0,02 (

n

= 3) pmol /10

6 κύτταρα. Ωστόσο, το παράγωγο NuKO είχε 175 φορές αυξημένο επίπεδο των 36,9 ± 0,3 (

n

= 3) pmol /10

6 κύτταρα, παρέχοντας τη σαφέστερη απόδειξη ακόμα ότι Ap

4Α είναι ένα σημαντικό NUDT2 υπόστρωμα

in vivo

και ότι αυτό το ένζυμο παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση του χαμηλού επιπέδου φόντο Απ

4Α. Σημειώστε ότι η περιεκτικότητα σε Ap

4Α του /10

6 κύτταρα 1 pmol ισοδυναμεί χονδρικά σε ενδοκυτταρική συγκέντρωση 0,5 μΜ και αν κατανέμονται ομοιόμορφα [17], έτσι ώστε το επίπεδο στα κύτταρα NuKO θα είναι περίπου 20 μΜ. Όσον αφορά το αν αυτό το υψηλό επίπεδο και οι προκύπτουσες αλλαγές στα κύτταρα που αναφέρονται εδώ είναι βιολογικά σχετικές, έχουμε μετρήσει στο παρελθόν έως 20 μΜ Ap

4Α στα κύτταρα επισκευή ελαττωματικών DNA που έλαβαν θεραπεία με μιτομυκίνη C [17], ενώ η συγκέντρωση όσο πιο ψηλά 775 μΜ έχει αναφερθεί σε FcεR1-ενεργοποιημένα μαστοκύτταρα [31]. Η χρωματογραφική ανάλυση του ΑΡ

4Α από κύτταρα NuKO έδειξε ότι περίπου το 35% ήταν παρούσα με τη μορφή του ADP-ριβοσυλιωμένων παραγώγων (ADPR-Ap

4Α), κυρίως μονο-ADPR-Ap

4Α (Εικόνα 1 ). Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η ADP-ριβοσυλίωση του Ap

4Α με PARP1 και PARP2 σε Κινεζικού χάμστερ κύτταρα EM9 και ινοβλάστες εμβρύου ποντικού συμβαίνει σε απόκριση σε βλάβη του DNA [17]? Ωστόσο, φαίνεται ότι το υψηλό επίπεδο της ΑΠ

4Α εδώ υπόκειται σε συστατική ADP-ριβοσυλίωση.

Ένα εκχύλισμα νουκλεοτιδίων από κύτταρα NuKO υποβλήθηκε σε χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής και τα κλάσματα προσδιορίστηκαν φωτομετρικά για Ap

4Α όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Ένθετο: ένα δείγμα της ανασυνδυασμένης NUDT2 και εκχυλίσματα πρωτεΐνης του ΚΒΜ-7 και ΚΒΜ-7 NuKO κύτταρα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και επακόλουθη στυπώματα νιτροκυτταρίνης ανιχνεύτηκαν για την παρουσία NUDT2 με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-NUDT2 (Santa Cruz) που ακολουθείται από ανίχνευση με HRP-συζευγμένο IgG αίγας-αντι-κουνελιού και ECL οπτικοποίηση (ECL Επιλέξτε, GE Healthcare). Mouse β-ακτίνη ανιχνεύθηκε με συζευγμένο με HRP αίγας-αντι-ποντικού IgG (Santa Cruz).

Η

RNA-Seq και ανάλυση διαφορική γονιδιακή έκφραση

Ap

4Α έχει έχουν αναφερθεί ότι ενεργοποιούν την μεταγραφή των υποσυνόλων των γονιδίων που ελέγχονται από τους παράγοντες μεταγραφής MITF και USF2 [31, 36]. Στο πλαίσιο αυτό, και να διερευνήσει περαιτέρω το φαινότυπο των

NUDT2

νοκ-άουτ κύτταρα, θα πραγματοποιηθεί μια συγκριτική ανάλυση των transcriptomes του KBM-7 και κύτταρα NuKO από την RNA-Seq για τον εντοπισμό βαθμούς με. Ένας μέσος όρος 46,1 εκατομμύρια ζεύγη 100 bp ζεύγη-άκρο διαβάζει ανά δείγμα παρήχθησαν ότι ευθυγραμμίζεται με το ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς. Τα αποτελέσματα Ευθυγράμμιση συνοψίζονται στον Πίνακα 1, που δείχνει τον αριθμό και το ποσοστό των αναγνώσεις χαρτογραφηθεί για κάθε δείγμα. ποσοστά χαρτογράφηση για τα έξι δείγματα ήταν μεταξύ 80,2 και 81,3%. 31.177 (48,5%) των γονιδίων αναφοράς 64.253 είχαν τουλάχιστον ένα ανάγνωσης ευθυγραμμίζονται ενώ 33.076 γονίδια δεν είχε διαβάσει ευθυγραμμισμένη από οποιοδήποτε από τα έξι δείγματα.

Η

Η διαφορά στο προφίλ της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων απεικονίζεται στο Principal Component Analysis (PCA) οικόπεδο δεδομένων γονιδιακής έκφρασης log2 φαίνεται στο σχήμα 2Α. Οι τριπλές δείγματα κάθε τύπου κυττάρου ομαδοποιήθηκαν και μακριά το ένα από το άλλο, δείχνοντας ένα υψηλό βαθμό διαφορικής έκφρασης γονιδίων μεταξύ τους. Επιπλέον, η heatmap των συντελεστών συσχέτισης Pearson στο Σχ 2Β έδειξαν ότι τα προφίλ έκφρασης για τα τρία δείγματα από τον ίδιο τύπο κυττάρων ήταν πολύ πιο στενά συσχετιζόμενα από δείγματα από διαφορετικούς τύπους κυττάρων, δείχνοντας ότι η επίδραση του

NUDT2

νοκ-άουτ στη γονιδιακή έκφραση ήταν πολύ ισχυρότερη από την επίδραση τυχόν τεχνικών ή βιολογικών διαφορών μεταξύ των δειγμάτων. Η θερμικός χάρτης δείχνει επίσης μια πολύ υψηλή συσχέτιση (R & gt? 0,99) μεταξύ δειγμάτων από τον ίδιο τύπο κυττάρων. Έτσι, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η διαφορική γονιδιακή έκφραση ανιχνεύεται εδώ είναι στατιστικά πολύ ισχυρή.

(A) PCA οικόπεδο δεδομένων γονιδιακής έκφρασης log2 δείχνει το 2

ου και 3

rd κύριες συνιστώσες. οπτικοποίηση (Β) Heatmap των συντελεστών συσχέτισης Pearson του

2 γονιδιακή έκφραση μεταξύ των δειγμάτων καταγραφής. Τα τρία δείγματα από κύτταρα άγριου τύπου ΚΒΜ-7 σημασμένο WT1-WT3 και εκείνων που προέρχονται από τα κύτταρα ΚΒΜ-7-NuKO ΚΟ1-ΚΟ3. (C) οικόπεδο MA δείχνει την κατανομή των μέσων επιπέδων γονιδιακής έκφρασης (log

2Counts Per Million χαρτογραφηθεί διαβάζει) έναντι log

2 Fold-Change (KO

vs

WT) για μεμονωμένες απαντήσεις γονίδιο. γονίδια χαμηλή έκφραση (log

2CPM & lt? -5) είναι χρωματισμένα με πορτοκαλί χρώμα. Σημαντικές διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (βαθμούς με) κόκκινο χρώμα? Τα γονίδια δείχνουν καμία μεταβολή στην έκφραση χρώματος μαύρου.

Η

Από το 31177 διαβάζει χαρτογραφηθεί (S2 Πίνακας) συνολικά 6288 βαθμούς με ταυτοποιήθηκαν με

P

-τιμή (FDR προσαρμοσμένο ) & lt? 0,05, εκ των οποίων 2.550 είχαν ρυθμιστεί μέχρι-και 2285 κάτω-ρυθμίζονται με ≥ φορές αλλαγή 1.2 (Σχήμα 2C και S3 πίνακα). Το οικόπεδο ΜΑ στο Σχήμα 2C δείχνει ένα αρκετά συμμετρική κατανομή των πάνω και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια σε όλα τα επίπεδα της έκφρασης. Από αυτά τα γονίδια, 980 ήταν επάνω ρυθμισμένη και 705 ρυθμισμένα προς τα κάτω με μια πολλαπλή μεταβολή ≥ 2. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, το 88% είχε FPKM ≥ 0,3 για ένα ή δύο από τα σύνολα δεδομένων WT και ΚΟ. Το 40 υποβαθμίσουν τα πιο έντονα και up-ρυθμιζόμενης είναι σχολιασμένο γονίδια παρουσιάζονται στους Πίνακες 2 και 3 αντίστοιχα. Σημειώστε ότι πολλά από αυτά τα γονίδια είχαν μηδενικές μετρήσεις ανάγνωση είτε για τα σύνολα δεδομένων WT ή ΚΟ αναγκαία την προσθήκη ενός μικρού μηδενικό offset pseudocount από το λογισμικό Edger, προκειμένου να υπολογίσει ημερολόγιο

2ΕΜ [42].

Η

Η ανάλυση RNA-Seq είχε επικυρωθεί από την εκτέλεση σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR σε μια επιλογή των γονιδίων που εκπροσωπούν διάφορες πληγείσες μονοπάτια (Σχήμα 3). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την κατεύθυνση της ρύθμισης (πάνω ή κάτω) για όλα τα γονίδια που μελετήθηκαν. Το μέγεθος της αλλαγής ήταν επίσης παρόμοια για την πλειοψηφία των γονιδίων, με συντελεστή συσχέτισης 0,83 μεταξύ των δύο συνόλων δεδομένων (Σχήμα 3, ένθετο). Ωστόσο, για ορισμένα γονίδια με μηδενική τιμή του FPKM για ένα από τα δείγματα στην ανάλυση RNA-Seq, η χρήση της μεθόδου pseudocount με Edger να υπολογίσει μια πολλαπλή μεταβολή οδήγησε σε σημαντικά διαφορετική τιμή, π.χ.

GFRA1

και

TNF

. Παρ ‘όλα αυτά, οι τιμές υπολογίζονται με Edger χρησιμοποιείται στις ακόλουθες συζητήσεις, δεδομένου ότι διατίθενται για όλα τα γονίδια και είναι ακόμα μια καλή σχετική ένδειξη της μεταβολής της έκφρασης. Για να δειχθεί ότι η διαφορική γονιδιακή έκφραση παρατηρούμενη συσχετίζεται μόνο με αυξημένη Ap

4Α αντί των σχετικών ADPR-Ap

παράγωγα 4Α, ανάλυση qRT-PCR πραγματοποιήθηκε επίσης με RNA που εκχυλίζεται από κύτταρα NuKO αναπτύχθηκαν παρουσία του 100 ηΜ KU-0058948, ένας αναστολέας PARP1 και PARP2 που εμποδίζει τη σύνθεση του ADPR-Ap

είδη 4Α [17]. Τα αποτελέσματα ήταν πολύ παρόμοια με εκείνα που ελήφθησαν με την απουσία του KU-0058948 (Σχήμα 3), δείχνοντας ότι για αυτά τα γονίδια τουλάχιστον, ADPR-Ap

4Α δεν είναι η αιτία της διαφορικής έκφρασης. Η λειτουργία του ADPR-Ap

4Α, εάν υπάρχουν, είναι ακόμα ασαφής.

ανάλυση qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε επιλεγμένα RNAs από ΚΒΜ-7 και κύτταρα NuKO υπό την παρουσία και απουσία 100 ηΜ του αναστολέας PARP KU-0058948 χρησιμοποιώντας τους εκκινητές που παρατίθενται στο S1 πίνακα όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι και το ημερολόγιο

2 πολλαπλή μεταβολή στην έκφραση χαράσσεται δίπλα εκείνα που λαμβάνονται από την ανάλυση του RNA-Seq. Ένθετο: απλό διάγραμμα συσχέτισης του ημερολογίου

2 φορές-αλλαγές στην έκφραση που λαμβάνονται από την RNA-Seq (

x

-άξονα) και qRT-PCR χωρίς αναστολέα PARP (

y-άξονα

).

Η

Ingenuity

® Διαδρομή Ανάλυση

για να τοποθετήσετε τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης σε ένα βιολογικό πλαίσιο, Ingenuity

® Διαδρομή Ανάλυση (IPA

® ) λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για να εκχωρήσετε τις βαθμούς με τη γνωστή κανονικών μονοπατιών και λειτουργικά δίκτυα, προκειμένου να προβλεφθούν οι βιολογικές λειτουργίες των μεταγραφικών αλλαγών. Για λόγους απλότητας, η αρχική ανάλυση περιλάμβανε μόνο τα γονίδια που ήταν πάνω ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται από ≥ 2 φορές (

P

& lt? 0,05)? Ωστόσο, σε περίπτωση που υπάρχει στα προκύπτουν οδούς και τα δίκτυα, τα γονίδια της επέκτασης ή υποβιβασμού ρυθμίζεται από ≥ 1,2 ήταν επίσης θεωρείται ότι είναι πιθανό ενδιαφέρον, καθώς δεν υπάρχει βιολογική αιτιολογία για ένα cut-off τιμή 2. Διαπιστώθηκε ότι οι βαθμούς με αντιστοιχίζονται με ένα μεγάλο αριθμό διόδων με σημαντικό αποτέλεσμα εμπλουτισμού (-log (

P

-τιμή)) (S4 πίνακα). Κορυφαία και στις δύο πάνω και κάτω-ρυθμίζονται σύνολα γονιδίων μονοπάτια που σχετίζονται με την ανοσία και τη φλεγμονή σηματοδότησης. Πορείες κατά κύριο λόγο συνδέονται με την έμφυτη ανοσοαπόκριση, όπως ενεργοποίηση της ιντερφερόνης ρυθμιστικών παραγόντων (ΔΠΧΑ) από τους υποδοχείς αναγνώριση προτύπων (PRRs), και η φλεγμονή ήταν ειδικά εμπλουτισμένο στο κάτω ρυθμισμένα σύνολο γονιδίων ενώ λειτουργίες που συνδέονται με αντιγόνα MHC τάξης II ήταν ειδικοί για το σύνολο των up-ρυθμισμένων γονιδίων (Πίνακας 4). Η επικράτηση αυτών των οδών στο σύνολο δεδομένων μπορεί να αντανακλά την μυελοειδή φύση της κυτταρικής σειράς KBM-7 [37]. Αυτά τα μονοπάτια συζητούνται λεπτομερώς παρακάτω.

Η

ανταπόκριση ιντερφερόνης και έμφυτη ανοσία.

Οι ιντερφερόνες είναι σημαντικοί μεσολαβητές της έμφυτη ανοσολογική αντίδραση, η οποία παρέχει μια αρχική ζωτικής σημασίας άμυνα κατά της εισβολής των παθογόνων (ιών , βακτήρια, πρωτόζωα) μετά από αλληλεπίδραση των συστατικών παθογόνου με PRRS σε διάφορα κυτταρικά διαμερίσματα. Μπορούν επίσης να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ρυθμίζουν την προσαρμοστική ανοσολογική απόκριση, και να είναι προ- ή αντι-φλεγμονώδη, ανάλογα με το πλαίσιο [48-51]. Υποβολή του συνόλου των 4.835 βαθμούς με αναδιπλούμενη αλλαγή ≥ 1.2 στη βάση δεδομένων Interferome (v2.01) [52] αποκάλυψε ένα υποσύνολο των τουλάχιστον 1.038 βαθμούς με γνωστό ότι ρυθμίζονται από τις τύπου Ι IFN (ΙΡΝα και ΙΡΝβ) σε άλλα συστήματα. Περίπου τα μισά από αυτά επικαλύπτονται με το σύνολο των 944 που δείχνει γνωστό ρύθμιση από Οι IFN τύπου ΙΙ (ΙΡΝγ). Κάποιοι (56) έδειξε επίσης ΙΙΙ (IFNλ) ρύθμιση Τύπος με 15 από αυτά τα δυνητικά μοναδικά στο Type III (S5 Πίνακας).

Το σχήμα 4 δείχνει το IPA

® κανονική πορεία για την ενεργοποίηση των υποδοχέων ιντερφερόνης (IFNRs ) με τύπου Ι και ιντερφερόνες τύπου II, με παραδείγματα των γονιδίων βρέθηκε να εκφράζεται διαφορικά σε αυτή τη μελέτη τονίζεται. Η πλειοψηφία των λειτουργιών σε αυτό το μονοπάτι ήταν κάτω-ρυθμίζονται, με την έκφραση του

IFNB

είναι το πιο επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό (15-φορές, S3 πίνακα). Οι οδοί σηματοδότησης JAK-STAT είναι κεντρικής σημασίας για την αντιμετώπιση της ιντερφερόνης. Σε Τύπος σηματοδότηση II ιντερφερόνη, ενεργοποιημένα ομοδιμερή STAT1 δεσμεύονται στο GAS (Ιντερφερόνη Γάμμα Activated Sequence) προαγωγό και επάγουν την έκφραση του γονιδίου, ενώ Τύπου Ι σηματοδότηση περιλαμβάνει το συνδυασμό του STAT1-STAT2 ετεροδιμερή με IRF9 (Ιντερφερόνη Response Factor 9) που σχηματίζει ISGF3 (Ιντερφερόνη εξαναγκασμένη Gene Factor), το οποίο στη συνέχεια συνδέεται προς τον προαγωγό ISRE (ιντερφερόνη Διεγειρόμενη Response Element).

STAT1

,

STAT2

και

IRF9

ήταν όλα κάτω-ρυθμίζονται (1.4-, 1.8- και 3,7 φορές αντίστοιχα), ενώ οι καταστολείς της οδού

SOCS1

και

PTPN2

ρυθμίζονταν up-(1,2-1,4 φορές). Αν και μεμονωμένα μικρή, η συνδυασμένη επίδραση των αλλαγών αυτών θα μπορούσε, ωστόσο, να είναι σημαντική. Οι αυξήσεις στο

SOCS1

και

PTPN2

δείχνουν επίσης ότι δεν υπάρχει μόνο μια γενική καταστολή της γονιδιακής έκφρασης, αλλά ότι η αρνητική ανάδραση μέσω αυτών των γονιδίων διατηρείται. Τέλος, αρκετές από τα γονίδια STAT ελεγχόμενες που ρυθμίζεται προς τα κάτω είναι οι ίδιοι ενεργοποιητές της περαιτέρω γονίδια απόκριση IFN, π.χ.

IRF1

,

IRF7

και

IRF9

(1.2-, 3.8- και 3,7 φορές αντίστοιχα).

Down-ρυθμιζόμενα γονίδια βρίσκονται στο πράσινο, up-ρυθμιζόμενα γονίδια με κόκκινο χρώμα. ένταση του χρώματος αντιστοιχεί στη στάνη αλλαγή? τολμηρή σύνορα αναδείξει γονίδια με & gt? αλλαγή 2 φορές στην έκφραση. Γραμμές αντιστοιχούν σε φυσικές αλληλεπιδράσεις και βέλη για λειτουργικές σχέσεις μεταξύ πρωτεϊνών. Συμπαγείς γραμμές και βέλη υποδηλώνουν άμεσες σχέσεις και διακεκομμένες γραμμές και βέλη υποδηλώνουν έμμεσων σχέσεων. Λειτουργικές σχέσεις περιλαμβάνουν μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, ρύθμιση της μεταγραφής, πρωτεόλυση ή συν-έκφρασης. Επίπεδη αιχμές βελών δείχνουν αναστολή.

Η

Η κανονική πορεία στο Σχήμα 5 καθορίζει τους ρόλους των τριών RIG-1-όπως PRRs ελικάση του έμφυτη ανοσολογική απόκριση, RIG-1 (DDX58), MDA5 (IFIH1) και LGP2 (DHX58) στην ενεργοποίηση του

IFNB

μετά από διέγερση από ιογενή δίκλωνο RNA και την ανατροφοδότηση που παρέχεται από ΙΡΝβ για την έκφραση αυτών των PRRS. Και τα τρία γονίδια υποδοχέων ρυθμίζονται προς τα κάτω (3.1-, 2.3- και 3,0-φορές, αντίστοιχα) (Πίνακας S3) σε κύτταρα NuKO. Επιπλέον,

IFITM2

και

IFITM3

, των οποίων τα προϊόντα περιορίζουν την είσοδο πολλών ιών [53], και τα τέσσερα αντι-ιική μέλη της οικογένειας iFit που συνδέουν ιογενείς εξαρτήματα (

IFIT1

,

2

,

3

και

5

) [54] είναι κάτω-ρυθμίζονται μεταξύ 1,6 και 6,8 φορές. Άλλες κάτω-ρυθμίζονται αντι-ιικών γονιδίων περιλαμβάνουν

PKR

,

GBP1

και

TLR10

[55-58] (S3 Πίνακας).

Επεξήγηση σύμβολα όπως στο σχήμα 4.

η

σηματοδότηση κυτοκίνης, φλεγμονή και NF-κΒ.

η ιντερλευκίνη-1 σηματοδότηση (IL-1) επισημαίνεται από το IPA

® ως μια κορυφαία ρυθμισμένα προς τα κάτω οδού (Πίνακας 4) με μειωμένη έκφραση σημαντικών προ-φλεγμονωδών μέλη της IL-1 υπεροικογένεια [59]. Για παράδειγμα, το mRNA για την IL-1β, υποδοχέα της IL-1R1 και βοηθητική πρωτεΐνη IL-1RAP μειώνονται 1,5-, 11.7- και 1,2 φορές αντίστοιχα, ενώ η IL-18, IL-18R1 και IL-18RAP είναι κάτω 2.3-, 3.0- και 4,0 φορές αντίστοιχα. Έκφραση των προφλεγμονωδών

IL32

μειώνεται επίσης 5-φορές, ενώ η έκφραση του Παράγοντα Νέκρωσης Ογκου (

TNF

ή

TNFα

), το οποίο μπορεί να ενεργοποιήσει τόσο τύπου Ι IFNs και η φλεγμονώδης μεσολαβητής ΝΡ-κΒ, ρυθμίζεται προς τα κάτω 30 φορές (S3 πίνακα). Η κανονική οδός που οδηγεί σε μεταγραφική ενεργοποίηση από NF-κΒ μέσω της IL-1, TNFa και άλλα προσδέματα φαίνεται στο Σχ συγκρότημα 6. Η ΝΡ-κΒ είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής των φλεγμονωδών και ανοσολογικών αποκρίσεων και ανταποκρίνεται σε PRRs και προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες [ ,,,0],60]. Μπορεί να συνεργούν με STAT σηματοδότησης με την αυξημένη επαγωγή των γονιδίων στόχων που προκύπτουν από το συντονισμό δέσμευσης των στατιστικά και NF-κΒ στο GAS και NF-κΒ υποστηρικτές. Οι p50 και p52 συστατικά του NF-κΒ συγκρότημα και το

RELB

μετενεργοποιητής όλα κάτω-ρυθμίζονται όπως και πολλά συστατικά οδών σηματοδότησης που οδηγούν στην ενεργοποίηση του NF-κΒ.

Η

είναι γνωστό ότι IFNs τύπου Ι και TNF μπορούν αμοιβαία να καταστείλει την έκφραση του άλλου, και έχει προταθεί ότι οι μεταβολές στην εγκάρσια ρύθμιση αυτών των οδών θα μπορούσε να επηρεάσει την ισορροπία μεταξύ των δυνητικών καταστροφικές και προστατευτικούς ρόλους αυτών των κυτοκινών στην παθογένεση των αυτοάνοσων φλεγμονώδεις ασθένειες όπως ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (SLE) και η ρευματοειδής αρθρίτιδα (RA) [61]. IPA

® προσδιορίζει σηματοδότησης σε RA ως κορυφαία πληγείσα κανονικό μονοπάτι (Πίνακας 4) και τον κατάλογο των βαθμούς με σχετίζεται με ΡΑ και ΣΕΛ παρουσιάζονται στον Πίνακα S6. Παρά το γεγονός ότι οι μικρές αλλαγές στην έκφραση σε κάποιες άλλες υποδοχείς κυτοκινών θα μπορούσε δυνητικά να είναι προ-φλεγμονώδη (π.χ.

IL10RA

και

IL23R

), η συνολική εικόνα είναι ένα από τα καταστολή της φλεγμονής από αυξημένα Απ

4Α, με τον προς τα κάτω ρύθμιση του NF-κΒ σηματοδότηση που χαρακτηρίζει έντονα.

κανονικών μονοπατιών επάνω ρυθμισμένη και αντιγόνα MHC τάξης II.

ΚΒΜ-7 κύτταρα μπορεί να θεωρηθεί ως ανώριμη πρόδρομοι στην επαγγελματική αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, όπως τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα και σχεδόν όλα τα κορυφαία 20 μέχρι ρυθμίζεται κανονικά μονοπάτια σημαία από το IPA

® περιλαμβάνει λειτουργίες που σχετίζονται με την προσαρμοστική ανοσολογική απάντηση, συμπεριλαμβανομένης της παρουσίασης του αντιγόνου, σηματοδότηση ΟΧ40, απόρριψη μοσχεύματος και ανάπτυξη Β κυττάρων (Πίνακας 4 και S4 πίνακα). Ωστόσο, θα πρέπει να τονισθεί ότι αυτή είναι σε μεγάλο βαθμό επειδή αυτές οι πορείες Όλες περιλαμβάνουν ένα από τα πιο γνωστά σύνολα γονιδίων πάνω ρυθμισμένα, οι επαγώγιμοι αντιγόνα MHC κατηγορίας II (ΜΗΟΙΙ). μόρια MHC-II ασχολούνται κυρίως με την παρουσίαση των αντιγόνων που προέρχονται από εξωκυτταρικά παθογόνα με αποτέλεσμα εκκίνηση βοηθητικών κυττάρων CD4 + Τ και την παραγωγή αντισωμάτων από Β κύτταρα [62]. Σχεδόν όλα τα κατηγορίας II γονίδια υποτύπου δείχνουν σημαντική αύξηση στην έκφραση, με μερικά δείχνει μια μεγάλη αύξηση, π.χ.

HLA-DOA

47 φορές και

HLA-DPA1

12 φορές. *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?