Αφηρημένο

Survivin είναι ένα συστατικό του συμπλέγματος χρωμοσωμικών επιβατών (CPC) που είναι απαραίτητη για την ακριβή διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων. Η παρεμβολή στην λειτουργία του Survivin σε μίτωσης οδηγεί σε σφάλματα διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και ελαττωματικά κυτοκίνηση. Survivin περιέχει ένα Επαναλάβετε Baculovirus ΙΑΡ (BIR) και ως εκ τούτου είχε αρχικά ταξινομηθεί ως αναστολέας της πρωτεΐνης απόπτωση (IAP), αλλά ο ρόλος του στην απόπτωση μετά από κυτταρικό στρες παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Έχουμε αποδείξει εδώ, ότι Σουρβιβίνης καταστέλλει κυρίως anoikis, μια μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που επάγεται από την απώλεια της κυτταρικής πρόσφυσης σε εξωκυτταρική μήτρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν εκτοπικά ΕΟΡΡ- Survivin έδειξε μετά την απώλεια της μήτρας-κυττάρων-αλληλεπίδραση μια μειωμένη έκφραση της ΙκΒ-α. Μετέπειτα πειράματα υποκυτταρικής κλασμάτωσης πρωτεϊνών και ανοσοκαταβύθιση αποκάλυψε ότι ΧΙΑΡ αλληλεπιδρά με απορρυπαντικό διαλυτά Σουρβιβίνης που είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί συνεργατικά ΝΡ-κΒ σηματοδότηση. Η εξέταση των επιπέδων έκφρασης του απορρυπαντικού διαλυτά Σουρβιβίνης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές και σε καρκινικούς ιστούς παχέος αποκάλυψε ότι απορρυπαντικό διαλυτό κυτταροπλασματικό επίπεδα Survivin συσχετίζεται αντίστροφα με anoikis επιδεκτικότητα σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Ως εκ τούτου, το απορρυπαντικό διαλυτό κυτταροπλασματικό Survivin μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη προγνωστική βιοδείκτης για λεμφαδένα και απομακρυσμένες μεταστάσεις του καρκίνου του παχέος εντέρου. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ένα αντι-αποπτωτική λειτουργία του απορρυπαντικού διαλυτά Σουρβιβίνης σε κύτταρα μεσόφασης που αντιμετωπίζουν anoikis διαμεσολαβείται τουλάχιστον μέσω ΧΙΑΡ /ΙκΒ-α /ΝΡ-κΒ σηματοδότηση

Παράθεση:. Hori Μ, Miki Τ, Okamoto Μ , Yazama F, Konishi Η, Kaneko H, et al. (2013) Το απορρυπαντικό-διαλυτό κυτταροπλασματικό πισίνα Σουρβιβίνης Καταστέλλει Anoikis και η έκφρασή της σχετίζεται με μεταστατική νόσο του Ανθρώπου καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (2): e55710. doi: 10.1371 /journal.pone.0055710

Επιμέλεια: Srinivasa Μ Srinivasula, IISER-TVM, Ινδία

Ελήφθη: 20 Ιούλ 2012? Αποδεκτές: 29, Δεκ 2012? Δημοσιεύθηκε: 6η Φεβρουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Hori et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (KAKENHI Νο 21591730 για Masaaki Tatsuka) και Νομαρχιακών Πανεπιστήμιο της Χιροσίμα (Σημαντικό ερευνητικό έργο, GAKUNAI Kyodo Kenkyu H-24 για Masaaki Tatsuka, Hiroaki Konishi, και Φούμιο Shimamoto), και Νομαρχιακό Πανεπιστήμιο της Χιροσίμα Graduate School Συνολικών Επιστημονικής Έρευνας για την Mayumi Okamoto και Guangying Qi (Ερευνητικός Συνεργάτης Grant H-24). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου, μεταστατικά κύτταρα αποσπώνται από γειτονικά κύτταρα του όγκου, αποκτούν κινητικότητα κυττάρου, εισβάλουν και να εισέλθουν στο λεμφικό σύστημα ή την κυκλοφορία του αίματος, να επιβιώσουν και να σχηματίσουν μεταστατικές βλάβες. Αυτά τα βήματα περιλαμβάνουν πολλά γονίδια και τα μονοπάτια, και όμως αυτές οι βιολογικές διεργασίες είναι ελάχιστα κατανοητή, παρά τις πολλές επιστημονικές προσεγγίσεις [1]. εξακολουθεί να απαιτείται η ταυτοποίηση των μεταστατικών όγκων μόρια στόχευσης για διαγνωστικές και θεραπευτικές διαδικασίες.

Survivin είναι ένα μέλος του συμπλέγματος πρωτεϊνών χρωμοσωμικές επιβατών (CPC) που αποτελεί βασικό ρυθμιστή της μίτωσης. Survivin και άλλα συστατικά CPC, Aurora-Β, εσωτερική πρωτεΐνη κεντρομερίδιο (INCENP), και Borealin (Dasra Β) είναι απαραίτητα για τις λειτουργίες CPC συμπεριλαμβανομένων των διορθώσεων σφαλμάτων συνημμένο κινητοχώρου και την ολοκλήρωση της κυτοκίνησης [2]. Survivin συμβάλλει στην μιτωτική εντοπισμό του CPC και έχει περιγραφεί για την ενίσχυση της δραστηριότητας της κινάσης Aurora-Β, όπως φαίνεται στο

Xenopus laevis

και

S. pombe

[3], [4]. Στις αρχές της μίτωσης, η φωσφορυλίωση ιστόνης Η3 στη θρεονίνη 3 διαμεσολαβείται από Haspin και επακόλουθη σύνδεση Σουρβιβίνης σε αυτήν την περιοχή είναι κρίσιμη για τη συναρμολόγηση CPC επί kinetochores [5], [6], [7].

Survivin είναι περιοδικά εξέφρασε κατά τη διάρκεια της κορύφωσης του κυτταρικού κύκλου στη μίτωση [8]. Previou μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση Σουρβιβίνης παρεμποδίζεται από ρ53, και απώλεια της λειτουργίας ρ53, η οποία συχνά παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα, αυξάνει τη μεταγραφή του [9], [10]. Πράγματι τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα που αναλύθηκαν μέχρι σήμερα πλειορύθμιση Σουρβιβίνης [11], [12], σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα ή γειτονικούς ιστούς. Επιπλέον, σε πολλές ανθρώπινες περιπτώσεις καρκίνου, Σουρβιβίνης έχει ανιχνευθεί ακόμη και κατά τη διάρκεια της ενδιάμεσης φάσης [13], [14]. Η υπερέκφραση Σουρβιβίνης απαντάται συχνά στον καρκίνο του παχέος [15], [16], [17]. έχουν εδώ αυξημένα επίπεδα Survivin έχουν περιγραφεί να συσχετίζονται με κακή πρόγνωση [18], [19], αλλά αντιφατικά στοιχεία που έχουν δημοσιευθεί σχετικά με αυτό [20]. Εκτός από τις λειτουργίες CPC της Σουρβιβίνης πιστεύεται ότι έχει πολλαπλούς ρόλους σε αποπτωτικά κανονισμού [21], [22], [23]. Ωστόσο, εντός του Ν-άκρου του Survivin, υπάρχει μόνο ένα βακουλοϊού αναστολέας της απόπτωσης επανάληψης τομέα (BIR). Επίσης Survivin δεν περιέχει Ο-τερματικό πεδίο δακτύλου RING η οποία είναι κοινή για τα μέλη της οικογένειας ΙΑΡ [11], [24]. Παρά το γεγονός ότι Survivin είχε αρχικά ταξινομηθεί ως αναστολέας της απόπτωσης (BIR) ότι αναγνωρίζεται πλέον ότι η βασική μοριακή λειτουργίες του συνδέονται με το σημείο ελέγχου συναρμολόγηση ατράκτου και κυτοκίνηση. Σήμερα, τα αντι-αποπτωτικά λειτουργίες Σουρβιβίνης αμφισβητηθεί δεδομένου ότι τα περισσότερα πειράματα τα οποία μπλοκάρει Survivin λειτουργία οδήγησε στην ανάπτυξη της μιτωτικής ελαττώματα που μπορούν να παρενοχλήσουν την ακριβή ανάλυση των ΙΑΡ λειτουργία του [25], [26], [27], [28 ]. Σε μια προηγούμενη μελέτη εκτομή του survivin σε λεμφοκυττάρων κοτόπουλο Β DT40 ήταν θανατηφόρος, λόγω της έλλειψης των δύο CPC λειτουργίες και επιπλέον άλλων πολλαπλασιαστικών ικανότητες κυττάρου [29]. Ωστόσο, αυτά τα κύτταρα εμφανίζονται κανονική ευαισθησία σε ετοποσίδη επαγόμενη απόπτωση σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

Στη μελέτη μας δείχνουν για πρώτη φορά ότι απορρυπαντικό διαλυτά Σουρβιβίνης καταστέλλει anoikis σε εξαρτώμενα από αγκίστρωση κύτταρα, μια μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από την απώλεια της πρόσφυσης από την περιβάλλουσα εξωκυττάρια μήτρα. Υποκυτταρική πειράματα κλασματοποίησης προσκόμισε αποδεικτικά στοιχεία που απορρυπαντικό διαλυτά Survivin του κυτταρόπλασμα ήταν υπεύθυνος για την καταστολή anoikis. Ο μηχανισμός της καταστολής anoikis περιλαμβάνει την ενεργοποίηση του ΧΙΑΡ /ΙκΒ-α /ΝΡ-κΒ σηματοδότηση και αδρανοποίηση του c-Jun. Ένα περαιτέρω σημαντικό εύρημα της μελέτης αυτής είναι ότι απορρυπαντικό διαλυτά Σουρβιβίνης συσχετίζεται με την επεμβατική φαινότυπο του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. Ως εκ τούτου, απορρυπαντικό διαλυτά Survivin μπορεί να είναι κλινική αξία, δεδομένου ότι ενδέχεται προβλέπει λεμφαδένων και απομακρυσμένων μεταστάσεων σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

Η υπερέκφραση Σουρβιβίνης προστατεύει τα κύτταρα από anoikis

σε αρχικές μελέτες επιδιώξαμε να αναλύσει τον αντίκτυπο της Σουρβιβίνης υπερέκφραση σε p53-ανεπαρκή Κινέζικου χάμστερ εμβρυονικά διπλοειδή ινοβλάστες (κύτταρα CHE) και ισογονικούς κύτταρα CHE φιλοξενούν άγριου τύπου ρ53. Για την παρακολούθηση επιμόλυνση χρησιμοποιήσαμε μια ενισχυμένη πράσινη φθορισμού πρωτεΐνη-tagged Survivin (EGFP-Survivin). Ωστόσο, η έκτοπη υπερέκφραση της EGFP-Survivin δεν είχε καμία επίδραση επί της απόπτωσης σε CHE-p53 + /+ κύτταρα κατεργασμένα με DNA βλάπτουν ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) και UV-C σε σύγκριση με CHE-p53 + /+ – κύτταρα EGFP (Σχήμα 1Α) όπως μετρήθηκε με χρώση αννεξίνης V και τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης (TdT) μεσολάβηση τέλος επισήμανση dUTP nick (TUNEL) δοκιμασίας. Στη συνέχεια, έστρεψε την προσοχή μας στα κύτταρα CHE με ελαττωματική κατάσταση p53 (CHE-p53 – /- κύτταρα). Εντυπωσιακά, CHE-p53 – /- κύτταρα με έκτοπη υπερέκφραση της EGFP-Survivin παράγεται μεταστατικών όγκων πνεύμονα όταν ενίεται υποδορίως σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια ενώ δεν πνευμονικών μεταστάσεων παρατηρήθηκαν μετά ξενομεταμόσχευση CHE-p53 – /- κύτταρα που εκφράζουν EGFP (Πίνακας S1). Δοκιμές επαγωγή απόπτωσης μετά IR ή UV-C αποκάλυψε ότι CHE-p53 – /- κύτταρα είχαν σημαντικά μεγαλύτερη κλάσμα απόπτωσης-θετικών κυττάρων όταν συγκρίνονται με κύτταρα CHE έχοντας άγριου τύπου ρ53 [30], [31], [32] (Σχήμα 1Α ). Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με αναφορές χρησιμοποιώντας τρωκτικά εμβρυϊκών ινοβλαστών επιδεικνύοντας μια λιγότερο επιδεκτικότητα σε IR και UV-C από εκείνα τα κύτταρα τα οποία στερούνται τη λειτουργική πρωτεΐνη ρ53, έλεγχος σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Ενδιαφέρον, επίσης δεν κατάφερε να βρει τον προστατευτική επίδραση των υπερεκφράζεται Survivin σε CHE-p53 – /- κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα CHE με έκτοπη έκφραση της EGFP (Σχήμα 1Α)

Α.. Συχνότητα της απόπτωσης σε κύτταρα CHE (με p53 + /+ και p53 – /-) επιμολυσμένα με pEGFP-κενό και ρΕΟΡΡ-Survivin μετά από θεραπεία με Χ-ακτινοβολία (10 Gy) και UV-C (10 J /m

2) . Τα επιμολυσμένα κύτταρα εκτέθηκαν σε IR ή UV-C σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. συχνότητες επιμόλυνσης ήταν 80-90%, και EGFP-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν για Αννεξίνη V-θετικά ή -αρνητικοί κύτταρα (

πάνω πίνακα

) και δοκιμασία-θετικά ή -αρνητικοί κύτταρα ΤΟΥΝΕΛ (

κάτω πίνακα

). Χ-ακτινοβολημένα CHE-p53 – /- κύτταρα είχαν σημαντικά μεγαλύτερη κλάσμα απόπτωσης-θετικών κυττάρων σε σύγκριση με το Χ-ακτινοβολημένα CHE-p53 + /+ κύτταρα (

P

& lt? 0,03 για χρώση Annexin V και

P

& lt? 0,08 για δοκιμασία TUNEL), και UV-C ακτινοβολημένα CHE-p53 – /- κύτταρα είχαν σημαντικά μεγαλύτερη κλάσμα απόπτωσης-θετικών κυττάρων σε σύγκριση με UV-C ακτινοβολούνται CHE-p53 + /+ κύτταρα (

P

& lt? 0,001 για χρώση Annexin V και

P

& lt? 0,02 για δοκιμασία TUNEL). Απόπτωση-θετικών κυττάρων δεν μειώθηκε σημαντικά το pEGFP-Survivin-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με pEGFP-επιμολυσμένα κύτταρα σε κάθε περίπτωση (

P

& gt? 0.4 για χρώση Annexin V και

P

& gt? 0,4 για δοκιμασία TUNEL). Τιμές υποδηλώνουν μέσο ± Τ.Α. (N = 3). Β Αύξηση της παρακράτησης στον πνεύμονα μετά από ενδοφλέβια ένεση του EGFP- ή EGFP-Survivin-εκφράζοντα κύτταρα. Ο αριθμός των επιζώντων CHE-p53 – /- κύτταρα στον πνεύμονα ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τον αριθμό των επιζώντων κυττάρων ελέγχου που εκφράζουν EGFP. Τιμές υποδηλώνουν μέσο ± Τ.Α. των έξι ποντικών. * Σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0.005). Γ κασπάσης-3 ενεργοποίησης σε CHE-p53 – /- κύτταρα επιμολυσμένα με pEGFP-κενό και pEGFP-Survivin μετά την επαγωγή anoikis. Τα επιμολυσμένα κύτταρα αποκολλήθηκαν από εξωκυττάρια μήτρα και συγχρόνως στερήθηκαν ορού για να επάγει anoikis στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό για 6-36 ώρες, συλλέχθηκαν και υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό SDS-δείγμα Laemmli για ανάλυση ανοσοκηλίδος με αντι-ενεργοποιημένο αντίσωμα κασπάσης-3. συχνότητες επιμόλυνσης ελέγχθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού και επιβεβαιώθηκε να είναι 80-90%. Δ κασπάσης-3 ενεργοποίησης σε CHE-p53 – /- κύτταρα επιμολυσμένα με pEGFP-κενό και pEGFP-Survivin μετά από θεραπεία με ακτινοβολία UV-C (10 J /m

2). Τα επιμολυσμένα κύτταρα εκτέθηκαν σε ακτινοβολία UV-C σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες, συλλέχθηκαν και υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό SDS-δείγμα Laemmli για ανάλυση ανοσοκηλίδος με αντι-ενεργοποιημένο αντίσωμα κασπάσης-3. συχνότητες Μεταμόλυνση ελέγχθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού και επιβεβαιώθηκε να είναι 80-90%.

Η

Μέχρι στιγμής επιμόλυνση pEGFP-Survivin δεν αναστέλλει προκαλούμενη από ακτινοβολία απόπτωση σε CHE-κύτταρα, ανεξάρτητα από την κατάσταση ρ53 και επίπεδα έκφρασης Σουρβιβίνης αλλά από την άλλη πλευρά μόνο CHE-p53 – /- κύτταρα που υπερεκφράζουν ΕΟΡΡ- Survivin προκάλεσε μεταστατική ασθένεια σε ποντίκια. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η υπερέκφραση της Σουρβιβίνης μπορεί να αυξήσει την επιβίωση των ΧΗΜ-p53 – /- -EGFP-Survivin κύτταρα κάτω από συνθήκες στρες το οποίο πιθανόν περισσότερο μοιάζει με το

in vivo

φυσιολογικές συνθήκες διάδοσης καρκινικών κυττάρων, όπως αγκύρωση-ανεξάρτητο κατάσταση και θρεπτικό λιμοκτονία

Πράγματι, εφαρμόζοντας

iv

έγχυση των κυττάρων όγκου σε ποντικούς που αποκάλυψε ότι ο αριθμός των επιζώντων CHE-p53 -. /- κύτταρα στον πνεύμονα ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τον αριθμό των κυττάρων που επιβιώνουν ελέγχου που εκφράζουν EGFP (Σχήμα 1Β).

για να διερευνήσουν περαιτέρω την υπόθεση μας, ελέγξαμε εάν η υπερέκφραση του EGFP-Survivin ανατίθενται μειωμένη anoikis-ευαισθησία, δηλαδή αντοχή σε starvation- ορό και τον πολιτισμό των ανάρτησης απόπτωση, σε κύτταρα CHE. Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 2Α έγινε φανερό ότι η υπερέκφραση του ΕΟΡΡ- Survivin κατέστειλε σημαντικά anoikis σε σύγκριση με το CHE-p53 – /- κύτταρα ελέγχου, όπως μετράται με χρώση αννεξίνης V και επίσης με τη δοκιμασία TUNEL, σε CHE-p53 – /- κύτταρα . Επιπρόσθετη ανάλυση ανοσοκηλίδος για την ανίχνευση του επεξεργασμένου εκτελεστή κασπάσης-3 επιβεβαίωσε ότι υπερεκφράζεται ΕΟΡΡ- Survivin προστατεύεται από anoikis (Σχήμα 1C) αφού CHE-p53 – /- κυττάρων με έκτοπη έκφραση της EGFP-Survivin επέδειξε ασθενέστερη σταδιακή αύξηση των επεξεργασμένων κασπάσης-3 κατά τη διάρκεια της παρατηρούμενης χρονικής περιόδου. Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση του EGFP-Survivin δεν καταστέλλει κασπάσης-3 ενεργοποίησης σε UV-C-επαγόμενη απόπτωση (Σχήμα 1 D).

A. Συχνότητα anoikis στο CHE-p53 – /- κύτταρα επιμολυσμένα με pEGFP-κενό και pEGFP-Σουρβιβίνης. Τα επιμολυσμένα κύτταρα αποκολλήθηκαν από εξωκυττάρια μήτρα και συγχρόνως στερήθηκαν ορού για να επάγει anoikis στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. συχνότητες Επιμόλυνση ήταν 80-90%, και EGFP-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν για anoikis θετικά ή -αρνητική κύτταρα. Η υπερέκφραση του EGFP-Survivin κατέστειλε σημαντικά anoikis σε σύγκριση με το CHE-p53 – κύτταρα ελέγχου – /. Τιμές υποδηλώνουν μέσο ± Τ.Α. (N = 3). * Σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0,08). ** Σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0,04). B. Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 σε EGFP- και ΕΟΡΡ- Σουρβιβίνης κύτταρα που εκφράζουν μετά ασιτία ορού υπό συνδέεται ή αποσυνδέεται συνθήκες καλλιέργειας. Το πειραματικό πρωτόκολλο που απεικονίζεται στο Σχήμα S1. συχνότητες επιμόλυνσης ελέγχθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού και επιβεβαιώθηκε να είναι 80-90%. Τα κύτταρα διατηρούνται σε μέσο άνευ ορού για 24-72 ώρες, συλλέχθηκαν και υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό SDS-δείγμα Laemmli για ανάλυση ανοσοκηλίδος με αντι-ΟΡΡ, αντι-Survivin, αντι-ενεργοποιημένης κασπάσης-3 αντίσωμα, αντι-LC3B, και αντι -α-τουμπουλίνης. C. Survivin επαγόμενη ρυθμός καταστολής της απόπτωσης σε σύγκριση μεταξύ των κυττάρων που εκφράζουν EGFP-και-EGFP Survivin-εκφράζοντα κύτταρα. Τα επίπεδα της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης κασπάσης-3 εκτιμήθηκε με ανοσοστύπωση ανάλυση. Τα ποσοστά καταστολή εκφράστηκαν σε μια αναλογία ενεργού επιπέδου κασπάσης-3 πρωτεΐνης σε ΕΟΡΡ- Survivin-κύτταρα που εκφράζουν το επίπεδο στα κύτταρα που εκφράζουν EGFP-. Τιμές υποδηλώνουν μέσο ± Τ.Α. (N = 3). * Σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0,04). ** Σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0,02). *** Σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0.007). ανάλυση κατακερματισμού D. DNA σε κύτταρα EGFP που εκφράζουν και EGFP-Survivin-εκφράζοντα κύτταρα. Τα επιμολυσμένα κύτταρα αποκολλήθηκαν από εξωκυττάρια μήτρα και συγχρόνως στερήθηκαν ορού για να επάγει anoikis στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν για 24 ώρες, και συλλέχθηκαν. Γονιδιωματικό DNA εκχυλίστηκε και ηλεκτροφορήθηκε επί πηκτών αγαρόζης. Ε Αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων που εκφράζουν EGFP-και-EGFP Survivin-εκφράζοντα κύτταρα, χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία laser. Τα επιμολυσμένα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε μέσο άνευ ορού για 24, και απεικονίζεται με Nomarski αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής (

λωρίδα DIC

), με χρώση ροδαμίνη phalloidin (

λωρίδα F-ακτίνης

), με φθορισμό EGFP (

λωρίδα EGFP

), και με χρώση DAPI (

DAPI λωρίδα

). Rhodamine χρώση phalloidin και χρώση ϋΑΡΙ τυπικά έδειξε ότι EGFP κύτταρα που εκφράζουν υποβλήθηκαν anoikis, αλλά EGFP-Survivin κύτταρα που εκφράζουν δεν το έκανε. F. Προσδιορισμός της βιωσιμότητας των κυττάρων από WST-1 προσδιορισμό. Τα επιμολυσμένα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε μέσο άνευ ορού για 24 ώρες, και στη συνέχεια η κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων που εκφράζουν EGFP-και-EGFP Σουρβιβίνης κύτταρα που εκφράζουν αξιολογήθηκε. Τιμές υποδηλώνουν μέσο ± Τ.Α. (N = 3). * Σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0,04).

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίζεται εάν η προστατευτική επίδραση του υπερεκφρασμένης ΕΟΡΡ- Survivin επί κασπάσης-3 ενεργοποίησης ήταν anoikis-ειδική, με τη χρήση ένα πρωτόκολλο προσδιορισμού anoikis (απεικονίζεται σχηματικά στο Σχήμα S1). αναλύσεις ανοσοστυπώματος έδειξε ότι η κατασταλτική επίδραση ήταν πιο ισχυρός σε αποσπαστεί συνθήκη καλλιέργειας σε σχέση με το συνημμένο συνθήκες καλλιέργειας (Σχήμα 2Β). Αξίζει να σημειωθεί, αυτοφαγία, ένας άλλος τύπος κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από μια καταβολική διαδικασία για την υποβάθμιση των κυτταρικών συστατικών από λυσοσώματα, δεν συμμετείχε στη δράση (Σχήμα 2Β,

IB: αντι-LC3B

). Τα ποσοτικά δεδομένα έδειξαν την αποτελεσματική καταστολή της αναστολής anoikis καλλιέργεια επαγόμενη σε ΕΟΡΡ- Σουρβιβίνης κύτταρα που εκφράζουν σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που εκφράζουν EGFP (Σχήμα 2C). Σύμφωνα με αυτή την παρατήρηση, υπερέκφραση του EGFP-Survivin κατέστειλε κατακερματισμού του DNA (Σχήμα 2D και E) και να διατηρηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχήμα 2F) σε μονοκατοικία κατάσταση του πολιτισμού.

Η υπερέκφραση της Σουρβιβίνης ρυθμίζει μεταγραφικών παραγόντων απόπτωσης που σχετίζονται με

επόμενο ρώτησε ποια μονοπάτια σηματοδότησης θα μπορούσε να συμμετέχει στην anoikis-καταστολή σε EGFP-Survivin εκφράζουν CHE-p53 – /- κύτταρα. Σουρβιβίνη έχει περιγραφεί να αναστέλλουν προ-αποπτωτικών Bcl-2 σχετίζεται Χ πρωτεΐνη (BAX) προκληθείσα απόπτωση [33]. Ωστόσο τα επίπεδα έκφρασης του ΒΑΧ δεν μεταβλήθηκε μετά την επαγωγή anoikis σε ΕΟΡΡ- Survivin- καθώς ΕΟΡΡ- εκφράζουν CHE-p53 – /- κύτταρα (Σχήμα 3,

Bax

). Στη συνέχεια επικεντρώθηκε στο δεύτερο μιτοχόνδρια προερχόμενο ενεργοποιητής της κασπάσης /άμεσος αναστολέας της πρωτεΐνης απόπτωσης πρόσδεσης με χαμηλό ρΐ (Smac /DIABLO) το οποίο έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύονται σε Σουρβιβίνη [34], [35]. Ωστόσο, Smac /DIABLO ήταν μη ανιχνεύσιμη σε μονοκατοικία συνθήκες καλλιέργειας (Σχήμα 3,

Smac /DIABLO

). Ένα άλλο μέλος της οικογένειας ΙΑΡ, ο αναστολέας φυλοσύνδετη πρωτεΐνης απόπτωσης (ΧΙΑΡ) έχει αναφερθεί ότι σχηματίζει ετεροδιμερή με Σουρβιβίνης [36]. Μερικές γραμμές απόδειξης προτείνουν ότι αυτό ετεροδιμερές είναι ικανό να ενεργοποιεί ένα αντι-αποπτωτική σηματοδότηση ΝΡ-κΒ, μέσω φωσφορυλίωσης και μετέπειτα αποικοδόμηση του μοριακού αναστολέα κάππα Β-α (ΙκΒ-α) [37]. Είναι ενδιαφέρον, σημειώσαμε μια ρύθμιση προς τα άνω του ΙκΒ-α επίπεδα πρωτεΐνης σε μονοκατοικιών κατάσταση κουλτούρα ελέγχου CHE-p53 – /- κύτταρα, ενώ τα επίπεδα έκφρασης ΙκΒ-α παρέμεινε πολύ χαμηλός σε ΕΟΡΡ- Σουρβιβίνης που εκφράζουν κύτταρα (Σχήμα 3,

ΧΙΑΡ, ΙκΒ-α, και NF-κΒ

). Ταυτόχρονα, αύξηση της φωσφορυλίωσης του προ-αποπτωτικών παράγοντα μεταγραφής, c-Jun, καταστάλθηκε από υπερέκφραση του ΕΟΡΡ- Σουρβιβίνης σε αποσπαστούν συνθήκες καλλιέργειας (Σχήμα 3,

JNK, c-Jun-P (S73), και c-Jun

). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση του ΕΟΡΡ- Survivin μειώνει το επίπεδο ΙκΒ-α σε αποκολλημένα κύτταρα και στη συνέχεια να οδηγήσει στην ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ και την ίδια στιγμή σε ένα καταστολή της c-Jun-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή. Ωστόσο, δεν θα μπορούσαμε να βρεθεί μια συμβολή της κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) για καταστολή anoikis σε αυτό το κυτταρικό σύστημα αν και FAK θέση αυτο-φωσφορυλίωση στο Y397 έχει αναφερθεί ότι είναι σημαντικό για την αντι-αποπτωτική δραστηριότητα του ΡΑΚ [38], [39] .

Το πειραματικό πρωτόκολλο που απεικονίζεται στο σχήμα S1. συχνότητες επιμόλυνσης ελέγχθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού και επιβεβαιώθηκε να είναι 80-90%. Τα κύτταρα διατηρούνται σε μέσο άνευ ορού για 24-72 ώρες, συλλέχθηκαν και υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό SDS-δείγμα Laemmli για ανάλυση ανοσοκηλίδος με αντι-β-ακτίνης, αντι-Βαχ, αντι-Smac /DIABLO, αντι-ΧΙΑΡ, αντι- ΙκΒ-α, αντι-ΝΡ-κΒ, αντι-ΙΝΚ, αντι-c-Jun-P (S73), αντι-c-Jun, αντι-ΡΑΚ-Ρ (Y397), και αντι-ΡΑΚ.

συνιστώσες CPC συμπεριλαμβανομένων Survivin έχουν μια τάση να συνδέσει με χρωματίνη και επομένως βρίσκονται συχνά στον πυρήνα και είναι κυρίως απορρυπαντικό αδιάλυτο. Ωστόσο, άλλα ενδοκυτταρικά πισίνα Σουρβιβίνης έχει περιγραφεί στο κυτταρόπλασμα ή που σχετίζεται με μιτοχόνδρια [40], [41]. Ήταν ιδιαίτερο ενδιαφέρον το πώς Survivin συνεργάτες με ΧΙΑΡ σε ένα κύτταρο. Από πειράματα χρονικής πορείας, κασπάσης-3 ενεργοποίησης ευρέθη 6 ώρες μετά την επαγωγή anoikis (Σχήμα 1 C). Κατά συνέπεια, τα κύτταρα σε χρόνο 0, 3 και 6 ώρες μετά την επαγωγή anoikis χρησιμοποιήθηκαν για υποκυτταρική κλασμάτωση πειράματα για να αποφευχθούν παρερμηνείες που μπορούν να προκύψουν από τη χρήση των νεκρών κυττάρων που επάγεται από anoikis. Αναλύσεις ανοσοστυπώματος εξής υποκυτταρική κλασματοποίηση αποκάλυψε ότι ΧΙΑΡ βρέθηκε κυρίως στο απορρυπαντικό διαλυτό κλάσμα του κυτοσολίου (Σχήμα 4Α,

IB: αντι-ΧΙΑΡ

). Ωστόσο, η πλειοψηφία των ΕΟΡΡ- Σουρβιβίνης βρέθηκε στο κλάσμα του ιζήματος απορρυπαντικό αδιάλυτο περιέχει χρωματίνη αλλά βρέθηκε επίσης σε μικρότερο βαθμό στα απορρυπαντικά διαλυτά πυρηνικά και κυτοσολικά κλάσματα (Σχήμα 4Α,

IB: anti-Survivin και ΙΒ : αντι-EGFP

). Έτσι, η αλληλεπίδραση των ΧΙΑΡ και Survivin προφανώς περιορίζεται στο απορρυπαντικό διαλυτό κλάσμα του κυτοσολίου. Πράγματι βρήκαμε μια σταθερή αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης μεταξύ ΧΙΑΡ και Σουρβιβίνης εφαρμόζοντας πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρησιμοποιώντας το απορρυπαντικό διαλυτό κυτταροπλασματικό κλάσμα του CHE-p53 – /- κυττάρων με έκτοπη έκφραση της EGFP-Survivin (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, μη-tagged Survivin ήταν λιγότερο αποτελεσματικά κλασματοποιήθηκε μέσα στο απορρυπαντικό διαλυτό κυτταροπλασματικό κλάσμα και anoikis και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 ήταν επίσης λιγότερο αποτελεσματικά καταστέλλεται σε μη-επισημασμένη Survivin-υπερεκφράζεται CHE-p53 – /- κύτταρα. Από την άλλη πλευρά, μια Discosoma κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη με επισύναψη Survivin (Survivin-DsRed) ήταν πιο αποτελεσματικά κλασματοποιήθηκε μέσα στο απορρυπαντικό διαλυτό κυτταροπλασματικό κλάσμα και anoikis και κασπάσης-3 ήταν επίσης πιο αποτελεσματικά καταστέλλεται Survivin-DsRed-υπερεκφράζεται CHE-ρ53- /- κύτταρα (μη δημοσιευμένα δεδομένα μας)

Α.. Υποκυτταρική κλασματοποίηση και immunoblot ανάλυση των ενεργοποιημένων κασπάσης-3, Survivin, και ΧΙΑΡ. συχνότητες επιμόλυνσης ελέγχθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού και επιβεβαιώθηκε να είναι 80-90%. Τα κύτταρα διατηρούνται σε μέσο άνευ ορού για 3-6 ώρες, συλλέχθηκαν και λύθηκαν. Το κυτταρόλυμα κλασματοποιήθηκε σε το απορρυπαντικό-διαλυτό κυτταροπλασματικό (

C

), και πυρηνικών (

N

) κλάσματα και το απορρυπαντικό αδιάλυτο σφαιρίδιο (

P

) κλάσμα για ανάλυση ανοσοκηλίδος με αντι-ενεργοποιημένης κασπάσης-3, αντι-Survivin, αντι-ΟΡΡ, αντι-ΧΙΑΡ, αντι-α-τουμπουλίνης, αντι-H3-ιστόνης, και αντι-β-ακτίνης. Β αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης μεταξύ ΕΟΡΡ- Survivn και ΧΙΑΡ. Κυτταρόλυμα από το απορρυπαντικό διαλυτό κυτταροπλασματικό κλάσμα ανοσοκαταβυθίστηκε με αντίσωμα αντι-ΧΙΑΡ αντισώματος και αντι-GFP και στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκε με αντι-ΟΡΡ αντίσωμα (

κατώτερο πάνελ

) και αντι-ΧΙΑΡ αντισώματος (

άνω πάνελ

), αντίστοιχα. EGFP-Survivin και ΧΙΑΡ ήταν συν-imunoprecipitated μόνο στο κελί λύμα μορφή κυττάρων EGFP-Survivin εκφράζουν (

λωρίδα 2

).

Η

Το απορρυπαντικό-διαλυτό κυτταροπλασματικό Σουρβιβίνης εμπλέκεται σε μεταστατικό εξέλιξης του ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου

οριστικά το ζήτημα αν απορρυπαντικό-διαλυτό κυτταροπλασματικό Σουρβιβίνη, βρίσκεται στον καρκίνο του ανθρώπου και των κατά κάποιο τρόπο συνδέεται με την ανάπτυξη της μεταστατικής νόσου. Αναλύσαμε οκτώ ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, η κυτταρική σειρά καρκινώματος του τραχήλου HeLa, και την κυτταρική γραμμή καρκινώματος 8505C throid με κυτταρική κλασματοποίηση και ανοσοκηλίδωση. Όπως έλεγχο συμπεριλάβαμε φυσιολογική εμβρυϊκή διπλοειδή ινοβλαστών (NHDF). Μεταξύ των ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, Survivin βρέθηκε στα απορρυπαντικό διαλυτά κλάσματα αν και τα επίπεδα έκφρασης διέφερε σημαντικά (Σχήμα 5Α). Στη συνέχεια, anoikis-ευαισθησία εξετάστηκε σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5Β). Παρά το γεγονός ότι το μέγεθος της συνεισφοράς του Survivin προς anoikis ανθεκτικός φαινότυπος σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων είναι απροσδιόριστη, υπάρχει άμεση συσχέτιση μεταξύ υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της κυτταροπλασματικής Σουρβιβίνης και anoikis αντίσταση απορρυπαντικό διαλυτά ιδιαίτερα για HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα με υψηλότερη έκφραση του απορρυπαντικού διαλυτό κλάσμα του κυτταροπλάσματος. Αξιοσημείωτα, NHDF, LoVo και SW480 κύτταρα, στα οποία απορρυπαντικό διαλυτά Survivin δεν ήταν ανιχνεύσιμη, έδειξε μαζική κυτταρικό θάνατο μετά την επαγωγή anoikis.

A. Υποκυτταρική κλασματοποίηση και ανάλυση ανοσοστυπώματος Σουρβιβίνης. Το προϊόν λύσης κυττάρου από εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα εκλασματώθη εις το απορρυπαντικό-διαλυτό κυτταροπλασματικό (

C

), και πυρηνικών (

Ν

) κλάσματα και το απορρυπαντικό-αδιάλυτο ίζημα (

P

) κλάσμα για ανάλυση ανοσοκηλίδος με αντι-Survivin, αντι-α-τουμπουλίνης, αντι-H3-ιστόνης, και αντι-β-ακτίνης. Η κυτταροπλασματική επίπεδο Survivin απορρυπαντικό διαλυτά εκτιμήθηκε με ανάλυση ανοσοστυπώματος, και εκφράζεται ως ποσοστό του επιπέδου 8505C, η οποία είναι αδιαφοροποίητο καρκίνωμα του θυρεοειδούς που δείχνει αντοχή anoikis (+++, & gt? 80%? ++, 40-80%? +, 10-40%? -, & lt? 10%). B. Anoikis ευαισθησία στο ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα. Τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε μέσο άνευ ορού για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με WST-1 προσδιορισμό.

Η

Ποιες βιολογικές συμπεριφορές σε καρκίνο του παχέος εντέρου συνδέονται με απορρυπαντικό-διαλυτό κυτταροπλασματικό Survivin είναι σημαντική για διαγνωστικούς ή θεραπευτικούς διαθεσιμότητες της. Στην προηγούμενη ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις μας ορθοκολικού καρκινικούς ιστούς, η απουσία της πυρηνικής Σουρβιβίνης και την ύπαρξη κυτταροπλασματικής Survivin έχουν βρεθεί να είναι σημαντική πρόβλεψης της θνησιμότητας σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο [42]. Ωστόσο, η ανάλυση του ανοσοϊστοχημικός εντοπισμός και η υποκυτταρική κλασματοποίηση ανίχνευση δεν είναι το ίδιο. Πέντε δείγματα φυσιολογικού και αντίστοιχης πρωτοταγούς καρκινικούς ιστούς από τους ίδιους ασθενείς εξετάστηκαν με υποκυτταρική πειράματα κλασμάτωσης, αλλά ανεξάρτητα από τα επίπεδα της Σουρβιβίνης υπερέκφρασης, οι περιπτώσεις θετικός για την ανίχνευση του απορρυπαντικού-διαλυτό κυτταροπλασματικό Survivin ήταν ασθενείς με λεμφαδένες και άλλα μακρινό μεταστάσεων. Εδώ, εξετάστηκαν άλλες περιπτώσεις σαράντα. Το περίγραμμα της μεθόδου ανίχνευσης που απεικονίζεται στο σχήμα S2. Το Σχήμα 6 δείχνει ένα τυπικό αποτελέσματα από δύο ασθενείς με ή χωρίς το απορρυπαντικό-διαλυτό κυτταροπλασματικό Σουρβιβίνης σε πρωτογενείς καρκινικούς ιστούς (περίπτωση Α είναι ένας ασθενής χωρίς μετάσταση και υπόθεση Β είναι ένας ασθενής με μετάσταση). Κλινικοπαθολογοανατομικών σημασία του απορρυπαντικού-διαλυτό κυτταροπλασματικό Survivin έκφραση προσδιορίστηκε για τις σαράντα περιπτώσεις. Οι θετικές περιπτώσεις ήταν σημαντικά αυξημένα στο μέγεθος του όγκου (& lt? 0.005), τα πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο με λεμφαδένα μετάσταση (& lt? 0.001), και τα πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο με μακρινή μετάσταση (& lt? 0,01), σε σύγκριση με τις αρνητικές περιπτώσεις (Πίνακας 1) .

Η oultline της μεθόδου ήταν απεικονίζεται στην Εικόνα S6. Φυσιολογικών και καρκινικών ιστών από ασθενείς με ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου χωρίς μεταστάσεις (

Περίπτωση Α

) ή με μεταστάσεις (

Περίπτωση Β

) λύθηκαν. Το κυτταρόλυμα κλασματοποιήθηκε σε το απορρυπαντικό-διαλυτό κυτταροπλασματικό (

C

), και πυρηνικών (

N

) κλάσματα και το απορρυπαντικό αδιάλυτο σφαιρίδιο (

P

) κλάσμα για ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως με αντι-Survivin, αντι-α-τουμπουλίνης, αντι-H3-ιστόνης, και αντι-β-ακτίνης.

Η

Συζήτηση

Σήμερα, είναι ομόφωνα αποδεκτό ότι Survivin είναι ένα βασικό συστατικό της ΕΠΑ ρύθμιση chromomal διαχωρισμό και την κυτοκίνηση [2] αν και οι ακριβείς ρόλοι των Survivin σε μίτωση δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Κύτταρα με διαταραγμένη λειτουργία του Survivin ή ενός από τους εταίρους της, λόγω μεσολάβηση RNAi αναστολή ή την έκφραση των κυρίαρχων αρνητικών μεταλλάξεων έδειξε συγκρίσιμη φαινοτύπων (δηλαδή, διαταράσσεται διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και τα ελαττωματικά κυτοκίνηση) [25], [26], [28] , [43], [44], [45]. Επιπλέον, οι φαινότυποι των μεταλλακτών knock-out Σουρβιβίνης σε ζυμομύκητες [46], [47] και

C. elegans

[48], [49], επιβεβαίωσε το ρόλο της Σουρβιβίνης ως CPP. Στα σπονδυλωτά, ο ουσιαστικός ρόλος της Σουρβιβίνης κατά τη διάρκεια της μίτωσης έχει αποδειχθεί σε

Xenopus laevis

[3] και ποντίκια [50]. Από την άλλη πλευρά, διάφορες μελέτες αποκάλυψαν μία αντι-αποπτωτική λειτουργία του Survivin σε διαφορετικά είδη και κυτταρικές σειρές. Αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα της Σουρβιβίνης και του Survivin πρωτεΐνη παρόμοια Deterin αναφέρθηκαν σε ζύμη [51] και

D. melanogaster

[52], αντίστοιχα. Ωστόσο, η υπερέκφραση Σουρβιβίνης θα μπορούσε να δράσει ως ένα αντι-αποπτωτικό παράγοντα ακόμα και σε μη σπονδυλωτά, υπό ορισμένες προϋποθέσεις, αλλά φαίνεται πιθανό ότι οι φαινότυποι Σουρβιβίνης-knockout που ερμηνεύτηκαν ως απώλεια των αντι-αποπτωτική λειτουργία ενδέχεται να συνδέεται κυρίως προς απορυθμισμένες διεργασίες μιτωτική .

Σε συστήματα καλλιεργημένου κυττάρου, αυξημένη αποπτωτική ευαισθησία, η οποία εμφανίστηκε αυθόρμητα ή με αποπτωτικών παραγόντων, ανατίθεται από την απώλεια-του-λειτουργία ή knock-down της Σουρβιβίνης. Survivin knock-out σε ένα Τ-κυττάρων που επάγεται γενεαλογία ρ53-εξαρτώμενη φαινοτύπους, οδηγώντας σε αναπτυξιακές θυμοκυττάρων ελάττωμα [53]. Αυτός ο φαινότυπος δεν θα μπορούσε να διασωθεί με αδρανοποίηση του p53, γεγονός που υποδηλώνει ότι Survivin είναι πιθανό να είναι ένα αντι-αποπτωτικό παράγοντα, ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53. Στην κανονική ανθρώπινους ινοβλάστες, Survivin knock-down, επίσης, που προκαλείται από την επαγωγή ρ53, η οποία προκάλεσε διακοπή του κυτταρικού κύκλου, χωρίς άμεση απόπτωση [54]. Αυτός ο φαινότυπος διασώθηκε από αδρανοποίηση της p53, γεγονός που υποδηλώνει ότι Survivin είναι πιθανό να εργαστεί μέσω p53 κάτω προσκολλημένη συνθήκες καλλιέργειας. Αυτά τα διαφορετικά αποτελέσματα αποκρύπτοντας πληροφορίες για την κατανόηση Survivin επαγόμενη προστασία από την απόπτωση. Οι διάφοροι τύποι κυττάρων, τα προσκολλημένα κύτταρα και τα μη-προσκολλημένα κύτταρα, είναι διαφορετικά σε ρ53 προκαλούμενη φαινοτύπους. Μη προσκολλητικά κύτταρα με φυσιολογική p53 προδιαθέτουν σε κυτταρική απόπτωση άμεση στρες που προκαλείται από [55], η λεγόμενη ενδιάμεση φάση του κυτταρικού θανάτου, σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα, ενώ τα προσκολλημένα κύτταρα με ρ53 σύλληψη πρωτίστως τον κυτταρικό κύκλο [56], [57]. Survivin knock-out επάγει p53 τόσο προσκολλημένα και μη προσκολλημένα κύτταρα, συνεπώς εκφράζουν τα φαινοτύπους για κάθε τύπο των κυττάρων. Στην υπόθεση μας, η οποία υποστηρίζεται από τη μελέτη μας, Survivin είναι προτιμησιακά αναστολή anoikis σε κύτταρα υποβάλλονται σε αγκύρωση εξαρτώμενη επιβίωση και ανάπτυξη ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53.

Όταν εκτεθεί στον ετοποσίδη βλάβης του DNA παράγοντα, Survivin νοκ-out DT40 κύτταρα παρουσίασαν φυσιολογική ευαισθησία σε αυτόν τον παράγοντα [29]. Τα δεδομένα πρότειναν ότι Survivin δεν είναι μια καθολική αναστολέας για την απόπτωση παράγοντα που επάγεται προκαλούν βλάβη στο DNA. Εδώ παρατηρήσαμε κανονική ευαισθησίες στο IR και UV-C σε Σουρβιβίνη-υπερεκφράζουν CHE-p53 – /- κύτταρα. Κατά την άποψή μας, Survivin θα έχουν σημαντικό ρόλο στην anoikis καταστολής για την ανάπτυξη του καρκίνου (βλέπε παρακάτω).

Σύμφωνα με προηγούμενες εκθέσεις, δείχνουμε εδώ ότι Σουρβιβίνης ρυθμίζει δράση της κασπάσης-3. Έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει την Σουρβιβίνη κασπάσης-3 ενεργοποίησης σε φυσιολογικό καταστάσεις κατά την διάρκεια της απόπτωσης, αλλά αυτό το αποτέλεσμα δεν είναι πιθανό να οφείλεται στην άμεση αναστολή της κασπάσης-3 [58], [59], [60]. Εξ ου και η ακριβής αντι-αποπτωτικό μηχανισμό Σουρβιβίνης παραμένει μια πρόκληση. Δύο μηχανισμοί έχουν προταθεί για λογαριασμό για την αναστολή των μιτοχονδρίων ρυθμιζόμενες απόπτωση σαν αποτέλεσμα της κασπάσης-3 ενεργοποίησης. Η πιο μελετημένη μόριο για αυτό είναι ένα προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Smac /DIABLO, στην οποία Survivin συνδέεται άμεσα [34]. Ένα Smac /DIABLO μεσολάβηση αλληλεπίδραση με Survivin να καταστείλει anoikis φαίνεται πιθανό δεδομένου ότι στην πειραματική μας ρύθμιση μόνο λίγη ή καθόλου έκφραση του Smac /DIABLO διάρκεια anoikis του CHE-κυττάρων ανιχνεύθηκε (Σχήμα 3). Ο δεύτερος μηχανισμός πώς Survivin εκπληρώνει τη λειτουργία του ΙΑΡ είναι μια άμεση σύνδεση προς ΧΙΑΡ [36].